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UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS
CARRERA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS II
Profesor: Ing. M. Sc. Mario Paredes
Ayudante: Gabriela Vinueza
Semestre: Cuarto
Práctica:
2
TEMA: “SIEMBRA EN PLACA SOBRE MEDIOS SELECTIVOS”
1. INTRODUCCIÓN
A partir de una mezcla de microorganismos, se puede seleccionar una especie, eligiendo un medio selectivo
inhibidor adecuado. El medio agar-fluconazol permite la selección represiva de microorganismos procedente
de una muestra de zumo fermentado, mientras que los agares Azida y EAM permiten seleccionar bacterias
de tipo fecal.
2. OBJETIVOS
2.1.
Sembrar en placa sobre medios selectivos con el fin de aislar bacterias de tipos diferentes.
2.2.
Emplear antibióticos en un medio selectivo que permita el crecimiento de microorganismos fúngicos.
3. MATERIALES, REACTIVOS Y MUESTRAS
- Erlenmeyer 125 ml
- Pipetas de 1 y 10 ml
- Cajas Petri estériles
- Cocineta
- Incubadoras a 37 y 30ºC
- Agar Actidiona
- Agar EAM
- Muestra de librillo y/o visceras
crudas sin lavar.
-
Erlenmeyer 500 ml
Vasos de precipitación
Varillas de agitación
Autoclave
Microscopios
Agar Azida Sódica
Muestras de jugos de frutas
fermentados.
- Fluconazol
4. PROCEDIMIENTO
4.1.
AGAR FLUCONAZOL: Preparación para 1 litro.
Extracto de carne
3.00 g
Peptona
5.00 g
Glucosa
5.00 g
Fluconazol
0.03 g
Agar
15.00 g
Agua
1000 ml
Esterilizar el medio a 121ºC por 15 min. Y enfriarlo a 45ºC.
Nota: El fluconazol en este caso reemplazará a la actidiona.
-
Sembrar por el método de estría una caja con agar sin incluir el fluconazol y una caja añadida el
fluconazol con una muestra de jugo de fruta fermentado.
-
4.2.
Incubar a 30ºC, reporte las diferencias entre las placas. Observe el crecimiento del hongo que se
extiende sobre la placa que no contiene fluconazol y las interferencias que se producen para el
aislamiento de colonias bacterianas.
AGAR AZIDA SÓDICA Y AGAR EOSINA AZUL DE METILENO: Preparación para 1 litro.
AGAR AZIDA SÓDICA
AGAR EAM
5.0 g
Peptona
10.00 g
Triptona
10.0 g
Lactosa
5.00 g
K2HPO4
5.0 g
Sacarosa
5.00 g
Glucosa
1.0 g
K2HPO4
2.00 g
15.0 g
Eosina
0.40 g
Azul de metileno
0.06 g
Agar
15.0 g
Extracto de levadura
Agar
Azida sódica
0.2 g
IMPORTANTE:
→ La Azida Sódica es un veneno para los sistemas que contienen hierro, es decir cumple el papel de un
quelante. Los m/o que no tienen estos sistemas son relativamente resistentes a esta sustancia. El agar
EAM es un medio selectivo y a la vez diferencial, selectivo porque va a aislar especies del tipo Gram (-)
por ejemplo E. coli que son más tolerantes al complejo eosina/ azul de metileno que las especies Gram
(+). El medio es diferencial porque a la presencia de la lactosa, van a encontrarse especies que
fermenten esta última apareciendo pigmentadas y presentando un aspecto metálico, en cambio las
colonias que no fermentan a la lactosa son incoloras. (En el EAM se desarrollarán E. coli y Aerobacter
aerogenes).
→ Usando la técnica de dilución del inóculo, siembre la muestra del librillo y/o vísceras en las plaquetas con
ambos medios.
→ Incube a 37ºC por dos días, observe las grandes diferencias entre las colonias que se han desarrollado
en los medios.
RESIEMBRA:
→ Con una asa recoger muestra de dos colonias puntiformes de la placa Azida Sódica y dos colonias
típicas (ver tabla 49-1 en la hoja anexa) de la placa EAM.
→ Sembrar en cuatro tubos de medio Triptona / Extracto de levadura.
→ Incubar los tubos a 37ºC.
→ Efectúe tinciones de Gram y observar la morfología de los cultivos desarrollados en los dos medios.
5. RESULTADOS
- Detalle las principales características que presentan los cultivos.
- Presentar las gráficas de las observaciones macro y microscópicas.
6. CUESTIONARIO
6.1.
Qué es un medio selectivo y qué es un medio diferencial?
6.2.
Porqué el Agar Eosina Azul de Metileno es un medio diferencial y selectivo? Cómo actúa?
6.3.
Explique el modo de acción de los siguientes antibióticos:
6.3.1. Fluconazol.
6.3.2. Nystatin.
6.3.3. Rifampicina
6.3.4. Sulfato de Estreptomicina
6.3.5. Cloramfenicol
7. BIBLIOGRAFÍA
MADIGAN, M.; MARTINKO, J. & PARKER, J., 2004, Biología de los Microorganismos. Décima Edición. Pearson Prentice Hall, España.
PELCZAR, M., 1995. Microbiología. Segunda Edición. Ed. Mc Graw Hill. New York.
SEELEY, H., 1973, Microbios en acción. Primera edición. Editorial Blume,España.