Download CITOMETRIA DE FLUJO EN LA EVALUACION DE

UNIVERSIDAD DE CONCEPCION
ESCUELA DE GRADUADOS
MAGISTER EN CIENCIAS
MENCION MICROBIOLOGIA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
CITOMETRIA DE FLUJO EN LA
EVALUACION DE POTENCIAL DE
MEMBRANA Y VIABILIDAD CELULAR
DE Helicobacter pylori
JUAN LUIS CASTILLO NAVARRETE
CONCEPCION, CHILE
2005
i
UNIVERSIDAD DE CONCEPCIÓN
ESCUELA DE GRADUADOS
Esta tesis ha sido realizada en el Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana,
Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de
Concepción y en Laboratorio de Citometría de Flujo del Hospital del Trabajador, y
ha sido aprobada por la siguiente Comisión de Evaluación:
Dra. Apolinaria García C.
Bioquímico.
Magíster en Tecnología del DNA
Recombinante.
Magíster en Microbiología.
Doctor en Ciencias Biológicas.
Dr. Carlos González C.
Bioquímico.
Magíster en Microbiología
Doctor en Ciencias
Dr. Fernando Kawaguchi P.
Médico Gastroenterológo
Doctor en Medicina
-------------------------------Profesor Guía
Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad de Concepción
-------------------------------Comité de Tesis
Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad de Concepción
-------------------------------Comité de Tesis
Facultad de Medicina
Universidad de Concepción
Dr. Jaime Madariaga B.
Médico Anatomopatólogo
-------------------------------Comité de Tesis
Facultad de Medicina
Universidad de Concepción
Dr. Gerardo González R.
Licenciado en Biología.
Magíster en Microbiología
Doctor en Ciencias Biológicas
------------------------------Jefe de Programa Magíster en
Ciencias con Mención Microbiología
ii
“Different people see microorganisms from
different perspectives”
Howard M. Shapiro
iii
Con amor a
Carmen Gloria,
Francisco,
Loreto,
Cristina,
Tata, Tete
y Marcelo
iv
AGRADECIMIENTOS
Agradecimientos, sin duda lo más difícil de esta tesis, la cual al igual que las
asignaturas del programa de Magíster, no habrían prosperado sin el aliento
constante de muchos, la ayuda de otros y el apoyo incondicional de aquellos. Son
muchos los que se me escaparán, pero a ellos también les debo mucho.
Agradezco y reconozco públicamente, que sin el apoyo incondicional, paciencia,
consejos y amor de Carmen Gloria, esta empresa no habría llegado a puerto; no
puedo dejar de recordar aquellas noches de certámenes, en los me acompañó en mi
vigilia para que “no me durmiera”, así como también sus constantes “tu eres
capaz”….. Gracias y perdón por el tiempo que no te entregué…….
A Francisco, mi hijo y “padawan”, por su paciencia, comprensión (en especial
cuando me decía…“ya sé papá, es tu trabajo”….) y por su entereza al decirme las
cosas de frente.
A mi “princesa” Loreto, que con su cariño espontáneo me recargó mis baterías en
innumerables ocasiones.
A la “Señorita Titi”, Cristina, mi hija, mi “araña peluda”, la cual llegó a mi vida a
fines del primer año de Magíster, y que desde entonces sólo me ha entregado amor
incondicional junto con el misterio de la profundidad de sus ojos…
Como no agradecer a mi Padre, quién desde niño me inculcó las bases para buscar
información y siempre ir más allá en la búsqueda del conocimiento, por muy
particular que este sea. Además con su ejemplo de tesón, entrega y sacrificio, así
v
como entrañable amor me ha apoyado en mis locuras y siempre me ayudado a
levantarme, cuando ha sido necesario…..para ti “papito”…..
Y que decir la “chica”, mi madre que con su paciencia y sencillez, hasta la fecha
(y gracias a Dios), me acompaña y apoya.
Un abrazo de agradecimiento a mi colega, compadre y hermano Marcelo, quién
siempre me acompañado en mis tonteras y locuras y con quién tuve el privilegio
de ser compañero de algunas asignaturas del programa de Magíster, gracias
“manito”.
A mi profesor guía, “Pola”, por su apoyo y por creer en mi, así como su especial
sencillez
que
permite
entregar
desinteresadamente
apoyo
y
consejo…..Gracias…….
A la comisión evaluadora de esta tesis, Dr. Fernando Kawaguchi, Dr. Carlos
González y Dr. Jaime Madariaga, por su constante apoyo y aportes con ideas
interesantes, gracias.
Al Centro de Diagnóstico Oncoinmunológico Limitada, administrador del
Laboratorio de Citometría de flujo del Hospital del Trabajador Concepción, por su
confianza y por permitirme usar sus instalaciones.
A mi “yunta” (o llunta) Natalia, con la cual sufrimos codo a codo durante el
primer año del programa.
A mi amigo, Oscar Venegas, por su incondicional apoyo y constantes palabras de
aliento, gracias…
A mis amigos y socios comerciales, sin cuyo apoyo no habría podido intentar esta
aventura, gracias…
vi
A todos los docentes del Departamento de Microbiología que participaron directa
o indirectamente en mi formación académica; particularmente, a Carlos González,
Ángel Oñate, Gerardo González y Miguel Martínez por todos los conocimientos
aportados.
Especial agradecimiento al profesor Mario Henríquez, quién no sólo me entregó
conocimientos, si no que me entregó experiencia, confianza, sabiduría y amistad.
Al personal auxiliar del Departamento de Microbiología, que me tuvo paciencia y
siempre mostraron muy buen voluntad para ayudarme, gracias…
A mis colegas y personal del Laboratorio Clínico del Hospital del Trabajador,
quienes me permitían hacer mis siembras, traspasos e incubaciones en sus
instalaciones, gracias…
Quizás cuántos son los que se me quedan afuera de estas palabras, ellos me sabrán
disculpar por no mencionarlos, gracias a todos ellos…
vii
INDICE GENERAL
Página
Índice General
vii
Índice de Figuras
xi
Índice de Tablas
xv
Resumen
xvi
Abstract
xx
1.
INTRODUCCION
1
1.1
Citometría de flujo
1
1.1.1.
Fundamentos básicos
1
1.1.2.
Presentación de datos y análisis
3
1.1.3.
Citometría de flujo en estudios microbiológicos
5
1.2.
Potencial de Membrana (∆Ψ)
8
1.2.1.
Bases físico químicas del potencial de membrana
8
1.2.2.
Medición de ∆Ψ usando micro electrodos
11
1.2.3.
Medición indirecta de ∆Ψ en suspensiones celulares
12
usando ensayos de distribución
1.2.4.
Estimación de ∆Ψ por citometría de flujo
14
1.2.4.1.
Compuestos para ensayos potenciométricos
14
1.3.
Viabilidad celular
18
1.3.1.
Definiciones y evaluación por citometría de flujo
18
viii
1.4.
Helicobacter pylori
20
1.4.1.
Características microbiológicas
21
1.4.2.
Patogénesis de la infección por H. pylori
22
1.4.3.
Tratamiento de la infección por H. pylori
22
1.5.
Hipótesis
25
2.
MATERIALES Y METODOS
29
2.1.
Reactivos
29
2.2.
Cepas bacterianas
30
2.3.
Condiciones de cultivo
30
2.4.
Preparación de suspensiones celulares para evaluación
31
de patrones de tamaño bacteriano por citometría de
flujo
2.5.
Preparación de controles negativos para viabilidad
32
celular, ∆Ψ y eflujo bacteriano a bromuro de etidio
2.5.1.
Preparación de células muertas por calor
32
2.5.2.
Preparación de células muertas por shock frío
33
2.6.
Ensayo de viabilidad bacteriana por citometría de flujo.
34
2.7.
Ensayo de ∆Ψ por citometría de flujo.
34
2.8.
Ensayo de eflujo bacteriano a bromuro de etidio por
34
citometría de flujo
2.9.
Citometría de flujo
35
2.10.
Análisis de patrones de tamaño
35
ix
2.11.
Análisis de viabilidad bacteriana
37
2.12.
Análisis de ∆Ψ y cálculo de razón de fluorescencia
38
roja/verde
2.13.
Análisis de eflujo bacteriano a bromuro de etidio.
41
3.
RESULTADOS
42
3.1.
Determinación de calibración base
42
3.2.
Análisis de patrones de tamaño
43
3.3.
Ensayo de viabilidad celular en E. coli y S. aureus
49
3.4.
Ensayo de ∆Ψ en E. coli y S. aureus
59
3.5.
Ensayo de viabilidad celular en Helicobacter pylori:
68
3.6.
Ensayo de ∆Ψ en H. pylori
69
3.7.
Ensayo de eflujo de bromuro de etidio en E. coli y S.
70
aureus
3.8.
Ensayo de eflujo de bromuro de etidio en H. pylori
72
3.9.
Acción de CCCP sobre la viabilidad celular, ∆Ψ y el
73
probable eflujo de bromuro de etidio en S. aureus
3.10.
Acción de CCCP, valinomicina, azida de sodio y
74
MC207.110, sobre la viabilidad celular, el potencial de
membrana y el eflujo de bromuro de etidio en E. coli
3.11.
Acción de CCCP, valinomicina, azida de sodio y
77
MC207.110, sobre H. pylori
4.
DISCUSION
79
x
4.1.
Citometría de flujo y bacterias
80
4.2.
Análisis de patrones de tamaño
81
4.3.
Ensayo de viabilidad celular en E. coli y S. aureus
84
4.4.
Ensayo de ∆Ψ en E. coli y S. aureus
85
4.5.
Ensayo de viabilidad celular y ∆Ψ en H. pylori
89
4.6.
Ensayo de eflujo a bromuro de etidio en E. coli y S.
89
aureus
4.7.
Ensayo de eflujo a bromuro de etidio en H. pylori
95
4.8.
∆Ψ en H. pylori
95
5.
CONCLUSIONES
99
6.
PROYECCIONES
100
7.
GLOSARIO
102
8.
SOLUCIONES
109
9.
REFERENCIAS
110
xi
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1
: Distintas formas gráficas de presentar los mismos
datos.
5
Figura 2
: Esquema de medición de medición de ∆Ψ en
eucariontes usando micro electrodos.
12
Figura 3
: Selección de ventana de análisis en función de FSC
y SSC.
36
Figura 4
: Diagrama correspondiente a la secuencia de análisis
de estimación de ∆Ψ.
∆Ψ
40
Figura 5
: Selección de calibración base.
42
Figura 6
: Superposición de histogramas para la señal de FSCH, representando distintos patrones de tamaño
bacteriano.
44
Figura 7
: Estimación de tamaño para E. coli K12 frente a
diferentes antibióticos.
46
Figura 8
: Patrón de tamaño de cepas de H. pylori después de
incubación por 72 horas.
48
Figura 9
: Viabilidad bacteriana, mediante la incorporación de
PI.
49
Figura 10
: E. coli. Bacterias vivas y bacterias muertas por
calor.
50
Figura 11
: Evaluación de linealidad, mediante incorporación de
PI, en células de E. coli muertas por calor.
51
Figura 12
: Células de S. aureus muertas por calor. Formación
de agregados y el aumento de la destrucción celular.
52
Figura 13
: Evaluación de linealidad, mediante incorporación de
PI, en células de S. aureus muertas por calor.
52
xii
Figura 14
: Incorporación de PI en células de E. coli, bajo la
acción de diversas sustancias.
54
Figura 15
: Incorporación de PI en células de E. coli, bajo la
acción de solución en base a paraformaldehído y
dietilenglicol.
54
Figura 16
: Incorporación de PI en células de E. coli tratada por
30 minutos a 70ºC.
55
Figura 17
: Incorporación de PI en células de S. aureus, bajo la
acción de solución en base a paraformaldehído y
dietilenglicol.
55
Figura 18
: Incorporación de PI en células de S. aureus, en
diversas situaciones.
57
Figura 19
: Incorporación de PI en células de
sometidas a shock frío.
S. aureus
57
Figura 20
: Incorporación de PI en células de E. coli sometidas a
shock frío.
58
Figura 21
: Incorporación de PI en células de E. coli sometidas a
shock frío. Ensayo triplicado.
58
Figura 22
: Incorporación de PI en células de S. aureus
sometidas a shock frío. Ensayo triplicado.
59
Figura 3
: S. aureus y ∆Ψ:
∆Ψ Gráfico de FL2-H v/s FL1-H
mostrando células polarizadas y depolarizadas
60
Figura 24
: S. aureus: Histograma representando la razón
FL2/FL1 en células depolarizadas y polarizadas.
61
Figura 25
: Incorporación de PI en células de S. aureus muertas
por shock frío. Evaluación de linealidad.
62
Figura 26
: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío).
Evaluación de linealidad de ensayo de
∆Ψ (marcación con DiOC2(3)). Ensayo en
triplicado.
63
Figura 27
: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío).
63
xiii
Evaluación de linealidad de ensayo de ∆Ψ (razón de
fluorescencia roja/verde) en triplicado.
Figura 28
: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío).
Evaluación de estabilidad en el tiempo de ensayo de
∆Ψ (marcación con DiOC2(3)).
64
Figura 29
: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío).
Evaluación de estabilidad en el tiempo de ensayo de
∆Ψ ( razón de fluorescencia roja/verde).
64
Figura 30
: E. coli. Incorporación de Dioc2(3), según el buffer
usado.
66
Figura 31
: Evaluación de linealidad en la Incorporación de PI
de células de E. coli en PBS-EDTA.
66
Figura 32
: Células de E. coli en PBS-EDTA vivas y muertas
(shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de
∆Ψ (marcación con DiOC2(3)). Ensayo en
triplicado.
67
Figura 33
: Células de E. coli en PBS-EDTA vivas y muertas
(shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de
∆Ψ ( razón de fluorescencia roja/verde). Ensayo en
triplicado
67
Figura 34
: H. pylori. Incorporación de PI (PBS-EDTA).
68
Figura 35
: H. pylori en PBS-EDTA.
∆Ψ (marcación con DiOC2(3)).
de
69
Figura 36
: Eflujo a BrEt en E. coli. En A control positivo
(células vivas) y en B control de negativo (células
muertas).
70
Figura 37
: E. coli (células vivas y muertas). Evaluación de
linealidad para incorporación de PI y para eflujo a
BrET.
71
Figura 38
: S. aureus (células vivas y muertas). Evaluación de
linealidad para incorporación de PI y para eflujo a
BrET.
72
Evaluación
xiv
Figura 39
: Células vivas de S. aureus. Acción de CCCP sobre
la viabilidad celular y el eflujo a BrEt.
73
Figura 40
: Células vivas de S. aureus. Acción de CCCP sobre
el ∆Ψ (razón de fluorescencia roja/verde).
74
Figura 41
: Células vivas de E. coli. Acción de diversos
compuestos sobre la viabilidad celular.
75
Figura 42
: Células vivas de E. coli. Acción de diversos
compuestos sobre el eflujo a BrEt.
76
Figura 43
: Células vivas de E. coli. Acción de diversos
compuestos sobre la razón de fluorescencia
roja/verde (∆Ψ
∆Ψ).
∆Ψ
76
Figura 44
: H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre
incorporación de PI.
77
Figura 45
: H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre el
eflujo a BrEt.
78
Figura 46
: H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre la
razón de fluorescencia roja/verde (∆Ψ
∆Ψ).
∆Ψ
78
Figura 47
: Relación entre ∆Ψ,
∆Ψ DIOC2(3), tamaño celular,
formación de agregados y fluorescencias.
87
xv
INDICE DE TABLAS
Página
32
Tabla 1
: CMI para E. coli K12, frente a los antibióticos
usados.
Tabla 2
: Protocolo básico de trabajo.
33
Tabla 3
: Patrones de estimación de tamaño definidos por el
porcentaje de la gate para cada marcador.
37
Tabla 4
: Protocolo de cálculo de razón de fluorescencia roja
sobre verde usando programa Flow Explorer 4.0.
40
Tabla 5
: Detalle de calibración base utilizada (Citómetro de
flujo FACSCalibur)
43
Tabla 6
: Patrones de tamaño de cepas control.
45
Tabla 7
: Patrones de tamaño de E. coli K12 bajo el efecto de
diferentes antibióticos (a concentraciones de 0.5 y 2
veces la concentración mínima inhibitoria).
47
Tabla 8
: Patrones de tamaño para diferentes cepas de H.
pylori después de un cultivo de 72 horas.
48
xvi
RESUMEN
El potencial de membrana (∆Ψ
∆Ψ)
∆Ψ cumple un papel fundamental en la
fisiología bacteriana. Como un componente de la fuerza protón motriz, se
encuentra íntimamente involucrado en la generación de ATP. Además, participa en
varios procesos como auto lisis bacteriana, transporte de glucosa, quimiotaxis y
sobrevida a pH bajo. Los ∆Ψ en bacterias metabólicamente activas son generados
por diferencias en la concentración de iones en lados opuestos de la membrana
celular. Esta diferencia de potencial es negativa en el interior de la membrana,
variando
entre –100 y –200 mV. Una disminución y un incremento en la
magnitud del ∆Ψ se conocen como depolarización eléctrica e hiperpolarización,
respectivamente. El ∆Ψ se reduce a cero, si la membrana es rota, la cual se vuelve
permeable irreversiblemente a compuestos como el yoduro de propidio (PI),
usados para estudios de viabilidad celular. Bajo este concepto, por un lado, el ∆Ψ,
∆Ψ
y por otro, la impermeabilidad de la membrana a ciertas sustancias fluorescentes,
se han usado como los principales indicadores del estado fisiológico de la
membrana citoplasmática y de la viabilidad, respectivamente. El demostrar la
captación de estos compuestos impermeables (PI, TO-PRO3 y Sytox Green) por
células, es considerado un indicador de muerte celular.
La medición de ∆Ψ en bacterias en crecimiento activo, es esencialmente
imposible, a raíz de su pequeño tamaño. Sin embargo, existen varios compuestos
fluorescentes que se pueden usar para estimar el ∆Ψ en bacterias. Los compuestos
xvii
para ensayos potenciométricos, permiten efectuar mediciones de ∆Ψ en organelos
y en células que son muy pequeñas para permitir el uso de micro electrodos. En
mediciones efectuadas por citometría de flujo, la intensidad de de la fluorescencia
de estos compuestos es dependiente no sólo del ∆Ψ,
∆Ψ si no que también del tamaño
celular.
Considerando la importancia fisiológica del ∆Ψ en bacterias, y la
capacidad de H. pylori de sobrevivir en el estómago, al parecer, gracias a la
generación de un potencial bioenergético sobre un amplio rango de acidez, se
planteó como objetivos generales, determinar por citometría de flujo, los
parámetros de tamaño, forma celular, viabilidad celular y potencial de membrana
en bacterias y determinar el efecto que ejercen sobre el potencial de membrana y
la viabilidad celular de H. pylori, diversas sustancias que tienen acción contra esta
bacteria. De igual forma, se plantearon como hipótesis de trabajo, que «Usando
citometría de flujo es posible estudiar los parámetros de tamaño y forma celular,
potencial de membrana y viabilidad celular en Helicobacter pylori » y « Los
diversos agentes antibacterianos utilizados en el tratamiento de la infección por
Helicobacter pylori producen alteraciones en la células bacteriana, tanto de
tamaño y morfología, como también en el potencial de membrana y viabilidad
celular, parámetros determinables mediante citometría de flujo».
Se desarrolló un método de análisis de patrones de tamaño bacteriano,
basado en los datos de FSC correspondientes a diferentes tipos bacterianos
xviii
(Acinetobacter ssp., Pseudomonas aeuruginosa, Escherichia coli y Bacillus
subtillis), el cual se aplicó exitosamente en E. coli K12 bajo la acción de diversos
antibióticos, así como también en cultivos de H. pylori.
La determinación de viabilidad celular, mediante la incorporación de PI
tanto en S. aureus y E. coli (previa permeabilización de la membrana externa con
EDTA), así como la estimación de potencial de membrana usando DiOC2(3) (una
carbocianina catiónica) se lograron implementar exitosamente mediante citometría
de flujo. En el caso de H. pylori, no fue posible lograr la incorporación de PI en
células muertas, ni tampoco determinar células polarizadas. A fin de indagar en la
posibilidad de que la presencia de un sistema de eflujo impidiera la incorporación
de PI y el ingreso de DiOC2(3) al interior de células polarizadas, se implementó
exitosamente la medición de eflujo a bromuro de etidio (BrEt), tanto en E. coli,
como en S. aureus. En H. pylori, no fue posible evaluar la presencia de eflujo a
BrEt, así como también el uso de inhibidores metabólicos e inhibidores de
sistemas de eflujo (CCCP, azida de sodio, valinomicina y MC 207.110) sobre la
incorporación de PI y la estimación de ∆Ψ.
En el caso particular de H. pylori, junto con considerar la naturaleza
sorprendente de esta bacteria, se debe considerar la posibilidad de que tenga un
potencial de membrana positivo o que éste se encuentre íntimamente regulado por
el medio y pH del mismo.
Se concluye que la evaluación por citometría de flujo de viabilidad celular
en E. coli y S. aureus, puede ser definida por la determinación conjunta de tamaño
xix
y forma celular, potencial de membrana, incorporación de PI y eflujo a BrEt. Lo
anterior tienen una potencial aplicación en el estudio del efecto que diversas
sustancias puedan ejercer sobre E. coli y
adicional sobre la acción de éstas.
S. aureus, aportando información
xx
ABSTRACT
The membrane potential (∆Ψ
∆Ψ)
∆Ψ plays a fundamental role in the bacterial
physiology. Like a component of the proton motive force, is intimately involved
in the ATP generation.
In addition, it participates in several processes like
bacterial autolysis, glucose transport, Chemotaxis and survives at low pH. In
metabolically active bacteria, ∆Ψ are generated by differences in the concentration
of ions in opposed sides of the cellular membrane. This difference of potential is
negative inside the membrane, varying between -100 and -200 mV. A diminution
and an increase in the magnitude of ∆Ψ are known like electrical depolarization
and hyper polarization, respectively. ∆Ψ Is reduced to zero, if the membrane is
broken, which irreversibly becomes permeable to compound like propidium iodide
(PI), used for studies of cellular viability. On this way, the ∆Ψ for one side and
the impermeability of the membrane to certain fluorescent substances for the other
side, has been used like the main indicators of the physiological state of the
cytoplasmic membrane and the viability, respectively. Demonstrating the pick up
of these impermeable probes (PI, To-pro3 and Sytox Green) by cells is considered
an indicator of cellular death. The measurement of ∆Ψ in active growing bacteria
in, it is essentially impossible, as a result of his small size. Nevertheless, there are
several fluorescent probes that can be used to estimate ∆Ψ in bacteria. The
potentiometric probes allow carrying out measurements of ∆Ψ in organelles and
cells that are very small to allow the use of microelectrodes. In measurements
xxi
conducted by flow cytometry, the intensity of the fluorescence of these probes
depends of the ∆Ψ and of the cellular size.
Considering the importance physiological of ∆Ψ in bacteria, and the
capacity of H. pylori to survive in the stomach, apparently, thanks to the
generation of a bioenergetics potential on an ample rank of acidity, considered like
general missions, to determine by flow cytometry, the size parameters, cellular
forms, cellular viability and membrane potential in bacteria and to determine the
effect of diverse substances upon the membrane potential and the cellular viability
of H. pylori. Indeed the work hypothesis raised said "In Helicobacter pylori, using
flow cytometry, is possible to study the size parameters and cellular forms,
membrane potential and cellular viability" and "the diverse bacteriological agents
used in the treatment of the infection by Helicobacter pylori, produce alterations in
the cells bacterial, as much of size and morphology, like also in the potential of
membrane and cellular viability, parameters that are determinable by flow
cytometry". A method of analysis of patterns of bacterial size was developed,
based on the FSC data corresponding to different bacterial types (Acinetobacter
ssp., Pseudomonas aeuruginosa, Escherichia coli and Bacillus subtillis), which
were applied successful in E. coli K12 under the antibiotic action diverse, as well
as in cultures of
H. pylori.
The determination of cellular viability, by the
incorporation of PI in S. aureus and E. coli (previous permebilization of the
external membrane with EDTA), as well as the estimation of membrane potential
xxii
using DiOC2(3) (a cationic carbocianine) were implement successful by flow
cytometry.
In the case of H. pylori, was not possible to obtain the incorporation of PI
in died cells, and to either determine polarized cells. In order to investigate the
possibility that the presence of an efflux system prevented the incorporation of PI
and the entrance of DiOC2(3) to the interior of polarized cells, it was successful
implemented the measurement of BrEt efflux in E. coli and S. aureus. In H.
pylori, was not possible to evaluate the presence of BrEt efflux, as well as the
metabolic and efflux system inhibitors (CCCP, sodium azide, valinomicin and MC
207,110) on the incorporation of PI and the estimation of ∆Ψ.
In the particular case of H. pylori, indeed with to consider the surprising
nature of this bacterium, it must be considered the possibility that it has a positive
membrane potential or that this is intimately regulated by environment and pH
itself.
It is concluded that the flow cytometric evaluation of cellular viability in E
coli and S. aureus, can be defined by the integrated determination of size and
forms cellular, membrane potential, incorporation of PI and BrEt efflux. This has
a potential application in the study of the effect that diverse substances can exert
on E coli and S. aureus, contributing additional information on the action on these
molecules.
1
1.
1.1
INTRODUCCION
Citometría de flujo.
1.1.1. Fundamentos básicos.
La citometría de flujo permite evaluar características físicas y químicas de
células en suspensión. Entrega información sobre el tamaño celular, la
granularidad o complejidad interna, así como también de la intensidad de
fluorescencia relativa que poseen las células en estudio. Esta tecnología hace
posible medir los más diversos parámetros celulares como antígenos de superficie,
citoplasmáticos y nucleares, contenido de ácidos nucleicos, actividad enzimática,
flujo de calcio, potencial de membrana (∆Ψ)
∆Ψ) y pH entre otros (Bono y col., 1998;
Castillo y col, 1999; Castillo, 2005).
El principio básico de la citometría de flujo, es la interacción de una fuente
de luz, específicamente un rayo láser, con células en suspensión, las cuales son
canalizadas e "interrogadas" individualmente por el láser, recogiéndose la
información obtenida de dicha interacción. De este modo, es posible la medición
de un gran número de células, en forma individual, en un período muy corto de
tiempo mientras se desplazan en un sistema de flujo o torrente líquido (100-25000
células por segundo, en sangre periférica u otros líquidos corporales). Cada célula
pasa por un punto donde son impactadas por un láser que emite fluorescencia a
2
una longitud onda dependiente de cada tipo de láser, y cuya luz es desviada o
alterada de acuerdo a características propias de cada célula. La variación de la
longitud de onda así producida, es captada y depurada por un complejo sistema de
lentes y espejos especiales, que concentra esta luz y la transforma en pulsos de
voltaje. Estos son codificados e interpretados por un computador provisto del
programa adecuado. Los datos obtenidos de esta manera pueden manejarse muy
versátilmente, siendo de gran confiabilidad
y exactitud. Existen equipos que
cuentan con uno, dos o más rayos láser, siendo lo común, la presencia de un láser
que emite a 488 nm (láser de argón) (Castillo, 2005).
La interacción de una célula con la luz del láser (ligth scatering), puede
producir la desviación de esta última, en un ángulo menor a 10 grados, lo que se
conoce como dispersión frontal o FSC (forward scatter) y su vez la desviación de
la luz en más de 10 grados, pero en menos de 90, se conoce como dispersión
lateral o SSC (side scatter). Es así como FSC y SSC son parámetros intrínsecos a
la célula.
Si a la suspensión celular se agrega un fluorocromo que tenga afinidad por
algún componente celular y que además este fluorocromo sea excitable con el rayo
láser en uso, se podrá detectar un cambio en la longitud de onda de emisión del
fluorocromo; lo anterior se traducirá en formación de rangos o canales de
fluorescencia, la cual es posteriormente detectada, facilitando la identificación de
subgrupos específicos dentro de las grandes poblaciones celulares (Bono y col.,
1998; Castillo y col, 1999; Castillo, 2005). Estas moléculas fluorescentes pueden
estar acopladas a anticuerpos monoclonales específicos o en solución. Por
3
ejemplo, la fluoresceína, fluorocromo ampliamente usado tanto en microscopía de
fluorescencia como en citometría de flujo, tiene una excitación máxima a 490 nm,
siendo su emisión máxima a 520 nm. En los citómetros de flujo actuales, con
aplicación en clínica, es posible detectar simultáneamente desde 1 hasta 12 rangos
o canales de fluorescencia, lógicamente usando fluorocromos que emitan en
diferente longitud de onda.
Dado que ciertos fluorocromos se pueden unir a proteínas, es posible
disponer anticuerpos conjugados con diversos fluorocromos. Si a esto se le suma
el explosivo desarrollo de la producción y comercialización de anticuerpos
monoclonales, conjugados con diversos fluorocromos, las potencialidades son
enormes. Es así como hoy se dispone de anticuerpos contra una infinidad de
moléculas biológicas, lo que se ha traducido en un gran desarrollo de los estudios
de caracterización inmunofenotípica de diversos tipos celulares, muchos de ellos
con una aplicación clínica concreta (Castillo, 2005).
1.1.2. Presentación de datos y análisis.
Un citómetro de flujo, a pesar de tener un sistema de fluidos, un sistema
óptico y un sistema electrónico, es un equipo controlado informáticamente,
existiendo para ello, diversas plataformas (PC y Macintosh principalmente), las
cuales, mediante los programas adecuados permiten tanto la adquisición como el
análisis de los datos obtenidos.
4
La acción de evaluar una suspensión de células en un citómetro de flujo, se
llama adquisición (se adquiere la información de un determinado número de
células en un tiempo determinado). Una vez adquirida la información sobre una
suspensión celular, esta se almacena como un archivo, y éste es posible
visualizarlo de diversas formas, dependiendo del programa de análisis que se use.
Es así como los datos se pueden visualizar como gráficos de puntos, contorno,
densidad, histogramas, tridimensional, etc., obteniéndose, en cada caso
información numérica como por ejemplo coeficiente de variación, media de
intensidad de fluorescencia, mediana, media geométrica, etc. (Figura 1) (Castillo,
2005).
Un concepto fundamental al efectuar un análisis es la correcta selección de
la región de interés a estudiar, la que se conoce como “gate” o ventana de análisis.
Por ejemplo, si se han analizado bacterias, es posible acotar aún más el análisis, al
seleccionar la población de bacterias, y así eliminar partículas de similar tamaño
que puedan interferir con el análisis, para lo cual se dibuja una “gate”.
Posteriormente, se puede obtener información específica sólo de la región
seleccionada (Figura 3). Es posible combinar varias de estas regiones al momento
de hacer un análisis, lo que se traduce en una gran capacidad y versatilidad en el
manejo de la información (Castillo, 2005).
5
FIGURA 1: Distintas formas de presentar los mismos datos: SSC
(granularidad) y CD45 (antígeno leucocitario común). (A) Gráfico de puntos; (B)
gráfico de densidad; (C) gráfico tridimensional; (D) gráfico de contorno; (E)
histograma que representa sólo SSC. (Adaptado con autorización de:
Hematología: Fisiopatología y Diagnóstico. Palomo I., Pereira J. y Palma J.
Editorial Universidad de Talca)
1.1.3. Citometría de flujo en estudios microbiológicos.
La citometría de flujo permite la medición de diversas características
físicas y químicas a células individuales en suspensión, en microsegundos,
proporcionando así una indicación de la heterogeneidad de una población de
células eucarióticas o procarióticas en cuestión de minutos (Álvarez-Barrientos y
col., 2000; Davey y col., 1996; Novo y col., 1999, 2000; Shapiro, 1997, 2000,
2001, 2003).
6
La detección directa de microorganismos por citometría de flujo, ya sean
bacterias, hongos, parásitos y virus, tanto en sus parámetros intrínsecos (FSC y
SSC) como en sus características químicas, ha sido objeto de diversos estudios
(Álvarez-Barrientos y col., 2000; Davey y col., 1996). Es así como la detección
directa de bacterias, usando anticuerpos conjugados con diversos fluorocromos, ha
permitido la identificación rápida de diversos patógenos, como por ejemplo
Haemophilus spp., Salmonella spp., Mycobacerium spp., Brucella spp.,
Branhamella
catarrhalis,
Mycoplasma
pneumoniae,
Pseudomona
spp.,
Bacteroides fragilis, Legionella pneumophila, Bacillus spp, S. aureus y E. coli,
entre otros (Álvarez-Barrientos y col., 2000; Bhushan y col., 1997; Bowden y col.,
1995; Davey y col., 1996; Ozanne y col, 1996), con la ventaja de que es un ensayo
que no necesita cultivo y además es rápido, comparado con el tiempo que toma un
cultivo tradicional. De igual forma, se ha descrito la detección directa de hongos y
levaduras, como por ejemplo la serotipificación de Candida spp. (Davey y col.,
1996, Mercure y col., 1996), incluso demostrándose la etiología mixta de
onicomicosis (Álvarez-Barrientos y col., 2000). La detección directa de parásitos,
también ha permitido analizar rápidamente un gran número de muestras y con alta
sensibilidad, en casos de giardiasis,
así como también detectar antígenos de
Plasmodium spp., en eritrocitos y evaluar la viabilidad de este parásito una vez
fagocitado (Álvarez-Barrientos y col., 2000). La detección directa de virus, en
células eucariontes infectadas, ha permitido la detección y cuantificación de
antígenos y ácidos nucleicos virales, en diversas patología infecciosas, como por
7
ejemplo VIH, citomegalovirus, Herpes, Hepatitis B y C, entre otros (ÁlvarezBarrientos y col., 2000; Davey y col., 1996).
Aunque diversos investigadores han usado citometría de flujo para estudiar
las interacciones de bacterias y agentes antibacterianos, la literatura internacional
se ha centrado, principalmente, en el desarrollo de ensayos rápidos para la
determinación de susceptibilidad antimicrobiana. (Davey y col., 1996; Jepras y
col., 1997; Mason y col., 1995; Mortimer y col., 2000; Suller y col., 1998;
Wickens y col., 2000). Es así como, a partir de las primeras pruebas de
susceptibilidad por citometría de flujo, que datan de 1980, durante la década del
90 se produjo un considerable aumento de los informes internacionales, sobre la
respuesta microbiana frente a diversos compuestos antimicrobianos. La gran
ventaja de estos estudios, es que en pocas horas, se pueden evaluar poblaciones
microbianas, tanto desde el punto de vista de individual y poblacional, así como
también sus capacidades funcionales, es decir vías metabólicas, potencial de
membrana, acumulación y utilización de polihidroxibutirato, entre otros (ÁlvarezBarrientos y col., 2000; Davey y col., 1996). De este modo, dentro de los
parámetros metabólicos posibles de evaluar por citometría de flujo, los estudios de
tamaño celular, potencial de membrana y viabilidad celular, sin duda serán
fundamentales y proporcionarán valiosa información para entender el efecto de
nuevos agentes antibacterianos.
8
1.2.
Potencial de Membrana (∆Ψ)
1.2.1
Bases físico químicas del potencial de membrana.
En la mayoría de las células eucariotas y procariotas, existen diferencias de
potencial eléctrico a través de sus membranas y también entre el citosol y el
interior de organelos como cloroplastos y mitocondrias. Estas diferencias de
potencial se deben, en parte, a la existencia de gradientes de concentración de
iones Na+, K+, H+ y Cl- a través de la membrana celular y en parte, a la presencia
de varias bombas electrógenas.
En células de mamíferos en reposo, la diferencia de potencial a través de la
membrana citoplasmática tiene un rango de magnitud de 10 a 90 mV, siendo el
interior negativo, respecto del exterior. Existe además una diferencia de potencial
de 100mV o más, a través de la membrana de mitocondrias energizadas, con el
interior negativo respecto del exterior. Este ∆Ψ desaparece cuando el metabolismo
energético desaparece. En células procariotas, las diferencias de potencial a través
de estas membranas dependen del metabolismo energético, variando entre 100 y
200 mV.
Por convención, un ∆Ψ negativo en el interior se expresa como un número
negativo, después de una hiperpolarización de la membrana, lo cual se define
9
como un incremento en la magnitud del potencial de membrana, y cuyo valor es
típicamente menor que antes.
Los resultados de la depolarización eléctrica de la membrana pueden ser
más complejos. Mientras que en la mayoría de las situaciones, la depolarización
de una bacteria es completa cuando el ∆Ψ llega a cero, en el caso de células
nerviosas y musculares, el interior se vuelve transitoriamente positivo con respecto
al exterior.
Las bacterias aeróbicas, generan un gradiente electroquímico de protones a
través de la membrana interna, lo que se conoce como la fuerza protón motriz.
Este gradiente se logra gracias a oxidoreductasas orientadas a través de la
membrana bacteriana, de modo tal que los protones son exportados y los
electrones son ingresados, generándose de esta manera tanto un gradiente de
protones, como un gradiente eléctrico, el ∆Ψ (Sach y col., 1996).
El ∆Ψ cumple un papel fundamental en la fisiología bacteriana. Como un
componente de la fuerza protón motriz, se encuentra íntimamente involucrado en
la generación de ATP (Dimroth y col. 2000). Además, participa en varios
procesos, como por ejemplo, autólisis bacteriana, transporte de glucosa,
quimiotaxis y sobrevida a pH bajo (Novo y col., 1999, 2000; Shapiro, 1997, 2000,
2001, 2003). De esta manera, en las bacterias, el ∆Ψ,
∆Ψ refleja tanto el estado del
metabolismo energético como la integridad física de la membrana citoplasmática.
Organismos neutrófilos, como Escherichia coli, mantienen una fuerza
protón motriz constante, ajustando la diferencia de potencial a través de la
10
membrana para compensar los cambios del gradiente de pH (Sach y col., 1996).
Los ∆Ψ en bacterias metabólicamente activas son generados por diferencias en la
concentración de iones en lados opuestos de la membrana celular. Esta diferencia
de potencial es negativa en el interior de la membrana, y varia entre –100 y –200
mV (Novo y col.,1999, 2000; Sach y col., 1996; Shapiro, 1997, 2000, 2001,
2003).
Una disminución en la magnitud del ∆Ψ se conoce como depolarización
eléctrica. A su vez, un incremento en la magnitud del ∆Ψ,
∆Ψ se refiere como
hiperpolarización. El ∆Ψ se reduce a cero, si la membrana es rota, como es el caso
del desarrollo de agujeros lo suficientemente grandes como para permitir que
iones inorgánicos crucen libremente; por ejemplo, en células muertas por
calentamiento, congelamiento, tratamientos químicos (concentraciones de
aldehídos o alcoholes que actúen como fijadores) y ciertas clases de drogas
antibacterianas, fundamentalmente antibióticos beta lactámicos.
El ∆Ψ en reposo a través de la membrana citoplasmática se estima
frecuentemente a partir de la ecuación de Goldman:
11
∆Ψ
: Potencial de membrana
R
: Constante de gas
T
: Temperatura en grados Kelvin
F
: Faraday
[X]]i
: Concentración de iones X dentro de la célula
[K+]o
: Concentración de iones X fuera de la célula
Px
: Permeabilidad de la membrana a iones X
1.2.2. Medición de ∆Ψ usando micro electrodos
El ∆Ψ se puede medir directamente usando micro electrodos implantados,
técnica muy difícil de aplicar a células pequeñas. Sin embargo, con estas
mediciones directas se ha logrado detectar cambios en el potencial de membrana
en respuesta a interacciones ligando receptor, así como también durante el impulso
nervioso. En las células de gran tamaño, el potencial a través de la membrana
plasmática se puede medir con un micro electrodo insertado dentro de la célula y
que se construye mediante el llenado de un tubo de vidrio de diámetro muy
pequeño con un líquido conductor (por ejemplo KCl), de manera tal que la
membrana de superficie se selle alrededor del electrodo. Además se coloca un
electrodo de referencia en el líquido extracelular. Ambos electrodos se conectan
con un voltímetro capaz de medir pequeñas diferencias de potencial.
12
Figura 2: Esquema de medición de medición de ∆Ψ en eucariontes usando
micro electrodos.
1.2.3. Medición indirecta de ∆Ψ en suspensiones celulares usando ensayos de
distribución.
La estimación indirecta de ∆Ψ se puede obtener monitoreando la
distribución
de
indicadores
catiónicos
lipofílicos
radiomarcados
(3H-
triphenylmethylphosphonium) o fluorocromos catiónicos lipofílicos, como
cianinas y safraninas. Los indicadores lipofilícos son usados porque pueden pasar
libremente la porción lipídica de la membrana.
13
Una depolarización de las células provocará la liberación del indicador de
las células al medio, mientras que una hiperpolarización hará que ingrese el
indicador desde el medio. La distribución del indicador no representará
adecuadamente el nuevo valor de ∆Ψ hasta que se logre un equilibrio. Este
proceso requiere de períodos de tiempo que van desde unos pocos segundos a
varios minutos.
Es así como, mientras los ensayos de distribución son adecuados para la
detección de cambios lentos en el ∆Ψ,
∆Ψ no se pueden usar para monitorear cambios
rápidos que ocurren durante la propagación de potenciales de acción en tejidos
como el nervioso y muscular.
El uso de fluorocromos catiónicos lipofílicos es una alternativa un poco
menos compleja que el uso de cationes lipofílicos radiomarcados. Este úlitmo
método requiere que un mínimo volumen conocido de células (u organelos) en
suspensión esté en equilibrio con el indicador, para luego calcular la cantidad de
indicador unido a la célula mediante un contador de centelleo.
La adición de células a soluciones micromolares de fluorocromos, como
por ejemplo DiOC6(3) (3,3´dihexyloxacarbocianina), produce una suspensión con
una fluorescencia menor que la solución original, indicando que a concentraciones
externas micromolares, la fluorescencia del fluorocromo captado por las células
disminuye. La estimación de ∆Ψ de células en suspensión usando cianinas se
realiza en un espectrofluorómetro.
14
Sin embargo, estas técnicas proporcionan un valor promedio de ∆Ψ de la
suspensión celular completa, y no proporcionan información de variaciones de ∆Ψ
célula a célula, dentro de poblaciones celulares (Novo y col., 1999, 2000; Shapiro,
2000, 2001, 2003), siendo el interés de estas observaciones, las que estimularon el
desarrollo de técnicas que utilizaran la citometría de flujo para estimar ∆Ψ.
∆Ψ
1.2.4. Estimación de ∆Ψ por citometría de flujo
La estimación de ∆Ψ en células eucariotas y bacterianas individuales, por
citometría de flujo, usando fluorocromos, se ha efectuado por más de 20 años. El
primer informe de la medición de ∆Ψ usando citometría de flujo data de 1979,
cuando Howard Shapiro empleó cianinas y oxonoles, fluorocromos
usados
originalmente para mediciones volumétricas con espectrofluorometría (Shapiro y
col., 1979). Sólo recientemente, la disponibilidad metodológica ha permitido
determinaciones
más
precisas
en
términos
de
medias
poblacionales,
heterogeneidad poblacional y detección de cambios en el tiempo.
1.2.4.1.
Compuestos para ensayos potenciométricos.
Existen varios compuestos fluorescentes que se pueden usar para estimar el
∆Ψ en bacterias. Compuestos fluorescentes del tipo cianinas, junto con otros
compuestos lipofílicos que tienen una carga positiva, como la rodamina 123, y que
15
añadidos a suspensiones celulares, son concentrados en la bacteria, en respuesta al
gradiente de ∆Ψ negativo en el interior. De este modo, la fluorescencia de
organismos expuestos a bajas concentraciones de estos compuestos, se incrementa
con la hiperpolarización y disminuye con la depolarización (Novo y col., 1999,
2000; Rabinovitch, 1990; Shapiro, 1997, 2000, 2001, 2003).
La mayoría de los fluorocromos ahora usados como pruebas para ∆Ψ,
∆Ψ
fueron desarrollados durante la búsqueda sistemática hecha por Lawrence Cohen y
colaboradores, en la Universidad de Yale, Estados Unidos (Cohen y col, 1978;
Shapiro, 2003), para obtener materiales que exhibieran cambios rápidos, en sus
propiedades ópticas, para responder a los potenciales de acción de células
nerviosas. Muchos de los fluorocromos evaluados, se distribuían a través de
membranas celulares, en respuesta a cambios de potencial lentos. La mayoría de
estos fluorocromos catiónicos lipofílicos caen en esta categoría.
Los compuestos para ensayos potenciométricos, permiten efectuar
mediciones de ∆Ψ en organelos y en células que son muy pequeñas para permitir
el uso de micro electrodos. La selección del compuesto más adecuado para los
fines a estudiar, puede ser complicada a raíz de variaciones substanciales en su
respuesta óptica, fototoxicidad e interacciones con otras moléculas (Haugland,
2002; Shapiro, 1997, 2003). Los compuestos para ensayos potenciométricos se
pueden dividir en dos grandes grupos, basándose en su mecanismo de respuesta:
•
Compuestos de respuesta rápida (Fast response probes): Actúan por un
cambio en su estructura electrónica, y en consecuencia en sus propiedades
16
fluorescentes, en respuesta a un cambio en el campo eléctrico del medio. Su
respuesta óptica es lo suficientemente rápida para detectar cambios transitorios
de potencial (milisegundos). Sin embargo, la magnitud del cambio de
fluorescencia dependiente de potencial, es a menudo muy pequeña, mostrando
un cambio de fluorescencia de 2 – 10 % por 100 mV (Haugland, 2002).
•
Compuestos de respuesta lenta (Slow response probes): Muestran cambios
dependientes de potencial en su distribución de transmembrana, que son
acompañados de un cambio en la fluorescencia. La magnitud de su respuesta
óptica es mucho más grande que los compuestos de respuesta rápida,
mostrando un cambio de fluorescencia de 1% por mV. Este grupo incluye
carbocianinas y rodaminas catiónicas y oxonoles aniónicos, siendo adecuados
para detectar cambios en el ∆Ψ promedio de células no excitables (Haugland,
2002).
Dentro de las carbocianinas se pueden distinguir los derivados indo (DiI),
thia (DiS) y oxa (DiO), los cuales son moléculas de entre uno a siete átomos de
carbono. Son compuestos lipofílicos con una carga positiva localizada; su
estructura presenta dos anillos heterocíclicos idénticos, unidos por un puente
polimetilo (Haugland, 2002).
17
De acuerdo con la nomenclatura
usada por primera vez por Sims y col.,
en 1974, estos compuestos pueden ser
llamados DiYCn+1(2m+1). Donde Y
corresponde a los sustituyentes en el
anillo:
O : átomos de oxígeno
S : átomos de azufre
I : Grupo (C(CH3)2)
La hidrofobicidad de estos compuestos, con valores idénticos de m e Y,
aumenta con la longitud de la cadena lateral N-alkyl (aumentando n). Estos
fluorocromos catiónicos se acumulan en membranas hiperpolarizadas y son
translocados dentro de la bicapa lipídica (Haugland, 2002; Rabinovitch, 1990,
Shapiro, 2003). En mediciones efectuadas por citometría de flujo, la intensidad de
la fluorescencia de estos compuestos es dependiente no sólo del ∆Ψ,
∆Ψ si no que
también del tamaño celular. Aprovechando estas características, Novo y col.
(1999), desarrollaron un método para medir ∆Ψ en bacterias usando citometría de
flujo, basándose en la razón del aumento de emisión de fluorescencia roja de
DiOC2(3) (3,3´-dietiloxacarbocianina iodada).
18
1.3.
Viabilidad celular.
1.3.1. Definiciones y evaluación por citometría de flujo
Por un lado, el ∆Ψ,
∆Ψ y por otro lado, la impermeabilidad de la membrana a
ciertas sustancias fluorescentes, han sido usados como los principales indicadores
del estado fisiológico de la membrana citoplasmática y de la viabilidad del
microorganismo, respectivamente. Aunque células de diferentes especies, pueden
exhibir diferencias en la permeabilidad de la membrana, se cree que ciertas clases
de compuestos, incluyendo compuestos orgánicos que tienen al menos dos cargas
positivas y compuestos orgánicos cargados negativamente, son excluidos por
membranas celulares intactas, tanto de bacterias como de eucariontes (Guindulain
y col., 2002; López-Amorós y col., 1997; Novo y col., 2000; Shapiro, 2001, 2003;
Vives-Rego y col., 2000.). El demostrar la captación de estos compuestos
impermeables por células, es considerado un indicador de muerte celular. Los
colorantes que pueden entrar y teñir células vivas, han sido descritos como
colorantes vitales, aún cuando la mayoría de ellos son tóxicos para la célula.
Existe un problema semántico en lo que se refiere a definir viabilidad celular.
Generalmente se considera clonogenicidad o viabilidad reproductiva como
sinónimo de viabilidad celular. Lo anterior presenta dos notables desventajas:
19
1. La definición de viabilidad en términos de capacidad reproductiva, excluye
a células completamente diferenciadas y funcionales como es el caso de
células nerviosas y musculares en el caso de eucariontes y a células
vegetativas, en el caso de procariontes. En esta situación, la preservación
de alguna función celular específica sería más acorde con el criterio de
viabilidad.
2. Mientras que la reproducción celular en cultivo proporciona una evidencia
inequívoca de viabilidad, la falla en reproducir células se puede deber a
una falla en la metodología usada más que a un daño celular.
Howard Shapiro (2003), propone usar el término “células intactas”, para
describir a células que no han sido tratadas con fijadores o agentes lizantes, y que
no muestran una alteración morfológica y funcional. Entre los parámetros
considerados como característicos de células intactas, se encuentran: la integridad
de la membrana, la permeabilidad y fluidez de la membrana, el ∆Ψ y el pH.
Para poder teñir o marcar constituyentes no localizados en la superficie de
células intactas, un colorante o fluorocromo debe ser capaz de cruzar la membrana
celular, ya sea por difusión o por alguna forma de transporte activo. La mayoría de
los colorantes descritos como tinciones vitales, son pequeñas moléculas que son
relativamente solubles en lípidos y son, ya sea, cargadas positivamente o
eléctricamente neutras a pH fisiológico. Una alta solubilidad en lípidos favorece el
paso desde un medio acuoso a la fase lipídica de la bicapa de la membrana
20
celular. Compuestos orgánicos conteniendo al menos dos cargas positivas (DAPI,
PI, TO-PRO-1), son impermeables a las membranas intactas. El Bromuro de etidio
(BrEt), comparte la estructura de anillo heterocíclico del ioduro de propidium
(PI), pero sólo presenta una sola carga positiva. Ambos fluorocromos forman
complejos con ADN y ARN, y son tóxicos para las células, una vez que son
internalizados. Sin embargo el BrEt, entra normalmente en la célula y es
expulsado al exterior por algunas bacterias, mientras que el PI es excluido por su
carga positiva adicional.
1.4.
Helicobacter pylori
Por muchos años, se pensó que la presencia de secreción ácida en el
estómago no sólo ayudaba al proceso de digestión, sino que también actuaba como
una barrera para infecciones bacterianas. El aislamiento de Helicobacter pylori en
el estómago, al menos en parte, refutó esa idea. H. pylori es un patógeno
gastroduodenal humano, cuyo hábitat es la mucosa gástrica (Blaser y col., 1992,
1994). Se le considera uno de los factores etiológicos fundamentales de la
enfermedad péptica ulcerosa, siendo también agente etiológico importante de la
dispepsia no ulcerosa, de gastritis superficial crónica (denominada también
gastritis tipo B) y linfoma MALT. Específicamente coloniza y produce la
inflamación del antro del estómago (Blazer y col, 1992) y, desde 1994, la IARC
(grupo de estudio del cáncer, O.M.S., 1994) lo ha incluido entre los agentes
21
carcinógenos tipo 1, constituyéndose así en una de las especies bacterianas de
mayor interés en patología humana (De Fuigereido y col., 1998).
1.4.1. Características microbiológicas
Esta bacteria tiene morfología heterogénea. Puede presentarse en forma
helicoidal, espiralada o curva, con 2 a 6 flagelos lofótricos cubiertos por una
vaina; sin embargo, en cultivos envejecidos tiende a presentar forma cocoide.
Mide 0.5 a 1.0 µm de diámetro por 2.5 a 5.0 µm de longitud (Geis y col., 1989;
Goodwin y col., 1993). Las colonias son no pigmentadas, translúcidas y de 1 a 2
mm de diámetro. Entre sus características metabólicas destaca la producción de
una potente ureasa, con una actividad cercana al doble de la ureasa de Proteus
mirabilis (Mobley y col., 1988). Esta alta tasa hidrolítica, es muy importante para
la colonización de la mucosa gástrica (Hazell y col., 1986), pues en presencia de
urea forma amonio que neutraliza los iones hidrógeno que rodean la bacteria lo
que permite su sobre vivencia en el jugo gástrico (McNulty y col., 1987; Megraud
y col., 1989).
Es además, catalasa y oxidasa positivo. Desde el punto de vista de su
metabolismo respiratorio, la especie es microaerofílica, es decir, requiere una
atmósfera con 5% de O2 y 5 a 10% de CO2. Su temperatura óptima de
crecimiento es 37ºC, pero puede crecer a 30ºC, aunque no a 25ºC (Goodwin y col.,
1986). El crecimiento se manifiesta entre el 2º y 5º día de incubación. Los medios
22
de cultivo deben ser suplementados con sangre, suero de bovino fetal, carbón
activado, almidón de maíz o hemina (Buck y col., 1987; Kehler y col., 1994). H.
pylori, tiene un pH óptimo de crecimiento in Vitro (en ausencia de urea) entre pH
6.0 y pH 7.0 y no crece a pH menores a 4.5 o sobre 8.0, por lo que considerando
esta información, presenta características correspondientes a una bacteria
neutrófila (Sach y col., 1996).
1.4.2. Patogénesis de la infección por H. pylori
H. pylori accede al epitelio gastrointestinal pasando a través del moco y la
mucosa gástrica gracias a su morfología espiral y a la presencia de los flagelos.
Penetra la capa mucosa hasta quedar en contacto con las células secretoras de
mucus, donde se asocia a los receptores de superficie celular para formar
pedestales de adhesión. En este ambiente, encuentra un nicho ideal para
desarrollarse, pues obtiene todos los nutrientes necesarios y mantiene un pH
neutro producto de la secreción de bicarbonato realizada por las células más
internas del epitelio gástrico y la pared mucosa a diferencia de otras bacterias
(Axón, 1993).
1.4.3. Tratamiento de la infección por H. pylori
En la actualidad, uno de los mayores desafíos clínicos que presenta H.
pylori se relaciona con la toma de decisión en cuanto a cuándo realizar un
23
tratamiento de erradicación y cómo efectuarlo y pese a que las indicaciones para el
tratamiento se han expandido, aún no existe un acuerdo en relación con la terapia
óptima (Well y col., 1996), aunque existe consenso del beneficio de la
erradicación de H. pylori en todo paciente con úlcera péptica documentada (NIH
Consensus Conference, 1994.). La erradicación de H. pylori no es simple y se
requiere la administración de varias drogas en conjunto, incluyendo antibióticos e
inhibidores de la bomba de protones. Existen numerosos esquemas de tratamiento,
que incluyen neutralización del pH ácido en el interior del estómago y protección
de la mucosa. La neutralización del pH ácido se realizaba inicialmente con
bicarbonato, pero en la década del 70 se introdujeron en la terapia, los antagonistas
de protones, que reducen la secreción de ácido bloqueando los receptores que
permiten a la histamina estimular a las células productoras de ácido (Goodwin y
col., 1986; Rauws y col., 1988). En la actualidad, se cuenta con fármacos, como
por ejemplo el Omeprazol, que bloquean la bomba de protones. Estos fármacos
tienen mayor eficacia en inhibir la producción de ácido y lo hacen en menor
tiempo (Wood y col., 1995). No obstante que estos últimos fármacos han
mejorado los resultados de la terapia, en muchos pacientes reaparece la úlcera a
los pocos meses de finalizado el tratamiento y los cuadros se pueden presentar con
mayor intensidad e incluso las recaídas pueden manifestarse sin sintomatología
previa acompañada de hemorragia o perforación.
Los actuales esquemas de tratamiento varían ampliamente, entre una terapia
dual de 14 días hasta terapias triples o cuádruples de 7 a 10 días. Los tratamientos
utilizados incluyen inhibidores de la bomba de protones (omeprazol, lansoprazol,
24
pantoprazol, rabeprazol), antagonistas de los receptores H2 (ranitidina, famotidina,
cimetidina) y antibacterianos como sales de bismuto, beta lactámicos
(amoxicilina),
macrólidos
(azitromicina,
claritromicina
y
roxitromicina),
nitroimidazoles (metronidazol, tinidazol) o tetraciclina (González, y col., 2001).
25
1.5.
No está claro, por qué H.
Hipótesis
pylori coloniza el estómago y que propiedades
especiales posee esta bacteria, que le permiten desenvolverse en un medio ácido
hostil. Esta propiedades, parecen ser muchas, siendo la principal, la capacidad de
resistir al menos en parte, cierto grado de acidez, en una forma más eficiente que
una bacteria aeróbica como E. coli. Bajo estas condiciones, el ajuste de las
características bioenergéticas de H. pylori frente a un medio ácido o alcalino,
tendría un papel importante en la capacidad de la bacteria para sobrevivir en el
estómago (Matin y col., 1996; Sach y col., 1996). En este contexto, la generación
de un potencial bioenergético sobre un rango amplio de acidez y en especial el
potencial de membrana de
H. pylori, serían factores fundamentales en la
viabilidad, crecimiento y proliferación en un medio adverso, así como el efecto
que sobre dicho potencial puedan ejercen diversos compuestos con acción contra
H. pylori.
Por lo anterior, el desarrollar un protocolo para evaluar el potencial de
membrana en poblaciones bacterianas, toma un destacado papel en la
comprensión de los mecanismos fisiopatológicos de la infección por H. pylori,
así como en su terapia. Al respecto, y considerando la disposición de un
citómetro de flujo en nuestra ciudad, se plantearon las siguientes hipótesis de
trabajo:
26
1.
«Mediante citometría
de flujo, es posible determinar los
parámetros de tamaño, forma celular, potencial de membrana y
viabilidad celular en Helicobacter pylori. »
2.
« Los diversos agentes antibacterianos utilizados en el tratamiento
de la infección por Helicobacter pylori, producen alteraciones en la
células bacteriana, tanto de tamaño, morfología, como también en
el potencial de membrana y viabilidad celular; parámetros
determinables mediante citometría de flujo.»
Estas hipótesis se sustentan en los antecedentes previamente descritos en
diversos trabajos:
Característica Estudiada
Estimación
de
bio
Autores
volumen
Bouvier y col., 2001; Robertson y col.,
bacteriano.
1998, Shavalov y col., 2000.
∆Ψ en Staphylococcus aureus y
Novo y col., 1999, 2000; Shapiro,
Micrococcus luteus.
1997, 2000, 2001, 2003; Wickens y
col., 2000.
Análisis
monoparamétrico
poblaciones
celulares
de
por
Carbonari M.2002; Lampariello y col.,
1998; Watson, 2001.
citometría de flujo.
Marcación de ácidos nucleicos y
Alberghina y col. 2000; Guindulain y
27
viabilidad celular, por citometría
col., 2002; López-Amorós y col.,
de flujo, en bacterias.
1997; Mette y col., 1994; Steen y col.,
1994, 1999.
Estudios, por citometría de flujo,
Jernaes y col., 1994; Jepras y col.
del efecto de antimicrobianos sobre
1997; Mortimer y col., 2000; Stten y
bacterias.
col., 2000; Suller y col., 1997, 1998;
Vives-Rego y col., 1997; Walberg y
col., 1997, 1999; Wickens y col.,
2000.
Características bio energéticas de
Matin y col, 1996; Sach y col., 1996;
H. pylori.
Scout y col., 1998; Stingl y col., 2001,
2002.
Considerando por un lado, la capacidad de H. pylori de sobrevivir en el
estómago,
debido, entre otras razones, a la generación de
un potencial
bioenergético sobre un amplio rango de acidez, gracias a la síntesis y actividad
de la enzima ureasa, cuya acción (hidrólisis de urea, y formación de
(NH4)2CO3), es capaz de elevar el pH ácido en el medio ambiente cercano a la
bacteria, hasta valores relativamente neutros (Matin A. y col., 1996; Sach G. y
28
col., 1996), y por otro lado la importancia fisiológica del ∆Ψ en bacterias, se
planteó como objetivos generales:
1.
Determinar por citometría de flujo, los parámetros de tamaño,
forma celular, viabilidad celular y potencial de membrana en
bacterias.
2.
Determinar el efecto que ejercen sobre el potencial de membrana y
la viabilidad celular de H. pylori, diversas sustancias que tienen
acción contra esta bacteria.
Objetivos Específicos:
1.
Determinar, mediante citometría de flujo, los parámetros de
tamaño, forma, viabilidad celular y potencial de membrana, en E.
coli y S. aureus.
2.
Determinar, mediante citometría de flujo, los parámetros de
tamaño, forma, viabilidad celular y potencial de membrana, en H.
pylori.
3.
Evaluar el efecto de agentes antibacterianos usados comúnmente en
el tratamiento de erradicación de H. pylori, sobre el potencial de
membrana y viabilidad celular de H. pylori.
29
2.
2.1.
MATERIALES Y METODOS
Reactivos:
Yoduro de propidio (PI)
:
Sigma Chemical Co, Estados Unidos.
Preparado en PBS, solución madre de 2
mg/ml. Conservado en oscuridad y a 4ºC.
3,3`-dietiloxacarbocianina
:
iodada (DIOC2(3))
Aldrich Chem. Co., Estados Unidos.
Preparado en DMSO, solución madre de 1
mM. Conservado a -30ºC.
Valinomicina
:
Sigma Chemical Co, Estados Unidos.
Preparado
en
DMSO.
Conservado
en
oscuridad y a 4ºC.
Carbonyl cyanide m-
:
Sigma Chemical Co, Estados Unidos.
chlorophenyl-hydrazone
Preparado
(CCCP).
oscuridad y a 4ºC.
Bromuro de etidio (BrEt)
:
en
DMSO.
Conservado
en
Sigma Chemical Co, Estados Unidos.
Solución madre de 10 mg/ml. Conservado en
oscuridad y a 4ºC.
30
2.2.
Cepas bacterianas:
•
Escherichia coli ATCC 25922, utilizada en los ensayos de viabilidad
celular, eflujo a BrEt y estimación de potencial de membrana.
•
Staphylococcus aureus ATCC 29213, utilizada en los ensayos de viabilidad
celular, eflujo a BrEt y estimación de potencial de membrana.
•
Helicobacter pylori ATTC 43504, usada en los ensayos de viabilidad
celular, eflujo a BrEt y estimación de potencial de membrana.
•
Escherichia coli K12, Pseudomona aeuruginosa, Acinetobacter spp. y
Bacillus subtilis usados como referencia en los ensayos de estimación de
tamaño bacteriano.
2.3.
Condiciones de cultivo:
Todas las cepas, a excepción de H. pylori fueron cultivadas en medio
líquido (caldo Müller Hinton) filtrado (filtro con poros de 0.20 µm de diámetro) a
37ºC durante 18 horas.
Escherichia coli K12 se usó para evaluar el efecto de algunos antibióticos
sobre la forma y tamaño bacteriano. La CMI para ampicilina, gentamicina,
tetraciclina y ceftazidima se determinó mediante dilución en caldo tripticasa de
31
soya filtrado (0.20 µm). La CMI se definió como la mínima concentración de
antibiótico a la cual no hubo crecimiento a simple vista.
En esta Tesis, también se utilizaron cepas de H. pylori aisladas de biopsias
gástricas antrales, provenientes de pacientes sometidos a endoscopía digestiva alta
(sin tratamiento antibiótico previo). Estas muestras fueron obtenidas en el Hospital
del Trabajador de Concepción. Las biopsias gástricas se maceraron en suero
glucosalino (NaCl 0.85 %, glucosa 1%) estéril hasta formar una suspensión
homogénea. Se sembraron 100 µl de esta suspensión en agar Columbia con 5% de
sangre de caballo, suplementado con un inhibidor selectivo de la flora bacteriana y
fúngica (DENT: Oxoid, Hampshire, Inglaterra). Los cultivos se incubaron durante
cuatro días a 37°C, en microaerofilia (5% de O2 y 5-10% de CO2) usando sistema
generador de microaerofilia GasPak (Difco: Detroit, Estados Unidos). La
identificación de las cepas se hizo en base a tinción de Gram modificada (con
fucsina como colorante de contraste), prueba de ureasa y reacción de catalasa
(Gonzalez C. y col., 2001).
2.4.
Preparación de suspensiones celulares para evaluación de patrones de
tamaño bacteriano por citometría de flujo
En el caso de E.coli K12, ésta se cultivó en medio líquido, en presencia de
los antibióticos
ampicilina, gentamicina, tetraciclina y ceftazidima
a una
concentración de 0.5 y 2 veces la CMI (Tabla 1). A partir de cada cultivo líquido,
32
se obtuvo un sedimento mediante centrifugación (800 g por 10 minutos), el cual se
lavó con PBS, se resuspendió en 0.5 ml de PBS, para luego adquirir en el
citómetro de flujo. En el caso de H. pylori, las bacterias fueron resuspendidas en
2.0 ml de PBS, a partir de placas incubadas en las condiciones adecuadas, lavadas
y resuspendidas en 0.5 ml de PBS y así adquiridas en el citómetro de flujo.
Tabla 1:
2.5.
CMI para E. coli K12, frente a los antibióticos usados.
Antibiótico
CMI
0.5 CMI
2 CMI
Ampicilina
8 µg/ml
4 µg/ml
16 µg/ml
Gentamicina
16 µg/ml
8 µg/ml
32 µg/ml
Ceftazidima
0.5 µg/ml
0.25 µg/ml
1 µg/ml
Tetraciclina
1 µg/ml
0.5 µg/ml
2 µg/ml
Preparación de controles negativos para viabilidad celular, ∆Ψ y eflujo
bacteriano a bromuro de etidio
2.5.1. Preparación de células muertas por calor
A partir de un cultivo líquido de 18 horas (E. coli y S. aureus) y de una
emulsión en caldo MH (H. pylori), se tomaron 2.0 ml de medio conteniendo
bacterias y se sometió a baño María por 10 minutos para luego dejar enfriar. Se
centrifugó y luego se lavó el sedimento, para luego ser resuspendido en PBS.
33
2.5.2 Preparación de células muertas por shock frío
A partir de un cultivo líquido de 18 horas (E. coli y S. aureus) y de una
emulsión en caldo MH (H. pylori), se tomaron 1.0 ml de medio conteniendo
bacterias, se procedió a lavar con PBS, centrifugar y el sedimento se resuspendió
en 8.0 ml de etanol absoluto frío (conservado a -30ºC). Se incubó 1 hora a -30ºC,
para luego centrifugar, eliminar el sobrenadante y lavar con PBS, y finalmente se
resuspendió en PBS.
Con el objetivo de poder discriminar claramente bacterias vivas de
bacterias muertas, e incluso discriminar situaciones en que hubiera una mezcla de
bacterias vivas y muertas, se utilizó un protocolo básico de preparación de
suspensiones celulares (Tabla 2), el cual permitió la evaluación de una linealidad
en cuanto a la presencia de bacterias vivas y/o muertas a diferentes puntos,
siempre considerando 15 µl de bacterias (vivas o muertas) en 1.0 ml de PBS. La
concentración de bacterias vivas o muertas se pudo así relacionar directamente con
el inóculo del cultivo líquido usado.
Tabla 2:
Protocolo básico de trabajo.
Tubo
Bacterias vivas (µ
µl)
Bacterias muertas (µ
µl)
1
2
3
4
5
6
15
12
9
6
3
0
0
3
6
9
12
15
34
2.6.
Ensayo de viabilidad bacteriana por citometría de flujo.
En 1.0 ml de PBS, se resuspendieron 15 µl de bacterias (vivas y/o
muertas), luego se adicionaron 10 µl de yoduro de propidio (PI) a partir de una
solución stock de 1 mg/ml en PBS (10 µg/ml concentración final). Luego de
incubar por 5 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad, se adquiere en el
citómetro de flujo.
2.7.
Ensayo de ∆Ψ por citometría de flujo.
Tomando como base, el protocolo descrito por Novo y colaboradores en
1999, en 1.0 ml de buffer de marcación, se resuspendieron 15 µl de bacterias
(vivas y/o muertas), luego se adicionaron 30 µl de 3, 3`-dietiloxacarbocianina
iodada (DiOC2(3)) (30 µM concentración final), incubándose por 4 minutos a
temperatura ambiente y en oscuridad. Finalmente se adquirió en citómetro de
flujo.
2.8.
Ensayo de eflujo bacteriano a bromuro de etidio por citometría de
flujo.
Considerando el protocolo descrito por Mette y colaboradores (1994), se
utilizó BrEt a fin de evaluar la presencia de un eflujo a este compuesto. A partir de
35
una solución madre de 10 mg/ml de BrEt se preparó una solución de trabajo de 1
mg/ml. Para el ensayo de eflujo, en un 1.0 ml de PBS se resuspendieron 15 µl de
bacterias (vivas y/o muertas), se adicionaron 20 µl de BrEt (20 µg/ml
concentración final), incubándose por 5 minutos a temperatura ambiente y en
oscuridad. Finalmente se adquirió en citómetro de flujo.
2.9.
Citometría de flujo
Los estudios citométricos se efectuaron en el Laboratorio de Citometría de
Flujo del Hospital del Trabajador de Concepción (administrado por el Centro de
Diagnóstico Oncoinmunológico Limitada). El citómetro de flujo utilizado es un
FACSCalibur (Becton Dickinson), utilizando el programa de adquisición y análisis
CELLQuest v 1.1. La velocidad del flujo utilizada fue de 12 µl/min, lo que se
traduce en un máximo de 1.000 eventos celulares por segundo. Se adquirió un total
de 20.000 eventos celulares.
2.10. Análisis de patrones de tamaño
Se efectuó utilizando el programa de adquisición y análisis CELLQuest v
1.1. Se dibujó una ventana de análisis (gate), en función de FSC (Foward scatter o
dispersión frontal) y SSC (side scatter o dispersión lateral), de modo que más del
90% de los eventos celulares estuvieran incluidos (Figura 3).
36
Figura 3: Selección de ventana de análisis en función de FSC y SSC. En
función de FSC y SSC, se dibujó una ventana de análisis (R1), de modo que
incluyera más del 90% de los eventos celulares (A). Posteriormente se analizaron
los datos contenidos en esta región (histogramas B, C y D).
Todos los datos se expresaron en forma de canales. Los valores de canales
en el citómetro de flujo modelo FACSCalibur tienen un rango que va desde 0 hasta
1.023. Cada histograma fue dividido por 8 marcadores consecutivos con un
espacio de 100 canales cada uno. El primero de estos marcadores comprendía el
rango de 300 +/- 50 canales. Se utilizó el porcentaje de la región de análisis para
todos los datos.
37
Para evaluar el rango de tamaños celulares de las células detectadas en cada
sección, se consideraron intervalos de FSC-H que contuvieran un número
significativo de eventos celulares, relacionado con el porcentaje de la región de
análisis dentro de cada marcador y el número de eventos celulares. Al considerar
lo anterior con la definición arbitraria de células cocoides, bacilos cortos, bacilos y
bacilos largos, se pudieron definir algunos patrones de tamaño (Tabla 3).
Tabla 3:
Patrones de estimación de tamaño definidos por el porcentaje
de la gate para cada marcador.
Marcador
Rango de
canales
Patrón de
estimación de
tamaño
Sugerente
(% gate)
Concordante
(% gate)
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
250-350
350-450
450-550
550-650
650-750
750-850
850-950
950-1023
Cocoide (C)
Cocoide (C)
Bacilo corto (BC)
Bacilo corto (BC)
Bacilo (B)
Bacilo (B)
Bacilo largo (BL)
Bacilo largo (BL)
5 – 15
5 – 15
5 – 15
5 – 15
5 – 15
5 – 15
5 – 15
5 – 15
> 15
> 15
> 15
> 15
> 15
> 15
> 15
> 15
Un valor mayor de 15% se consideró en concordancia con el patrón dado
para cada marcador. Un valor entre 5% y 15%, sugiere un patrón dado
para cada marcador.
2.11. Análisis de viabilidad bacteriana.
Utilizando el programa de adquisición y análisis CELLQuest v 1.1. se
dibujó una ventana de análisis (gate) en función de FSC y SSC, de modo que más
38
del 90% de los eventos celulares estuvieran incluidos (Figura 3). Como control
positivo, se utilizaron células viables, es decir células que no incorporaron PI y
como control negativo, células muertas, es decir células que sí incorporaron PI. Se
evaluó la intensidad de fluorescencia roja del PI (FL3-H: mayor de 640 nm). Bajo
este mismo concepto se analizaron las filas correspondientes a las diversas
situaciones en las cuales se evaluó viabilidad celular, incluyendo el control
negativo, es decir de células muertas, el cual incluía sobre el 95% de los eventos
celulares dentro del segundo marcador descrito.
2.12. Análisis de ∆Ψ y cálculo de razón de fluorescencia roja/verde.
Tomando como base, el análisis descrito por Novo y colaboradores en 1999
(Novo y col., 1999, 2000), se utilizó el programa de adquisición y análisis
CELLQuest v 1.1. para lo cual se dibujó una ventana de análisis (R1) en función
de FSC y SSC, de modo que más del 90% de los eventos celulares estuvieran
incluidos (Figura 3). A continuación, en función de FL2-H v/s FL1-H, se definen
ventanas de análisis
rectangulares a fin de abarcar células polarizadas y
depolarizadas (R2 y R3, respectivamente). Los resultados se expresan como
porcentaje de cada ventana de análisis respecto de R1.
Como el análisis descrito por Novo y colaboradores, considera el cálculo
de la razón de fluorescencia roja sobre fluorescencia verde y debido a que el
programa CELLQuest v 1.1. funciona en ambiente Macintosh y no permite
39
calcular dicha razón, a fin de poder efectuar el cálculo de la razón de fluorescencia
roja sobre fluorescencia verde se utilizó el programa Flow Explorer 4.0, el cual
funciona en ambiente PC siendo compatible con Windows 9x, NT, 2000 y XP, y
que entre sus características, permite explorar archivos con datos de citometría de
flujo. Este programa se puede obtener gratuitamente en la dirección web
http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/software/Flowex2.htm.
Flow Explorer 4.0 tiene la capacidad de mostrar las propiedades de los
archivos con datos, como histogramas, gráficos de punto, contorno y densidad, así
como las estadísticas asociadas a ellos. Una característica muy importante de este
programa, es la capacidad de agregar notas y editar parámetros y hacer cálculos
con los datos. Dentro de los cálculos factibles de efectuar, está el cálculo de
razones entre parámetros; cálculos que son guardados como un nuevo archivo. En
la Tabla 4 se encuentra el protocolo de cálculo de la razón de fluorescencia roja
sobre verde.
Una vez obtenido el nuevo archivo (con el cálculo de la razón de
fluorescencia roja sobre verde), éste se convierte en un archivo con formato FCS
2.0 mediante el programa FACSConvert (Becton Dickinson), posterior a lo cual se
analizó nuevamente en programa CELLQuest v 1.1., donde se graficó y obtuvieron
las estadísticas correspondientes. En la Figura 4 se encuentra el diagrama
correspondiente a la secuencia de análisis de estimación de ∆Ψ.
∆Ψ
40
Tabla 4:
Protocolo de cálculo de razón de fluorescencia roja sobre verde
usando programa Flow Explorer 4.0.
1. Seleccionar fila
2. Elegir Math
3. Imput Parameters:
y1 = FL2-H
y2 = FL1-H
4. Math formula:
Seleccionar x = y1/y2
5. Output parameter:
x = FL3-H
6. New label:
Ratio FL2/FL1
7. File renaming:
Ingresar nombre de nueva fila
8. Apply calculation to file
9. Confirmation
10. La nueva fila esta lista
Figura 4: Diagrama correspondiente a la secuencia de análisis de estimación
de ∆Ψ.
41
Al graficar la razón de fluorescencia roja sobre verde en un histograma, el
pico ubicado a la izquierda (incluido en el marcador 1) corresponde a células
depolarizadas, mientras que el pico ubicado a la derecha del histograma (incluido
en el marcador 2) corresponde a células polarizadas. Los resultados se expresan
como porcentaje de cada marcador de análisis respecto de R1.
2.13. Análisis de eflujo bacteriano a bromuro de etidio.
En forma semejante al análisis de viabilidad bacteriana, utilizando el
programa de adquisición y análisis CELLQuest v 1.1., se dibujó una ventana de
análisis (gate) en función de FSC y SSC, de modo que más del 90% de los eventos
celulares estuvieran incluidos (Figura 3). Como control positivo, se utilizaron
células viables (E. coli), es decir células que no tenían fluorescencia (atribuible al
eflujo de bromuro de etidio) y como control negativo, células muertas, es decir
células que sí tenían fluorescencia (sin eflujo de bromuro de etidio). Se evaluó la
intensidad de fluorescencia roja del BrEt (FL2-H: 543-627 nm). Bajo este mismo
concepto se analizaron las filas correspondientes a las diversas situaciones en las
cuales se evaluó la presencia de eflujo al BrEt, incluyendo el control negativo, es
decir de células muertas, el cual incluía sobre el 95% de los eventos celulares
dentro del segundo marcador descrito.
42
3.
3.1
RESULTADOS
Determinación de calibración base
Debido a que no se tenía experiencia previa en el análisis de bacterias por
citometría de flujo, fue necesario establecer la correcta discriminación de bacterias
en función de FSC y SSC, logrando de este modo, para los diversos parámetros, un
adecuado ajuste de las diversas intensidades de señal, estableciéndose una
calibración base sobre la cual trabajar en los subsiguientes ensayos. En la Figura 5
se puede observa la selección de la mejor calibración base y en la Tabla 5 se
detalla la misma.
Figura 5: Selección de calibración base. En A y B se pierden los eventos
pequeños (señal amplificada por un factor de 10), mientras que en C, se pierden
los eventos grandes (señal amplificada por un factor de 1000). En D se aprecia la
una adecuada discriminación de eventos pequeños y grandes (señal amplificada
por un factor de 100). Bacteria usada: E.coli.
43
Tabla 5:
Detalle de calibración base utilizada (Citometro de flujo
FACSCalibur)
Detector
FSC
SSC
FL-1
FL-2
FL-3
Voltaje
Ganancia
amplificador
Modo
E02
450
633
681
622
1.78
1.00
1.00
1.00
1.00
Log
Log
Log
Log
Log
SSC
Ninguno
Valor
200
Threshold (umbral)
Parámetro primario
Parámetro secundario
Compensación
FL1-0.0 % FL2
FL2-0.0 % FL1
FL2-0.0 % FL3
FL3-0.0 % FL2
3.2.
Análisis de patrones de tamaño
Con el objeto de tener un punto de referencia con características similares,
en especial en lo que se refiere al índice de refracción, se utilizaron como control,
diversas bacterias con características conocidas, las que se representan el
histograma de la Figura 6, y en la Tabla 6, se puede apreciar los patrones de
tamaño para E. coli (bacilo), P. aeuruginosa (bacilo corto), Acinetobacter spp.
(Cocoide y bacilo corto) y Bacillus subtilis (bacilo a bacilo largo).
44
Figura 6: Superposición de histogramas para la señal de FSC-H.
Representando bacterias con un patrón de tamaño que incluye, cocáceas, bacilos
cortos, bacilos y bacilos largos. También se representa la posición de 8
marcadores (incluyendo +/- 100 canales).
En la Tabla 7 se muestran los patrones de tamaño para E. coli K12 bajo el
efecto de los antibióticos ampicilina, ceftazidima, gentamicina y tetraciclina a
concentraciones 0.5 y 2 veces la CMI (Tabla 1).
45
Tabla 6:
Marcador
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
Patrones de tamaño de cepas control.
Canal
E. coli
P. aeuruginosa
Rango
%G
Patrón
%G
Patrón
250-350
350-450
450-550
550-650
650-750
750-850
850-950
950-1023
0.00
0.00
0.00
2.40
47.10
49.20
1.30
0.00
bc
B
B
-
0.40
4.00
36.60
57.50
1.50
0.00
0.00
0.00
BC
BC
-
Acinetobacter
spp.
%G
Patrón
Bacillus subtilis
%G
Patrón
14.79
25.05
27.91
14.69
2.17
0.65
0.08
0.00
5.22
6.69
5.00
5.90
11.44
35.59
20.51
8.62
c
c
Bs
Bs
B
B
BL
bl
c
C
BC
bc
-
%G: porcentaje de la gate. Patrón sugerente: minúsculas. Patrón
concordante: mayúsculas. Para E. coli, el patrón concordante es bacilo
(marker 5 y 6). Para P. aeuruginosa el patrón concordante es bacilo corto
(marker 3 y 4). Para Acinetobacter spp., el patrón concordante es entre cocoide
y bacilo corto. Para Bacillus subtilis el patrón concordante es entre bacilo y
bacilo largo.
Al comparar el control (patrón de bacilo a bacilo corto) con los ensayos
con una concentración de antibiótico al doble de la CMI, se puede apreciar un
patrón de células cocoides para ampicilina y gentamicina, un patrón de células
cocoides a bacilos cortos para ceftazidima y un patrón de células cocoides a
bacilares para tetraciclina. En el caso de los ensayos con una concentración de
antibiótico de 0.5 veces la CMI, el patrón de tamaño difiere respecto de los
ensayos con 2 veces la CMI. Un patrón, principalmente, de bacilo corto se observó
con ampicilina. Con ceftazidima y tetraciclina, cambió a un patrón de bacilo a
bacilo alargado y para gentamicina, cambió a un patrón bacilar (Figura 7).
46
Figura 7: Estimación de tamaño para E. coli K12 frente a diferentes
antibióticos. En rojo se representa la intensidad de señal para FSC de la bacteria
sin antibióticos. La curva en negro representa 0.5 veces la CMI. La curva en azul
representa 2 veces la CMI.
En el caso de H. pylori, la Tabla 8 muestra el patrón de tamaño para cinco
cepas diferentes, después de un cultivo de 72 horas en medio sólido sin ningún
antibiótico. Es interesante señalar que cuatro cepas tuvieron un patrón cocoide a
bacilo corto, mientras que una cepa (594-C) tuvo un patrón de bacilo a bacilo
alargado, diferencias que fueron claramente observadas.( Figura 8).
47
Tabla 7:
Patrones de tamaño de E. coli K12 bajo el efecto de diferentes antibióticos (a concentraciones de 0.5
y 2 veces la CMI).
Marcador
Rango
canal
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
250-350
350-450
450-550
550-650
650-750
750-850
850-950
950-1023
Control
Ampicilina
Ceftazidima
Gentamicina
Tetraciclina
0.5 CMI
2.0 CMI
0.5 CMI
2.0 CMI
0.5 CMI
2.0 CMI
0.5 CMI
2.0 CMI
% G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat.
0.01
1.00
- 21.48 C 0.00
0.70
9.12
c 41.13 C 0.00
5.15 bc 27.01 BC 16.82 BC 0.02
42.02 BC 37.40 BC 6.56 bc 10.00
37.00 B 17.37 B
5.28
b 67.29
11.30 b
6.07
b
3.30
- 18.15
3.10
2.03
1.58
4.45
0.72
0.00
0.21
0.09
bc
B
B
-
12.86 c
4.83
30.74 C 10.65
17.19 BC 5.26
5.19 bc 24.20
11.78 b 44.60
16.00 B
8.10
3.57
1.78
0.73
0.38
c
bc
bc
B
b
-
22.61
40.24
16.45
7.44
3.95
2.89
1.45
0.01
C
C
bc
sb
-
%G: porcentaje de la gate. Patrón sugerente: minúsculas. Patrón concordante: mayúsculas.
0.00
0.00
0.04
2.41
45.82
42.07
7.70
2.00
B
B
bl
-
10.02
24.31
13.83
5.67
13.33
24.26
5.93
1.28
c
C
bc
bc
b
B
lb
-
48
Tabla 8:
Patrones de tamaño para diferentes cepas de H. pylori después de
un cultivo de 72 horas en medio sólido sin antibióticos.
Marcador
Rango
canal
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
250-350
350-450
450-550
550-650
650-750
750-850
850-950
950-1023
Cepa 636-C
% G Pat.
Cepa 594-C
% G Pat.
Cepa 612-C
% G Pat.
Cepa 632-C
% G Pat.
Cepa 633-A
% G Pat.
10.50
18.36
19.47
17.77
12.91
8.16
3.41
0.62
8.62
4.08
3.56
6.34
15.51
24.62
17.56
9.19
18.27
17.22
13.95
12.41
9.73
5.45
1.34
0.44
10.89
20.31
26.39
16.58
10.46
4.67
0.87
0.27
15.45
19.84
19.17
14.87
9.04
4.21
1.38
0.67
c
C
BC
BC
b
b
-
c
bc
B
B
BL
lb
C
C
bc
bc
b
b
-
c
C
BC
BC
b
b
-
C
C
BC
bc
b
-
%G: porcentaje de la gate. Patrón sugerente: minúsculas. Patrón
concordante: mayúsculas.
Figura 8: Cepas de H. pylori después de incubación por 72 horas. Todas
presentan un patrón cocoide a bacilo corto a excepción de la cepa 594-C, que
presenta un patrón de bacilo a bacilo alargado.
49
3.3.
Ensayo de viabilidad celular en E.coli y S. aureus:
En la Figura 9, se observa los histogramas correspondientes a la
evaluación de viabilidad celular mediante la incorporación de PI. En el histograma
correspondiente al control positivo, se dibujó a la izquierda un marcador que
incluyera sobre el 95% de los eventos celulares y un marcador (a la derecha del
histograma), que incluyera como máximo un 5% de eventos celulares. Las células
incluidas en este segundo marcador corresponden a células que incorporaron PI, es
decir no viables.
Figura 9: Viabilidad bacteriana, mediante la incorporación de PI. (A)
Control positivo (células vivas). (B) Mezcla 1:1 de bacteria vivas y muertas. (C)
Control negativo (células muertas).
50
En el caso de E. coli, al preparar el control de células muertas por calor, en
función de FSC y SSC, se logró una buena discriminación de las bacterias, sin
alterarse el patrón de tamaño de la población entera (Figura 10).
Cuando se evaluó viabilidad en E. coli, en base al protocolo básico de
preparación de suspensiones previamente definido (con el cual es posible evaluar
linealidad), se obtuvo una muy buena linealidad (R = 0.997) como se puede
apreciar en la Figura 11.
Figura 10: E. coli. En A bacterias vivas. En B, bacterias muertas por calor.
51
Figura 11: Evaluación de linealidad, mediante incorporación de PI, en
células de E. coli muertas por calor.
A su vez, al preparar el control de células de S. aureus muertas por calor, se
formó un precipitado macroscópico que se mantuvo en suspensión, lo que se
tradujo en una alteración considerable de las características de FSC y SSC (Figura
12). Al evaluar viabilidad en S. aureus en base al protocolo básico de preparación
de suspensiones previamente definido, se obtuvo una baja linealidad (R = 0,692)
dada por la asimetría poblacional producto de la probable formación de agregados
(Figura 13).
52
Figura 12: Células de S. aureus muertas por calor. En B, se puede apreciar la
formación de agregados y el aumento de la destrucción celular, con respecto a
células vivas (A).
Figura 13: Evaluación de linealidad, mediante incorporación de PI, en
células de S. aureus muertas por calor.
53
Producto de lo anterior se realizaron una serie de experiencias tendientes a
lograr establecer un adecuado control de células muertas, tanto para E. coli como
para S. aureus, es decir que no alteraran las características de FSC y SSC, y que
además se lograra una buena correlación entre el porcentaje de células que
incorporan PI y la cantidad de células muertas. En el caso de E. coli se ensayó:
etanol al 10%, metanol al 10%, Triton X-100 al 1%, twen 20 al 1% (Figura 14), e
incubación a distintos tiempos en una solución en base a paraformaldehído y
dietilenglicol (Figura 15) (FACSTM Lysing Solution; Becton Dickinson) y que
normalmente se usa para fijar y permeabilizar células eucariotas. En ninguno de
estos casos la incorporación de PI superó el 1.5%. Además, se ensayó una
incubación a 70º C por 30 minutos, con la cual se obtuvieron resultados muy
similares a la incubación a 100º C por 10 minutos (Figura 16).
A su vez, con S. aureus, se ensayó la acción de la agitación mecánica
vigorosa (vórtex) durante diferentes tiempos, así como también, la acción de
etanol al 10%, metanol al 10%, Triton X-100 al 1%, twen 20 al 1% (Figura 17), e
incubación a distintos tiempos con solución de lisis (FACSTM Lysing Solution;
Becton Dickinson). Nuevamente, en ninguno de estos ensayos, la incorporación de
PI superó el 3.0%, a excepción del Tritón X-100 al 1%, que logró 7.21% (Figura
18). Al ensayar una incubación a 70º C por 30 minutos, se obtuvieron resultados
similares a la incubación por 10 minutos a 100º C, con la formación del
precipitado macroscópico ya mencionado.
54
Figura 14: Incorporación de PI en células de E. coli, bajo la acción de
diversas sustancias.
Figura 15: Incorporación de PI en células de E. coli, bajo la acción de
solución en base a paraformaldehído y dietilenglicol.
55
Figura 16: Incorporación de PI en células de E. coli tratadas por 30 minutos a
70ºC.
Figura 17: Incorporación de PI en células de S. aureus, bajo la acción de
solución en base a paraformaldehído y dietilenglicol.
56
En la búsqueda de un adecuado control de células muertas, se exploró el
concepto de fijación con etanol absoluto a baja temperatura. Este shock frío
permite por un lado que las células sean fijadas por el etanol y por otro lado, que
no se alteren las características de FSC y SSC, producto de la brusca baja de
temperatura. En la Figura 19 es posible apreciar que en el caso de S. aureus, se
logró una muy buena incorporación de PI por parte de células sometidas al shock
frío, al igual que con E. coli (Figura 20). Cabe destacar que para S. aureus, este
procedimiento permitió eliminar la formación de agregados y las características de
FSC y SSC fueron óptimas para un adecuado análisis. Además el posterior cultivo
en placa de estas células demostró que el shock frío, al menos las transforma en
células no cultivables.
Cuando se procedió a evaluar viabilidad de E. coli muertas por shock frío,
en base al protocolo básico de preparación de suspensiones previamente definido,
se obtuvo, en un ensayo en triplicado, una muy buena linealidad (R = 0.978) como
se puede apreciar en la Figura 21. A su vez para S. aureus, también en un ensayo
por triplicado, la linealidad obtenida fue muy buena (R = 0.981) (Figura 22).
57
Figura 18: Incorporación de PI en células de S. aureus, en diversas
situaciones.
Figura 19: Incorporación de PI en células de S. aureus sometidas a shock
frío.
58
Figura 20: Incorporación de PI en células de E. coli sometidas a shock frío.
Figura 21: Incorporación de PI en células de E. coli sometidas a shock frío.
Ensayo triplicado.
59
Figura 22: Incorporación de PI en células de S. aureus sometidas a shock frío.
Ensayo triplicado.
3.4.
Ensayo de ∆Ψ en E. coli y S. aureus
Una vez establecidos los controles en base al protocolo de shock frío, y
demostrado que dichas células no son cultivables y no son viables (en base a la
incorporación de PI), se utilizaron como controles negativos para ∆Ψ,
∆Ψ es decir
estas células teóricamente presentaban una depolarización completa de su
membrana citoplasmática. En la Figura 23 se muestra un gráfico de FL2-H v/s
FL1-H donde se es posible apreciar las regiones correspondientes a células
polarizadas y depolarizadas. De igual forma, en la Figura 24, se muestra el
60
histograma que representa la razón de fluorescencia roja sobre verde (FL2-H/FL1H)
Figura 23: S. aureus y ∆Ψ.
∆Ψ Gráfico de FL2-H v/s FL1-H, que permite dibujar
regiones (R2 y R3), que corresponden a células polarizadas y depolarizadas,
respectivamente.
61
Figura 24: S. aureus. Histograma representando la razón FL2/FL1. Se
dibujan los marcadores M1 y M2 que corresponden a células depolarizadas y
polarizadas, respectivamente.
En S. aureus, y usando el protocolo básico de preparación de suspensiones
previamente definido y evaluando igualmente viabilidad celular en cada serie de
ensayos, se observó nuevamente una muy buena correlación entre la incorporación
de PI y la cantidad de células muertas (Figura 25).
62
Figura 25: Incorporación de PI en células de S. aureus muertas por shock frío.
Evaluación de linealidad.
A su vez, al medir ∆Ψ,
∆Ψ en ensayos en triplicado, se obtuvo una muy buena
correlación (R = 0.982) entre el porcentaje células que mostraban depolarización
y/o polarización y el número de células viables y/o muertas (Figura 26). Igual
situación ocurre al calcular la razón de fluorescencia roja/verde (Figura 27).
A fin de evaluar la estabilidad en el tiempo de la estimación de ∆Ψ en S.
aureus, usando DiOC2(3), se efectuaron mediciones en el tiempo a un mismo tubo
con bacterias viables, provenientes de un cultivo fresco, a intervalos de 2 minutos
durante 30 minutos (protegiendo el tubo de la luz ambiente). Tanto para células
polarizadas como para depolarizadas, la estabilidad se mantiene en el tiempo
(Figura 28). La misma situación se observa al calcular la razón de fluorescencia
roja/verde (Figura 29).
63
Figura 26: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de
linealidad de ensayo de ∆Ψ (marcación con DiOC2(3)). Ensayo en triplicado.
Figura 27: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de
linealidad de ensayo de ∆Ψ (razón de fluorescencia roja/verde) en triplicado.
64
Figura 28: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de
estabilidad en el tiempo de ensayo de ∆Ψ (marcación con DiOC2(3)).
Figura 29: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de
estabilidad en el tiempo de ensayo de ∆Ψ ( razón de fluorescencia roja/verde).
65
Es importante señalar, que una vez cumplido exitosamente el proceso de
estandarización de la metodología de estimación de ∆Ψ en S. aureus, se procedió a
los ensayos con E. coli. A fin de que la DiOC2(3) pueda acceder a la membrana
interna, es necesario permeabilizar la membrana externa de la bacteria, para lo cual
se utilizó una solución de PBS que además contenía TRIS 10 mM, EDTA disódico
1 mM y glucosa 10 mM. En la Figura 30 se puede observar la comparación entre
el uso de PBS-EDTA y sólo PBS. En este último caso, casi el 100% de las células
se observan como si estuvieran depolarizadas, y esto es atribuible a la incapacidad
de la DiOC2(3) de acceder a la membrana interna de la células, situación que se
revierte al usar PBS-EDTA. Es importante notar, sin embargo, que se observa un
porcentaje basal de células que aparecen como depolarizadas (16.5 %) y
lógicamente el porcentaje de células polarizadas es cercano al 83%.
Al efectuar el ensayo en triplicado, usando el protocolo básico de
preparación de suspensiones previamente definido, con PBS-EDTA, se logró una
muy buena correlación entre la incorporación de PI y la cantidad de células vivas
(Figura 31). Igual situación se observó entre el porcentaje células que mostraban
depolarización y/o polarización y el número de células viables y/o muertas
(Figura 32). Idéntica situación se observa al calcular la razón de fluorescencia
roja/verde, tanto para células polarizadas y depolarizadas (Figura 33).
66
Figura 30: E. coli. Incorporación de Dioc2(3), según el buffer usado.
Figura 31: Evaluación de linealidad en la Incorporación de PI de células de E.
coli en PBS-EDTA.
67
Figura 32: Células de E. coli en PBS-EDTA vivas y muertas (shock frío).
Evaluación de linealidad de ensayo de ∆Ψ (marcación con DiOC2(3)). Ensayo
en triplicado.
Figura 33: Células de E. coli en PBS-EDTA vivas y muertas (shock frío).
Evaluación de linealidad de ensayo de ∆Ψ (razón de fluorescencia roja/verde).
Ensayo en triplicado.
68
3.5.
Ensayo de viabilidad celular en Helicobacter pylori:
Para evaluar viabilidad en H. pylori ATTC 43504, se prepararon
suspensiones celulares en caldo MH filtrado, a partir de un cultivo en placa con 3
días de incubación. Luego de preparar células muertas (por calor y shock frío), una
alícuota se resuspende en PBS y se adiciona PI (10 µg/ml concentración final). En
la Figura 34 se muestra que el porcentaje de incorporación de PI por parte de
células teóricamente muertas, fue mínimo (no mayor al 13,8%). Luego de repetir
el ensayo, variando tanto el cultivo celular, como los tiempos de incubación con PI
(normalmente son 5 minutos), los resultados se mantuvieron, no descartándose que
el PI sea incapaz de acceder a la célula.
Figura 34: H. pylori. Incorporación de PI (PBS-EDTA).
69
3.6.
Ensayo de ∆Ψ en Helicobacter pylori
Al igual que para el ensayo de viabilidad, se prepararon suspensiones
celulares en caldo MH filtrado, a partir de un cultivo en placa con 3 días de
incubación, resuspendiéndose en PBS-EDTA. Se observó cerca de un 80% de
células aparentemente depolarizadas, incluso en el caso de células teóricamente
viables y que deberían haber aparecido como polarizadas. El porcentaje de células
teóricamente polarizadas no superó el 6.5% (Figura 35). A fin de descartar la
presencia de un sistema de eflujo que expulse los fluorocromos hacia el exterior de
la células, se implementó la medición de eflujo a BrEt en E. coli, como base para
posteriores ensayos con H. pylori.
Figura 35: H. pylori en PBS-EDTA. Evaluación de ∆Ψ (marcación con
DiOC2(3)).
70
3.7.
Ensayo de eflujo de bromuro de etidio en E.coli y S. aureus:
Para analizar la presencia de un eflujo para BrEt, como se observa en la
Figura 36, en el histograma correspondiente al control positivo, es decir células
que sí presentaban eflujo a BrEt, se dibujó a la izquierda un marcador que
incluyera sobre el 95% de los eventos celulares y un marcador (a la derecha del
histograma), que incluyera como máximo un 5% de eventos celulares. Las células
incluidas en este segundo marcador corresponden a células sin la capacidad de
eflujo al BrEt (no viables). Al ensayar tres puntos (células vivas, células muertas y
una mezcla 1:1 de ambas), se obtuvo una curva lineal muy similar a la producida
por el ensayo de viabilidad con PI (Figura 37).
Figura 36: Eflujo a BrEt en E. coli. En A control positivo (células vivas) y en B
control de negativo (células muertas).
71
Figura 37: E. coli (células vivas y muertas). Evaluación de linealidad para
incorporación de PI y para eflujo a BrET.
En S. aureus, si bien el control positivo mostró un valor coincidente con la
presencia teórica de un eflujo a BrEt, el control negativo, es decir células muertas
y que deberían haber mostrado una alta fluorescencia, mostró sólo un 61%; sin
embargo, se conservó la linealidad (Figura 38). Lo anterior se podría explicar por
la incapacidad de BrEt de ingresar completamente a la célula muerta.
72
Figura 38: S. aureus (células vivas y muertas). Evaluación de linealidad para
incorporación de PI y para eflujo a BrET.
3.8.
Ensayo de eflujo de bromuro de etidio en H. pylori:
Al ensayar tres puntos, se obtuvo una baja intensidad de fluorescencia
(cercana al 15 %), tanto en células vivas, células muertas y en la mezcla 1:1 de
ambas. Con este resultados se puede pensar, que H. pylori, no presentaría un
sistema de eflujo de BrEt, o bien por alguna razón el BrEt no es capaz de acceder a
la célula. A fin de intentar confirmar lo anterior, se intentó evaluar en H. pylori
(usando como referencia E. coli y S. aureus), viabilidad celular con PI, ∆Ψ con
DiOC2(3) y eflujo de BrEt bajo la acción de ionóforos, inhibidores de bombas de
eflujo y sustancias que alteran la cadena transportadora de electrones.
73
3.9.
Acción de CCCP sobre la viabilidad celular, ∆Ψ y el probable eflujo de
bromuro de etidio en S. aureus:
A partir de un cultivo bacteriano líquido en fase exponencial, se ensayó la
acción de Carbonyl cyanide m-chlorophenyl-hydrazone (CCCP) sobre S. aureus, a
diferentes tiempos (0, 10, 30, 60 y 120 minutos y a las 18 horas). En cada punto se
evaluó (incluyendo un control sin CCCP) viabilidad celular con PI, estimación de
∆Ψ y probable eflujo de BrEt, según los protocolos ya descritos.
La viabilidad celular y el probable eflujo de BrEt, no fue afectada por la
acción del CCCP (Figura 39), a diferencia de la clara acción ejercida en el tiempo
sobre el ∆Ψ (Figura 40), acción que se intensificó en el tiempo, demostrándose la
acción del CCCP como ionóforo de protones.
Figura 39: Células vivas de S. aureus. Acción de CCCP sobre la viabilidad
celular y el eflujo a BrEt.
74
Figura 40: Células vivas de S. aureus. Acción de CCCP sobre el ∆Ψ (razón de
fluorescencia roja/verde).
3.10.
Acción de CCCP, valinomicina, azida de sodio y MC207.110, sobre la
viabilidad celular, el potencial de membrana y el eflujo de bromuro de
etidio en E. coli
La viabilidad celular no fue afectada por la acción de ninguno de los
compuestos ensayados (Figura 41). El eflujo de BrEt no se afectó con
valinomicina y CCCP. Con azida de sodio y MC 207.110 se produjo una
disminución transitoria del eflujo de BRET, a los 60 minutos, la cual fue
posteriormente completamente revertida (Figura 42)
75
Figura 41: Células vivas de E. coli. Acción de diversos compuestos sobre la
viabilidad celular.
Figura 42: Células vivas de E. coli. Acción de diversos compuestos sobre el
eflujo a BrEt.
76
El ∆Ψ,
∆Ψ no fue mayormente alterado por ninguno de los compuestos a
excepción de CCCP, con el cual, se produjo una depolarización considerable (pero
no completa), durante los primeros tiempos, para luego retornar a la normalidad
luego de 18 horas de incubación (Figura 43).
Figura 43: Células vivas de E. coli. Acción de diversos compuestos sobre la
razón de fluorescencia roja/verde (∆Ψ
∆Ψ).
∆Ψ
77
3.11. Acción de CCCP, valinomicina, azida de sodio y MC207.110, sobre H.
pylori:
En el caso de intentar medir viabilidad celular con PI, no se logró ningún
efecto sobre la incorporación de PI, con ninguno de los compuestos y a ningún
tiempo (Figura 44). Igual situación ocurrió con el intento de medir eflujo de BrEt
(Figura 45).
Finalmente, al intentar evaluar ∆Ψ,
∆Ψ los resultados fueron invariables con
respecto a lo previamente ensayado, no siendo posible, con DiOC2(3), evidenciar
la presencia de células polarizadas (Figura 46).
Figura 44: H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre incorporación de PI.
78
Figura 45: H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre el eflujo a BrEt.
Figura 46: H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre la razón de
fluorescencia roja/verde (∆Ψ
∆Ψ).
∆Ψ
79
4.
DISCUSION
Las aplicaciones de la citometría de flujo son múltiples así como también
las áreas en las que es posible usarla como una herramienta de apoyo. La
microbiología no ha sido la excepción, siendo innumerables los estudios en
parásitos, hongos, bacterias y virus, en los cuales se ha usado ésta técnica. El
estudio de bacterias por citometría de flujo ha cobrado cada vez mayor interés, en
la medida que los bacteriólogos han tomado conciencia de las potencialidades y
ventajas que les puede ofrecer esta técnica, en especial el hecho de poder evaluar
simultáneamente miles de bacterias, en segundos,
y obtener así información
acerca de una población bacteriana dada. De este modo, no es extraño encontrar en
la literatura científica internacional, estudios centrados en las características
fisiológicas de las bacterias y sus interacciones con el medio, en especial bajo la
acción de antibacterianos, así como también, susceptibilidad a los mismos. Dentro
de este concepto, los estudios de viabilidad celular (mediante la inclusión y/o
exclusión de sustancias fluorescentes) y la evaluación del ∆Ψ y sus interacciones
con los sistemas de eflujo, han entregado información vital sobre lo que sucede
con una población bacteriana, en especial durante sus diferentes fases de
crecimiento.
En teoría, es posible usar un citómetro de flujo para medir los mismos
parámetros tanto en bacterias y células eucariontes. En la práctica, dado que en
una bacteria la señal de estos parámetros es aproximadamente la milésima parte de
80
los de una célula eucarionte, es difícil hacer una buena medición. Lo anterior es
producto, por un lado, de variaciones fotoeléctricas que hacen indetectables
algunos componentes bacterianos, y por otro lado, los citómetros comerciales,
diseñados para medir células eucariontes, presentan altos niveles de ruido de fondo
o background. Independiente de lo anterior, muchos citómetros comerciales logran
satisfacer las necesidades de sus usuarios, logrando una buena discriminación y
evaluación de parámetros bacterianos (Shapiro, 2003).
Coincidente con lo anterior, y considerando las limitaciones de un
citómetro de flujo diseñado para medir células eucariontes, en esta Tesis se evaluó
la detección de bacterias, en sus parámetros intrínsecos (FSC y SSC), así como
también de ciertos parámetros fisiológicos, como son viabilidad celular, eflujo
bacteriano y ∆Ψ.
∆Ψ
4.1.
Citometría de flujo y bacterias.
A pesar de no existir experiencia previa en el análisis de bacterias por
citometría de flujo, se logró establecer la correcta discriminación de éstas,
mediante la amplificación logarítmica de la señal (modo log). El principal
problema lo presentó el ruido de fondo, el cual es atribuible a la presencia de
micro cristales propios de la solución usada tanto como diluyente como para
resuspender las bacterias (PBS), y a la formación de micro burbujas producto del
paso de líquido a presión por la cámara de lectura del citómetro de flujo. Este
81
ruido de fondo se traduce en eventos con una señal de FSC levemente menor a la
de bacterias, pero que en el caso de células pequeñas, produce una contaminación
de la señal. Por otro lado este ruido, presenta una señal de SSC menor que la de
bacterias, por lo que es discriminable sin mayor dificultad. Producto de lo anterior,
se definió el umbral de detección o threshold en función de SSC con un valor de
200. Lo anterior se traduce en que cualquier evento celular que produzca una señal
de SSC inferior a 200, no será considerado y por lo tanto eliminado del total de
eventos almacenados para ese conjunto de datos o fila de almacenaje. Finalmente
la adecuada detección de la señal de FSC se consiguió amplificando la señal de
voltaje por un factor de 100 y la ganancia del amplificador se ajustó en 1.78. La
amplificación de la señal de FSC por un factor de 10 o de 1000, produjo la pérdida
de elementos celulares pequeños o grandes, respectivamente (Figura 9).
4.2.
Análisis de patrones de tamaño.
Las mediciones de FSC se han usado ampliamente para estimar tamaño
celular, desde que fue demostrado por Mullaney y colaboradores, en 1969, que la
intensidad de la luz desviada en pequeños ángulos (0.5 – 2.0º) desde una luz láser
incidente, era proporcional al volumen de una partícula dada (Bouvier y col.,
2001; Shapiro 2003).
La medición FSC es el resultado de un haz de luz que pasa a través de un
líquido (agua), impactando la partícula medida, refractando el haz de luz, lo que
es detectado en dirección frontal. Debido a que el índice de refracción entre las
82
células y el medio que las suspende también afecta las mediciones de FSC, si el
índice de refracción de las células fuera igual al del medio que las suspende, las
células no dispersarían la luz del incidente.
La diferencia en los índices de
refracción entre las células y el medio que las suspende, es mantenida en parte, por
la acción de la membrana como una barrera de la permeabilidad a solutos y agua.
De esta forma, las señales de partículas más grandes no son necesariamente más
grandes que señales de partículas más pequeñas.
Las mediciones de FSC pueden ser útiles, considerando cuidadosamente
sus limitaciones, las que proviene del hecho de que muchos factores distintos del
tamaño celular son capaces de afectar la dispersión frontal de la luz incidente
(Shapiro, 2003). Diversos intentos de estimar tamaño celular bacteriano han sido
propuestos (Robertson y col., 1998; Shapiro, 2003; Shvalov y col., 1999, 2000).
Algunas técnicas analíticas actualmente en uso, estiman el porcentaje de células
positivas, basado en diferentes criterios de comparación del control negativo y del
estudio en cuestión (Lampariello y col., 1998; Shapiro, 2003).
Pocos trabajos analíticos comparables, se han efectuado para el análisis de
datos monodimensionales. Tradicionalmente se corre una muestra control,
delimitando según apreciación visual lo que corresponde al control negativo, y en
función de éste, definir las células positivas (Figura 5 y 36). Si ambas poblaciones
están completamente separadas, no existe mayor problema para discriminarlas, a
diferencia de poblaciones superpuestas, donde la diferenciación es difícil. (Watson
y col., 2001).
83
La utilidad del método de análisis propuesto aquí, se puede ilustrar por la
estimación del efecto producido por la acción de diversos antibióticos sobre el
tamaño celular en E .coli K12 (Tabla 6 y Figura 10). En el caso de ceftazidima,
esta droga se une a varias proteínas que unen penicilina (PBPs: penillin binding
protein); a baja concentración, se une con alta afinidad a PBP3, produciendo
filamentación de las bacterias, mientras que a altas concentraciones, tiene afinidad
por la PBP1, produciendo lisis bacteriana. Del mismo modo, la inhibición de
PBP2 produce la formación de células esféricas, esto se puede apreciar en la Tabla
6 y Figura 10 donde a concentraciones de antibiótico de 0,5 veces la MIC, las
células mostraron un aumento en el patrón del tamaño respecto del control (de
bacilos cortos a bacilos), mientras que a concentración del antibiótico de 2 veces la
CMI, los patrones del tamaño correspondieron a células cocoides y a bacilos
cortos a bacilos.
Para H. pylori, la aplicación de este método de análisis, permite discriminar
claramente y eficientemente, diferentes patrones de tamaño, en especial células
cocoides de bacilos y de bacilos largos, como se puede apreciar en la Tabla 7 y
Figura 11, donde se muestran varias cepas con diferentes patrones de tamaño, que
van desde células cocoides a bacilos largos.
Si se consideran, las diversas aplicaciones de los estudios de tamaño celular
en bacterias, bajo diferentes condiciones (exposición a antimicrobianos,
condiciones ambientales, etc.) y el uso de parámetros intrínsecos a un citómetro
de flujo, junto con un método de análisis e interpretación sencillo, como el
84
desarrollado, posibilitan integrar fácilmente información sobre poblaciones
bacterianas con otros estudios (genéticos, moleculares, fisiológicos, etc.).
4.3.
Ensayo de viabilidad celular en E. coli y S. aureus
Como se planteó previamente, es difícil estructurar una definición de
viabilidad, considerándose viabilidad reproductiva o clonogenicidad, como
sinónimos de viabilidad celular. En consecuencia, al evaluar viabilidad en E. coli y
S. aureus, se deben definir muy bien los criterios a considerar para un control
positivo (células vivas) y para un control negativo (células muertas). Por lo
anterior, en esta Tesis, se consideró que la definición de control negativo, no debe
alterar significativamente las propiedades de FSC y SSC, a fin de que existiera la
mayor similitud posible con el control positivo (células vivas) y sólo hubiera una
clara diferencia en el parámetro a evaluar (viabilidad y potencial de membrana).
Estas condiciones se cumplieron en el caso de células de E. coli muertas por calor,
no así para S. aureus donde se produjo la agregación macroscópica ya descrita.
Cuando se consideró el concepto de criofijación, se obtuvieron las
condiciones ideales para un control negativo, tanto en E. coli como en S. aureus.
Lo anterior se logró gracias a que por un lado que las células son fijadas por el
etanol y por otro lado, la brusca baja de temperatura no permite que se alteren las
características de FSC y SSC.
Con el protocolo básico de preparación de suspensiones celulares definido
(Tabla 2), fue posible evaluar exitosamente la linealidad de la incorporación de PI
85
por parte de células vivas y/o muertas. Es así como el alto coeficiente de
correlación obtenido en los ensayos en triplicado, tanto para E. coli y S. aureus
(0.978 y 0.981, respectivamente), permiten concluir que el protocolo de evaluación
de incorporación de PI en las bacterias ensayadas es adecuado, y si consideramos
la definición de viabilidad bacteriana en función de la incorporación de PI, esta
metodología es adecuada para medir viabilidad bacteriana en E. coli y S. aureus,
bajo las condiciones ensayadas.
4.4.
Ensayo de ∆Ψ en E. coli y S. aureus.
La estimación de potencial de membrana por citometría de flujo ya sea en
eucariontes, organelos (mitocondrias) y bacterias está ampliamente establecida, y
son muchos los estudios que así lo demuestran (Haugland, 2002; Novo y col.
1999, 2000; Shapiro 2000, 2001, 2003). De hecho son innumerables los
compuestos para ensayos potenciométricos disponibles en el mercado (Haugland,
2002; Shapiro 2003) y de fácil acceso. Incluso la empresa Molecular Probes, en su
página web (www.probes.com) tiene
disponible una manual de compuestos
fluorescentes donde se discute ampliamente sobre los diversos compuestos para
ensayos
potenciométricos
disponibles
(Haugland,
2002;
www.probes.com/handbook/sections/2200.html).
En cuanto a la estimación de ∆Ψ en bacterias, son muchos los estudios en
los cuales se usa citometría de flujo, tanto para determinar el estado metabólico de
86
bacterias en sus medios naturales, como también en ensayos de respuesta frente a
agentes antibacterianos.
Dado que los fluorocromos presumiblemente se unen a sitios hidrofóbicos,
células con más sitios, captan más moléculas de fluorocromos. De este modo, se
produce una variación considerable célula a célula y lógicamente, altamente
dependiente del tamaño. Más aún si se considera la alta hidrofobicidad de estos
compuestos, los cuales en alta concentración y en medio acuoso, precipitan o por
lo menos forman agregados, en especial en el citoplasma (acuoso) de una célula.
Lo anterior es especialmente importante en el caso de S. aureus, por su tendencia a
formar agregados, de modo que la fluorescencia de “n” células, es “n” veces más
brillante que la de una sola célula.
En el caso de carbocianinas, y en especial DIOC2(3), en altas
concentraciones (como la usada), desarrollan un segundo pico de emisión cercano
a los 610 nm (rojo). El primero se produce cerca de los 560-580 nm (verde). Novo
y col. demostraron que en S. aureus, usando DIOC2(3) a una concentración de 30
µM, no se observa un cambio significativo de la fluorescencia verde en función
del ∆Ψ y sí lo es proporcional al tamaño celular, a diferencia de lo observado con
la fluorescencia roja que es dependiente del tamaño y de la formación de
agregados de DIOC2(3).
87
Figura 47: Relación entre ∆Ψ,
∆Ψ DIOC2(3), tamaño celular, formación de
agregados y fluorescencias.
En la Figura 47, se esquematiza lo anterior. Si se considera dos células,
una pequeña y otra de mayor tamaño y que ambas tienen el mismo ∆Ψ,
∆Ψ al unirse
DIOC2(3), molécula catiónica, la fluorescencia verde será proporcional al tamaño,
ya que la célula más grande tiene mas cargas negativas en su interior. A su vez la
fluorescencia roja, dependiente del tamaño y sensible a la presencia de agregados
insolubles de DIOC2(3) será mayor en la célula más grande. La fluorescencia roja
es producto de la formación de agregados de moléculas de fluorocromo, a altas
concentraciones intracelulares en el medio acuoso del citosol, debido a la baja
solubilidad en agua del fluorocromo. La intensidad de fluorescencia roja
88
proporciona una medida de la cantidad total de agregados del fluorocromo en la
célula, función del tamaño celular y de la concentración intracelular.
La consecuencia lógica de lo anterior es la utilización de una razón
matemática que permita eliminar la contribución de diferencias célula a célula, en
lo que se refiere a la unión del fluorocromo, entregando distribuciones más
angostas y haciendo fácil identificar heterogeneidad poblacional.
La razón de fluorescencia roja/verde elimina el efecto de variaciones de
tamaño, ya que es independiente de este y es sensible al ∆Ψ.
∆Ψ Si bien, esta razón es
fundamental en el cálculo de un número real de ∆Ψ,
∆Ψ en esta Tesis sólo se estimó
en forma porcentual, es decir qué porcentaje de las células analizadas se
encontraban ya sea polarizadas o depolarizadas. Bajo estas condiciones, la
reproducibilidad queda demostrada por el alto coeficiente de correlación obtenido.
En el caso de E. coli, la situación es muy similar, con la diferencia que es
necesario permeabilizar la membrana externa usando EDTA, con lo cual se logró
una buena estimación de ∆Ψ,
∆Ψ lo que nuevamente quedó demostrado por el alto
coeficiente de correlación obtenido. De esta forma, la estimación de ∆Ψ en S.
aureus y E. coli, se logró exitosamente de acuerdo a lo ya descrito en la literatura
internacional, lo cual posibilita su aplicación en otros géneros bacterianos con
características fisiológicas y estructurales semejante a los controles ensayados, en
especial, en estudios del efecto que diversos antimicrobianos ejerzan sobre
bacterias,
tanto
Gram
positivas
como
Gram
negativas
(estafilococos,
estreptococos, enterobacterias y bacilos no fermentadores, entre otras).
89
4.5.
Ensayo de viabilidad celular y ∆Ψ en Helicobacter pylori.
Bajo el mismo criterio analítico usado exitosamente para E. coli y S.
aureus, se procedió a evaluar, en H. pylori, tanto viabilidad celular mediante la
incorporación de PI y ∆Ψ con DIOC2(3). Bajo las condiciones ensayadas, no fue
posible evidenciar la incorporación de PI en H. pylori muertos, lo que sumado a la
imposibilidad de evidenciar células polarizadas en H. pylori vivos (sólo se
visualizaban como depolarizadas), hizo plantear la posibilidad de que por alguna
razón el fluorocromo, ya sea PI o DIOC2(3) no eran capaces de ingresar a la
células, y si lo hacían eran rápidamente excluidos por algún sistema de eflujo. A
fin de poder evidenciar lo anterior, basándose en la literatura internacional, se
efectuaron una serie de pruebas tendientes a evaluar la posible presencia de
sistemas de eflujo, así como el efecto inhibidores de estos.
4.6.
Ensayo de eflujo a bromuro de etidio en E. coli y S. aureus
La tinción vital, en bacterias es más compleja que para células eucariontes,
debido a la estructura más compleja de la membrana de las bacterias (Jernaes y
col., 1994). Dentro de los compuestos ya mencionados para estudios de viabilidad
celular, el PI pertenece a un subgrupo de compuestos que son excluidos de células
viables y sólo ingresan al interior de éstas, cuando se altera la barrera de
90
permeabilidad de la membrana. El otro subgrupo lo constituyen compuestos que
son incorporados por células viables. Para que estos últimos alcancen su blanco,
deben superar por un lado la barrera de permeabilidad de la membrana
citoplasmática y en el caso de bacterias Gram negativas, también la barrera de
permeabilidad de la membrana externa, así como también la presencia de
mecanismos de eflujo situados en la membrana citoplasmática que pueden expeler
compuestos en forma muy eficiente (Gibbons y col., 2003; Walberg y col., 1999).
Los sistemas transportadores que efluyen múltiples sustratos, incluyendo
antibióticos, no han evolucionado en respuesta al estrés de la era antibiótica. Por el
contrario, todos los genomas bacterianos estudiados contienen varias bombas de
eflujo diferentes, lo que indica su origen ancestral, estimándose que entre el 5 a
10% de todos los genes bacterianos están involucrados en el transporte, y un gran
número de estos codifican bombas de eflujo. Aunque en plásmidos se pueden
encontrar bombas de eflujo, la existencia de genes de bombas de eflujo en el
cromosoma bacteriano, da a la bacteria un mecanismo intrínseco, que permite la
supervivencia en un medio ambiente hostil (presencia de antibióticos), de modo
tal, que bacterias mutantes que sobre expresan genes de bombas de eflujo, pueden
ser seleccionados sin la adquisición de nuevo material genético. Incluso, se acepta
que la resistencia intrínseca de bacterias Gran negativas a ciertos antibióticos en
relación con bacterias Gram positivas, es el resultado de la actividad de sistemas
de eflujo. Se han descrito sistemas de eflujo en diversas bacterias, como por
ejemplo Campylobacter jejuni (CmeABC), E. coli (AcrAB-OprM, MexCD-OprJ,
MexEf-OprN y MexXY-OprM), Streptococcus pneumoniae (PmrA), Salmonella
91
typhimurium (AcrB), Staphylococcus aureus (NorA) y Pseudomona aeruginosa
(Li y col., 2000; Webber, 2003). La sobre expresión de una bomba de eflujo se
puede traducir en resistencia a antibióticos de más de una clase, así como también
algunos colorantes y fluorocromos, detergentes y desinfectantes (incluyendo
algunos biocidas comúnmente usados).
Se han descrito cinco grandes grupos o familias de transportadores:
1.
MFS
:
Major facilitator superfamily
2.
ABC
:
ATP binding cassette family
3.
RND
:
Resistance modulation division family
4.
SMR
:
Small multidrug resistance family (miembro de
drug/metabolite transporter (DMT) superfamily)
5.
MATE :
Multidrug and toxic compound extrusion family
Los transportadores de la familia RND no son exclusivos de bacterias
Gram negativas, pero si son muy comunes y son los más importantes desde el
punto de vista clínico. Operan como parte de un sistema tripartito que incluye una
proteína de fusión de membrana periplásmica (MFP) y una proteína de membrana
externa (OMF: factor de membrana externa). Los sistemas de eflujo del tipo RNDMFP-OMF se acomodan a un amplio rango de estructuras moleculares no
relacionadas, que pueden incluir la mayoría de las clases de antibióticos y
biocidas, fluorocromos, detergentes, inhibidores metabólicos, hidrocarburos
aromáticos (solventes orgánicos), péptidos catiónicos antimicrobianos, ácidos
92
grasos tóxicos y sales biliares, entre otros, y son responsables de contribuir a la
resistencia antimicrobiana, siendo descritos en un rango amplio de patógenos y no
patógenos, tanto en humanos, animales y plantas (Poole y col., 2004).
En S. aureus, NorA, miembro de la superfamilia MFS, es una bomba de
eflujo dependiente de la fuerza protón motriz y entre sus sustratos se encuentran
fluoroquinolonas hidrofílicas y compuestos orgánicos monocatiónicos como por
ejemplo acriflavina, bromuro de etidio y bromuro de tetrafenilfosfonio (Kaatz y
col., 2002).
El BrEt cruza la membrana por difusión pasiva y se intercala entre las
bases de polinucleótidos inhibiendo el crecimiento y produciendo efectos
mutagénicos (Bolhuis y col., 1994). Cuando el BrEt se une en el estado
intercalado, existe un gran incremento de la fluorescencia (aproximadamente 25
veces), como resultado del medio ambiente hidrofóbico que rodea a la molécula de
BrEt (Morgan y col., 1979-a; Morgan y col., 1979-b).
Es así como el influjo de BrEt se ha tomado como una medida de la
permeabilidad de la pared bacteriana, considerándose la intensidad de
fluorescencia como una medida del contenido celular del fluorocromo,
representando el efecto neto del influjo de fluorocromo debido a la permeabilidad
de la pared celular y el flujo externo del fluorocromo causado por la bomba de
eflujo conducida metabolitamente (Jernaes y col., 1994). Bajo estas condiciones, el
contenido celular del fluorocromo se considera que representa un balance en el
influjo del fluorocromo, el cual es un proceso pasivo guiado por el gradiente de
concentración del fluorocromo a través de la pared celular, y el eflujo, el cual por
93
definición, debe ser un proceso activo, ya que requiere energía, porque trabaja
contra el mismo gradiente de concentración.
La exclusión de una sustancia, puede ser el efecto combinado de un bajo
influjo y de una actividad de eflujo dependiente de energía, guiada por el gradiente
electroquímico a través de la membrana citoplasmática proceso que es alterado por
inhibidores metabólicos, lo que es evidenciado por el uso de sustancias
desacoplantes de protones, como CCCP (Jernaes y col., 1994; Bolhuis y col.,
1994; Walberg y col., 1999).
La función fisiológica de los sistemas de extrusión de BrEt se podría
relacionar con la necesidad del organismo de extrudir compuestos tóxicos
encontrados en el hábitat natural, como toxinas producidas por microorganismos o
plantas, muchos de los cuales son tanto solubles en lípidos como también en agua
(Bolhuis y col., 1994).
La citometría de flujo es una herramienta eficiente para estudiar la
captación y eflujo de sustancias fluorescentes, tanto en eucariontes como en
procariontes. Quizás la gran ventaja de este método, es que permite la distinción
de subpoblaciones de células. Además, las células pueden ser medidas mientras
están en una solución con el fluorocromo, sin ninguna contribución de
fluorescencia por parte del fluorocromo extracelular. De este modo, la capacidad
de discriminar la fluorescencia intracelular de la extracelular es la principal razón
por la cual la citometría de flujo tiene un rango más dinámico que la medición de
fluorescencia de células en suspensión en cubetas. Los primeros estudios de
permeabilidad bacteriana, se efectuaron con suspensiones celulares en cubetas,
94
donde está tácitamente implicado el hecho de que todas las células, deben ser
esencialmente similares, lo que puede ser groseramente erróneo.
En concordancia con la literatura internacional, la demostración, por
citometría de flujo, de un eflujo a BrEt, tanto en E.coli y S. aureus, es un
parámetro metabólico más a considerar al momento de efectuar estudios de
viabilidad celular, lo que se demuestra claramente y en forma categórica en las
Figuras 37 y 38. Más aún al considerar el efecto que diversas sustancias ejercen
sobre la incorporación de PI, el eflujo a BrEt y la estimación de ∆Ψ.
∆Ψ Si bien, en E.
coli, el uso de CCCP sólo alteró la medición de ∆Ψ y el eflujo a BrEt, este último
sólo en parte, la concentración de CCCP usada fue baja, por lo que su acción, a
pesar de evidenciarse, permitió la recuperación de la población celular completa,
en términos de ∆Ψ y eflujo a BrEt, lo que en conjunto con la incorporación de PI,
permiten definir viabilidad celular en la población analizada.
El compuesto phe arg-b-naphthylamide o MC 207,110, es un inhibidor
activo contra las bombas de eflujo de P. aeruginosa MexAB-OprM, MexCD-OprJ
y MexEF-OprN, así como contra la bomba de eflujo de E. coli, AcrAB (Ribera y
col., 2002; Sánchez y col., 2003 ). Su utilización en los ensayos de eflujo a BrEt,
en E. coli, no evidenciaron acción, lo que permite concluir, en concordancia con la
literatura internacional, que el sistema de eflujo a BrEt no es inhibido por la acción
de MC 207,110.
95
4.7.
Ensayo de eflujo a bromuro de etidio en H. pylori
Como ya se mencionó, en H. pylori, la imposibilidad de lograr evidenciar
tanto la incorporación de PI como de DiOC2(3), necesariamente plantea la
posibilidad de que el fluorocromo no pueda llegar a la célula o bien que éste sea
rápidamente expulsado al exterior. A fin de poder evidenciar esta última
posibilidad, se evaluó el eflujo a BrEt, bajo las mismas condiciones analíticas
usadas en E. coli y S. aureus. Si bien en H. pylori se ha identificado un operón
hefABC (Nº aceso AF059041) (Alm y col., 1999; Poole y col., 2004; Tomb y col.,
1997), no se descrito el producto de ese gen, ni tampoco un sistema de eflujo
similar. Con ninguno de los compuestos utilizados se logró evidenciar algún grado
de marcación ya sea con PI, BrET o DiOC2(3), lo que indicaría que de existir un
sistema de eflujo en H. pylori, este no es inhibido por los compuestos utilizados y
no involucraría a BrEt.
4.8.
∆Ψ en H. pylori
Como una bacteria neutrófila capaz de crecer en el estómago, H. pylori es
único en su capacidad de tolerar ambientes ácidos. Stingl y colaboradores (2002),
demostraron que en presencia de urea y sin ninguna adaptación previa, son
capaces de sobrevivir por varias horas después de un incremento del pH del medio
hasta pH 1.0 (Stingl y col., 2001, 2002), una condición importante y frecuente en
96
el lumen gástrico. A este pH, los organismos acidófilos tendrían un valor de ∆Ψ
positivo en el interior de la membrana (Stingl y col., 2002). Si bien en H. pylori, el
signo y valor de ∆Ψ a un valor de pH extracelular bajo es asunto de debate; se ha
descrito a pH menor a 3.0, un ∆Ψ positivo en el interior, el cual sin embargo no es
sensible a la adición de un ionóforo de protones (Matin y col., 1996). En otros
estudios, el ∆Ψ permanece negativo en el interior de la membrana, con valores de
pH externo menor a 3.0 (Scott y col., 1998). Finalmente hay trabajos que indican
que en presencia de urea, el ∆Ψ permanece negativo en el interior frente a rangos
de pH extracelular entre 1.2 y 7.0 (Stingl y col., 2002). Más aún la adición de urea
a células de H. pylori a un pH extracelular bajo, producen una rápida y
considerable hiperpolarización de la membrana (Scott y col., 1998; Stingl y col.,
2001, 2002), probablemente por extrusión de cationes NH4+ desde el citoplasma.
Se debe recordar que en el citoplasma, el NH3 (un producto de la reacción
catalizada por la ureasa), une protones desde el medio ácido. Esto ocurre por que
todos los procariontes, incluyendo los acidófilos, poseen una membrana
citoplasmática con cierta permeabilidad para protones, removiéndose desde el
citoplasma, los iones NH4+ producidos (Stingl y col., 2001, 2002).
Si el planteamiento de que H. pylori posea un ∆Ψ positivo, a rangos bajos
de pH, es correcto, podría explicar porqué no fue posible marcar con DiOC2(3);
compuesto catiónico y que frente a un teórico ∆Ψ positivo, simplemente no
lograría entrar en la célula. Ahora bien, cabe la posibilidad de que H. pylori
presente un ∆Ψ positivo, no sólo en presencia de un pH ácido, si no que también
97
frente a estresantes del medio en que se encuentra y que estos sean capaces de
alterar en alguna medida la capacidad de intercambio iónico de la membrana
plasmática. A fin de poder evaluar ∆Ψ por citometría de flujo, en H. pylori, se
debiera ensayar la metodología propuesta en presencia de urea y a diferentes
rangos de pH, así como también usando fluorocromos aniónicos como por ejemplo
oxonoles. Entre estos últimos destaca el bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine
oxonol o DiBAC4(3), el cual tiene un alto grado de sensibilidad de voltaje y es
capaz de entrar en células depolarizadas a diferencia de las carbocianinas que
ingresan en células polarizadas (Haugland, 2002; Shapiro, 2003).
Otro factor que podría explicar, en algún grado, el no lograr una marcación
con los fluorocromos usados, es una barrera de impermeabilidad de la membrana
externa de H. pylori. La membrana externa de bacterias Gram negativas, funciona
como una eficiente barrera de permeabilidad, que es capaz de excluir
macromoléculas (como bacteriocinas o enzimas) y sustancias hidrofóbicas
(antibióticos hidrofóbicos).
La propiedad de barrera de permeabilidad de la
membrana externa se debe en gran parte a la presencia del LPS. Ciertos agentes
externos que liberan LPS u otros componentes de la membrana externa o que se
intercalan en la membrana, pueden alterar la integridad de la membrana externa,
con la pérdida de la función de barrera de permeabilidad. Estos agentes llamados
permeabilizantes, incluyen entre otros EDTA, el cual es un quelante de cationes
divalentes que estabilizan las interacciones moleculares en la membrana externa de
tal forma que el LPS es liberado. No se debe descarta que la permeabilización
98
efectuada con EDTA no sea la adecuada para las características de la membrana de
H. pylori, siendo necesario ensayar diversos compuestos alternativos que actúen a
distintos niveles y no sólo como quelantes de calcio.
Finalmente no se debe dejar de considerar la posibilidad, que esta
sorprendente
bacteria
posea
características
estructurales
y
fisiológicas
desconocidas en su membrana citoplasmática y que estas seguirán siendo un
desafío para los estudios fisiológicos, no descartándose más de alguna sorpresa al
respecto, por parte de H. pylori.
99
5.
5.1
CONCLUSIONES
Se desarrolla un método de análisis que permite la estimación de patrones
de tamaño celular de células bacterianas por citometría de flujo.
5.2
En E. coli y S. aureus, la citometría de flujo evalúa exitosamente
viabilidad celular mediante la incorporación de yoduro de propidio, ∆Ψ,
∆Ψ
usando DIOC2(3) y la presencia de eflujo a bromuro de etidio.
5.3
En E. coli y S. aureus, la evaluación por citometría de flujo de la
incorporación de yoduro de propidio, la estimación de ∆Ψ y la presencia
de eflujo a bromuro de etidio, en conjunto se pueden considerar criterios
para definir viabilidad celular
5.4
En H. pylori, bajo las condiciones experimentales ensayadas no fue
factible evaluar viabilidad celular, definida por la incorporación de
yoduro de propidio, ∆Ψ,
∆Ψ usando DIOC2(3) ni evaluar la presencia de
eflujo a bromuro de etidio.
100
6.
6.1.
PROYECCIONES
El desarrollo de una metodología de estimación de patrones de tamaño
celular por citometría de flujo, así como la incorporación de yoduro de
propidio, la estimación de ∆Ψ y la presencia de eflujo a bromuro de
etidio, ya sea en forma individual o en conjunto, tienen una potencial
aplicación en el estudio del efecto que diversas sustancias puedan ejercer
sobre E. coli, S. aureus y H. pylori, aportando información adicional
sobre la acción de estas, en especial en casos donde el desarrollo
bacteriano es escaso (pero suficiente para estudios por citometría de
flujo). Dentro de estas sustancias, no sólo se incluyen antimicrobianos de
uso terapéutico, si no que sustancias como por ejemplo, el resveratrol y
su efecto sobre cepas multiresistentes.
6.2.
Los estudios de incorporación de yoduro de propidio, la estimación de
∆Ψ y la presencia de eflujo a bromuro de etidio realizados en esta
investigación, bajo las condiciones ya definidas, han proporcionado una
valiosa información que permitirá continuar con estos estudios bajo otras
condiciones metodológicas a desarrollar y que impliquen el uso de otros
fluorocromos así como también la búsqueda de otras condiciones de
permeabilización de H. pylori.
6.3.
Este trabajo sienta las bases para el desarrollo de una línea de trabajo
relacionada con la evaluación de la presencia y actividad de sistemas de
101
eflujo en bacterias, desde un punto de vista fisiológico y funcional, lo que
sin duda, permitirá complementar los estudios microbiológicos,
moleculares y epidemiológicos, existentes y actualmente en desarrollo.
6.4.
Una derivación importante de este trabajo, y con clara utilidad clínica, es
el estudio de sistemas de eflujo y resistencia a drogas en células
eucariontes, en especial, células neoplásicas y el fenotipo MDR (Multi
Drug Resistant), particularmente la presencia y actividad de eflujo de la
glicoproteína p (DIOC2(3) es sustrato de la glicoproteína p).
6.5.
El estudio integral de viabilidad celular en E. coli y S. aureus
considerando la incorporación de yoduro de propidio, la estimación de
∆Ψ y la presencia de eflujo a bromuro de etidio por citometría de flujo,
realizado en esta investigación, es hasta donde se tiene conocimiento,
pionero en nuestro país, por lo que debiera fomentar el uso de la
citometría de flujo en estudios de microbiológicos y en especial
bacteriológicos.
102
7.
Adquisición
GLOSARIO
: Proceso durante el cual las células están
siendo analizadas en el citómetro de flujo, y
se registra la información referente a cada
una de ellas. El tiempo que dura la
adquisición dependerá de la concentración
celular de la suspensión celular usada y del
número total de células definido para el
análisis en particular.
Amplificador
: Componente electrónico de un citómetro de
flujo que incrementa la señal en función de
un factor ajustable.
Archivo de datos
: Un archivo que contiene datos en modo de
lista.
BrEt
: Bromuro de etidio
Calibración
: Ajustes automático o manuales de los
controles electrónicos de un citómetro de
flujo,
para
un
análisis
consistente
y
103
reproducible.
Canal
: El
valor
medido
de
un
parámetro,
representando la intensidad de señal de un
evento después de amplificarlo. Para ser
graficado, los datos para un evento deben
estar incluidos en un canal dentro de 256
canales (0-255) o en un canal dentro de 1024
(0-1023)
canales,
dependiendo
de
la
resolución del gráfico.
Compensación
: Un cálculo electrónico que remueve la
superposición de señales y que el sistema
óptico no puede remover. La compensación
de fluorescencias trabaja para específicos de
parámetros fluorescentes, como por ejemplo
FL1 Y FL2.
DiOC2(3)
: 3,3`-dietiloxacarbocianina iodada
Escala
: El número máximo de eventos mostrados por
canal, en un histograma. Un número bajo de
escala, magnifica los datos.
Escala lineal
: Desde el punto de vista electrónico, es aquella
104
en que la salida es directamente proporcional
a la entrada. Cuando el control se posiciona
en
lineal,
la
medición
de
voltaje
es
directamente proporcional al canal en el cual
evento cae.
Escala logarítmica
: Aquella en la cual los valores aumentan
logarítmicamente.
Se
usa
cuando
el
instrumento se posiciona en LOG. Existen
cuatro décadas a través de los 1024 canales
de un FACSCalibur (256 canales por
década). La escala fluctúa entre 1 a 10.000.
Para el FACSCalibur, el número de décadas
es fijo.
Evento
: Una unidad de datos representando una
partícula o célula. Un evento tiene un valor
de intensidad relativa y un número de canal
por cada parámetro.
Filtro
: Artículo
óptico
usado
para
detener
longitudes de onda en particular, mientras
deja pasar otras.
105
FL1
: Señal de fluorescencia verde recibida por el
tubo fotomultiplicador (PMT), FL1. El rango
de señal detectado es dependiente de los
filtros asociados con el fotomultiplicador.
Para citómetro FACSCalibur, FL1 mide luz
en rango verde del espectro (515 a 545 nm).
FL2
: Señal de fluorescencia roja recibida por el
tubo fotomultiplicador (PMT), FL2. Para
citómetro FACSCalibur, FL2 mide luz en
rango verde-naranjo del espectro (564 a 606
nm).
FL3
: Señal de fluorescencia roja recibida por el
tubo fotomultiplicador (PMT), FL3. Para
citómetro FACSCalibur, FL3 mide luz en
rango rojo del espectro (sobre 670 nm).
Fluorescencia
: Una propiedad de las moléculas de absorber
luz a una longitud de onda y emitir luz a una
longitud de onda mayor. Un citómetro de
flujo detecta la emisión de fluorescencia en
un ángulo de 90 grados respecto de la fuente
de excitación.
106
Forward Scatter (FSC)
: Parámetro que mide la luz desviada por las
células en menos de 10 grados respecto de la
luz láser. FSC se relaciona con el tamaño
celular.
Fotodiodo
: Un elemento semiconductor usado para
detectar
luz
y
generar
una
corriente
eléctrica. Típicamente se usa en la detección
de FSC.
Fotomultiplicador (PMT)
: Un fotodetector con voltaje ajustable, que
traduce la señal óptica en una corriente
eléctrica. Los detectores PMT son usados
para SSC y los parámetros de fluorescencia.
Aumentando el voltaje del PMT, se aumenta
la señal de salida para una cantidad de luz
dada.
Ganancia
: Un ajuste que modifica la respuesta del
amplificador.
Aumentando
la
ganancia
aumenta el pulso electrónico (y el valor de
intensidad de fluorescencia relativa y el valor
del canal) en respuesta a una señal de luz.
107
Gate
: Un límite que define una porción o una sub
población de eventos. Las gates se establecen
al dibujar los límites alrededor de los datos
en un gráfico. Las gates se usan tanto en
adquisición como en análisis.
Gating
: El proceso de dibujar una gate en un gráfico
de puntos o en un histograma, con el mouse o
con las teclas del teclado.
Histograma
: Un gráfico que representa datos de un solo
parámetro correspondiendo a valores de
intensidad de fluorescencia relativa o a
valores de canales.
Marker
: Una
línea
histograma
separando
y
que
son
regiones
en
un
estadísticamente
tratadas por separado.
Muestra de referencia
: Una muestra con características conocidas y
que se usa como estándar.
Parámetro
: Una medida de intensidad de luz, desviada o
de fluorescencia emitida, por una partícula
cuando pasa a través del láser. Para los cinco
108
parámetros (FSC, SSC, FL-1, FL-2 y FL-3),
se usa el alto del pulso electrónico generado.
PBS
: Buffer fosfato salino
Pulso
: Señal electrónica generada por una partícula
(célula o núcleo) en un citómetro de flujo.
Rate
: El
número
de
eventos
por
segundo,
analizados por un citómetro de flujo, que son
procesado por el computador.
Side Scatter (SSC)
: También llamada 90º scatter, right angle
scatter o dispersión lateral de la luz, la cual
es desviada en un ángulo de 90º cuando la
célula pasa a través del rayo láser. Esta
medida se relaciona con la granularidad o
complejidad interna de una partícula.
Umbral de detección
: Conocido como threshold. Es el número más
bajo
de
canal
para
un
parámetro
seleccionado, para el cual un evento puede
ser grabado. El citómetro de flujo envía al
computador, sólo eventos sobre el nivel de
threshold.
109
9.
SOLUCIONES
PBS
:
•
•
•
•
•
NaCl (7.650 g)
Na2HPO4 anhidrido (0.724 g)
KH2PO4 (0.210 g)
Disolver en H2O, ajustar pH a 7.4
Llevar a 1 litro de H20
PBS-EDTA
:
•
•
•
•
10 mM TRIS (0.1211 g)
1 mM EDTA disódico (0.3722 g)
10 mM Glucosa (0.0198 g)
Llevar a 100 ml de PBS, pH 7.4
110
9.
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