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Producción de
Tubérculos-Semillas de Papa
Manual de Capacitación
Fascículo4.2
Cultivo de Tejidos para la
Eliminación de
Patógenos con fines de
Producción de Semilla de Papa
Ana Panta, Ali Golmirzaie
Introducción
Los patógenos vegetales, tales como nematodos, hongos, bacterias, micoplasmas, virus y viroides pueden
ser transmitidos de plantas enfermas y plantas sanas de papa. Sin embargo, no todas as células resultan
infectadas;
los tejidos meristemáticos se encuentran algunas veces libres de patógenos por lo que es posible recobrar
plantas no infectadas mediante técnicas de cultivo de meristemas in vitro, y lograr su crecimiento coma
plantas sanas.
La termoterapia, tratamiento de las plantas y temperaturas altas, también se aplica en la erradicación de
virus. Desde hace muchos años se utiliza con éxito en la erradicación de virus de claveles, geranios, fresas
y cítricos; para ella, las plantas son tratadas y temperaturas altas bajo condiciones de invernadero o cámara
de crecimiento. Actualmente el método estándar para erradicar virus en muchos cultivos propagados
vegetativamente es la termoterapia combinada con el cultivo de meristemas.
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Este documento describe los métodos que pueden aplicarse para eliminar los patógenos del material
infectado y producir plantas “libres de patógenos, para la distribución internacional y propagación en
programas de producción de semillas de papa.
Naturaleza de los Patógenos
Los patógenos que afectan y la papa pueden ser transmitidos de plantas enfermas y plantas sanas por
vectores y través de la semilla. El tamaño relativo de estos patógenos varia mucho. Entre los patógenos
vegetales los nematodos son los más grandes y pueden ser observados fácilmente con un microscopio
estereoscópico. Los virus y viroides son los más pequeños y se requiere de la ayuda de un microscopio
electrónico para su observación.
La ocurrencia de una enfermedad no sólo depende de la presencia del huésped, sino también de las
condiciones ambientales, especialmente la humedad y la temperatura que juegan un papel importante en el
desarrollo de una enfermedad. La enfermedad, por tanto, puede definirse coma el producto de y interacción
del huésped, el patógeno y el ambiente.
La distribución de los diferentes patógenos dentro de y planta enferma varia también mucha. Por ejemplo,
Pseudomonas solanacearum, el virus del enrollamiento de la hoja de la papa (PLRV) y los micoplasmas
están restringidos al tejida vascular de una planta; Erwinia carotovora y el virus X de la papa (PVX), invaden
tanto el tejido vascular coma el resto de los tejidos de la planta.
No todas las células en una planta enferma llegan y ser infectadas con patógenos. Los tejidas
meristemáticos de la raíz y brotes terminales de una planta infectada están, algunas veces, libres de ellos.
En algunas ocasiones, tal como sucede en la papa con el PVX y el TRV (Tobacco Rattle Virus), solamente
la cúpula y los primeros primordios foliares se encuentran libres de virus. Se desconoce la razón exacta de
este problema; sin embargo, se cree que uno ó más de los siguientes factores podrían ser responsables de
ello:
-
Alta actividad metabólica: Los virus se multiplican acompañando el curso del metabolismo del
huésped. Debido y la gran actividad metabólica en las células meristemáticas del huésped, los virus no
pueden tornar el control de la maquinaria biosintética del mismo.
-
Carencia de tejido vascular: Los virus se diseminan rápidamente y través del sistema vascular. Los
virus que se ubican tan solo en el floema (PLRV) no pueden invadir los tejidos meristemáticos debido y
la ausencia de diferenciación celular. En esta zona meristemática, los virus que infectan los tejidos no
vasculares se diseminan de célula y célula y través de los conductos intercelulares (plasmodesmos).
Este es un proceso lento por lo quo resulta relativamente difícil que los virus infecten en su totalidad y
las células que vienen dividiéndose rápidamente.
-
Alta concentración de auxinas: Los tejidos meristemáticos de las plantas tienen una concentración
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más alta de auxinas que los tejidos de otras partes de las mismas. Algunos autores indican que estas
auxinas inhiben y multiplicación de los virus.
Termoterapia
Experimentos llevados y cabo con huéspedes y sus virus han demostrado que el tratamiento de plantas con
temperaturas elevadas (termoterapia) lleva y una reducción en la concentración del virus en la planta
(Kassanis, 1957; Quak, 1977]. Se han dado diferentes explicaciones para este fenómeno. Posiblemente no
es solo una, sino una combinación de ellas la responsable de y reducción en la concentración de virus.
Entre estas explicaciones está la de la competencia entre las células del huésped que se encuentran en
proceso de rápida división y las partículas del virus por lugares de síntesis de ácidos nucleicos y proteínas
lo cual puede llevar y un cambio en el balance entre la síntesis y degradación de las partículas del virus.
Otra es y del ácido nucleico del virus, portador de su información genética, este está protegido del ataque
de enzimas degradantes por una cubierta compuesta de muchas subunidades de proteína. A altas
temperaturas, la unión entre estas subunidades se vuelve más débil, se pueden abrir aberturas temporales,
y permitir el ataque de las nucleasas, lo que inactive al virus y disminuye la concentración del mismo.
La termoterapia ha sido aplicada y tubérculos de papa en reposo. Se ha observado una reducción en la
concentración de virus, especialmente del virus del enrollamiento de la hoja (PLRV), habiéndose logrado
eliminación total de este virus, tan solo utilizando termoterapia.
La termoterapia aplicada y la planta entera, al igual que y aplicada y tubérculos ya brotados, seguida por
cultivo de meristemas, ha sido exitosamente utilizada para la eliminación de muchos virus de y papa (StaceSmith y Mellor, 1970:Pennazio y Redolfi, 1973).
En el procedimiento estándar empleado en el CIP, los mejores resultados se han obtenido cuando la planta
es decapitada antes de ser tratada por termoterapia, y las yemas axilares se encuentran creciendo mientras
reciben el tratamiento de calor Un régimen de temperatura diana de 3600 por 16 horas, y 30 C por 8 horas.
baja luz continua de alta intensidad (10000 lux = 108 mEm-2s-1) mejoró las tasas de eliminación de virus.
Las plantas son mantenidas baja estas condiciones por cuatro semanas. Meristemas, tanto de las yemas
axilares, coma de las yemas apicales, son aisladas y cultivadas coma se muestra más adelante.
La termoterapia antes descrita se puede aplicar y plántulas in vitro. Nudos (20 nudos/caja) con una yema se
colocan en cajas de plástico (Magenta GA-7) que contienen medio semisólido de propagación (Espinoza, et
al., 1991). Las cajas se incuban baja las condiciones antes reportadas (Espinoza, et al. 1991). Las cajas
son selladas con cinta adhesiva cuando las plantas alcanzan aproximadamente 3 cm de altura y presentan
un buen sistema radicular, sometiéndolas luego al tratamiento de termoterapia antes mencionado. Al cabo
de un mes, los meristemas apicales se aislan y siembran en un medio de cultivo apropiado.
Cultivo de Meristemas
Debido y quo los tejidos meristemáticos algunas veces se encuentran libros de patógenos, es posible
recobrar plantas no infectadas mediante técnicas de cultivo de meristemas in vitro, y mantenerlos hasta
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obtener plantas adultas sanas.
El cultivo de meristemas incluye un proceso de esterilización de superficie, la escisión y aislamiento del
meristema, y su cultivo en un medio baja condiciones adecuadas. Cuando el material vegetal proviene de in
vitro no es necesaria la esterilización de superficie.
1. Esterilización de superficie. Es necesaria esterilizar y superficie del material vegetal en case esté,
contaminada con patógenos y saprofitas dada que algunas de as contaminantes crecen rápidamente y
pueden matar al tejido y órgano (explante) de la planta sembrada en un medio de cultivo.
La mayoría de las contaminantes de la superficie del tejida, pueden ser eliminados del material vegetal
utilizando un agente esterilizador apropiada. Baja condiciones asépticas, la solución esterilizadora
normalmente se aplica por 10-15 minutas, ésta es eliminada y el material vegetal lavado por agitación en
agua destilada estéril 3 d 4 veces durante 5 minutas cada vez . El lavada es muy importante para eliminar el
exceso del agente esterilizador el cual puede inhibir el crecimiento de la planta.
Alcohol (etanol). Es un agente esterilizador común de la superficie para eliminar bacterias y hongos. y
frecuentemente es utilizada para un lavado breve (30’) antes de aplicar otros tratamientos de esterilización
de superficie. Tiene una baja tensión superficial por la cual puede penetrar fácilmente entre las pilosidades
foliares y mojar la superficie de la planta. Etanol de 70% es más efectiva cama agente esterilizador que el
de 95-100%.
Hipoclorito de sodio o de calcio. La superficie del material vegetal también puede ser esterilizada con
soluciones acuosas de hipoclorito de sodio (NaOCl) y de hipoclorito de calcio (CaOCl). La sal de calcio es
preferida porque es menos fitotóxica. Muchas laboratorios utilizan lejía (hipoclorito de sodio) de uso
doméstico tal como el Clorox. Estas productas comerciales contienen normalmente 5,25% de NaOCl coma
producta active. Cuando se es diluye con agua (1 parte de lejía 9 partes de agua), la solución esterilizadora
resultante debe contener no menos de 05% de NaOCl.
Debido y la disociación completa, el hipoclorito tiene una actividad relativamente baja y un pH superior y 8,0
y es más efectiva fijando la solución y alrededor de pH 6,0.
La superficie del tejido recientemente disecado y sumergido completamente en la solución de hipoclorito
(de Ca ó Na), queda esterilizada después de una exposición de 10-15 minutes. Luego del tratamiento con
hipoclorito, el material tratado debe ser lavada cuidadosamente con varios cambios de agua destilada, para
eliminar completamente el desinfectante.
Bicloruro de mercurio. El bicloruro de mercurio (HgCl2) ha sido utilizado coma desinfectante pese y que
es extremadamente toxica. La solución de bicloruro de mercurio es volátil y temperatura ambiente y puede
provocar un envenenamiento por mercurio. Por lo tanto: no recomendamos su uso como agente
esterilizador!
Bactericidas y fungicidas. Para material altamente contaminado, se recomiendan el lavado en una mezcla
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comercial bactericida / fungicida antes de proceder a la esterilización de su superficie. Debe recordarse, sin
embargo, que este tratamiento no tiene efecto sobre infecciones sistémicas.
2. Aislamiento y cultivo de meristemas. El meristema es el punto activo de crecimiento del ápice de la
planta. Es una zona pequeña compuesta de células (meristemáticas) dividiéndose rápidamente.
El domo de la yema apical contiene las verdaderas células meristemáticas V está rodeada por primordios
foliares y hojas primarias. Debido a que los
tejidos vasculares más diferenciados se encuentran alejados de los meristemas (hacia los tejidos más
viejos del tallo), los elementos vasculares de los primordios foliares son incipientes, y no han hecho aún
contacto con la parte principal del sistema vascular en el tallo. Por lo tanto, las partículas de virus que
puedan estar presentes en el sistema vascular, pueden llegar a la zona meristemática del ápice sólo
moviéndose lentamente de célula en
célula. Esta es una de las razones principales del porqué, en una planta infectada la concentración de los
virus disminuye desde la base hacia los meristemas tanto del ápice como de las yemas axilares.
El aislamiento del punto meristemático en condiciones asépticas y su cultivo en un medio nutritivo aséptico,
permite el desarrollo de plántulas. El desarrollo del meristema en condiciones in vitro se lleva acabo en
forma similar al que se realiza en una planta normal. Las células del meristema se dividen y continua la
diferenciación de tejidos nuevos. La nutrición de los tejidos de la sección disecada es proporcionada por el
medio artificial. La disección aséptica del meristema es un proceso delicado y requiere muchas horas de
práctica.
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3. Escisión de meristemas:
Bajo un microscopio binocular de disección, se eliminan las hojuelas que rodean el punto de crecimiento
hasta que solamente quede la cúpula de la yema apical y unos cuantos primordios foliares (generalmente
dos).
4. Cultivo del meristemas:
La cúpula y dos primordios foliares se disecan y transfieren a! medio de cultivo de meristemas. El
meristema disecado se transfiere semanalmente a medio fresco. Después de 6-8 semanas de cultivo se
obtienen plántulas, las cuales deben ser micro propagadas para su indexación.
El medio de cultivo utilizado para este trabajo esta basado en las sales de Murashige y Skoog (1962) y
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suplementado con 2 mg/L de glicina, 0.5 mg/L de ácido nicotínico 0.5 mg/L de piridoxina, 0.4 mg/L de
tiamina, 0.1 mg/L de ácido giberélico, 0.04 mg/L de kinetina y 2.5 % de sacarosa. El medio es gelificado con
agar (0.6%) y se esteriliza en autoclave a 15 lb de presión, 12100, durante 15 minutos.
5. Pruebas de indexación:
Las plantas desarrolladas a partir de meristemas, son probadas para detectar cualquier infección
persistente de virus. En el CIP las pruebas que se realizan son: NASH para la detección de PSTVd, prueba
serológica de ELISA y prueba de plantas indicadoras (International Potato Center, 1993). La búsqueda de
partículas virales mediante el microscopio electrónico se realiza en forma opcional. Todas estas pruebas se
pueden realizar en un periodo de 2 meses.
Usa de Antibióticos
En cultivo de tejidos vegetales, los antibióticos solo son empleados cuando los microorganismos no pueden
ser eliminados par otros métodos. Estos compuestos son caros y no existe ninguno que será efectivo para
controlar todos los organismos contaminantes. Antes de decidir utilizar antibióticos se recomienda eliminar
todas las posibles fuentes de contaminación (Reed and Tanprasert, 1995).
Las siguientes combinaciones de antibióticos se han aplicado con éxito en cultivo de tejidos de plantas:
Cefotaxime, Gentainicina, Rifampicina, Nystatina + Carbenicilina, Gentamicina + Amphotericina B,
Vancomicina HCI + Mycostatin and Streptoinicina + Carbenicilina. Existen reportes de toxicidad causada en
algunos cultivos par: Penicilina, Estreptomicina, Bactericina y Sparsomicina (Lizárraga et al., 1991].
En el dR las infecciones con bacterias y levaduras pueden ser eliminadas satisfactoriamente. Para ella los
productos antibióticos son añadidos al medio de cultivo a las concentraciones que se indican a
continuación. Para bacterias se utiliza Rifampicina (Rimactan 300-) a una concentración de 60 mg/L, 0
Cefatoxime sódica (Claforan) 200 mg/L. Cefatoxine (Mefoxin) también puede ser utilizado a la
concentración de 200 mg/L. Cuando la infección es con levaduras se añade al medio de cultivo 0.25 a 0.5
mg/L. de Amphotericin B.
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