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CITOMETRIA DE FLUJO: Generalidades. Microbiología. Fenotipo T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N. Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda. Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador, Concepción, Chile. Genotipo www.oncoinmun.co.cl Caracterización fenotípica Microscopio óptico Microscopio electrónico Microscopio epifluorescencia Anticuerpos ELISA Citometría de Flujo Southern blot Northen blot Western blot PCR Caracterización genotípica Utilidad clínica ¿Qué es la Citometría de Flujo? ¿QUE ES LA CITO / METRIA DE FLUJO? La Citometría de Flujo es una tecnología que permite la “medición simultánea de múltiples características físicas y químicas de células en suspensión” Gucker - 1947 • Desarrolló un citómetro de flujo para la detección de bacterias en aerosoles. • Trabajo hecho duante la Segunda Guerra Mundial: • MATERIAL CLASIFICADO. • Objetivo: • Identificación rápida de bacterias y esporas aerotransportadas, usadas en guerra biológica ¿QUE INFORMACION ENTREGA UN CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA CELULA? 1.- Su tamaño. 2.- Su granularidad o complejidad interna. 3.- Evaluación de características químicas: • Fluorocromos • Anticuerpos conjugados con fluorocromos FACS: Fluorescence activated cell sorter Flow Cell Relative Sizes of Biologicals 1 µm Injector Tip Sheath fluid S.aureus 5-8 µm 15-30 µm Lymphocyte Fluorescence signals Amoeba Focused laser beam FLUOROCROMOS Propidium Iodide Emisson Excitation 300 nm 500 nm 500 nm 600 nm 600 nm R el at i ve I nt ensi t y 400 nm 400 nm DNA 700 nm 700 nm Hybridoma Fluorescein (FITC) Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 500 nm 600 nm 600 nm 700 nm 1975 Kohler and Milstein Multiple myeloma (human disease) Fusions generated by Sendai virus or PEG 700 nm R el at i ve I nt ensi t y 400 nm Wavelength Protein Bence Jones proteins in urine http://www.immunecentral.com/images/immune_series/immune29.gif ANTICUERPOS MONOCLONALES •Gran disponibilidad comercial •Gran variedad de fluorocromos •Precios accesibles •Pedidos vía Internet •Gran Calidad Flow Cytometry Optics PMT 4 Flow cell Dichroic Filters PMT 3 PMT 2 Bandpass Filters PMT 1 Laser BD VantageSE DiVa option DakoCytomation MoFlo Partec PPCS Union Biometrica COPAS BD FACSCalibur Beckman Coulter Epics Altra Hypersort BD FACSAria FORMA DE PRESENTACION DE DATOS • Histograma • Gráfico de Puntos (Dot Plot) • Gráfico de Contorno (Countour Plot) • Gráfico Isométrico (3D) • Gráfico de Densidad (Density Plot) CITOMETRIA DE FLUJO: APLICACIONES • • • • • • Hematología Inmunología Patología Transplantes Farmacología Biología • • • • • • Toxicología Microbiología Parasitología Citogenética Virología ........... Citometría de flujo: mediciones “GATE” SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN G M L CITOMETRIA DE FLUJO: Aplicaciones Clínicas más Frecuentes • Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias • Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas • Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular • Cuantificación de moléculas • Estudio de HLA-B27 • Estudio de Células Progenitoras (CD34) • Estudios de Función Plaquetaria • Estudios de Resistencia a Drogas • Estudio de Función Neutrofílica • Estudio de Citokinas Intracelulares Aplicaciones en Microbiología clínica ¿ Aplicaciones en Microbiología? Detección directa: • Bacterias • Hongos • Parásitos • Virus Light Scatter of Bacterial Spores B.anthracis SS B.subtilis irradiated B.anthracis FS Light scatter signals from a mixture of live B.anthracis spores, live B. subtilis spores and gamma irradiated B. anthracis spores. Detección Directa de Bacterias • Uso de anticuerpos: • Identificación de patógenos • No es necesario el cultivo • Método rápido • Usado en: • Haemophilus sp. • Salmonella sp • Mycobacterium sp. • Brucella sp. • Branhamella catarrhalis Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 J. Bacteriol 1996;178:7254-7259 Infect. Immun. 1995;63:3945-3952 Infect. Immun. 1997;65:2668-2675 Cytometry 1997;28:90-95 • • • • • Mycoplasma pneumoniae Pseudomona sp. Bacteroides fragilis Legionella pneumophila Bacillus sp. Detección Directa de Hongos A • Candida albicans • Acs. Conjugados B • Uso de anticuerpos A-B: Control (-) • Onicomicosis: C-D: Con Acs. • Pierard et al., 1996: C • Demostraron infecciones mixtas. D • Serotipificación de Candida sp. Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 J. Clin. Microbiol. 1995;34:2106-2112 Infect. Immun. 1997;65:4100-4107 Detección Directa de Parásitos • Plasmodium: • Marcar ADN del Parásito • Ag del parásito expresados en eritrocitos. • Viabilidad del parásito fagocitado. Intensidad de fluorescencia verde (Log) J. Clin. Microbiol. 1995;34:2106-2112 Detección Directa de Virus • • • • Detección de Ag. virales. Cuantificación de Ag. Virales. Detección de ácidos nucleicos virales. Cuantificación de ácidos nucleicos virales • Giardiasis: • Análisis rápido • Alta sensibilidad • Gran Número de muestras Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 J. Immunol. Methods. 1995;179:1-12 J. Immunol. Methods. 1997;202:27-33 Cytometry 1997;27:84-91 En células eucariontes infectadas Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 Diagnóstico Serológico por Citometría de Flujo. Bacterias: Uso de Microesferas (beads) * Ag + bead + Suero paciente * Anti Ig humana conjugada * Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 J. Clin. Microbiol.. 1998;36:802-806 Cytometry 1994;18:103-108 Diagnóstico Serológico por Citometría de Flujo. Hongos: • Intentos desde 1984, pero no plenamente validados Parásitos: • Trypanosoma cruzi • Toxoplasma gondii Virus: • CMV • HSV-1, HSV-2 • HCV • HIV-1, HIV-2 Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 Diagnóstico Serológico por Citometría de Flujo. Bacterias: Uso de Microesferas (beads) • Ensayo en corto tiempo • Escelente sensibilidad • Detección de múltiples Ac: • Microesfereas de diferente tamaño • Aplicado: • Brucella abortus • Staphylococcus aureus • Helicobacter pylori • Clostridium sp. • Bacillus sp. Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 J. Clin. Microbiol.. 1998;36:802-806 Cytometry 1994;18:103-108 Antimicrobianos, Pruebas de Susceptibilidad y Citometría de Flujo • Primeras pruebas datan de 1980 • En los 90 aumenta significativamente los reportes internacionales sobre respuesta microbiana frente a antimicrobianos. • Se pueden estudiar POBLACIONES microbianas: • Viabilidad individual y poblacional • Capacidad funcional: • Vias metabólicas • Potencial de membrana • Resultado en pocas horas Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 Cytometry 1982;2:392-395249-257 Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 Agentes antibacterianos: • Microbiología tadicional (18-24 horas) • Citometría de flujo (pocas horas) • Evaluación de parámetros metábolicos: • Potencial de membrana • Tamaño celular • Cantidad de ADN • Pruebas de suceptibilidad: Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 http://cmr.asm.org/ • Efecto bacteriostático • Efecto bactericida Susceptibilidad bacteriana: FSC/SSC Susceptibilidad bacteriana Combinación de: • Tamaño (FSC) • Granularidad (SSC) • Fluorescencia: • Fluorocromos para ADN y ARN • Fluorocromos para ensayos metabólicos: • Unión a proteínas • Potencial de membrana Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 Cytometry 1997;27:169-178 Universidad de Concepción, Chile Hospital del Trabajador Concepción, Chile Susceptibilidad bacteriana: FSC/SSC + proteínas (FITC) In vitro STUDIES OF pH EFFECT UPON MEMBRANE COMPONENTS, SHAPE AND SIZE OF Helicobacter pylori: EPIFLUORESCENCE AND FLOW CYTOMETRY STUDIES. pH 3 pH 3 pH 7 pH 7 pH 10 pH 10 Strain ATCC43504 Strain 747 LO-Skolen, Helsingør, Denmark, July 4-7, 2002 Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 Gradiente electroquímico de protones (membrana interna) Bacterias aeróbicas Susceptibilidad bacteriana Combinación de: • Egreso de protones • Ingreso de electrones • Tamaño (FSC) • Granularidad (SSC) • Fluorescencia: • Fluorocromos para ADN y ARN Fuerza protón motriz Ingreso / Egreso de solutos Gradiente eléctrico • Fluorocromos para ensayos metabólicos: • Unión a proteínas Interior negativo • Potencial de membrana -100 a -200 mV Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 Cytometry 1997;27:169-178 Potencial de membrana Involucrado • Autolisis bacteriana • Transporte de glucosa • Quimiotaxis Bacterias Potencial de membrana J Exp Biol 2000:203;51-59 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43;223-226 Agentes antibacterianos Hiperpolarización Depolarización Disminución Daño membrana Aumento Depolarización Hiperpolarización Colapso de potencial de membrana Se reduce a cero Ionóforos J Exp Biol 2000:203;51-59 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43;223-226 Potencial de Membrana Muerte celular Puede ser medido efectivamente por citometría de flujo Potencial de membrana Citometría de Flujo Compuestos para ensayos Potenciométricos Eucariontes Célula Procariontes Organelos (mitocondria) Compuestos para ensayos Potenciométricos DiOC2(3) (488 nm) Carbocianinas (slow response probes) •Fluorescencia verde: • Se altera con el tamaño celular y presencia de agregados. • Es independiente del PM • Fluorescencia roja: • Dependiente del tamaño y del PM •Razón F. roja / F. verde: • Medida de PM Independiente del tamaño DiOC2(3): (3,3´-dietiloxacarbocianina iodada Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43;223-226 Handbook of fluorescent probes, 2002. (www.probes.com) Handbook of fluorescent probes, 2002. (www.probes.com) Mycobacterias: Susceptibilidad por citometría de flujo • S. aureus • Uso de diacetato de fluoresceina (DAF) • Depolarización en 1 hora. • Potencial demembrana permanece disminuido. Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Molécula no fluorescente Molécula fluorescente Esterasas citoplasmáticas Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 J. Clin. Microbiol. 1996;34:1386-1390 CITOMETRIA DE FLUJO: Generalidades. Microbiología. T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N. Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda. Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador, Concepción, Chile. www.oncoinmun.co.cl
