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CURSO:
CENTRO:
ESTUDIOS:
ASIGNATURA:
CÓDIGO:
CICLO:
CURSO:
CUATRIMESTRE:
CARÁCTER:
CRÉD. TEÓ.:
CRÉD. PRÁC.:
2008/09
FAC. CC. EXPERIMENTALES
LICENCIADO EN QUÍMICAS-2000
QUÍMICA FÍSICA DE MACROMOLÉCULAS BIOLÓGICAS
5008312
2º
OPT
II
OPTATIVA
4,50
3,00
ÁREA:
QUIMICA FISICA
DEPARTAMENTO: QUIMICA FISICA, BIOQUIMICA Y QUIMICA INORGANICA
DESCRIPTORES:
DINÁMICA, ESTRUCTURA Y TERMODINÁMICA DE PROTEINAS. TÉCNICAS
QUÍMICO-FÍSICAS APLICADAS AL ESTUDIO DE PROTEÍNAS.
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TEMARIO DE TEORÍA
Lección 1: Introducción. Introducción histórica de la Química Física Biológica.. Objeto y metodología de la
Química Física Biológica.
Lección 2 : Fuerzas intermoleculares en macromoléculas biológicas
Interacciones de Van der Waals. Interacciones electrostáticas. Enlace de hidrógeno. El agua y las interacciones
hidrofóbicas.
Lección 3: Estructura de proteínas
Propiedades químico físicas de los aminoácidos. El enlace peptídico. Estructura de las proteínas.
Lección 4 : Estructura de los ácidos nucleicos
Propiedades químico físicas de los nucleótidos. Estructura de los ácidos nucleicos.
Lección 5 : Estructura de las membranas biológicas
Propiedades químico físicas de los lípidos. Modelos estructurales de biomembranas. Estructura de las proteínas de
membrana.
Lección 6: Termodinámica de las disoluciones de macromoléculas
Características de las disoluciones de macromoléculas biológicas. Entropía conformacional de mezcla. Teoría de
Flory – Huggins y de Flory - Krigbaum.
Lección 7 : Estadística conformacional de macromoléculas
Introducción al análisis conformacional. Dimensiones del ovillo estadístico. Modelos.
Lección 8: Equilibrio conformacional en proteínas y ácidos nucleicos.
Introducción. Modelos. Plegamiento reversible de proteínas. Cambios conformacionales en el ADN natural.
Lección 9: Equilibrio macromolécula – ligando.
Conceptos básicos. Unión a sitios iguales e independientes. Unión a sitios distintos e independientes.
Cooperatividad y modelos alostéricos
Lección 10: Termodinámica de procesos irreversibles.
Introducción. Flujos, fuerzas y producción de entropía. Ecuaciones constitutivas. Coeficiente fenomenológicos.
Relaciones de Onsager. Estados estacionarios : El principio de mínima producción de entropía.
Lección 11 : Las macromoléculas biológicas como partículas hidrodinámicas. Métodos hidrodinámicos.
Volúmenes macromoleculares e hidratación. Coeficientes de fricción y forma de la macromolécula. Difusión.
Sedimentación. Viscosidad. Electroforesis.
Lección 12: Espectroscopia
Espectroscopía de absorción ultravioleta – visible. Fluorescencia. Espectroscopia infrarroja. Discroismo circular
y dispersión óptica rotatoria. Dispersión elástica de la luz. Microscopía electrónica. Difracción de Rayos X.
Resonancia magnética nuclear.
TEMARIO DE PRÁCTICAS
Práctica 1: METODOLOGIA BASICA
Se trata no de una práctica en sí, sino de una iniciación al laboratorio específico de esta asignatura. En
ella se expondrán una serie de metodologías básicas.
Manipulación de muestras biológicas:
• Preparación de las muestras:
- Diálisis
- Cromatografía de exclusión molecular
- Concentración de las muestras de macromolécula
- Centrifugación
• Medidas de la concentración
- Proteínas
- Ácidos nucleicos
Instrucciones de los aparatos
• Espectrofotómetro
• Centrífugas
• Cubetas y fuentes de electroforesis
Utilización de medios informáticos
• Búsqueda de información en bases de datos informatizadas
• Uso de programas de cálculo para el análisis de los datos
• Uso de programas de gráficos para representación de los resultados
Práctica 2: VISUALIZACIÓN DE LA DESNATURALIZACION DE UNA PROTEINA
En esta proteína se determinará la diferente accesibilidad al medio de los aminoácidos de una proteína
en estado nativo y desnaturalizado. Para ello se determinará el número de grupos sulfhidrilo expuestos al medio
en las dos conformaciones. Para realizar la práctica se utilizarán la glucógeno fosforilasa de músculo, que se
encuentra disponible comercialmente. La enzima contiene 9 grupos sulfhidrilo de los cuales cuatros son
accesibles al medio en su estado nativo. Para desnaturalizar la proteína se utilizará el detergente lauril sulfato
sódico (SDS) y para la determinación de los grupos sulfhidrilo el reactivo de Ellman (DTNB).
Al comenzar la práctica es necesario un tratamiento previo de la enzima con βmercaptoetanol para
reducir los grupos sulfhidrilo posiblemente oxidados durante el almacenamiento de la misma. Dado que este
reactivo es un tiol, reaccionará también con el DTNB, por lo que es necesario su eliminación del medio antes de
proceder a las medidas de los grupos sulfhidrilo. Para ello se utilizará una columna de exclusión molecular. La
proteína de la columna (libre de mercaptanos) se ensaya en presencia y ausencia de SDS, mediante adición de
una exceso de DTNB y midiendo la absorbancia a 412 nm al cabo de una hora (tiempo para asegurar la que la
reacción es casi completa en el caso de la reacción en estado nativo). La absorbancia se relaciona la cantidad de
anión libre 2-nitro-5-tiobenzoato que se produce en la reacción del DTNB con las cisteinas presentes en la
proteína, que procede mol a mol, lo que permite cuantificar las cisteinas que han reaccionado en condiciones
nativas y desnaturalizantes.
En una segunda parte de la práctica el alumno comprobará la presencia de estas cisteinas en la
secuencia de la fosforilasa utilizando cualquiera de las estructuras de la misma depositadas en la base de datos
del PDB (Protein Data Bank) que pueden descargar en el ordenador a través de Internet. Comprobaran cuales
son las cisteinas accesibles analizando la estructura de la proteína con el programa RasMol.
El contenido básico de esta práctica se encuentra publicado en: “Visualitation of protein denaturation
by chemical modification of sulfhydryl groups” Parody-Morreale A. and Barón, C.. Journal of Chemical
Education, Vol 63, 1003-4, 1986.
Práctica 3: CRISTALIZACIÓN DE PROTEINAS PARA
ESTRUCTURA MEDIANTE DIFRACCIÓN DE RAYOS X
LA
DETERMINACIÓN
DE
SU
En esta práctica se levará a cabo la cristalización de varias proteínas mediante los métodos más usuales
en la cristalización de macromoléculas biológicas. A partir de datos experimentales reales del patrón de
difracción de la lisozima se llevará a cabo una simulación del proceso de determinación de la estructura de esta
proteína mediante la técnica de reemplazamiento molecular.
Se le enseñara al alumno el uso de base de datos de estructuras de macromoléculas biológicas como son
las direcciones web:
http://www.rcsb.org/pdb/
http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/pdbsum/
Práctica 4: MEDIDA DE LA CONSTANTE DE UNION DE UN LIGANDO A UNA PROTEINA
Para esta práctica utilizaremos la proteína aspartato - glutamato transaminasa (GOT) y como ligando el
succinato y el cloruro. Estos ligandos no son el sustrato de la proteína sino que se trata de un inhibidor y un
anión que se unen al sitio catalítico de la enzima. En este se encuentra también localizado el cofactor fosfato de
pidiroxal (PLP), el cual presenta un espectro UV-visible característico que depende del pH. Así, el PLP unido a
la enzima presenta un máximo de absorción en pHs ácidos a 430nm, y de 360nm en pHs básicos. Estos cambios
en función del pH se atribuyen a la protonación del grupo amino que aparece en la base de Schiff enzima - PLP,
que presenta un pK de 5,4. Pero este pK se ve afectado por la presencia en el sitio activo de cloruros (pK=6,3) y
succinato (pK=8,1). Si llevamos a cabo la adición de ión succinato a una disolución de enzima de pH 7,2 con
una concentración constante de cloruros, podremos seguir espectrofotométricamente la unión del succinato
midiendo el aumento de absorbancia a 430nm.
Cada grupo de alumnos realizarán la práctica a una concentración diferente de cloruros. Esto nos
permitirá disponer de datos de la unión del succinato a varias concentraciones de cloruros, lo que ampliará las
posibilidades del análisis de los datos obtenidos en esta práctica. En este el alumno deberá relacionar los valores
de absorbancia medidos con el parámetro de unión. Se proporcionará el alumno la información bibliográfica
necesaria para el análisis como la masa molecular de la enzima, su coeficiente de extinción molar, el estado de
agregación,.... Para el análisis de los datos se le indicará al alumno que realice varias representaciones gráficas
(curva de saturación, doble reciproca, Scatchard, Hill) y que obtenga el valor de la constante aparente al que se
llega a partir de cada una de ellas. Los resultados obtenidos deben ser expresados de forma crítica, observando
las coincidencias o discrepancias en el valor de la constante obtenida por uno u otro procedimiento gráfico, y
que información nos proporciona cada una de estas gráficas. Una vez analizados los datos individuales de
constantes aparentes de unión de succinato a una concentración dada de cloruros, se pasara a recopilar los datos
obtenidos por otros grupos para otras concentraciones de cloruros en el medio y se calculará la constante de
unión de este ion a la enzima y la constante de unión de succinato en ausencia de cloruros.
Para finalizar la práctica los alumnos compararán los resultados obtenidos con los de la bibliografía.
Esta práctica está basada en la publicada en: “Spectrophotometric Determination of the Binding Constants of
Succinate and Chloride to Glutamic Oxalacetic Transaminase” Parody-Morreale A, Camara-Artigas A. And
Sánchez-Ruiz JM, Journal of Chemical Education, Vol 67, 988-990, 1990.
Práctica 5: DESNATURALIZACION DE PROTEINAS EN PRESENCIA DE AGENTES QUÍMICOS
En esta práctica utilizaremos la fluorescencia como técnica para seguir la desnaturalización de una
proteína, la lisozima, en presencia de una agente desnaturalizante químico, el cloruro de guanidinio.
Para
realizar esta práctica se prepararan muestras que contengan la misma concentración final de proteína
(aproximadamente de 20 μg/mL) y distintas concentraciones de cloruro de guanidinio en el intervalo de 0 a 5 M
en un tampón acético - acetato sódico 50 mM a pH 5. Las muestras se dejaran incubando a temperatura ambiente
durante 24 horas, tras las cuales se procede a la medida de la intensidad de fluorescencia característica de los
triptofanos presentes en las proteínas. Para la excitación utilizaremos una longitud de onda de 280 nm y se
registrará el espectro de emisión de fluorescencia en el intervalo 300-450 nm. De la variación de la intensidad de
fluorescencia a 350 nm se calcula la fracción de proteína desnaturalizada en función de la concentración de
agente desnaturalizante. El análisis de estos datos nos permite obtener la constante de equilibrio y el cambio de
energía libre de Gibbs para el proceso de desnaturalización. Los datos obtenidos se compararan con los de la
bibliografía.
La práctica esta diseñada con los datos publicados en: “A Model-Independent, Nonlinear Extrapolation
Procedure for the Characterization of Protein Folding from Solvent-Denaturation Data” Ibarra-Molero B. And
Sánchez-Ruiz J.M., Vol 35, 14689-14702; “Are There Equilibrium Intermediate States in the Urea-Induced
Unfolding of Hen Egg-White Lysozyme? ” Ibarra-Molero B. And Sánchez-Ruiz J.M., Vol 36, 9616-9624.
Práctica 6: ENZIMAS REGULADAS ALOSTÉRICAMENTE Y COVALENTEMENTE. MODELO DE
MWC.
En esta práctica se utiliza una enzima regulada alostéricamente y covalentemente, la glucógeno
fosforilasa, que se ha utilizado como modelo clásico para explicar tanto un tipo como otro de regulación. Esta
enzima presenta regulación alostérica por parte del AMP (5’adenosin monofosfato) y covalente por
fosforilación de un resto serina, catalizada por la enzima fosforilasa quinasa.
En la práctica se mide la actividad de la enzima utilizando la reacción catalizada en el sentido inverso al
que tiene lugar in vivo, es decir en el sentido de síntesis de glucógeno a partir de glucosa-1-fosfato
GLUCOGENOn-1 + GLUCOSA - 1 - P ⇔ GLUCOGENOn + Pi
La actividad se mide a partir del fosfato liberado en la reacción mediante el método de Fiske Subbarow.
Se realizan ensayos de actividad con la forma b de la enzima, que es la no fosforilada y por tanto no es
activa per se, a varias concentraciones de sustrato (Glucosa-1-Fosfato) y de activador AMP. Para la
interpretación de los resultados se aplicará el modelo de Monod-Wyman-Changeaux.
BIBLIOGRAFÍA
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CRITERIOS DE EVALUACIÓN