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Cátedra de Quimica Biológica
Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales
Universidad Nacional de Córdoba
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INDICE
DOCENTES ....................................................... 4 PROGRAMA ANALITICO de Química Biológica . 5 PROGRAMA SINTÉTICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA TEORICO‐PRACTICOS TRABAJOS PRACTICOS OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA. BIBLIOGRAFIA 8 9 9 9 9 PARTE PRÁCTICA I: Purificacion de fosfatasa ácida de hígado de rata ............................................. 41 OBJETIVOS: 41 Purificación de fosfatasa ácida de hígado de rata: 42 BIBLIOGRAFÍA ESPECIFICA (Purificación de Proteínas) 43 TRABAJO PRACTICO Nº 5 ............................... 44 CRONOGRAMA 2014 ...................................... 11 PURIFICACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS III ....................... 44 TRABAJO PRACTICO Nº 1 ............................... 19 PARTE PRÁCTICA II: Cuantificación de fosfatasa ácida ................................................................ 44 OBJETIVOS 44 MATERIALES Y MÉTODOS 44 Experimento nº1: 44 ACTIVIDADES 12 EVALUACIONES 12 CONDICIONES PARA LA REGULARIZACIÓN 12 MÉTODOS DE ANÁLISIS QUÍMICO: ESPECTROFOTOMETRÍA .................................... 19 OBJETIVOS: 19 TEMAS PARA REPASAR: 19 Cuantificacióin de proteínas totales: Método de 44 Biuret Sistema de Incubación 44 Experimento nº2 : 44 Determinación de la Actividad enzimática 44 RESULTADOS 45 Cuantificación de Proteínas 45 Actividad Enzimática 45 Tabla de Purificación 45 BIBLIOGRAFÍA 45 PROPIEDADES DE LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS QUÍMICO
19 ERRORES EN LAS MEDICIONES DE LABORATORIO 19 ESPECTROFOTOMETRÍA 20 Generalidades 20 Espectro de Radiación Electromagnética 21 LEYES DE LA ABSORCIóN 22 Desviaciones de la Ley de Lambert y Beer 23 TRABAJO PRÁCTICO Nº 6 ............................... 46 Espectrofotometría: Análisis cuantitativo 24 Determinación de la concentración de soluto en CINÉTICA ENZIMÁTICA I .................................... 46 24 una disolución OBJETIVOS 46 Curva de Calibración 24 CONCEPTOS TEÓRICOS 46 Espectrofotometría: Análisis cualitativo 25 Modelo Cinético de Michaelis‐Menten 50 Espectro de Absorción 25 Guía de estudio 51 Espectrofotometría: Equipamiento y procedimientos 26 PROBLEMAS 52 Espectrofotómetro 26 Medicion de la Absorbancia 26 GUIA DE ESTUDIO 27 TRABAJO PRÁCTICO Nº 7 ............................... 53 PROBLEMAS ...................................................... 28 EJERCITACION ADICIONAL 31 CINÉTICA ENZIMÁTICA II ................................... 53 Parte practica I 53 Estudio sobre la fosfatasa ácida de hígado 53 TRABAJO PRACTICO Nº 2 ............................... 33 OBJETIVOS 53 Fundamento de la reacción 53 MATERIALES Y MÉTODOS 53 ESPECTROFOTOMETRÍA .................................... 33 Protocolo 54 RESULTADOS 54 PARTE PRÁCTICA ............................................... 33 Curva de Tiempo 55 Cuantificación de albúmina por el método de Biuret 33 CONCLUSIONES 55 MATERIALES Y MÉTODOS: 33 PROBLEMAS 55 RESULTADOS 34 DISCUSIÓN 34 BIBLIOGRAFÍA específica (Espectrofotometría) 35 TRABAJO PRÁCTICO Nº 8 ............................... 56 TRABAJO PRACTICO Nº 3 ............................... 36 CINÉTICA ENZIMÁTICA III .................................. 56 Parte practica II 56 OBJETIVOS 56 PURIFICACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS PROTOCOLO 56 ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS I ......................... 36 RESULTADOS 56 OBJETIVOS 36 Curva de Concentración de enzima 57 TEMAS PARA REPASAR 36 CONCLUSIONES 57 INTRODUCCIÓN 36 PROBLEMAS 57 Técnicas utilizadas en el estudio de proteínas: 37 PROBLEMAS 37 TRABAJO PRÁCTICO Nº 9 ............................... 58 PROBLEMAS (a resolver en Teórico Práctico) 40 BIBLIOGRAFÍA ESPECÍFICA (Proteínas) 40 CINÉTICA ENZIMÁTICA IV ................................. 58 Parte practica III 58 TRABAJO PRACTICO Nº 4 ............................... 41 OBJETIVO 58 PROTOCOLO 58 PROTEÍNAS II: ................................................... 41 Análisis de datos: 58 RESULTADOS: 59 Curva de Saturación 59 3
Curva de dobles recíprocas CONCLUSIONES PROBLEMAS 59 60 61 TRABAJO PRÁCTICO Nº 10 ............................. 62 Objetivos EXPERIENCIA Nº 1: 70 Fot
osíntesis y luz. Liberación de O2, consumo y fijación de CO2. 70 EXPERIENCIA Nº 2: Fotólisis del agua. Reacción de Hill. 72 Bibliografía 73 CINÉTICA ENZIMÁTICA V ................................... 62 Discusión de trabajos científicos 62 OBJETIVOS 62 Trabajo practico Nº 13 .................................. 74 GUÍA DE ESTUDIO. 62 Trabajo científico Nº1: 62 MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN DE ENERGÍA – Trabajo científico Nº2: 62 Bibliografía ESPECÍFICA (Cinética Enzimática) 63 DISCUSIÓN DE PROBLEMAS Y PRESENTACIÓN DE TRABAJO PRÁCTICO Nº 11 ............................. 64 TRABAJO CIENTÍFICO ........................................ 74 Objetivos 74 Guia de Problemas 74 FOTOSÍNTESIS I ................................................. 64 O
T
R
O
S
P
R
O
B
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M
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S
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5 Objetivos 64 Trabajo científico: 77 Introducción 64 Guia de estudio 66 Problemas 67 Trabajo practico Nº 14 .................................. 78 Bibliografía 69 MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN DE ENERGÍA – TRABAJO PRÁCTICO Nº 12 ............................. 70 DISCUSION DE PROBLEMAS Y ANÁLISIS DE TRABAJO CIENTÍFICO ........................................ 78 FOTOSÍNTESIS II ................................................ 70 Objetivos 78 Bibliografía ESPECÍFICA (Bioenergética) 78 PARTE PRÁCTICA ............................................... 70 4
DOCENTES
Profesora Titular:
Dra María Angélica Perillo (Inv. Principal CONICET))
Profesores Adjuntos:
Dr. Daniel A. García (Inv. Independiente CONICET)
Dr. Raúl H. Marín (Inv. Principal CONICET)
Profesores Asistentes
Dra. Dolores Carrer (Inv. Asistente CONICET)
Dr. Eduardo M. Clop (Inv. Asistente CONICET)
Dra. Jackelyn M. Kembro (Inv. Asistente CONICET)
Dra. Verónica Nolan (Inv. Asistente CONICET)
Dra. Julieta María Sanchez (Inv. Adjunta CONICET)
Dra. Mariela E. Sánchez (Inv. Asistente CONICET)
Dra. Anahi del V. Turina (Inv. Asistente CONICET)
Dr. Benjamín Caruso (Becario Posdoctoral FONCyT)
Ayudante Alumno
Iván Felsztyna
Aspirantes a Adscripto
Dr Andrés Fábrega
Biól. Nicolás Nazar (Becario doctoral CONICET)
Colaboradores
Dr.. Pedro D.Clop (Becario doctoral CONICET)
Dra Inés Burgos (Becaria Posdoctoral CONICET)
Dra Virginia Miguel (Becaria Posdoctoral SeCyT)
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PROGRAMA ANALITICO de Química Biológica.
1. La lógica molecular de la vida
Diversidad biológica y unidad bioquímica. Generalidades sobre metabolismo celular. Obtención,
almacenamiento, liberación y utilización de la energía. Ubicación subcelular de la actividad metabólica;
fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial. Macromoléculas y ensambles supramoleculares:
caracterización; papel del agua, efecto hidrofóbico e importancia de las interacciones débiles (puente de
hidrógeno, van del Waals) en su estructura y función. Propiedades coligativas de disoluciones acuosas.
Superpoblación molecular: efectos sobre la actividad del agua y sobre la actividad y difusión de los
solutos.
2. Evolución Bioquímica
Composición química de la materia viva. Evolución prebiótica. Ribozimas. Evolución: desde la información
unidimensional de la secuencia (ADN) a la información tridimensional de la función (proteína).
Transferencia de información biológica a nivel molecular (ADN- ARN- Proteína; gradientes de carga y de
materia) y de la dinámica estructural (cambios conformacionales en proteínas, catástrofe microtubular, el
citoplama celular como una matriz de percolación de dimensión fractal). Evolución de la estructura:
molécula, agregados supramoleculares, compartamentalización, aparición de gradientes y de bombas.
Mecanismos de transducción de energía y de señales. Evolución de la complejidad. Patrones
bioquímicos: metabolones.
3. Estructura y función de las Proteínas
Equilibrios ácido-base en aminoácidos. Unión peptídica. Proteínas: estructura primaria, secundaria (αhélice, hoja , giros, bucles), terciaria (motivos: patrones de clasificación estructural) y cuaternaria.
Plegamiento: cooperatividad, estabilización progresiva. Desplegamiento. Cambios conformacionales y
actividad. Aislamiento, purificación y fraccionamiento de proteínas (precipitación selectiva, cromatografías
de intercambio iónico, filtración molecular y de afinidad). Electroforésis: determinación de la masa
molecular, número de protómeros y localización de puentes disulfuro. Ultracentrifugación. Secuenciación
de proteínas. MALDI-TOFF. Inmunodetección y cuantificación, ELISA, “Western blot”. Síntesis en fase
sólida. Determinación de estructura tridimensional: RMN (unidimensional y NOESY), dicroismo circular,
fluorescencia, difracción de Rayos X. Cuantificación de proteínas.
4. Ácidos nucleicos y flujo de información genética
Estructura química de los ácidos nucleicos. Bases púricas y pirimídicas. Nucleósidos y nucleótidos:
nomenclatura. Acido desoxirribonucleico (ADN): estructura primaria, secundaria y terciaria. Estructura de
los ácidos ribonucleicos: mensajero(ARNm), de transferencia(ARNt) y ribosomal (ARNr). Duplicación del
ADN, Transcripción de ADN en ARN, Procesamiento del RNA, intrones y exones, Código genético.
Virus: tipos ADN-virus y ARN-virus de uno y de dos filamentos. replicación. Virus oncogénicos. El
bacteriofago λ: mecanismo de integración al genoma de la celula huesped. Oncogenes. Viroides.
Plásmidos.
5. Investigación en genética
Ingeniería genética: aplicaciones y obtención del gen: por corte del ADN con endonucleasas de
restricción, por síntesis orgánica en fase sólida y a partir del ARNm. Secuenciación por interrupción
controlada de la replicación. Amplificación: PCR. Tecnología del DNA recombinante: Unión de segmentos
de ADN de distinto origen: método de las colas homopoliméricas. Vectores: plásmidos semisintéticos y
derivados del bacteriofago λ: características deseables. Introducción del vector a la célula huésped
(transformación). Selección del clon con el ADN recombinante y clonado. Manipulación de genes de
eucariotas, bibliotecas de genes a partir de ARNm. Niveles de expresión génica, chips de genes
(microarrays). Animales transgénicos. Mutagénesis dirigida para producir proteínas nuevas.
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6. Investigación en evolución
Relaciones evolutivas a partir de secuencias de proteínas. Homologías de secuencias: secuencias
alineadas, significación estadística (“shuffling”), matriz de sustitución, bancos de datos para detectar
secuencias homólogas. Estudio de estructuras tridimensionales. Gráfico autodiagonal (autoalineamiento)
para detectar secuencias repetidas. Relación estructura/función: evolución divergente y convergente.
Construcción de árboles evolutivos. Evolución molecular en el laboratorio.
7. Bioenergética
Estados de equilibrio y estados estacionarios. Entropía y vida. Bioenergética: cambios de energía libre de
una reacción. Relación entre la constante de equilibrio y el cambio de energía libre estandar. Cálculo del
cambio de energía libre estandar y el cambio de energía libre de una reacción redox. Reacciones
acopladas. Energética del transporte activo. Compuestos con alto potencial de transferencia de fosfato:
factores que influyen en el cambio de energía libre estandar durante la hidrólisis.
8. Enzimología
Enzimas clasificación y nomenclatura. Ribozimas. Cofactores. Coenzimas: definición: estructura química y
clasificación. Coenzimas de oxido-reducción: nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), nicotinamida
adenina dinucleótido fosfato (NADP), flavina adenina dinucleótido (FAD), coenzima Q (CoQ) y ácido
lipoico. Coenzimas que transfieren grupos fosfato; que transfieren grupos acilo: Coenzima A (Co A). Que
transfieren grupros glicosilo. Que intervienen en reacciones de decarboxilación: piridoxal fosfato y biotina.
Otras coenzimas. Vitaminas hidrosolubles que forman parte de coenzimas. Vitaminas liposolubles,
estructura y función. Estrategias catalíticas.
9. Cinética Enzimática
Mecanismo de la actividad enzimática. Cinética. Reacciones monosustrato: el modelo de MichaelisMenten; determinación de la Km y Vm por el método deLineweaver-Burk. Activadores e inhibidores. Tipos
de inhibición. Análogos del estado de transición. Anticuerpos catalíticos (reconocen el estado de
transición). Reacciones bisustrato: de desplazamiento simple y desplazamiento doble. Estrategias
reguladoras: enzimas alostéricas (cinética y modelos), isozimas, modificación covalente, escisiones
proteolíticas.
10. Glúcidos y Lípidos
Glúcidos: Monosacáridos, carbohidratos complejos, glicoproteínas, lectinas.
Lípidos: lípidos de membranas, balance hidrofílico-hidrofóbico, estructuras de autoagregación.
11. Biomembranas
Estructura y función de la membrana biológica. El modelo del mosaico fluido. Membranas internas de
células eucariotas. Membranas de células procariotas. Tipos de movimientos de las moléculas
constituyentes. Difusión (FRAP, SPT). Fluidez (anisotropía) y curvatura. Efectos de factores físicoquímicos y de la composición. Proteínas de membrana: extrínsecas, ancladas, intrínsecas. Predicción de
secuencias transmembrana a partir de la estructura primaria. Secuencias señalizadoras de
direccionamiento de proteínas. Fusión de membranas.
12. Transporte
Difusión: Difusión facilitada. Transporte activo.:Las bombas de Na+, K+ y Ca2+. Cotransporte y
contratransporte. Antibióticos de transporte. Medidas de conductancia: platch clamp. Sinapsis. Potenciales
de acción. Canales activados por voltaje. Canales activados por ligando. Canales iónicos. Nexus o
uniones íntimas. Potenciales electroquímicos. Potencial Donnan.
13. Transducción de la información
Receptores de superficie. Curvas de saturación. Receptores ionotrópicos. Receptores 7TM. Segundos
mensajeros. Conversación cruzada. Sistema nervioso. Ultraestructura de la sinapsis. Teoría química de la
transmisión nerviosa. El potencial de membrana. Liberación, recaptación y degradación de los
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neurotransmisores. Unión mioneural. El receptor nicotínico de acetilcolina: inhibidores. La acetil
coilinesterasa: inhibidores. Receptores de otros neurotransmisores.
14. Metabolismo
Metabolismo: visión de conjunto. Reacciones aclopladas. El ATP como divisa universal de energía libre.
Potencial de transferencia de grupos fosfato. Potencial de fosforilación. Motivos recurrentes en las vías
metabólicas. Transportadores activados. Evolución de las vías metabólicas.
Oxidaciones biológicas. Enzimas de oxido-reducción: Clasificación y ejemplos. Metabolismo del
superóxido. Glucólisis : reacciones, consumo y generación de ATP a nivel de sustrato. Generación de
NADH. Balance energético. Destinos del piruvato: formación de acetil-CoA, de etanol y de lactato. Entrada
de fructosa y galactosa. Gluconeogénesis : reacciones. Ciclo de Cori: rendimiento de ATP del lactato.
15. Ciclo de Krebs
Ciclo de Krebs o de los ácidos tricarboxílicos (TCA): reacciones, formación de coenzimas reducida y ATP
a nivel de sustrato. Acoplamiento de las reacciones. Interacción de los metabolismos de glúcidos , lípidos
y proteinas. rendimiento de ATP en la oxidación total de glucosa. Ciclo del glioxalato.
16. Fosforilación oxidativa.
Fosforilación oxidativa. Ubicación submitocondrial. Cadena Respiratoria Componentes. Niveles de
formación de ATP. La hipótesis quimio-osmótica. Motores moleculares: ATPsintasa. Bioenergética.
Regulación de la fosforilación oxidativa. Inhibidores.
17. Metabolismo de glúcidos
Via de las pentosas-fosfato. Biosíntesis del ácido ascórbico. Degradación intracelular del almidón y del
glucógeno: reacciones. Digestión. Interconversión de hexosas. Biosíntesis del glucógeno, almidón y
celulosa: reacciones. Regulación del metabolismo del glucógeno via AMPc. Biosíntesis de disacáridos.
18. Fotosíntesis
Fotosíntesis: ecuación global. Ubicación del proceso en el cloroplasto, pigmentos. Reacción de Hill. Las
reacciones luminosas: fotosistemas I y II. Cadena transportadora de electrones. Formación de ATP y
NADPH. Bioenergética. Mecanismo de formación de ATP. Reacciones enzimáticas: ciclo de Calvin.
Eficiencia de la fotosíntesis.
19. Metabolismo de lípidos
Biosíntesis y degradación de los triglicéridos, glicerofosfolípidos y esfingolípidos. Biosíntesis del colesterol
a partir de acetato. Formación de colecalciferol y ácidos biliares
Metabolismo de los ácidos grasos, degradación por  -oxidación de ácidos grasos saturados de cadena
par e impar y de ácidos grasos insaturados. Balance energético.  y -oxidación. Ubicación subcelular.
Biosíntesis: sistema del citosol, reacciones. Sistemas microsomal y mitocondrial.
20. Metabolismo de amino ácidos
Metabolismo de los aminoácidos. Ciclo de fijación del nitrógeno. Degradación de los aminoácidos:
reacciones de tipo general: desaminación por transaminación, desaminación oxidativa, desaminación no
oxidativa y descarboxilación, ejemplos. Transporte del amoníaco. Ciclo de la urea: reacciones. Los
aminoácidos como precursores de otras biomoléculas: metabolismo del triptofano, fenilalanina, tirosina,
histidina y glutamato. Glutatión. Porfirinas. Biosíntesis del Hem. Hemoglobinas A, F y A2. Derivados de la
hemoglobina: oxihemoglobina, carboxihemoglobina, metahemoglobina y carbohemoglobina. Degradadción
de la hemoglobina. Formación de pigmentos biliares.
21. Metabolismo de ácidos nucleicos
Síntesis de novo de pirimidinas. Biosíntesis de bases púricas y desoxiribonucleótidos. Síntesis de NAD+,
FAD, Coenzima A.
Uratos. Replicación, recombinación y reparación del DNA, polimerasas,
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topoisomerasas y helicasas. Fragmentos de Okazaki. Síntesis de DNA en eucariotas, ciclo celular,
telomerasa. Síntesis y maduración del RNA. El ribosoma como estructura desupramolecular.
22. Metabolismo de proteínas
Biosíntesis de proteínas. Codigo genético: características. Formación de aminoacil-ARNt. Mecanismo de
la síntesis de proteínas: etapas de iniciación, elongación y terminación. Modificaciones posttraduccionales. Antibióticos inhibidores. Endo y Exopeptidasas. Tipos de mutaciones.
23. Integración metabólica y control de la expresión génica
Regulación metabólica. Control de la expresión genética en procariotas. Ooperón lac y operón trp:
inducción y represión. Control en eucariotas. Regulación por modificación de la actividad de la enzima:
activación por precursor e inhibición por producto final. Regulación hormonal. Hormonas de mamíferos:
bases moleculares del mecanismo de acción. Receptores de hormonas de estructura esteroide, peptídica
y derivada de aminoácidos. Endocitocis y reciclo de los receptores. Hormonas vegetales y de insectos.
24. Inmunoquímica
Inmunoquímica. Inducción de anticuerpos específicos. La unión Ag-Ac. Heterogeneidad de los
anticuerpos. Estructura química de las inmunoglobulinas. Teorías sobre la formación de anticuerpos.
25. Bioquímica de sistemas sensoriales
Olfato, gusto, visión, audición y tacto, aspectos bioquímicos. Receptores y mecanismos de transducción
de señales involucrados.
26. Motores moleculares
NTPasas de lazo P. Mecanismo de la contracción muscular, asociación cíclica de la actina y miosina.
Microtúbulos, tubulina, quinesina y dineína. Movimiento flagelar en bacterias, motor rotativo; quimiotaxis.
PROGRAMA SINTÉTICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA
1. La lógica molecular de la vida
2. Evolución Bioquímica
3. Estructura y función de proteínas
4. Ácidos nucleicos y flujo de información genética
5. Investigación en genética
6. Investigación en evolución
7. Bioenergética
8. Enzimología
9. Cinética Enzimática
10. Glúcidos y lípidos
11. Biomembranas
12. Transporte
13. Transducción de la información
14. Metabolismo
15. Ciclo de Krebs
16. Fosforilación oxidativa
17. Metabolismo de glúcidos
18. Fotosíntesis
19. Metabolismo de lípidos
20. Metabolismo de amino ácidos
21. Metabolismo de ácidos nucleicos
22. Metabolismo de proteínas
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23. Integración metabólica y control de la expresión génica
24. Inmunoquímica
25. Bioquímica de sistemas sensoriales
26. Motores moleculares
TEORICO-PRACTICOS
1. ProteÍnas
2. Ácidos nucleícos
3. Investigacion en genética
4. Bioenergética
5. Cinética Enzimática
6. Ciclo de Krebs y cadena respiratoria
7. Fotosíntesis
8. Inmunoquímica
9. Integración metabólica
TRABAJOS PRACTICOS
TP 1 y 2: Espectrofotometría.
TP 3-5: Purificación, cuantificación y análisis estructural de proteínas
TP 6-10. Cinética Enzimática
TP 11 y 12: Fotosíntesis.
TP 13 y 14: Mecanismos de transducción de energía
OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA.
Al terminar el curso el estudiante deberá:
 Adquirir una clara comprensión del metabolismo celular a la luz de conceptos de:
- Mecanismos de transducción de energía y de información.
- Termodinámica, cinética y catálisis de reacciones bioquímicas
- Importancia de la compartamentalización en la generación de gradientes químicos y
electroquímicos.
- Modulación dinámica de la estructura y función de biomembranas, proteínas y de la organización
compleja del citoplasma
- Vías metabólicas fundamentales y su integración
- Patrones bioquímicos y su evolución
 Desarrollar del pensamiento crítico.
 Adquirir destreza en el uso de metologías del laboratorio bioquímico
BIBLIOGRAFIA
Bioquímica General
- Blanco, A. Química biológica, Ed.El Ateneo, 2006.
- Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996*.
- Harper, H.A, Manual de Química Fisiológica. Ed. El manual moderno 1980*
- Horton, R.H, Moran, L.A., Ochs, R.S., Rawn, J.D., Scrimgeour, K.G. Bioquímica. Ed.Pentice Hall,
Hispanoamericana, SA. Mexico, 1995, 1999*.
- Lehninger, Albert L.. Principios de bioquímica . 2ºEd., Omega, Barcelona, 2001.
- Nelson, David L.. Lehninger : principios de bioquímica .3º Ed., Omega, Barcelona, 2001.
- Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, 5º Ed., Reverté SA, España, 2003.
- Torres, H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioquímica General. Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983*.
- Voet D., Voet JG, Pratt C.W. Fundamentos de Bioquímica. La vida a nivel molecular, Ed. Médica
Panamericana. 2006.
10
- Walker, J. M.. Biología molecular y biotecnología .2º Ed. Acribia, Zaragoza, 1997.
Problemas
- Esteban J.M. y Cavanillas J.M.. Problemas de Química. Ed. Alhambra. 4a. España. 1976.
- Holme, David J. . Resolución de problemas de bioquímica analítica, Acribia, Zaragoza, 1996.
- Segel I.J. Cálculos en Bioquímica. Acribia. Saragoza. España. 1972.
Bibliografía de consulta sobre temas específicos
Química General, Química Orgánica y Química-Física
- Atkins, P.N y M.J Clugston. Principios de Fisicoquímica. 1986. Addisson-Wesley. Ed. Iberoamericana.
México.
- Atkins, P.W. Fisicoquimica. Ed. Addison-Wesley Iberoamericana, S.A. Wilmington, Delaware, USA.1991
- Brown, T. L., LeMay, H. E.
y Bursten, B.E.. Química, La Ciencia Central. Prentice-Hall
Hispanoamericana, S.A., Quinta Edición. 1993.
- Morris, J.G. Fisicoquímica para biólogos. Ed. Reverté. Barcelona. 2002.
- Whitten, W.K y K.D Gailey. Química General. Ed. Interamericana. México. 1986.
Biofísica-Química y Biología Celular
- Alberts, B. . Biología molecular de la célula , 3º Ed., Omega, Barcelona, 1996-2002.
- De Robertis, E.M.F.. Biología celular y molecular de Eduardo D. P. De Robertis .12º Ed., El Ateneo,
Buenos Aires, 1998.
- Estrada Cerqueda, C.. Cinética del transporte a través de membranas, Ed. Blume, Madrid, 1976.
- Grigera, J.R. Introducción a la biofísica del agua, Eudeba, Buenos Aires, 1976.
- Maggio B. Introducción a la biofísico-química. Ed.Gonzalez Truccone. Córdoba, Argentina. 1987*.
- Vicente Córdoba, C.. Biofísica, Ed.Síntesis, Madrid, 1992
Cinética enzimática
- Segel I.H.. Enzyme kinetics. Behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme
systems. Wiley Classics Library Editions. Wiley Intersci.Pub., New York. 1993*.
- Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimología. Ed Aguilar. 1967.
- Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan vol. XXXI
Fotosíntesis
- Andreo C., Vallejos R. Fotosíntesis. Serie Biología, monografía no 30 OEA, 1984.
- Hall D.O., Rao K. Fotosíntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977.
- Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977.
Análisis Bioquímico e Instrumental
- Gore M.G.. Spectrophotometry and Spectrofluorometry A practical Approach. Ed. Oxford University
Press. Inc. NY. USA. 2000.
- Henry RJ, Cannon D.C. y Winkelman J.W. Química Clínica: Bases y Técnicas. Tomo I. 2a Ed. Jims.
Barcelona. España.1980*.
- Willard H.H. Merritt Jr. .L, y Dean J.A.. Métodos Instrumentales de Análisis. Ed. CECSA. México. 1974.
- Skoog D.A. y West D.M.. Análisis Instrumental. Ed.Interamericana. México. 1975.
- D'Ocon Navaza, María Carmen. Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico, Paraninfo, Madrid,
1999.
Bibliografía especializada
- Aon M.A. and Cortassa S. Dynamic Biological Organization. Fundamentals As Applied To Cellular
Systems. Chapman and Hall, London, UK. 1997*.
- Daune, M.. Molecular Biophysics. Structures in motion, Oxford University Press, Oxford. 1999*.
- Makishima, Shoji. Pattern dynamics : a theory of self-organization, Ed. Kodansha Scientific, Tokio, 2001.
La bibliografía citada está disponible en la Biblioteca “Ricardo Lutti" (Centro) de la FCEFyN, UNC.
* disponibles en la Cátedra de Química Biológica.
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QUÍMICA BIOLÓGICA (Ciencias Biológicas)
CRONOGRAMA 2014
Finalizan: 27 de junio
CLASES TEÓRICAS y TEÓRICO- PRÁCTICAS
Com 1,2,6,7,8 Mier 8 -10 hs (Aula 200) y Viernes 10-12 hs (Aula 218)
Com 3,4,5
Mier 17-19 hs (Aula 302) y Viernes 14-16 hs (Aula 103)
Miércoles
1
12/03/14
2
19/03/14
3
26/03/14
4
Comienzan: 12 de marzo
02/04/14
TEMA
La lógica molecular de la
vida
Proteínas
Ácidos nucleicos
(Teórico-Práctico)
FERIADO
Viernes
14/03/14
21/03/14
28/03/14
TEMA
Metabolismo.
Evolución Bioquímica
Proteínas
(Teórico-Práctico)
Investigación en
Genética (Teórico-
TRABAJOS PRÁCTICOS
Aula 224 (ex Lab 13)
TP
TP 1
Espctrofotometría
TP 2
Espctrofotometría
Práctico)
Investigación en
TP 3
04/04/14 evolución / Bioenergétic Proteínas I*
(Teórico-Práctico)
Cinética Enzimática
5
09/04/14
Cinética Enzimática
11/04/14
6
16/04/14
Enzimología
18/04/14
7
23/04/14
Glúcidos / Lípidos
25/04/14
Biomembranas
8
30/04/14
02/05/14
Transporte
9
07/05/14
09/05/14
PRIMER EXAMEN
PARCIAL
10
14/05/14
11
21/05/14
12
28/05/14
13
04/06/14
14
11/06/14
15
18/06/14
16
25/06/14
Hormonas/
Transducción de señales
Glicólisis
Gluconeogénesis
Glucógenolisis
Interconversión de
hexosas; Vía de las
pentosas
Fotosíntesis + Ciclo de
Calvin (Teórico-Práctico)
16/05/14
(Teórico-Práctico)
FERIADO
Ciclo de Krebs
Cadena Respiratoria
(Teórico-Práctico)
23/05/14
Metabolismo de lípidos
Metabolismo de lípidos
30/05/14
Metab. aminoácidos/
Biosínt. de Nucleótidos
Biosíntesis de ácidos
nucleicos
06/06/14
Biosíntesis de proteínas
Regulación de la expresion
13/06/14
génica
Bioquímica de sistemas
sensoriales
Inmunoquímica
(Teórico-Práctico)
Integración Metabólica
(Teórico-Práctico)
20/06/14
2º EXAMEN PARCIAL
27/06/14
Aula /confirmar/ 12-14 hs
FERIADO
TP4
Proteínas II
TP 5
Proteínas III*
TP 6
Cinética I
TP 7
Cinética II y III*
TP 8
Cinética IV y
Seminario 1
TP 9
Cinética V y
Seminario 1
TP 10
Fotosíntesis I
TP 11
Fotosíntesis II
TP 12 Transducción
de energía y
Seminario 2
TP 13 Transducción
de energía y
Seminario 2
RECUPERAT.
PRUEBAS TP *
RECUPERATORIO EXAM. PARCIALES
Firma Regularidad
Recup TP
*Las Comisiones cuyo día de TP coincida con un feriado, deberán recuperar el TP en alguna de las
otras comisiones en las que se dicta ese TP (dentro de la misma semana).
Semana
CLASES TEÓRICAS :
12
CONDICIONES PARA EL CURSADO y REGULARIZACIÓN
TRABAJOS PRÁCTICOS
Los alumnos deberán:
- Aprobar antes de comenzar los trabajos prácticos un examen sobre Normas Básicas De Trabajo y Seguridad en
Laboratorios. Los contenidos a evaluar se encuentran en la guía de trabajos prácticos.
- Concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, calzado adecuado (cerrado) y cabello recogido.
No podrá realizar el TP aquel alumno que concurra sin estos elementos mínimos de seguridad personal.
ASISTENCIA:
Clases Teóricas: no obligatoria
Teórico Prácticos: 80% obligatoria
Trabajos Prácticos: 80% obligatoria
ACTIVIDADES
Clases teóricas: Exposición y discusión de temas teóricos.
Clases teórico-prácticas: Discusión de problemas teóricos.
Trabajos prácticos: Resolución de problemas, Trabajos de laboratorio, Seminarios de discusión de trabajos científicos.
EVALUACIONES
I. Trabajos Prácticos:
a) Evaluación oral durante el desarrollo del TP. Se tendrá en cuenta: desempeño, destreza, atención, participación,
puntualidad, y la presentación de Trabajos Científicos (cuando corresponda).
b) Una evaluación escrita al final de cada TP. El resultado de la evaluación estará disponible en el TP siguiente.
II. Exámenes Parciales:
Se tomarán 2 (dos) exámenes parciales sobre temas desarrollados en clases teóricas y prácticas.
CONDICIONES PARA LA REGULARIZACIÓN
- Correlativas regularizadas: Química Orgánica y Física I.
- Asistir al 80% de las Clases Teórico-Prácticas
- Desempeñarse satisfactoriamente durante los TP (item a) y
- Aprobar el 80% de los TP (12 de las 14 evaluaciones escritas de los Trabajos Prácticos (item b) (Las evaluaciones
de los TP se aprueban con el 60% de las respuestas correctas o alcanzando el 60% de los contenidos de TP) y
- Obtener un puntaje mínimo de 4 (cuatro) puntos en los exámenes parciales teóricos.
CONDICIONES PARA LA PROMOCIÓN:
Correlativas Aprobadas (al comenzar el cursado): Química Orgánica y Física I.
Asistir al 80% de las clases teórico prácticas.
Asistir y Aprobar el 80% de los TP
Alcanzar un promedio de 7 puntos entre ambos Exámenes Parciales, con una nota no inferior a 4 puntos.
RECUPERATORIOS
Se podrá recuperar al final del cuatrimestre:
- Un TP que haya resultado reprobado, para alcanzar las condiciones indicadas más arriba.
- Un examen parcial (por cualquier razón: inasistencia, reprobado o para aumentar nota).
Inasisterncias:
En caso de inasistencia a un TP sólo podrá recuperarse por causa debidamente justificada (con certificado médico
expedido por Bienestar Estudiantil), en alguna Comisión donde el mismo TP aún no se hubiera dictado. En el caso
de inasistencias no habrá recuperatorio al final del cuatrimestre.
FIRMA DE REGULARIDADES: Se realizará el mismo día y horario del recuperatorio de parciales. La firma de
libretas se realizá únicamente ese día. El trámite no es personal.
EXAMEN LIBRE: El alumno que se presente a rendir la materia en condición de Libre deberá avisar con 1 semana
de anticipación, con respecto al turno de examen.
13
NORMAS BÁSICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS
He leído las NORMAS BÁSICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN
LABORATORIOS incluidas en la Guía de Trabajos Prácticos de Química Biológica
(Ciencias Biológicas-Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales-Universidad
Nacional de Córdoba) y estoy al tanto de las medidas de seguridad de trabajo en el
laboratorio.
Nombre y Apellido: ……………………………………………………………..
DNI: ……………………………….
Nº de Matrícula: ……………………………………
Firma: ……………………………………………………………..
Lugar y Fecha: ……………………………………………………………..
Completar, firma, cortar y entregar al Profesor Asistente.
14
NORMAS BASICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS1
INDICE
1. ORGANIZACIÓN DEL TRABAJO
2. HABITOS PERSONALES
3. MANIPULACIÓN EN LABORATORIOS
4. MEDIOS DE PROTECCIÓN
4. ACTUACIÓN EN CASO DE ACCIDENTES
5. TELÉFONOS IMPORTANTES
Pág.
17
17
18
20
20
21
TEMAS
1. ORGANIZACIÓN DEL TRABAJO
 La organización del laboratorio, debe ser estudiada a fondo y procurar que sea adecuada para
el mantenimiento de un buen nivel preventivo.
 No debe trabajar nunca una persona sola en el laboratorio fuera de horas habituales, por la
noche o en operaciones con riesgo.
 Cuando se realicen operaciones con riesgo, incluso las personas que no intervengan en ellas
deben estar informadas de las mismas.
 Deberá trabajarse en las campanas extractoras siempre que se manipulen productos tóxicos,
inflamables y/o que se desprendan en el proceso. En éstas deberá comprobarse
periódicamente el funcionamiento del extractor, su estado general, el cumplimiento de los
caudales mínimos de aspiración, que su uso sea el adecuado, etc.
 La programación de trabajos con productos químicos, deberá ir acompañada de la adopción de
medidas preventivas que se requiera en cada caso.
 Deberá comprobarse la ventilación general del laboratorio.
 Los reactivos almacenados en el laboratorio deben preservarse del sol, no guardarse en
estanterías altas, cuidar su etiquetado y mantenerlos en las cantidades imprescindibles. No
deberá haber botellas con líquidos inflamables, incluso las botellas empezadas o los reactivos
preparados con mezclas de productos inflamables. Ha de controlarse que las botellas una vez
utilizadas, se cierren correctamente.
 Está prohibido fumar, beber y comer en los laboratorios.
 Los envases para recuperar se enjuagarán y colocarán, sin taponar, para el posterior proceso
de lavado.
 No se permitirá la presencia de personas no autorizadas y debidamente informadas de los
riesgos inherentes en el laboratorio.
2. HABITOS PERSONALES
 Mantener en todo momento guardapolvos, camisas y vestidos abrochados.
 No abandonar objetos personales en mesas de trabajo.
 No comer o beber en los laboratorios.
 No guardar alimentos ni bebidas en las heladeras del laboratorio.
 No fumar en los laboratorios.
 Llevar recogidos los cabellos.
 No llevar pulseras, anillos, colgantes o mangas anchas que pudieran engancharse en
los montajes.
1
Extraído de “Seguridad y condiciones de trabajo en los laboratorios” del CSIC-España.
15
 Los guardapolvos no deberán llevarse a lugares de asistencia común como son las bibliotecas,
cafeterías, salas de reuniones, comedores etc.
 No es aconsejable guardar la ropa de calle en la mesada del laboratorio, para lo cual deberá
disponerse de armarios o lugares específicos fuera del área de trabajo.
 Es recomendable usar gafas de seguridad cuando se manipulen productos químicos
líquidos de cualquier tipo en ebullición.
 Si la naturaleza del trabajo lo requiere, el personal del laboratorio deberá utilizar los medios de
protección adecuados.
 No utilizar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidentes por salpicaduras
de productos químicos o sus vapores, al pasar por detrás de las lentes, podrían provocar
lesiones en el ojo antes de retirarlas. En estos casos se recomienda el uso de gafas graduadas.
 Si un producto químico salpica a los ojos, utilizar inmediatamente un lavaojos y lavarlos durante
15 minutos sin interrupción. Actuar con urgencia en menos de 10 segundos. No dirigir una
corriente de alta presión directamente al ojo porque podría lesionarse. Es necesario mantener
los ojos abiertos con ayuda de los dedos para el lavado debajo de los párpados.
 Lavarse las manos: antes de abandonar el laboratorio, siempre que se quiten los guantes
protectores y después de toda operación que haya comportado el posible contacto con material
irritante, cáustico, tóxico o infeccioso.
 Para secarse las manos, en vez de toallas es preferible el uso de papel desechable o
secadores de aire.
 La persona que al término de la jornada sea la última en abandonar el laboratorio deberá
asegurarse que los procesos que no queden en funcionamiento, las conducciones de agua y
gas estén cortadas, la energía eléctrica desconectada y que el local se encuentra en un estado
que excluya el riesgo de incendio.
3. MANIPULACIÓN EN LOS LABORATORIOS
Laboratorios con riesgo químico
 Toda persona que manipule un producto químico, deberá tener conocimiento de sus
características físico-químicas y toxicológicas.
 Deberán conocerse, como mínimo, las frases de riesgo y seguridad (R y S) de los productos.
 Como norma general, cualquier manipulación de una sustancia química deberá realizarse
dentro de las vitrinas de laboratorio.
 No llenar los tubos de ensayo más de la mitad de su volumen total.
 Calentar los tubos de ensayo de lado y utilizando las pinzas.
 Utilizar en todo momento gradillas y soportes.
 Tomar los tubos de ensayo con los dedos, nunca con las manos.
 No llevar tubos de ensayo ni productos en los bolsillos.
 No calentar nunca un recipiente totalmente cerrado. Cuando se caliente, dirigir siempre la
abertura en dirección contraria a uno mismo y a las demás personas cercanas.
 Transportar los productos en bandejas o recipientes para evitar derrames en caso de
roturas.
 No oler productos químicos si no se está debidamente informado.
 No tocar con las manos ni probar los productos químicos.
 En caso de producirse una contaminación se limpiará la zona y no podrá utilizarse
hasta tener seguridad de su descontaminación utilizando los productos adecuados en cada
caso y que deben conocerse previamente.
 No tocarse ninguna parte del cuerpo, material o instrumental con los guantes contaminados. En
el caso de que esta circunstancia hubiera ocurrido, limpiar con los productos adecuados y
eliminar los elementos utilizados en la limpieza, como residuos tóxicos.
 No efectuar pipeteos con la boca. Se realizará con peras de goma para pipetas o pipetas de
seguridad.
 No trabajar separado de la mesa.
 Para el encendido de mecheros, utilizar encendedores piezoeléctricos; no usar fósforos
16
ni encendedores de bolsillo.
 Los mecheros no deberán dejarse encendidos sin vigilancia.
 Asegurarse del enfriamiento de los materiales antes de aplicar directamente las manos
para tomarlos.
 Al finalizar una tarea u operación, recoger materiales, reactivos, equipos, etc., evitando las
acumulaciones innecesarias y dejando la zona de trabajo en las debidas condiciones de
limpieza.
 Al terminar el trabajo, asegurarse de la desconexión de los aparatos, agua, gases, etc.
 Usar y almacenar sustancias inflamables en las cantidades imprescindibles.
 Deberá ponerse especial cuidado en cerrar botellas y frascos inmediatamente después de
su utilización.
 No transportar frascos o recipientes tomados por la tapa o tapón.
 Siempre que sea posible se trabajará en bandejas con el fin de confinar un posible
derrame. Será muy conveniente forrar con papel de filtro dichas bandejas.
 Siempre que sea necesario, deberán utilizarse guantes específicos para los productos que
se manipulan.
 Los guantes y todo material contaminado con productos tóxicos y /o infecciosos deberán
descontaminarse y/o esterilizarse antes de ser eliminados. Cuando no se utilicen guantes en la
manipulación de sustancias químicas, las manos deberán lavarse frecuentemente. Al finalizar
la sesión de trabajo, es aconsejable un lavado cuidadoso antes de abandonar el laboratorio.
 Las puertas de los laboratorios deberán permanecer cerradas durante la jornada de trabajo.
 Deberá mantenerse la limpieza y el orden en los laboratorios en todo momento.
 Deberán mantenerse libres los espacios de trabajo, así como las zonas de paso y salida de los
recintos.
 No utilizar nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento.
 Antes de comenzar un experimento asegurarse de que los montajes y aparatos están en
perfectas condiciones de uso. Ante cualquier mínima duda consultar con el responsable del
equipo.
 Los trapos o materiales ensuciados con aceite o sustancias inflamables deberán colocarse en
recipientes cerrados que deberán vaciarse diariamente y su contenido será neutralizado.
 Las instalaciones, aparatos e instrumentos destinados a reparación, deberán enviarse limpios,
sin trazas de sustancias químicas nocivas.
 Antes de utilizar sustancias inflamables deberemos asegurarnos de que no hay cerca
mecheros encendidos, calentadores etc.
 No debe dejarse sin vigilancia ningún tipo de reacción química.
 Al finalizar un experimento los productos deberán etiquetarse y colocarse en lugar seguro.
 Las sustancias cuya disolución sea exotérmica, deberán disolverse por porciones, agitando y
enfriando continuamente.
 Durante la destilación de sustancias inflamables de bajo punto de ebullición, deberá controlarse
la llegada de agua al refrigerante y alejar del aparato cualquier otra materia inflamable.
 Cuando se derrame alguna sustancia combustible se procederá a:
- Apagar el mechero, si ha lugar.
- Cortar la corriente eléctrica en el exterior del laboratorio.
- Asegurar una ventilación eficaz.
- Se absorberá el líquido con un cuerpo poroso que posteriormente se depositará en un lugar
sin peligro.
- Se eliminará como residuo tóxico.
 Las sustancias químicas deberán estar colocadas en recipientes con materiales adecuados y
etiquetados debidamente. Los recipientes deberán estar cerrados.
 Los recipientes que contengan líquidos deberán estar protegidos contra la acción directa de los
rayos solares o contra el calentamiento.
 Los metales alcalinos como sodio o potasio deberán conservarse con una capa protectora de
un solvente con un punto de ebullición elevado (petróleo, aceite de parafina) y el fósforo blanco
17
con una capa de agua.
 Los productos incompatibles deberán guardarse separadamente.
 Los recipientes que contengan productos agresivos no deberán almacenarse a una altura
superior a sesenta y cinco cm. Y serán recipientes de pequeña capacidad para su fácil manejo.
4. MEDIOS DE PROTECCIÓN
 El trabajo en laboratorios requiere la utilización de guardapolvos, que en trabajos con riesgo
deberá considerarse el tejido de los mismos.
 Los guardapolvos deberán tener los puños ajustados a las muñecas. Asimismo, deberán estar
cerrados en la parte delantera y en el cuello.
 Tener siempre a disposición las gafas de seguridad. Es recomendable el uso permanente de
las mismas. Estas serán de uso personal.
 Utilizar los guantes adecuados para cada tarea que requiera el uso de tales prendas.
 Conocer la protección brindada por los distintos equipos de protección individual para las
vías respiratorias.
 Conocer la aplicación de los productos de primeros auxilios del botiquín y los
mecanismos para recibir posibles ayudas exteriores.
 Mantener en condiciones de uso las duchas de emergencia y lavaojos.
 Conocer y ensayar el funcionamiento de equipos extintores.
5. ACTUACIÓN EN CASO DE ACCIDENTES
5.1 Derrames
. Líquidos inflamables
Absorber con carbón activado productos específicos.
Alejar cualquier foco de calor.
. Ácidos
Neutralizar con bicarbonato o emplear productos específicos comercializados para su
neutralización o absorción.
Si por casualidad se ha producido un derrame sobre la piel, el remedio inmediato sería exponer
la zona afectada al chorro de agua del grifo durante cinco o diez minutos.
Las duchas de emergencia serán utilizadas en los casos en que la zona afectada del cuerpo sea
grande. Es necesario quitar la ropa contaminada de la persona afectada mientras esté bajo la
ducha. Si se produjesen quemaduras se precisará la asistencia médica.
No utilizar cremas ni pomadas grasas en las quemaduras graves.
.Bases
Emplear productos específicos comercializados para su neutralización y absorción.
.Otros líquidos no corrosivos ni inflamables
Absorber con aserrín.
5.2. Salpicaduras.
En piel y ojos
Deben lavarse con abundante agua (si es en los ojos, mediante un lavaojos).
No intentar neutralizar. Acudir al médico con prontitud.
En la ropa
Debe quitarse rápidamente la ropa, lavándola, o colocarse bajo la ducha, según la magnitud de
la impregnación.
Si hay contacto con la piel, lavar la zona afectada y acudir al médico.
5.3. Cortes
Se deberán lavar con abundante agua corriente durante diez minutos como mínimo. Si son
pequeños y dejan de sangrar en poco tiempo, lavar con agua y jabón y taparlos con una venda o
apósito adecuado. Si son grandes y no dejan de sangrar, se requiere asistencia médica
18
inmediata.
5.4. Ingestión
Si es un ácido o una base. Beber abundante agua, salvo que la sustancia ingerida reaccione con
ella.
No provocar el vómito, salvo indicación expresa.
Disponer de información sobre los productos que se manipulan, consultando a un servicio de
información toxicológica cuando sea posible.
Si la persona está inconsciente, Ponerlo en posición inclinada con la cabeza de lado y estirarle
la lengua hacia fuera. Taparlo para que no coja frío.
Acudir al médico con una etiqueta del producto.
5.5. Inhalación
Conducir a la persona afectada a un lugar con aire fresco.
Al primer síntoma de dificultad respiratoria, iniciar la respiración artificial boca a boca.
Tratar de identificar el vapor tóxico.
5.6. Incendio
Dar la alarma inmediatamente
Apagar los fuegos pequeños tapándolos sin utilizar agua.
Escoger adecuadamente el tipo de extintor, recordando el modo de empleo y la duración de la
carga. No utilizar nunca sobre una persona.
Si prende fuego la ropa:
-Tenderse en el suelo y rodar sobre si mismo para apagar las llamas. No correr ni intentar llegar
a una ducha de emergencia salvo que esté muy cercana.
-Se le cubrirá con una manta apagafuego, llevarle a una ducha de emergencia o hacerle rodar
por el suelo. Una vez apagado el fuego, mantener a la persona tendida procurando que no coja
frío y proporcionarle asistencia médica.
Si se evacua el laboratorio, cerrar las puertas al salir.
Comportamiento ante un incendio en un local donde existan botellas de gases
La elevada temperatura provoca un aumento de la presión interna de la botella pudiendo
explotar.
Las botellas que puedan activar el fuego no deberán abrirse, cerrando las que estén en servicio.
Siempre que se pueda se desalojaran de la zona del incendio y si se han calentado se
refrigeraran con chorro de agua fría para disminuir la presión interna, avisando de ello al
suministrador.
En caso de intervenir el Cuerpo de Bomberos se les advertirá de la presencia de éstas
indicándoles, cuantas son, donde están y contenido.
6. TELÉFONOS IMPORTANTES
En todos los laboratorios debe haber un listado telefónico con los Centros de URGENCIA que
enumeramos a continuación, el cual será de conocimiento general.
ECCO (visitantes y alumnos)
4466666
BOMBEROS
100
SEGURIDAD INTERNA
4334408
ART Docentes y becarios SeCyT
Becarios e Inv. CONICET
Liderar
Prevención
4686868
0800-333-7700
0800-888-3297
19
TRABAJO PRACTICO Nº 1
MÉTODOS DE ANÁLISIS QUÍMICO: ESPECTROFOTOMETRÍA
Los problemas y la guía de estudio deberán ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En caso de
necesitar aclarar dudas, los docentes estarán disponibles en sus horarios de consulta, en la cátedra. Los alumnos
serán evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante el desarrollo de la experiencia práctica (evaluación
oral), sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP.
OBJETIVOS:
-
Comprender las propiedades que deben reunir los métodos experimentales de análisis.
Conocer los fundamentos teóricos y las aplicaciones de la espectrofotometría.
Adquirir destreza en el manejo del espectrofotómetro.
Valorar la importancia del dominio de técnicas auxiliares, adquiriendo la capacidad de aplicarlas con criterio ante
los problemas planteados.
TEMAS PARA REPASAR:
-
Disoluciones.
Estequiometría.
Luz. Teoría ondulatoria. Teoría cuántica.
Ondas electromagnéticas. longitud, frecuencia, período de una onda y unidades en que se miden. Relación entre
velocidad, longitud de onda y frecuencia. Energía de ondas electromagnéticas.
PROPIEDADES DE LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS QUÍMICO
Las mediciones, cualquiera que estas sean, generalmente involucran la utilización de un instrumento
como un medio físico para determinar una cantidad de algún parámetro o de alguna variable, por lo
tanto,cuando se practica un método de análisis quimico, se debe tener en cuenta, para la correcta
interpretación de los resultados, el grado de exactitud, presición, sensibilidad y especificidad de la técnica.
Exactitud: es el grado en que la medida promedio se aproxima al valor real. La determinación de la
exactitud se logra comparando los resultados observados con el valor real. Expresa la corrección de una
medición. Un método exacto no es necesariamente preciso.
Precisión: es el error debido al azar, la variación de los resultados obtenidos con una técnica cuando la
misma muestra se analiza repetidamente. Expresa la reproducibilidad de una medición. Cuanto menor sea
la variación observada, mayor es la precisión. Un método preciso no es necesariamente exacto.
Sensibilidad: es la variación mínima en la cantidad de un compuesto que puede ser detectada, o la
mínima cantidad significativamente diferente del blanco.
Especificidad: es la propiedad del método de medir sólo la especie química en estudio, sin la
interferencia de otras que puedan estar presentes.
ERRORES EN LAS MEDICIONES DE LABORATORIO
Las mediciones que se realizan en el laboratorio inevitablemene conllevan un error asociado, por lo tanto
es de suma importancia conocer los tipos de errores posibles que puede tener la técnica que se utiliza.
En este contexto, error se define como la diferencia entre el valor observado y el real, es decir, la
combinación del error sistemático y el error debido a la falta de precisión. Los errores pueden dividirse en
dos clases: 1) errores determinados, 2) errores indeterminados.
Errores determinados: son aquellos cuya magnitud puede determinarse:
20
a) errores instrumentales y debidos a aparatos y reactivos: balanza y pesas, aparatos volumétricos,
material de vidrio calibrado, reactivos, etc.;
b) errores operativos: son de naturaleza física, asociados con manipulaciones en un análisis.
c) errores personales: errores operativos del analista.
d) errores del método: tienen origen en las propiedades químicas y fisicoquímicas del sistema analítico.
Errores indeterminados o aleatorios: son pequeñas fluctuaciones en los sucesivos valores de una
cantidad medida. No son evitables ni previsibles por parte del observador. Pueden tratarse por métodos
estadísticos. Dada una cantidad de datos el analista puede estimar la incertidumbre introducida por
errores aleatorios y concluir con respecto al efecto de esos errores en un resultado analítico.
ESPECTROFOTOMETRÍA
GENERALIDADES
El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas analíticas que
permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su caracterización físico-química y biológica.
Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectrofotometria, en general, y la
espectroscopía ultravioleta-visible, en particular. Estos métodos permiten identificar y cuantificar
biomoléculas en solución y en muestras biológicas. A veces es necesario el empleo de reactivos
específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite
detectarlo en muestras complejas.
La espectrofotometría es una técnica que permite medir la absorción de radiación electromagnética,
dentro de los rangos ultravioleta (UV) y visible, de numerosas especies químicas inorgánicas y orgánicas,
para su análisis cuali y cuantitativo.
Las bandas de absorción de radiación electromagnética en las regiones UV-Visible del espectro se
asocian con transiciones electrónicas en la capa de valencia. Los electrones involucrados en dichas
transiciones corresponden a aquellos más débilmente atraídos por el conjunto de núcleos atómicos que
componen la molécula y cuyos estados pueden ser descritos a través de orbitales moleculares.
La Espectroscopía UV-Visible se ha aplicado en el campo de la elucidación de estructuras de
compuestos orgánicos desde los años 40 del siglo XX. El espectro de absorción es una propiedad física
de gran utilidad para caracterizar un compuesto y es un elemento corroborativo de una estructura
propuesta. Por ejemplo: permite detectar con rapidez la presencia de insaturación conjugada y ciertos
grupos funcionales (carbonilos en cetonas y aldehidos, algunos grupos funcionales nitrogenados).
Además, la espectroscopia UV-Visible es un método de extensa aplicación en la cuantificación de
sustancias. A partir de datos espectrofotométricos es posible calcular diferentes tipos de constantes de
equilibrio (ácido-base, formación de complejos, etc) y parámetros cinéticos, siendo condición necesaria
que las especies involucradas en el equilibrio difieran en su absorción en la región UV-Visible del
espectro de radiación electromagnética.
21
ESPECTRO DE RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA
 x 10-17 (Hz)
Color
en el vacío (nm)
Violeta
390 – 455
7.69 – 6.59
Azul
455 – 492
6.59 – 6.10
Verde
492 - 577
6.10 – 5.70
Amarillo
577 – 597
5.70 – 5.03
Naranja
597 – 622
5.03 – 4.82
Rojo
622 – 780
4.82 – 3.84
E  h.
E
 
c

h.c

h, Constante de Planck (6.626 10-34 J/s)
, frecuencia de la radiación
c, velocidad de la luz en el vacío
(300000 km/s)
Mecanismos de absorción de radiación electromagnética
Las moléculas son capaces de absorber radiaciones electromagnéticas. Tanto la longitud de onda de la
radiación absorbida como la eficiencia con que se absorbe, dependen de:
 la estructura de la molécula y
 el medio en que se encuentra.
En el proceso de absorción de la radiación, un fotón incidente cede su energía a una molécula, lo que da
lugar a la excitación de la misma que pasa a un nivel de energía superior:
A*
A
E = h
En donde A es la molécula absorbente, A* es la molécula absorbente en estado de excitación
energética, h corresponde a la energía de un fotón siendo h la Constante de Planck y la frecuencia de
la radiación.
Los estados excitados de los átomos o moléculas poseen una vida media corta (10-9 s) y, en
consecuencia, la molécula en estado excitado vuelve rápidamente al estado fundamental. Comunmente,
la energía es liberada al medio como calor, pero en ciertos casos la especie química excitada puede sufrir
un cambio (reacción fotoquímica) o emitir parte de la energía absorbida como radiación electromagnética
de longitud de onda mayor a la incidente (fluorescencia o fosforescencia). La Fig.1 muestra un esquema
de los procesos de absorción, fluorescencia y fosforescencia.
Estados
Excitados
Singlete
S2
Conversión
Interna
Cruzamiento
Intersistemas
Absorción
Fluorescencia
Fosforescencia
Estado
Fundamental
Singlete
S0
Fig. 1: Diagrama de Jablonsky
Estado
Excitado
Triplete
T0
22
LEYES DE LA ABSORCIÓN
Cuando la luz atraviesa una muestra, sólo una fracción de ella es transmitida. La proporción de luz
transmitida se denomina Transmitancia (T) y se calcula de la siguiente manera:
T = I1 / I0
b
Donde I1 = la intensidad de luz transmitida por la muestra
I0 = la intensidad de luz incidente
La transmitancia toma valores entre 0 – 1. También se expresa como porcentaje si se multiplica por 100 y
sus valores están en el rango de 0-100%.
%T = (I1 / I0 ) x 100
La relación (I / I0 ), también puede ser expresada como luz absorbida en lugar de luz transmitida. En ese
caso nos referimos a la Absorbancia (A) de una muestra.
La Absorbancia es adimensional, varía desde 0 hasta  y se define como:
A = log 1/T = log10 (I0 / I1)
Por sustitución se comprueba que la absorbancia y el porcentaje de transmitancia están relacionados
mediante la siguiente expresión:
A= log (100 / %T)
A = 2 - log( % T)
Todos los métodos espectrofotométricos que miden absorción, responden a dos leyes básicas:
LEY DE LAMBERT:
¨La fracción de luz absorbida por un medio transparente es independiente de la intensidad de luz
incidente, y cada capa sucesiva del medio, absorbe una fracción igual de la luz que pasa a través de él¨.
Esto lleva a un decaimiento exponencial de la intensidad de luz a lo largo del paso óptico (b) en la
muestra, que puede ser expresado matemáticamente como sigue:
%T
Log10 (I0/I) = A = K b
b
b
Donde b = la longitud del paso óptico de la cubeta de espectrofotometría y K es una constante del medio,
que fue descifrada por Beer.
23
LEY DE BEER:
¨La cantidad de luz absorbida es proporcional al número de moléculas de cromóforo que la luz
atraviesa¨. En el esquema siguiente, la concentración de cromóforo en la Condición 1 (C1) es menor a la
concentración de cromóforo en la Condición 2 (C2), es decir C1  C2. El decaimiento del %T es más
pronunciado en la Condición 2.
Condición 1
Condición 2
%T
b
%T
b
b
b
La constante K, es proporcional a la concentración de cromóforo (c) : K = ac , donde aes la
absortividad o coeficiente de absorción, una propiedad del cromóforo en sí misma.
La absortividad a es una constante que depende:
 de la longitud de onda de la luz incidente,
 de la identidad de la sustancia analizada y
 del medio en que ésta se encuentre (pH, solvente e interacción con otras sustancias)
La constante a representa la probabilidad de absorción a una longitud de onda determinada
La LEY DE LAMBERT Y BEER queda resumida entonces, en la expresión:
Log10 (I0/I) = ac b
A = ac b
Cuando el paso óptico está expresado en cm y la concentración en M (molar), la absortividad se denomina
¨coeficiente de extinción molar o absortividad molar¨ (), entonces sus unidades son M-1 cm-1.
Cuando b=1 cm, la absorbancia se denomina Densidad óptica (DO).
DESVIACIONES DE LA LEY DE LAMBERT Y BEER
En algunas situaciones es posible que no se cumpla la relación lineal entre la A y la c, en esos casos
estamos ante desviaciones de la Ley de Lamber y Beer, por ejemplo:
1- En soluciones muy concentradas puede que se establezcan equilibrios entre dos especies con diferente
. (Por ej: dimerización).
2- En soluciones muy concentradas, la probabilidad de que todas las moleculas sean alcanzadas por la
radiación y puedan ser excitadas disminuye (efecto pantalla).
3- Cuando se trabaja con reacciones acopladas, debe esperarse sufuciente tiempo como para que se
alcance el equilibrio en ellas. (Por ej. El tiempo de incubación en el metodo de Biuret). Por otro lado, a
altas concentraciones la desviacion puede ser generada por insuficiente cantidad de uno de los
reactivos (Por ej. Insuficiente cantidad de Reactivo de Biuret).
4- Falta de uniformidad de la muestra o presencia de impurezas (fenómenos que dispersan la luz).
24
ESPECTROFOTOMETRÍA: ANÁLISIS CUANTITATIVO
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE SOLUTO EN UNA DISOLUCIÓN
CURVA DE CALIBRACIÓN
La gran mayoría de métodos instrumentales requieren una calibración, proceso que relaciona la señal
analítica medida con el instrumento con la concentración del analito que se desea estudiar. Uno de los
métodos frecuentemente utilizado es la curva de calibración En el caso de la espectrofotometría, la curva
de calibración es de especial interés porque permite determinar si existe una relación lineal entre la
absorbancia y la concentración del soluto (ver Ley de Lambert y Beer).
Una curva de calibración es un gráfico de absorbancia (A) o porcentaje de trnasmitancia (%T) en
función de la concentración de soluto; su empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay
que calcular la concentración del absorbente. En general se grafica A en función de la concentración (Fig.
2a) pero, hay instrumentos que sólo miden %T (Fig. 2b). En éste caso, deben transformarse las lecturas
de %T en valores de A, mediante el empleo de la ecuación: A = 2 - log( % T).
Alternativamente, puede trazarse el gráfico de %T en función de la concentración en papel
semilogarítmico (Fig.2c). De otro modo, resultaría difícil utilizando un número limitado de puntos obtenidos
experimentalmente, comprobar gráficamente si la lectura sigue o no la ley de Lambert y Beer .
Papel semilogarítmico
b
%T
A
Concentración (mg/ml)
c
%T
a
Concentración (mg/ml)
Concentración (mg/ml)
Fig. 2: Curvas de calibración
Los espectrofotometros miden T por lo que la escala del sistema de registro del aparato es lineal para %T
y logarítmica para A. Por éste motivo, el error en las lecturas de %T es constante en toda la escala, lo cual
no ocurre con la A. Sin embargo, debido a que A y concentración se relacionan proporcionalmente, en la
práctica se lee A.
Por consideraciones del error fotométrico, debe procurarse que los puntos situados entre valores de A
de 0,1 y 1,0 (80% y 10% T) sean representados de la forma más exacta posible al trazar la gráfica. Los
errores en la determinación de absorbancia dependen de la calidad del equipo. Por ejemplo, según el
grafico que se muestra a continuación (Fig. 3a), seria recomendable trabajar en el rango de absorbancia
0.3-0.8, en la región de mínimo error. En los equipos más modernos la precisión fotométrica que se
alcanza permite extender los límites antes mencionados.
Mediante una regresión lineal de los datos que caen en la región de mínimo error y teniendo en cuenta
el punto (0,0) se obtiene la constante de proporcionalidad entre absorbancia y concentración
(absortividad) la que permite calcular el valor de concentración de una muestra problema
25
(a)
(b)
Fig. 3: a) Variación del error de la medición en función de la absorbancia medida. b) Curva de
calibración en donde se observa la variación del error en función del valor de absorbancia medida
y la curva del ajuste realizada por cuadrados mínimos para la cual no se tuvieron en cuenta los
puntos en verde.
ESPECTROFOTOMETRÍA: ANÁLISIS CUALITATIVO
ESPECTRO DE ABSORCIÓN
Las soluciones absorben energía preferentemente en una ó más regiones del espectro
electromagnético, siendo la absorción inferior o nula en las demás regiones. Se denomina Espectro de
absorción a la representación gráfica de la probabilidad de absorción en función de la longitud de onda
(Fig. 4a). El espectro de absorción se determina midiendo la absorbancia a distintas longitudes de onda
para establecer la longitud de onda de máxima absorción (max).
En el siguiente ejemplo (Fig. 4a) max es aproximadamente 550nm. En la Fig. 4b se muestran 4 curvas
de calibración realizadas a diferentes longitudes de onda. Para hacer determinaciones cuantitativas, en
general es preferible trabajar a la max pues el error de la medición es mínimo y la sensibilidad es máxima.
0.8
A550nm (max)
0.6
A640nm
A490nm
Absorbancia
Absorbancia
0.6
1 mg/ml
2 mg/ml
3 mg/ml
4 mg/ml
5 mg/ml
8 mg/ml
10 mg/ml
0.4
A670nm
0.4
0.2
0.2
0.0
400
0.0
450
500
550
 (nm)
600
650
700
0
2
4
6
8
Proteinas (mg/ml)
10
Fig.4 a) Espectros de Absorción. b) Curvas de Calibración a diferentes longitudes de onda.
26
ESPECTROFOTOMETRÍA: EQUIPAMIENTO Y PROCEDIMIENTOS
ESPECTROFOTÓMETRO
Las mediciones de absorbancia se realizan en un espectrofotómetro, que básicamente consta de una
fuente de luz, un monocromador para seleccionar la longitud de onda, una cubeta transparente para
contener la muestra, un detector de intensidad luminosa y un sistema de registro.
Fig. 5 Esquema de un
espectrofotómetro
MEDICION DE LA ABSORBANCIA
1) Si tenemos una solución coloreada de concentración desconocida, la denominamos tubo problema.
Podemos conocer su concentración midiendo la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de
onda apropiada.
2) Previamente a la lectura, se determina la absorbancia de un tubo que contiene solvente, en ausencia
de la sustancia problema. A este tubo se le denomina Tubo Blanco. Este tubo puede contener otras
sustancias, además de disolvente, a la misma concentración en que se encuentra en el tubo problema,
pero no debe estar presente la sustancia que se desea cuantificar. Por ej. si la sustancia coloreada
problema se encuentra disuelta en agua conteniendo NaCl al 1% e KOH al 2%, el tubo blanco contendrá
NaCl al 1% e KOH al 2% en agua, sin la sustancia en estudio. La finalidad de usar el tubo blanco es
descontar la absorción de sustancias que no sean específicamente la sustancia problema y así poder
medir la absorbancia propia de la sustancia en estudio. Los equipos permiten descontar de manera
automatica el valor de absorbancia del tubo blanco de la abosorbancia de los tubos testigo y problema.
3) Un tercer tipo de tubo que denominamos Tubos Testigo corresponde a soluciones de concentración
conocida de la sustancia en estudio. Se preparan disolviendo una cantidad conocida de soluto en un
volumen conocido de solvente conteniendo las mismas sustancias que la solución problema: por ej. NaCl
al 1% e KOH al 2% para el caso que se está analizando. Se leen de la misma forma que se hizo con el
tubo problema. Finalmente, la concentración del tubo problema se puede calcular mediante la
interpolación del valor de absorbancia en una curva de calibración construida con los tubos testigo.
4) Lo descripto en los puntos anteriores es válido para medir la concentración de sustancias incoloras
siempre que estas sustancias sean capaces de reaccionar con otras, dando productos de reacción
coloreados y que el color finalmente obtenido sea proporcional a la concentración de la sustancia en
estudio. El tubo blanco, el cual no contiene la sustancia que desarrolla color, deberá ser tratado de forma
similar al tubo problema y a los testigos, es decir tendrá los mismos reactivos y se los procesará de forma
similar y paralela a los otros tubos. Hay sustancias incoloras que tienen la propiedad de absorber la luz
ultravioleta; en estos casos pueden ser cuantificadas sin tratamiento previo, midiendo la absorbancia a
una  comprendida entre 200 y 400 nm (correspondiente al rango de luz ultravioleta).
27
GUIA DE ESTUDIO
1. Observe el esquema del espectro electromagnético del Esquema 1 y compare c (velocidad),  (longitud
de onda),  (frecuencia) y energía de la radiación electromagnética indicada.
2. Defina luz blanca y luz monocromática.
3. ¿Qué tipos de monocromadores conoce ?
4. ¿Qué efecto produce la absorción de la luz por una molécula?
5. ¿Existe alguna restricción con respecto a la longitud de onda de la luz que una sustancia puede
absorber?
6. ¿Cuál es la utilidad de un espectro de absorción?
7. Concepto de ley de Lambert y Beer.
8. Definición de absorbancia y transmitancia.
9. ¿Cómo se preparan y qué utilidad tienen los tubos blanco, testigo y problema?
10. ¿Cómo construye y qué utilidad tiene una curva de calibración ?
11. ¿Cómo elige la longitud de onda de trabajo?
12. ¿Cuál es el fundamento químico del método de Biuret para cuantificar proteínas? (Ver TP2 de esta
guía).
13. ¿ Que aplicaciones puede tener la espectrofotometria en el contexto de la biologia?
28
PROBLEMAS
1- Una disolución de proteínas de concentración desconocida, se diluye 5 veces con agua destilada. A
partir de esta dilución, se vuelve a diluir 3 veces con agua destilada. Esta última dilución dió por método
Biuret una absorbancia de 0,12 (a = 0,06  0.01 ml/mg cm). ¿Cuál es la concentración de la solución
original de proteínas? R = 30 mg/ml.
2- En un laboratorio se realiza de manera rutinaria la determinación de la concentración de proteínas en
suero humano aplicando el método de Biuret.
a) Para esto se preparan las disoluciones de reactivos que se utilizan para hacer reaccionar con una
serie de testigos. Los valores de absorbancia de estos testigos se utilizan para construir una curva de
calibración. ¿Cómo?
b) Periódicamente el laboratorio recibe muestras de disoluciones de proteínas de concentraciones
desconocidas (“problemas”) las que son ensayadas utilizando los mismos reactivos y producen
valores de aborbancia que al ser interpolados en la curva de calibración permiten determinar la
concentración de estos “problemas”. ¿Cómo?
c) También periódicamente se debe corroborar la estabilidad físico-química de los reactivos utilizados
en esa reacción colorimétrica. Para ello se utiliza una muestra testigo la cual debe producir siempre el
mismo valor de absortividad. El día 30 después de la preparación de los reactivos y de la
construcción de la curva de calibración un testigo de concentración 4mg/ml dio una A = 0,242.
i) ¿Es posible asumir que la absortividad es la misma que la indicada en el ejercicio 1?
ii) ¿Será correcto utilizar aquella curva de calibración para interpolar el valor de A obtenido en una
nueva disolución problema (A= 0.09) y así determinar su concentración de proteínas ?
iii) ¿ Qué volumen de la disolución del punto ii se debe pipetear para tomar 100 g de proteínas?
R = 67 l.
d) Una semana después se desea cuantificar la concentración de proteínas en otra muestra problema
utilizando los mismos reactivos para la reacción colorimétrica. El testigo de concentración 4 mg/ml dio
un valor de absorbancia de A=0.35. Indique si es correcto hacer la cuantificación con los datos que
dispone. JSR.
3- Para la determinación de la concentración de una sustancia X se construyeron tres curvas de
calibración empleando métodos colorimétricos diferentes. Se estima que la concentración del tubo
problema de X es el valor aproximado A.
a) Indique cuál curva de calibración elegiría para determinar la concentración de X. JSR.
b) Explique a qué podrían deberse las diferencias entre las tres curvas.
c) ¿Cómo haría para determinar la concentración de X, si sólo contara con la curva de calibración 1?
1
Absorbancia
2
3
A
Concentración (mg/ml)
4- Se realizó un espectro de absorcion del flunitrazepam, que es una droga que posee efectos
hipnoticos, anticonvulsionante, ansiolitico y miorelajante de acción central. Los datos de la Tabla 1
corresponden a absorbancias de una solución de flunitrazepam 25 M en etanol 3% V/V y en tris HCL
50 mM, pH 7,4 medidos a diferentes longitudes de onda:
29

210
220
250
260
270
280
290
320
330
340
350
360
370
A
0.2
0.604
0.446
0.407
0.320
0.286
0.272
0.250
0.190
0.120
0.070
0.040
0.020
a) Grafique el espectro de absorción y coloque el título correspondiente.
b) ¿Qué longitud de onda elegiría para realizar una curva de calibración?
c) ¿Cómo se preparó el tubo blanco?
d) ¿Es necesario descontar el blanco cada vez que se cambia la longitud de onda? Si-No. J.S.R.
5- El siguiente es un protocolo de trabajo para la cuantificación de ADN en base a su contenido de
desoxirribosa empleando el reactivo de difenilamina.
Blanco
NaCl 1M
Testigo
Problema
1ml
ADN 100 µg/ml en Nacl 1M
1 ml
ADN [ ] desc en NaCl 1M
difenilamina
2ml
Volumen final
a) Complete los espacios en blanco.
b)¿ Por qué coloca NaCl 1M y no agua destilada en el blanco?
c)¿ Cómo realizaría una curva de calibración si sólo cuenta con una solución de ADN de 100 g/ml?
d)¿ Qué precauciones debe tener al elegir las concentraciones de los testigos?
e)¿ Cómo corregiría este protocolo en los casos en que: 1-la absorbancia del problema sea >> 0,3 y 2la absorbancia del problema sea << 0,1 ?
f)¿ Por qué deben tener todos los tubos igual volumen final?
6-
La siguiente tabla corresponde a absorbancias de soluciones estándares de albúmina sérica bobina:
a)¿Se cumple la ley de Lambert y Beer en este intervalo
[Albúmina] (Mx10-3)
A
de concentraciones?
b) Si no fuera así.¿Cuál es el límite superior de
0.0
0.00
concentración del rango lineal?
0.2
0.033
c) Determinar la concentración de albúmina cuya
0.5
0.081
absorbancia medida en las mismas condiciones
1.25
0.195
experimentales es 0,116.
3.12
0.440
7.81
0.703
7- Calcule el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol si A = 0,2 y la concentración es 11.428 oles/l,
= 410 nm y b = 1 cm. R = 17.500
8- Se cuantificó una solución de tirosina por absorción al UV. Esta solución dio A = 0,16 ; calcule la
concentración nM de tirosina considerando que dicha solución había sido diluida primero 3 veces y
luego 2 veces más. 274nm= 14.000 L.mol-1 . cm-1 ,  = 274 nm. R = 6,85.10-5 M.
9- Una solución de una sustancia de PM 600 g/mol a una concentración de 40 g/ml tiene A = 0,3 a 540
nm, medida en una cubeta de 1 cm de paso óptico. Calcule el coeficiente de extinción molar. R = 4.500
30
Absorbancia
10- Si tuviera una mezcla de las sustancias A y B. ¿Qué longitud de onda elegiría para cuantificar cada
una de ellas?
0.4
A
0.3
0.2
B
0.1
0.0
300
450
600
750
Long Onda (nm)
Absorbancia
11- Una solución contiene dos flavonoides : flavonoide 1 (F1) y flavonoide 2 (F2). Se quiere cuantificar
ambos sin una purificación previa. Analizando la Fig. 6 se
observa que entre 220 nm y 420 nm sus espectros se
F1
superponen, por lo tanto la cuantificación de cualquiera de
ellos interfiere con la del otro. A longitudes de onda superiores
a 420 nm sólo absorbe F1. Calcule la concentración molar de
F2
F1 y F2 en ésa solución sabiendo que:
Testigo de F1
Testigo de F2
c1 = 15 M
c2 = 15 M
A350 = 0,05
A350 = 0,3
A450 = 0,15
200
300
400
500
Longitud de onda (nm)
600
Solución problema (mezcla de F1/F2)
c1 = ? c2 = ?
A350 = 0,45
A450= 0,3
Respuesta:
concentración de F1=30 µM.
concentración de F2=17,5 µM.
31
EJERCITACION ADICIONAL
1- Calcule el número de moles, micromoles y milimoles que hay en 2g de Na(OH) (PM=40).
2- ¿Qué cantidad de glucosa (PM=180) tiene que pesar para preparar 200 ml de una solución 0,05 M?
R = 1,8 g.
3- ¿Qué volumen de una solución 10 mM se puede preparar con 1 g de glucosa (PM=180). R = 555,6 ml.
4- Si tiene 3 litros de una solución de Na(OH) 0,5 M, ¿Cuántos moles y que concentración molar poseen
los siguientes volúmenes: a) 50 ml; b) 0,25 ml; c) 1 litro.
R: a) 0.025 moles, 0.5 M; b) 1.25 x 10-4 moles, 0.5 M; c) 0.5 moles, 0.5 M
5- ¿Qué molaridad tiene una solución que contiene 60 gr de NA(OH) (PM=40) por litro? R: 1.5 M.
6- ¿Qué cantidad de NA(OH) (PM=40) estan contenidos en 3 litros de una solución 2.5 M ? R: 300gr.
7- Una solución de ácido sulfúrico al 98% P/P, cuya densidad es 1.8 g/cm3, ¿qué molaridad tiene? R: 18
M.
8- ¿Cuál será la molaridad de una solución de ácido clorhídrico (PM=36.5) al 37% P/P cuya densidad es
1.19 g/cm3?. R: 12 M
9- ¿Cómo procedería para preparar 2 litros de una solución de ClK 10 mM a partir de una solución 3 M ?
R: tomar 6.67 ml (3 M). colocarlos en un matraz de 2 litros enrasar con agua destilada.
10-Se quieren preparar 6 litros de una solución 0.25 M de ácido sulfúrico a partir de una solución 63% P/P
(densidad=1.7 g/cm3 ). ¿Qué volumen debe tomar?. R: 137,28 ml.
11-Los siguientes son los resultados de la cuantificación de H2SO4 en una misma muestra realizado por
un método "A" por cuatro analistas diferentes:
a- 50,00 % P/P, densidad= 1,3952 g/ml
b- 70,00 % P/V
c- 7,00 M
d- 7100 mM
De acuerdo al enunciado anterior diga:
a-¿Cómo procede para comparar los resultados anteriores?
b-¿Que puede decir acerca de la precisión del método empleado en la cuantificación?
DATOS: PM H2SO4 = 98,08
12-Se desea investigar los efectos de flunitrazepam sobre el comportamiento de ratas en situación de
"stress". Para ello cuenta con dos lotes de cinco ratas de 300 g cada una. El lote Nº1 (experimental) es
inyectado con una solución de flunitrazepam 67µM en cloruro de sodio 0,8775 % P/V (solución
fisiológica).
a) ¿Cómo procede para preparar 100 ml de dicha solución ?
b) ¿Cuál es la utilidad del segundo lote de ratas? ¿Con qué inyecta esas ratas? ¿Cómo prepara esa
solución?
c) Si la dosis de flunitrazepam cuyo efecto se desea investigar es 70 µg/kg de peso corporal, ¿qué
volumen debe inyectar a cada animal?.
DATOS: flunitrazepam = droga sólida , PMflunitrazepam = 313,3 PACl = 35,5 PANa = 23
32
13-
En el siguiente gráfico se muestran espectros de absorción de varias sustancias. ¿Cuál de las
longitudes de onda indicadas elegiría para luego trabajar con un fotocolorímetro y cuál para trabajar
con un espectrofotómetro? Estos espectros fueron obtenidos con un espectrofotómetro o con un
fotocolorímetro? Podria obtener un espectro como el B si sólo dispusiera de un fotocolorómetro para
analizar su muestra?
Absorbancia
0.4
0.3
B
A
0.2
0.1
0.0
C
300
450
600
750
Long Onda (nm)
14- Calcular la absorbancia que corresponde a cada uno de los siguientes valores de transmitancia:
a) 0%
b) 0,2%
c) 0,8%
d) 1,52%
e) 68%.
15- Se desea investigar el contenido de glucosa en sangre después de la administración por vía oral de
0,5 g de dicho compuesto. Se trabajó con un grupo de 20 ratas de 2 meses de edad, peso promedio
300 g. Se tomaron muestras de sangre a 0, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos después de la ingestión y se
determinó en suero la cantidad de glucosa por un método fotocolorimétrico, expresó como el valor
promedio en mg % P/V de glucosa en sangre. (Tabla 4). En otro experimento se tomó otro grupo de
20 ratas con las mismas características y sometidas al mismo tratamiento que las anteriores. Una
hora antes del experimento fueron inyectadas por vía endovenosa con 200 l de una solución 20 M
de Glucagón (el glucagón es una hormona pancreática que incrementa el nivel de glucosa por la
estimulación de la degradación de glucógeno en higado) (Tabla 5).
a) Identifique para cada experimento la variable dependiente y la independiente. J.S.R
b) Grafique los resultados y coloque título a los mismos.
c) Indique la ecuación matemática a la que se ajustan los datos.
TABLA 4
TABLA 5
mg % p/v glu/sangre
tiempo min
mg % p/v glu/sangre
tiempo min
70
0
140
0
105
30
175
30
122
45
195
45
140
60
210
60
175
90
260
90
210
120
290
120
16- Postule dos modelos de experimentación donde pueda identificar variables dependientes e
independientes.
33
TRABAJO PRACTICO Nº 2
ESPECTROFOTOMETRÍA
PARTE PRÁCTICA
CUANTIFICACIÓN DE ALBÚMINA POR EL MÉTODO DE BIURET
FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE BIURET (GORNALL, A.G ET AL., 1949, J. BIOL. CHEM., 177-766):
Las sustancias que contienen dos grupos -CONH2 (amida); -CH2NH2 (amina); -C(NH)(NH2) (diamina); o
-CSNH2 (tioamida), unidos, sea directamente entre sí, o a través de un átomo de carbono o nitrógeno; y
las estructuras peptídicas que contengan como mínimo dos enlaces peptídicos, en presencia de Cu++y en
solución alcalina, forma un complejo de color violeta, el complejo de Biuret.
O
C
C
NH
RC H
O
C
NH
RC H
O
HN
Cu2+
H CR
C
O
HN
H CR
Violeta-púrpura
El método de biuret desarrollado por Gornall et al. permite cuantificar soluciones que contengan entre 1 y
10 mg de proteínas por mililitros y no depende de la compodición de aminoácidos.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Reactivo de biuret: Disolver 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) y 6g de tartrato de sodio y potasio
tetrahidratado en 500ml de agua destilada. Agitando constantemente, añadir 300ml de Na(OH) al 10%.
Diluir hasta 1 litro con agua destilada y guardar en frasco de plástico.
Solución testigo: Albúmina bovina a una concentración de 5mg/ml en agua destilada.
Protocolo: En el tubo blanco colocar 0.5 ml de agua destilada.
En los tubos testigo de la curva de calibración, colocar entre 0.1 y 0.5 ml de solución testigo de
albúmina y completar con agua tal que cada tubo contenga un volumen de 0.5ml.
En el tubo problema colocar 0.5 ml de la solución problema.
Agregar a cada uno de los tubos 2 ml de reactivo de biuret.
Agitar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Leer la absorbancia a 550 nm. Graficar la curva de calibración y realizar la regresión lineal de
los datos.
REACTIVOS
CURVA DE CALIBRACIÓN
TUBO
TUBO
PROBLEMA
BLANCO
T1
T2
T3
T4
T5
Agua
Disolución de albumina 5 mg/ml
Disolución de albumina de
concentracion desconocida
Reactivo de Biuret
Volumen Final
Concentración de proteínas
34
RESULTADOS
Tubo
T1
T2
T3
T4
T5
P
CURVA DE CALIBRACIÓN
DISCUSIÓN
Absorbancia
[Proteinas] (mg/ml)
35
BIBLIOGRAFÍA ESPECÍFICA (Espectrofotometría)
- Problemas de Química. J.M. Esteban y J.M. Cavanillas. Ed. Alhambra. 4a. 1976. España.
- Cálculos en Bioquímica. I.J.Segel. Ed. Acribia. Saragoza. España. 1972.
- Métodos instrumentales de análisis. H.H. Willard,.L.Merritt Jr., y J.A.Dean. Ed. CECSA. México. 1974.
- Análisis Instrumental. D.A. Skoog y D.M. West. Ed.Interamericana. México. 1975.
- Química Clínica: Bases y Técnicas. R.J. Henry, D.C. Cannon y J.W. Winkelman. Tomo I. 2a Ed. Jims. Barcelona. España.1980.
- Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3º Ed. NY. USA.2000
- Spectrophotometry and Spectrofluorometry A practical Approach. Edited by Michael G. Gore. Ed. Oxford University Press. Inc. NY.
USA. 2000.
36
TRABAJO PRACTICO Nº 3
PURIFICACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS I
Los problemas deberán ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En caso de necesitar
aclarar dudas, los docentes estarán disponibles en sus horarios de consulta en la cátedra. Los alumnos serán
evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante el desarrollo de la experiencia práctica (evaluación oral),
sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP.
OBJETIVOS
- Conocer los fundamentos teóricos de las técnicas utilizadas en la purificación y caracterización de proteínas.
- Valorar la importancia del dominio de diferentes técnicas y del conocimiento acerca de las características
particulares de la proteína a purificar, para poder aplicarlos con criterio.
- Adquirir y aplicar herramientas teóricas para la resolución de los problemas planteados.
TEMAS PARA REPASAR
123456-
Estructura de Proteínas. Abreviaturas de los nombre de los aminoácidos: código de 1 y 3 letras.
Equilibrio Acido-Base de amino ácidos y de proteínas.
Coeficiente de sedimentación.
Enzimas proteolíticas.
Concepto Actividad específica
Temas 2-3 del programa de la materia.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas constituyen uno de los grupos de moléculas biológicas más importantes en cuanto a
su diversidad de funciones: catálisis, de movimiento, de recepción de información, de almacenamiento o
de respuesta inmune entre otras. Las proteínas son macromoléculas lineales constituidas por la unión de
aminoácidos. Estas estructuras lineales se pliegan adquiriendo una estructura tridimensional (estructuras
secundaria y terciaria) particular que determinará su función. La secuencia de aminoácidos de la proteína
(estructura primaria) está determinada a su vez por la información genética contenida en la secuencia de
nucleótidos de los ácidos nucleicos de un organismo (en general el ADN, en el caso de algunos virus es
ARN).
Algunas
proteínas
sufren
la
adición
de
residuos
no
aminoacídicos
(modificaciones
postraduccionales) que también modulan su estructura y función.
La proteómica, ciencia que relaciona las proteínas con sus genes, estudia el conjunto de proteínas
(proteoma) que se expresan en la célula a partir del genoma en un momento dado. Esto permite tener una
imagen de todas las proteínas expresadas en un determinado momento y bajo determinadas condiciones
ambientales. Permite identificar aquellas proteínas cuya presencia, ausencia o alteración está relacionada
con diferentes condiciones metabólicas y/o patológicas, correlacionandolas con diferentes estadios
fisiológicos o patológicos.
La enorme complejidad del proteoma de los organismos vivos obliga al empleo de diversas
técnicas para separar las proteínas. Muchas de estas técnicas, como la cromatografía líquida y la
37
electroforesis entre otras, permiten tanto la separación de proteínas (purificación) como su
caracterización.
Durante la separación de las proteínas es importante poder cuantificar el rendimiento del proceso
de purificación de las proteínas de interés, para lo que se utilizan diferentes técnicas espectroscópicas
(fluorescencia, espectrofotometría).
El análisis de la estructura y de la actividad de las proteínas nos permitirá relacionar cambios en
estos dos parámetros con condiciones fisiólógicas o patológicas.
TÉCNICAS UTILIZADAS EN EL ESTUDIO DE PROTEÍNAS:
PROCESO
PURIFICACIÓN
CUANTIFICACIÓN
ANÁLISIS DE
ESTRUCTURA
ANÁLISIS DE
ACTIVIDAD
Fraccionamiento subcelular
por centrifugación diferencial y
por gradiente de sacarosa.
Espectrofotometría
Espectrofluorimetría
Actividad enzimática
Precipitación salina.
Espectrofluorimetría
Dicroismo circular
Unión de
radioligandos
Diálisis.
ELISA
RMN
Formación de
complejo Ag-Ac
Cromatografía de filtración por
gel.
FT-IR
Conductancia a
iones
Cromatografía de intercambio
iónico.
MALDI-MS
Cromatografía de afinidad.
Secuenciación
Cromatografía líquida de alta
presión.
Perfil hidropático
Electroforesis en geles.
Difracción de rayos X
Isolelectroenfoque y
electroforesis bidimensional.
Comparación de
secuencias.
PROBLEMAS
1. Una disolución de una proteína cuya secuencia incluye tres residuos de triptofano (Trp), sin residuos
de tirosina, ni de fenilalanina, tiene una absorbancia de 0,1 a 280 nm en una celda de 1 cm de paso
óptico. Obtener la concentración de la proteína en unidades de molaridad. Si la proteína tiene una
masa molecular de 100 kDa, calcular la concentración en miligramos de proteína por mililitro de
disolución. trp =3400 cm-1.M-1.
2. Determinación del tamaño. Las movilidades electroforéticas relativas de una proteína de 30 kDa y una
de 92 kDa utilizadas como estándar en un gel de SDS-poliacrilamida son, respectivamente, 0,8 y
0,41. ¿Cuál es la masa aparente de una proteína que tiene una movilidad de 0,62 en este gel?
3. Elegir la columna. El octapéptido AVGWRVKS se digirió con tripsina. (a) ¿Sería el intercambio iónico o
la exclusión molecular la técnica más apropiada para separar estos productos? Explicarlo (b) Suponer
que el péptido se digiere con quimiotripsina. ¿Cuál sería la técnica de separación óptima? Explicarlo
38
4. Esferas que sedimentan ¿Cual es la dependencia entre el coeficiente de sedimentación S de una
proteína esférica y su masa? ¿Cuánto más rapidamente sedimentará una proteína de 80 kDa que una
de 40 kDa?
0.012
pH 7
0.008
0.004
0.000
a)
320
340
360
380
400
420
440
Intensidad de fluorescencia (UA)
intensidad de fluorescencia (UA)
5. Estructura terciaria. La secuencia de la proteína FABP contiene sólo un residuo triptofano, ubicado en
su interior hidrofóbico. El siguiente gráfico muestra la emisión de fluorescencia de FABP cuando es
excitada a 280 nm, a pH fisiológico (a) y a pH ácido (b). Qué conclusiones se pueden obtener acerca
del efecto del pH sobre la estructura tridimensional de la proteína?
0.012
pH 2.5
0.008
0.004
0.000
longitud de onda (nm)
b)
320
340
360
380
400
420
440
longitud de onda (nm)
6. Transiciones hélice-ovillo. a) las medidas de NMR han demostrado que la poli-L-lisina es un ovillo
estadístico a pH 7 pero se vuelve -hélice cuando el pH se eleva por encima de 10. Explicar esta
transición conformacional dependiente del pH. b) Predecir la dependencia del pH en la transición
hélice-ovillo del poli-L-glutamato.
7. Secuencia de proteínas I. Determinar la secuencia de un hexapéptido basándose en los siguientes
datos. Nota: Cuando no se conoce la secuencia, los aminoácidos se separan con una coma.
(ver datos en la Tabla de ruptura específica de los polipéptidos, al final de la guía).
Composición de aminoácidos
Análisis N-terminal del hexapéptido
Digestión por tripsina
Digestión por carboxipeptidasa
Digestión por quimiotripsina
(2R,A,S,V,Y)
A
(R,A,V) y (R,S,Y)
no hay digestión
(A,R,V,Y) (R,S)
DATOS
1 residuo de -hélice contribuye con 1.5 Å a la longitud total de la -hélice.
1 residuo de hoja plegada contribuye con 3.5Å a la longitud total de la estructura .
1 residuo = 110 D
Ruptura específica de los polipéptidos
Reactivo - Ruptura química
Lugar de ruptura
Bromuro de cianógeno
Lado carboxilo de los residuos metionina
O-Iodobenzoato
Hidroxilamina
2-Nitro-5tiocianobenzoato
Lado carboxilo de los residuos triptofano
Enlaces asparragina-glicina
Lado amino de los residuos cisteína
Ruptura enzimática
tripsina
Lado carboxilo de los residuos lisina y arginina
39
clostripaína
Proteasa de Staphylococcus
Lado carboxilo de los residuos arginina
Lado carboxilo de los residuos aspartato y glutamato
(el glutamato solo en ciertas condiciones)
Lado carboxilo de los residuos arginina
Lado carboxilo de los residuos tirosina, triptofano,
fenilalanina, leucina y metionina.
Lado amino del aminoácido C-terminal (salvo arginina,
lisina y prolina)
trombina
quimiotripsina
Carboxipeptidasa A
8. Problema de purificación de proteínas. Completar la siguiente tabla
Proteína
total (mg)
Actividad
total
mol/min
20 000
4.000000
5000
3.000000
1500
1.000000
Cromatografía de
exclusión molecular
500
750 000
Cromatografía de
afinidad
45
675 000
Procedimiento de
purificación
Extracto puro
Precipitación con
(NH4)2SO4
Cromatografía
DEAE-celulosa
Actividad
específica
mol/min/mg
proteína
Nivel de
purificación
Rendimiento
(%)
1
100
9. ¿Haciendo más enzima? Durante la purificación de una enzima un investigador realiza un paso de
purificación que produce un incremento en la actividad total dando un valor mayor que el que está
presente en el extracto crudo. Explicar cómo se puede incrementar la actividad total.
10- Suponga que está desarrollando una marcha de purificación para obtener una enzima soluble propia del
citoplasma de las células hepáticas de ratas. Inicialmente se desea evaluar el rendimiento del primer paso
del proceso que consiste en una centrifugación a 1000g durante 15 min de un homogenato de tejido
hepático. Para ello es necesario cuantificar proteinas y actividad enzimática por lo que se tomaron
alícuotas de 0.5 ml de las fracciones H y S1 y se diluyeron hasta 4 ml con agua bidestilada. Por otra parte
la fraccion P1 fue resuspendida en 10 ml de agua. El siguiente esquema resume el protocolo aplicado
Centrifugación
1000 x g
Homogenato
0.5 gr de tejido
en 5 ml de
buffer
Muestra H =
alúcuota de 0.5
ml de H en 4 ml
de agua
Sobrenadante
1 (S1)
Pellet 1
(P1)
Muestra S1 =
alúcuota de 0.5
ml de S1 en 4 ml
de agua
Muestra P1 = P1
resuspendido en
10 ml de agua
40
En la siguiente tabla se muestran los valores obtenidos para la concentración de proteínas y los moles de
producto formado calculados a partir de valores de absorbancia a 550nm obtenidos en la cuantificación de
proteínas (testigo 1 mg /ml, A=0.1) y los valores de absorbancia a 410nm obtenidos para la cuantificación
del producto formado durante 15 min de reacción (producto= 17500 M-1 cm-1).
mg prot/ml
Muestra H
Muestra S1
Muestra P1
2.04
1.21
1.05
µmoles de
Producto
16.62
15.6
3.16
1) Calcule los valores de proteína total y actividad total y complete la sigueinte tabla.
2) En que fracción se recuperó la mayor cantidad de enzima? Por qué?
3) Según los datos mostrados, la centrifugación a 1000 g por 15 min permite purificar la enzima hepática?
Procedimiento de
purificación
Proteína
total (mg)
Actividad
total
mol/min
Actividad
específica
mol/min/mg
proteína
Nivel de
purificación
Rendimiento
(%)
--
--
Homogenato (H)
Centrifugacion a
1000g (S1)
Centrifugacion a
1000g (P1)
PROBLEMAS (a resolver en Teórico Práctico)
1‐ Las proteínas transmembranas contienen a menudo ‐hélices. Teniendo en cuenta que el interior de las membranas es muy hidrofóbico, predecir qué tipo de aminoácidos habría en estas hélices. ¿Porqué una ‐hélice es especialmente adecuada para encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una membrana? 2‐ En un aminoácido como la alanina la forma principal a pH 7 en disolución es la zwitteriónica. Suponiendo un valor de pKa = 8 para el grupo amino y un valor de pKa = 3 para el ácido carboxílico, calcular la proporción entre la concentración de la forma neutra del aminoácido y (con el ácido carboxílico protonado y el grupo amino neutro) y la forma zwitteriónica a pH 7. 3‐ Cuáles de los siguientes aminoácidos tendrá mayor tendencia a encontrarse en el interior de una proteína soluble y cuáles en su superficie? JSR ‐ valina: (‐CH‐(CH3)2) ‐ asparragina: (‐CH2‐CONH2) +
‐ lisina: (‐CH2‐CH2‐CH2‐CH2‐NH3 ) ‐leucina:(‐CH2‐CH1‐(CH3)2)
‐ aspártico: (‐CH2‐COO‐) 4‐ La tropomiosina, una proteína muscular de 93 kDa , sedimenta más lentamente que la hemoglobina (65 kDa). Sus coeficientes de sedimentación respectivos son 2,6 S y 4,31 S. ¿Cuál es la carácteristica estructural responsable de su lentitud en la sedimentación? 5‐ El gen que codifica una proteína que tiene un único puente disulfuro experimenta una mutación que sustituye un residuo de serina por uno de cisteína. Se quiere comprobar si el apareamiento de los sulfhidrilos en este mutante es el mismo que en la proteína original. Proponer un experimento que resuelva esta cuestión. BIBLIOGRAFÍA ESPECÍFICA (PROTEÍNAS)
Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3º Ed. NY.
USA.2000
Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
41
TRABAJO PRACTICO Nº 4
PROTEÍNAS II:
PARTE PRÁCTICA I: Purificacion de fosfatasa ácida de hígado de rata
OBJETIVOS:
- Adquirir destreza en el manejo de técnicas de laboratorio para purificación de proteínas
- Obtener una fracción enriquecida en fosfatasa ácida, la cual será utilizada en las actividades prácticas de
cinética enzimática.
El objetivo principal de cualquier método de purificación es obtener una sustancia de interés aislada
del resto de compuestos presentes en la muestra original. El rendimiento (o porcentaje de recuperación)
alcanzado durante el proceso de purificación, es la relación entre la cantidad total de la sustancia de
interés obtenida respecto a la cantidad inicial de la misma. El proceso de purificación a partir de muestras
biológicas puede resultar muy trabajoso debido a que estas muestras son mezclas extremadamente
complejas de sustancias químicas como por ejemplo diferentes tipos de lípidos, proteínas, hidratos de
carbono, material genómico (ADN y ARN), compuestos solubles, entre otros. Por esta razón, los
protocolos de purificación suelen constar de sucesivos pasos en los que se van eliminando sucesivamente
diferentes sustancias, lo cual a su vez suele ser acompañado de métodos de monitoreo del grado de
purificación logrado en cada paso. En el presente Trabajo Práctico se llevará a cabo una marcha de
purificación con el objetivo de obtener una fracción enriquecida en fosfatasa ácida, la cual será utilizada en
las actividades prácticas de Cinética Enzimática.
Las fosfatasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de uniones ésteres de fosfato. Fosfatasa
Ácida es el nombre dado a todas las fosfatasas que tienen actividad óptima por debajo de un pH de 7.0.
Éstas se localizan fundamentalmente en los lisosomas.
Los lisosomas son estructuras esféricas rodeadas por una membrana. Podrían considerarse “bolsas
de enzimas” las que, en caso de liberarse, destruirían la célula. Una característica común entre ellos es
que contienen enzimas hidrolíticas que funcionan a pH ácido: se han identificado unos 40 tipos distintos
de enzimas hidrolíticas que degradan proteínas (proteasas), ésteres de sulfato (sulfatasas), lípidos
(lipasas y fosfolipasas) o fosfatos de moléculas orgánicas (fosfatasas).siendo la más común la fosfatasa
ácida. El pH interno del lisosoma es de aproximadamente 5, pH óptimo para la actividad de las enzimas
que se encuentran en su interior.
Para obtener la proteína de interés debemos fraccionar la célula y precisar qué fracción está
enriquecida en la proteína que nos interesa. Para esto, procederemos a diagramar un protocolo de
centrifugación diferencial que nos permita obtener la fracción celular enriquecida en la proteína de interés.
En nuestro caso, la fosfatasa ácida se encuentra como se mencionó anteriormente, en los
lisosomas, que se aislan en la fracción microsomal del protocolo de centrifugación diferencial.
42
PURIFICACIÓN DE FOSFATASA ÁCIDA DE HÍGADO DE RATA:
- Material de partida: hígado de rata congelado.
- Buffer de purificación: sacarosa 0,33 M, buffer fosfato 10 mM pH 7,4, Cl2Mg 3 mM.
- Buffer de actividad: acido acético- acetato de sodio, pH 5, 0,1 M.
Centrifugación
1000 x g
Homogenato
Sobrenadante 1
(S1)
Pellet 1: fracción
nuclear (P1)
Centrifugación
10000 x g
Sobrenadante 2:
Lisosomas + Proteínas
Pellet 2: fracción
mitocondrial (P2)
solubles citosólicas
Figura 1. Representación esquemática de un fraccionamiento subcelular por
centrifugación para obtener la fracción microsomal como sedimento.





Paso 1: cortar 0,5 gr hígado y resuspenderlo en 5 ml de buffer fosfato pH 7 + sacarosa 0,33 M
(condiciones isosmóticas), concentración de tejido de 10 % P/V
Paso 2: homogeneización en frio.
Paso 3: centrifugación a 1000xg (2800 rpm en la centrífuga del TP) durante 10 min
Paso 4: tomar el sobrenadante de la centrifugación anterior y someterlo a una nueva
centrifugación durante 20 min. a 10000xg (8900 rpm en la centrífuga del TP).
Material final: sobrenadante.
Tomar alicuotas de cada fracción (homogenato, sedimento 1, sobrenadante 1, sedimento 2 y
sobrenadante 2). Estas muestras se utilizarán luego para cuantificar proteínas totales por método de
Biuret y medir actividad de fosfatasa ácida en cada una de las fracciones (practico Nº 5). Con estos datos
podremos construir el cuadro de purificación.
Como se discutió anteriormenter, la fosfatasa ácida se encuentra dentro de los lisosomas, por lo que
para poder cuantificarla y medir su actividad es necesario liberarla. Esto se logra sometiendo a los
lisosomas a condiciones hipo-osmóticas (agua bidestilada)
Las distintas alicuotas serán diluidas en condiciones hipo-osmóticas de acuerdo al siguiente
esquema:
43
Fracción
Alícuota
de la fracción
Agua bidestilada
Volumen total
Homogenato
0,5 ml
3,5 ml
4 ml
Pellet 1
Todo el pellet
~20 ml
20 ml
Sobrenadante1
0,5 ml
3,5 ml
4 ml
Pellet 2
Todo el pellet
~10 ml
20 ml
Sobrenadante 2
0,5 ml
3,5 ml
4 ml
Luego del shock hipo-osmótico las muestras serán conservadas a -18ºC (en freezer) hasta el
siguiente práctico en el cual serán utilizadas.
BIBLIOGRAFÍA ESPECIFICA (Purificación de Proteínas)
- Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3º Ed. NY.
USA.2000
- Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
44
TRABAJO PRACTICO Nº 5
PURIFICACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS III
PARTE PRÁCTICA II: Cuantificación de fosfatasa ácida
OBJETIVOS
- Seguir la eficiencia de la “marcha” de purificación mediante la cuantificación de proteínas totales y la
actividad de fosfatasa ácida.
Cada grupo tomará las alicuotas colectadas en el practico anterior correpsondientes a las distintas
fracciones obtenidas durante la purificación y cuantificará cantidad de proteínas totales y actividad
enzimática.
MATERIALES Y MÉTODOS
EXPERIMENTO Nº1:
CUANTIFICACIÓIN DE PROTEÍNAS TOTALES: MÉTODO DE BIURET
Reactivo de biuret: Disolver 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) y 6g de tartrato de sodio y potasio
tetrahidratado en 500 ml de agua destilada. Agitando constantemente, añadir 300ml de Na(OH) al 10%.
Diluir hasta 1 litro con agua destilada y guardar en frasco de plástico.
Solución testigo: Albúmina bovina a una concentración de 1 mg/ml en agua destilada.
SISTEMA DE INCUBACIÓN
En el tubo blanco colocar 1 ml de agua destilada; en el tubo testigo colocar 1 ml de solución testigo de
albúmina (1mg/ml); en los tubos problema (las distintas fracciones) colocar 1 ml de las fracciones
colectadas. Agregar a cada uno de los tubos 4 ml de reactivo de biuret, agitando y dejar en reposo a
temperatura ambiente durante 30 minutos. Determinar la absorbancia ( = 550 nm) de los tubos testigo y
problema. Todas los ensayos deben ser realizados por duplicado.(para qué y cómo se usa el tubo
blanco?)
EXPERIMENTO Nº2 :
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Sistema de incubación (Actividad Enzimática)
Sustrato (p-nitrofenilfosfato): 100 l
Buffer (acido acético- acetato de sodio, pH 5, 0,1 M): 250 l
Enzima (distintas fracciones): 100 l
Activador (Cl2Ca 11 mM): 100 l
Inactivador (NaOH 0,1M): 5 ml
Recomendaciones:
Colocar en un tubo todos los componentes menos la enzima. La reacción comienza con el
agregado de la enzima y la incubación a 37°C. Mezclar rápidamente y continuar la incubación durante 15
min. La reacción se detiene por el agregado de 5 ml de NaOH 0.1 M (inactivador). El álcali, por un lado
inactiva a la enzima y por otro da el medio alcalino necesario para que el producto (p-nitrofenol) desarrolle
color. Es importante hacer en cada caso un control de tiempo de incubación sin actividad enzimática, este
tubo contiene lo mismo que los tubos problema pero con la inactivador agregado previamente a la enzima.
Este tubo se usa como blanco para el espectrofotómetro. Leer a 410 nm y calcular los moles de producto
formado por minuto, utilizando un  = 17500 M-1.cm-1.
45
RESULTADOS
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Tubo
Absorbancia
[Proteinas] (mg/ml)
Testigo
Homogenato
Pellet 1
Sobrenadante1
Pellet 2
Sobrenadante 2
o
Tubo N
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Absorbancia
moles de P
moles de p/min
1 (Fracción H)
2 (Fracción P1)
3 (Fracción S1)
4 (Fracción P2)
5 (Fracción S2)
Procedimiento de
purificación
Homogenato
(H)
Pellet
Centrifugacion 1000g
x 10 min (P1)
Sobrenadante
Centrifugacion 1000g
x 10 min (S1)
Pellet
Centrifugación 10000g
x 20 min (P2)
Sobrenadante
Centrifugación 10000g
x 20 min (S2)
Proteína
total (mg)
TABLA DE PURIFICACIÓN
Actividad
Actividad específica
total
(moles/min/mg prot)
(moles/min)
Nivel de
purificación
Rendimiento
(%)
1
100
BIBLIOGRAFÍA
- Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3º Ed. NY.
USA.2000
- Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
46
TRABAJO PRÁCTICO Nº 6
CINÉTICA ENZIMÁTICA I
En el presente Trabajo Práctico se discutirán los aspectos teórico-prácticos de Cinética Enzimática.
La parte experimental se desarrollará bajo la denominación de Cinética Enzimática II, III y IV, en los TP 7, 8 y 9.
En el TP nº 10, Cinética Enzimática V, se discutirán diversos trabajos científicos y se elaborará una conclusión final
del tema.
Los alumnos serán evaluados al finalizar cada T.P acerca de todos los apectos teóricos y de los fundamentos de
las técnicas utilizadas. Deberán concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.
EN EL PRESENTE TP SE DISTRIBUIRÁN TRABAJOS CIENTIFICOS ENTRE LOS ALUMNOS.
EN EL TP Nº 9 LOS ALUMNOS REALIZARÁN UNA EXPOSICIÓN ORAL Y RESPONDERÁN PREGUNTAS
SOBRE EL CONTENIDO DE ESTOS TRABAJOS.
OBJETIVOS
- Conocer el mecanismo por el cual transcurren las reacciones catalizadas por enzimas.
- Comprender cómo influyen las variables tiempo de incubación, concentración de enzima, concentración de sustrato,
temperatura, pH, y la presencia de inhibidores sobre la velocidad inicial y la cantidad de producto formado en
reacciones catalizadas por enzimas “Michaelianas”.
- Interpretar el significado de las constantes cinéticas KM y Vmax.
- Valorar la importancia del trabajo prolijo y ordenado para la obtención de resultados confiables.
CONCEPTOS TEÓRICOS
Todas las reacciones químicas pueden ser descriptas en términos de su estado de equilibrio y de su
cinética. La condición de equilibrio se da cuando las concentraciones de reactivos y productos
permanecen constantes en un sistema cerrado. El estado de equilibrio está caracterizado por la constante
de equilibrio la cual establece cuál debe ser la relación entre las concentraciones de los reactivos y
productos en la condición de equilibrio. Pero además da una idea (relativa) de la dirección y magnitud en
que ocurriria la reacción alejada del equilibrio. Por otro lado, la cinética de una reacción es la descripción
de la velocidad y del mecanismo por el cual la reacción llega al estado de equilibrio y está caracterizada
por las constantes de velocidad.
A
k1
B (a)
k-1
K
B 
 A
(eq. 1)
Teniendo en cuenta la reacción del esquema (a) responda:
¿Cuál es la expresión que relaciona la velocidad de formación de B en función de la concentración de A?
¿Cuál es la relación de la constante de equilibrio K con las constantes de velocidad de formación de B
(k1) y de formación de A (k-1)?.
Una reacción con un valor grande de K implica que la formación del producto B está muy favorecida en
términos energéticos, sin embargo, la velocidad a la cual A se transforma en B puede ser muy lenta, tardar
años o cientos de años, o necestitar condiciones de presión y temperatura extremas para que ocurran en
una escala de tiempo observable. La cinética de la reacción estará condicionada por la altura de la barrera
de energía necesaria para pasar de reactivos a productos la que se denomina energía de activación (G‡),
Figura 1B. La velocidad de la reacción aumenta con la temperatura, ya que aumenta la fracción de
moléculas que tiene una energía cinética mayor que G‡ y pueden transformarse en productos Figura 1A.
47
Las reacciones químicas también pueden ser aceleradas por la acción de un catalizador. Analizando la
Figura 1B explique:
¿Cómo explica el aumento de la velocidad de la reacción por la acción de un catalizador?, ¿Qué variable
de energía se ve afectada por la presencia de un catalizador y cuál no? ¿Qué implicancias tiene?
A
B
Estado de transición, S‡
Energía libre
G ‡ (sin catalizar)
G ‡ (catalizada)
reactivos
G
productos
Progreso de la reacción
Fig.1 A: Efecto de la temperatura en la distribución de moléculas en función de la energía. B:
Efecto de un catalizador sobre la energía de activación de la reacción.
La mayoría de las reacciones biológicas transcurren lentamente si no son catalizadas. Las enzimas son
catalizadores biológicos, en la mayoría de los casos de naturaleza proteica y en esencia, las enzimas
catalizan reacciones mediante la estabilización del/de los estados de transición, disminuyendo así la
energía de activación, en consecuencia la velocidad de la reacción aumenta (aumenta la fraccion de
moleculas con energia igual o superior a la de la barrera de activacion) y aunque el equilibrio de esas
reacciones no cambia, es alcanzado rápidamente.
Para el caso de reacciones catalizadas por enzimas ¿Cómo cree que afectará el aumento de la
temperatura en la cinética de la reacción? ¿Por qué?
El esquema más sencillo para representar una reacción catalizada enzimáticamente se da cuando una
determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un complejo
enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima libre (E):
k1
k2
E + S
ES
E + P
k-2
k-1
La naturaleza proteica de las enzimas determina que varios factores tales como: a) la temperatura del
medio, b) el pH, c) la concentración de enzima, d) el tiempo de incubación y e) la concentración de
sustrato, influyan en el transcurso de la reacción.
a) EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACIÓN: Dentro de ciertos límites, la velocidad de reacción aumenta
con la temperatura. Se asume que las reacciones que ocurren a temperatura ambiente, cuya energía de
activación ha sido determinada, aumentan al doble su velocidad por cada aumento de 10°C. Existe una
temperatura óptima; por encima de ésta, la velocidad decrece rápidamente por desnaturalización de la
enzima (Fig. 2). La temperatura de máxima actividad no se corresponde necesariamente con la
temperatura de máxima estabilidad. Además, un aumento de temperatura permite que mayor cantidad de
moléculas alcancen la energía de activación (Fig. 3).
48
T1
T2>T1
N° de
moléculas
Actividad
T2
Temperatura
Energía de
Activación
Fig.2. Actividad enzimática vs temperatura
Energía
Fig.3. N° de moléculas vs energía
b) EFECTO DEL PH DEL MEDIO DE INCUBACIÓN: Cambios moderados en el pH afectan el estado iónico de la
enzima y con frecuencia también del sustrato. Muchas de las enzimas conocidas presentan actividad
máxima a pH fisiológico (entre pH 5 y pH 9), por ejemplo la tripsina (Fig.4), sin embargo algunas enzimas
como la pepsina (Fig.5) tiene su óptimo a valores de pH bastante alejados de dichos límites. A valores
extremos de pH se produce desnaturalización de la enzima.
Actividad
Actividad
6
8
10
Fig.4. Actividad de
tripsina a distintos pH.
pH
la
2
4
6
pH
Fig.5. Actividad de
pepsina a distintos pH
la
c) CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA: La Fig. 5 muestra el comportamiento de la cantidad del producto de
reacción en función del tiempo de incubación. Además se muestran varias curvas correspondientes a
diferentes concentraciones de enzima (en orden creciente de concentración de enzima desde E1 a E5).
Explique: ¿Cómo se obtiene la velocidad de formación de P a cada tiempo a partir de las curvas?
Todas las curvas muestran que a tiempos cortos la cantidad de producto formado aumenta en
función del tiempo de acuerdo a la ecuación de una recta (velocidad inicial V0).
¿Cómo es la pendiente de la curva a tiempos cortos?
A tiempos largos se alcanza un valor de concentración de producto que permanece constante en
el tiempo (equilibrio).
¿En las curvas de la Fig. 5, se ha llegado al equilibrio en todos los casos? ¿Cómo es la
concentración de P en el equilibrio? Si la concentración inicial de sustrato es 0.006 M, por qué la
concentración de P nunca llega a ese valor?
49
La figura muestra que a un valor de tiempo corto la cantidad de producto formado es mayor
cuanto mayor es la concentración de enzima . Esto se evidencia claramente en la Fig.6 donde se grafica
la velocidad de formación de producto en función de la concentración de enzima, si se toma la [P] a un
mismo valor de tiempo . A una concentración inicial de sustrato [S] constante, y en un rango de baja
concentración de enzima, la velocidad de formación de producto aumenta en forma directamente
proporcional a la concentración de enzima, es decir que toda la enzima que se incorpora al sistema tiene
la posibilidad de reaccionar con el sustrato y formar producto (Fig. 6). Sin embargo cuando la
concentración de enzima es alta la velocidad de la reacción tiende a permanecer constante a pesar de
que la [E] aumente.
V
Concentración de enzima
óptima para trabajar a V0
Fig. 5. Formación de producto en función del
tiempo con concentraciones crecientes de
enzima y una [S] inicial constante
E
Fig. 6. Velocidad de reacción en función
de la concentración de enzima.
La velocidad se expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej. µmoles/min).
en esencia, las enzimas catalizan reacciones mediante la estabilización del/los estados de transición,
disminuyendo así la energía de activación, en consecuencia la velocidad de la reacción aumenta. En
presencia de la enzima el estado de equilibrio de la reacción global no cambia pero es alcanzado
rápidamente.
d) TIEMPO DE INCUBACIÓN: En la fig. 8 se observa la variación de las concentraciones de: complejo enzimasustrato ([E-S]), de sustrato [S], de enzima [E] y de producto [P], en función del tiempo.
Las líneas vericales del gráfico separan 3 estados por los que transcurre una reacción:
- estado pre-estacionario: período muy corto que se caracteriza por el aumento en la [E-S],
- estado estacionario: la concentración del complejo (E-S) se mantiene estable en el tiempo
- estado de equilibrio: una vez transcurrido un tiempo suficiente, la reacción llega al equilibrio periodo
durante el cual la velocidad de formación de producto es igual a la de transformación de éste en
sustrato.
Concentración 
Fig. 8. Variación de la concentración
de las especies químicas que
participan en una reacción catalizada
por enzimas, en función del tiempo.
[E]: concentración de enzima; [S]:
concentración de sustrato; [ES]:
concentración de complejo enzimasustrato;
[P]:
concentración
de
producto.
Estado
Estado
Pre- estacionario estacionario
Equilibrio
Tiempo 
50
e) EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO: A una concentración de enzima constante, la velocidad de
la reacción aumenta de forma lineal con el incremento de la [S]. La velocidad crece hasta que la enzima
es saturada por el S y por lo tanto se alcanza la máxima concentración de complejo. y por lo tanto la
velocidad máxima (Vmax) de formación de producto (Fig. 9).
V0
V0, max
Fig. 8. Velocidad de reacción en función
de la concentración de sustrato.
S
MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
Para explicar las características cinéticas de algunas reacciones, Michaelis y Menten propusieron un
modelo sencillo que las describe. Este modelo supone que la reacción inversa, la de formación de ES a
partir de E y P, prácticamente no ocurre, lo cual es posible cuando la [P] es muy baja. es decir, a tiempos
cortos y en donde la cantidad de sustrato consumido es despreciable respecto a la cantidad de
sustrato inicial. A su vez, la ecuación de Michaelis-Menten se deduce de ecuaciones que parten de la
condición de estado estacionario (ver las etapas en el gráfico de la Fig.7), en donde la [E-S] se mantiene
estable en el tiempo en este sistema termodinámicamente abierto.
Se denominan condiciones de velocidad inicial (V0) a las condiciones en que se debe trabajar para que
los supuestos del modelo se cumplan. En estas condiciones (tiempos cortos y concentración de ES
constante) la formación de producto es directamente proporcional al tiempo y la curva puede aproximarse
a una recta. El rango de tiempo en que puede hacerse esa aproximación, la velocidad de la reacción se
denomina velocidad inicial (V0).
E + S
k1
k-1
ES
k2
E + P
Determinando V0 a distintas concentraciones de S los datos se pueden ajustar all modelo de MichaelisMenten (M-M )(eq. 2 y Fig. 9a).
V0=
Vmax.[S](eq.2)
KM + [S]
¿Qué parámetros cinéticos se pueden obtener del ajuste de V0 vs. [S]? ¿Cómo se relacionan estos
parámetros con las constantes de velocidad? ¿Qué condiciones experimentales se deben cumplir para
que el ajuste del modelo de M-M a los datos experimentales sea válido?
51
Vo
1
Vo
(a)
(b)
Vmax
1
Vmax
Vmax
2
KM
[S]
1
KM
1
[S]
Fig.9 (a) Curva de Michaelis–Menten de Vo en función de la concentración de S; (b) Gráfico
de Lineweaver-Burk o de dobles recíprocas.
_____________________________________________________________________________________
A partir de estos gráficos se puede determinar las parámetros cinéticos que caracterizan a una enzima: KM
(constante de Michaelis) y Vmax (velocidad máxima), para un sustrato y en condiciones determinadas.
V=
Vmax.[S]
KM + [S]
KM: este valor corresponde a la concentración de sustrato necesaria para alcanzar una velocidad igual a la
mitad de la Vmax y esta relacionada inversamente con la afinidad de la enzima por el sustrato
Vmax: es la velocidad que se alcanza cuando la enzima está saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato).
_____________________________________________________________________________________
GUÍA DE ESTUDIO
1. Catalizadores.
2. Enzimas. Características. Sitio activo de una enzima: características. Cofactor. Coenzima. Holoenzima.
3. Clasificación de enzimas.
4. Ubicación de las enzimas en la célula.
5. ¿A que se llama sustrato y producto?
6. Mecanismo de acción de las enzimas.
7. ¿Alteran las enzimas el equilibrio de la reacción?
8. ¿Cómo se mide la concentración de una enzima?
9. ¿Qué es la actividad específica de una enzima y en qué unidades se expresa?
10. Factores que influyen en una reacción catalizada por enzimas.
11. Función de Michaelis Menten. Representación gráfica.
12. Velocidad inicial. Velocidad máxima. Unidades.
13. ¿Porqué se debe trabajar a velocidad inicial?
14. KM. Unidades. ¿Cómo se determina?
15. Ecuación de Lineweaver-Burk. Representación gráfica.
16. Inhibición reversible e irreversible, concepto. Inhibidores competitivos y no competitivos, concepto. ¿Cómo se
diferencian? ¿cómo son las curvas de las directas e inversas de la velocidad en función de la concentración de
sustrato?
52
17. Reacciones bisustrato.
18. Enzimas alostéricas. Modelos.
PROBLEMAS
1. Explique el siguiente gráfico
V
Tiempo
2. a. Grafique velocidad en función de concentración de sustrato
b. Grafique la inversa de velocidad en función de la inversa de la concentración de sustrato.Identifique
en cada una de estas curvas Km y Vm.
3. ¿Qué relación existe entre Km y la afinidad de una enzima por un determinado sustrato?
4. ¿Cuándo la concentración de sustrato es igual a Km, cual es el valor de la velocidad inicial? (resuelva
analíticamente)
5. ¿Qué relación exíste entre Km y la concentración de sustrato cuando la velocidad de la reacción
catalizada por la enzima alcanza el 80% de la Vm?
6. Se ha aislado una enzima dimérica que contiene dos centros de activos idénticos. La unión del sustrato
a un centro activo disminuye la afinidad por el sustrato del otro centro activo. ¿Qué modelo alostérico
se ajusta mejor a esta cooperatividad negativa (concertado o secuencial)?
53
TRABAJO PRÁCTICO Nº 7
CINÉTICA ENZIMÁTICA II
PARTE PRACTICA I
ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA ÁCIDA DE HÍGADO
OBJETIVOS
-
Medir la formación de producto en función del tiempo de incubación.
Determinar rango de tiempo donde la variación de [P] vs. t sigue la ecuación de una recta.
Es decir, se determinarán las condiciones óptimas de tiempo de incubación, que garanticen condiciones
de V0. Note que este valor de “tiempo óptimo” de incubación será el que se aplique en los experimentos
a realizar en los TP 8 y 9.
FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN
La fosfatasa ácida de hígado cataliza la siguiente reacción:
HO
Paso nº
P
Paso nº
O
OH
O
O-
OH
Enzima
O 2N
H+
p-nitrofenilfosfato
p-nitrofenilfosfato + H2O
+ Enz +
O2N
PO4-3
OH-
+ H2O
O2N
p-nitrofenol
p-nitrofenolato
p-nitrofenol + PO43-
El sustrato, p-nitrofenilfosfato disódico, es una reactivo artificial que tiene la propiedad de ser hidrolizado
por la fosfatasa ácida del hígado y de otros tejidos, por ello puede ser usado para estudiar dichas
enzimas.
La reacción se mide registrando la cantidad de producto formado, el p-nitrofenol, a distintos tiempos. Para
esto, se incuba el sustrato en presencia de la enzima purificada o de homogenato de tejido conteniendo la
enzima (Paso nº 1). Una vez transcurrido el tiempo establecido, la reacción se detiene por medio del
agregado de una base fuerte (NaOH) la cual, además de inhibir la actividad enzimática debido al cambio
de pH, induce una disociación total del p-nitrofenol a p-nitrofenolato (Paso nº2). La concentración de esta
última especie química se puede medir mediante espectrofotometría en un medio alcalino a 410 nm
(Coeficiente de extinción molar: 17500) (ref. Methods in Enzimology ed. Colowick-Kaplan vol. XXXI).
MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación de la enzima:
Homogeneizar (en homogeneizador a émbolo) 0.25 g de hígado en 15 ml de agua destilada. Dejar en
baño de hielo durante 10 min. En esas condiciones hipo-osmóticas, se rompen los lisosomas que
contienen la enzima, la cual queda soluble. Luego, llevar la suspensión a 30 ml con buffer acético- acetato
de sodio, pH 5 y 0,2 M. La suspensión queda con una concentración de 1 mg de proteína por ml.
54
Sistema de incubación:
Contiene cantidades variables de los siguientes componentes:
Sustrato: p-nitrofenilfosfato, 25 mM. PM 371,12.
Buffer: acido acético- acetato de sodio, pH 5, 0,1 M.
Enzima: homogeneizado de hígado 1 mg de proteína / ml.
Activador: Cl2Ca 11 mM.
Inactivador: NaOH 0,1 M.
Recomendaciones:
Colocar en un tubo todos los componentes menos la enzima. La reacción comienza con el agregado de la
enzima y la incubación a 37°C. Mezclar rápidamente y continuar la incubación durante un tiempo que se
indicará en cada caso. La reacción se detiene por el agregado de 5 ml de NaOH 0,1 M. El álcali, por un
lado inactiva a la enzima y por otro provee el medio alcalino necesario para que el producto (p-nitrofenol)
desarrolle color. Es importante preparar una muestra denominada tiempo cero de incubación. Esta
muestra contiene los mismos componentes que las muestras problema pero en ella la enzima se agrega
después que el NaOH. Esta muestra se usa como blanco para el espectrofotómetro.
PROTOCOLO
A) CURVA DE TIEMPO :
Muestra No
sustrato l
Cl2Ca l
buffer l
enzima l
tiempo
(min)
1
100 (5 mM)
100
250
100
(0,1
mg
10
prot)
2
100
“
100
250
100
“
15
3
100
“
100
250
100
”
20
4
100
“
100
250
100
”
25
5
100 ”
100
250
100
”
30
blanco
100 ”
100
250
100
”
0
Incubar a 37°C. Al cabo del tiempo de incubación frenar la reacción agregando 5 ml de NaOH 0.1 M. En el
blanco la enzima debe añadirse después del alcali. Leer la absorbancia a 410 nm usando el
espectrofotómetro y calcular los moles de producto formado.
RESULTADOS
Tubo No
1
2
3
4
5
Absorbancia
moles de P
moles de P/min
55
CURVA DE TIEMPO
CONCLUSIONES
PROBLEMAS
7. Para medir la actividad catalítica de la fosfatasa ácida de higado de rata, la preparación enzimática fue
obtenida homogenizando 0.5 g de hígado en 10 ml de buffer. Se incubaron 0.2 ml de la preparación
enzimática a pH 5 y 37ºC en presencia de Ca++ durante 6 min., en un volumen de 0.4 ml de sustrato.
Para detener la reacción se agregó 3,4 ml de NaOH. Calcule los moles de producto formado por min.
y por mg de tejido, sabiendo que la absorbancia fue 0.2, : 17500 M-1 cm-1.
56
TRABAJO PRÁCTICO Nº 8
CINÉTICA ENZIMÁTICA III
PARTE PRACTICA II
ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA ÁCIDA DE HÍGADO
OBJETIVOS
- Evaluar la variación de la velocidad de formación de producto en función de la concentración de la enzima.
- Determinar el rango de [E] donde la variación de V vs. [E] responda a la ecuación de la recta.
Es decir, se determinarán la concentración de enzima óptima (que permita alcanzar condiciones de V0)
que será usada durante el TP 9 siguiente para determinar KM y Vmax.
PROTOCOLO
CURVA DE CONCENTRACIÓN DE ENZIMA
Buffer
(l)
(l)
(l)
Volumen (l)
Masa proteína (mg)
100 (5 mM)
100
300
50
0,05
2
100
“
100
250
100
0.10
3
100
“
100
200
150
0.15
4
100
“
100
150
200
0.20
5
100 ”
100
100
250
0.25
blanco
100 ”
100
100
250
0.25
Tiempo
(min)
EN TP6
1
Cl2Ca
DETERMINADO
Muestra
Suspensión de enzima
Sustrato 5mM
Incubar a 37°C durante el tiempo determinado en el TP 6. Frenar la reacción agregando 5 ml de NaOH 0.1
M. En el blanco la enzima debe añadirse después del álcali. Leer la absorbancia a 410 nm en el
espectrofotómetro y calcular los moles de producto formado.
RESULTADOS
Muestra No
1
2
3
4
5
Absorbancia
moles de P
moles de P/min
57
CURVA DE CONCENTRACIÓN DE ENZIMA
CONCLUSIONES
PROBLEMAS
8. Se incubaron 200 l de una preparación enzimática (0,3 mg proteínas/ml) en presencia de 0,5 ml del
sustrato correspondiente y de 0,5 ml de buffer pH 5, durante 15 min. a una temperatura constante de
37ºC. La reacción se detuvo por dilución del incubado hasta un volumen final de 10 ml con NaOH 0,1
M. La absorbancia de esta solución fue 0,215. Calcular los moles de producto formado por min, y por
mg de proteínas. Solución testigo 2 M  Abs. 0,15.
58
TRABAJO PRÁCTICO Nº 9
CINÉTICA ENZIMÁTICA IV
PARTE PRACTICA III
ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA ÁCIDA DE HÍGADO
OBJETIVO
Determinar los valores de Km y Vmax de la fosfatasa ácida de hígado.
PROTOCOLO
PREPARACIÓN DEL SISTEMA DE INCUBACIÓN:
Disolución de Sustrato
Muestra
CaCl2
Buffer
Suspensión de
enzima (l)
Tiempo de
Incubación
[S] (mM)
Volúmen (l)
(l)
(l)
1
2.5
50
100
250
2
5
100
100
200
3
7.5
150
100
150
ESTIMADO
ESTIMADO
EN: TP8
EN: TP7
4
10
200
100
100
5
12.5
250
100
50
5
100
100
200
blanco
(min)
Incubar a 37°C según el tiempo determinado en TP 6. Luego agregar a cada tubo 5 ml de NaOH 0.1 M. En
el blanco la enzima se añade después del alcali. Leer en el fotocolorímetro a 410 nm y calcular los moles
de P formado.
ANÁLISIS DE DATOS:
a) Calcular las inversas de las concentraciones de sustrato indicadas en el Protocolo.
b) Calcular las inversas de la masa de producto (moles) formado en cada muestra.
c) Graficar 1/Vo en función de 1/[S].
d) Determinar los valores de KM y Vmax.
59
RESULTADOS:
CURVA DE SATURACIÓN
Muestra No
Absorbancia
moles de P
moles de P/min
1
2
3
4
5
GRÁFICO
CURVA DE DOBLES RECÍPROCAS
Muestra
1
2
3
4
5
1/V
1/[S]
60
GRÁFICO
CONCLUSIONES
61
PROBLEMAS
9. La trehalasa cataliza la hidrólisis de la trehalosa, en determinadas condiciones (pH 7, 30ºC). Una
muestra de trehalasa presenta un valor de Vmax de 1.5 mol de glucosa formada por minuto por mg de
proteína. ¿Cuál será el valor de Vmax para la misma preparación enzimática pero en presencia de 5
mmoles de trehalosa 6-fosfato el cual es un inhibidor competitivo con Ki = 2mmol/ml?
10. Pseudomonas aeruginosa cultivada en un medio de acetato posee una enzima que puede hidrolizar la
propionamida.
CH3CH2CONH2 + H2O -----------------> CH3CH2COOH + NH3
los estudios de velocidad inicial en los que se midió la producción de amoníaco a partir de la
propionamida a pH 7 y 37oC demostraron que la urea inhibe esta reacción. Examinando los efectos de
dos concentraciones diferentes de urea sobre un rango de concentraciones de propionamida se
obtuvieron los siguientes resultados:
[Propionamida]
VELOCIDAD INICIAL
(moles de NH3 liberados/min/mg de proteína)
CON INHIBIDOR (Urea)
SIN INHIBIDOR
5
6.7
10
20
50
1 mM
111
140
183
279
400
160
194
263
400
576
2mM
76
95
123
188
277
Determinar la Km para las diferentes condiciones. ¿Actúa la urea como un inhibidor competitivo o no
competitivo?
11. A partir de los siguientes datos correspondientes auna reacción enzimática, determinar:
a. El tipo de inhibición
b. La Km del sustrato
Concentración de S
(mM)
2
3
4
10
15
VELOCIDAD INICIAL
(g de producto formado/hora)
Sin inhibidor
139
179
213
313
370
Con inhibidor 6 mM
88
121
149
257
313
62
TRABAJO PRÁCTICO Nº 10
CINÉTICA ENZIMÁTICA V
DISCUSIÓN DE TRABAJOS CIENTÍFICOS
OBJETIVOS
Exponer el trabajo cientifico asignado, de manera clara y prolija.
Responder individualmente a las preguntas formuladas por el docente.
GUÍA DE ESTUDIO.
TRABAJO CIENTÍFICO Nº1:
Jung G.Y. and Stephanopoulos G. (2004). A functional protein chip for pathway optimization and in
vitro metabolic engineering. Science 304: 428-431.
1. Escriba la cita bibliográfica completa (busque en bases de datos tales como PubMed).
2. Optimización de vías metabólicas: a) ¿cuál es su interés?, b)¿dónde reside su dificultad?, ¿cómo puede
encararse?.
3. ¿Qué son los microarreglos?, ¿en qué contexto se comenzaron a desarrollar?.
4. ¿Cuál es el objetivo del presente trabajo?
5. ¿Cuál es la estrategia experimental elegida? (palabras clave: fusión RNA-proteína, polilisina, DNA,
hibridización).
6. ¿Cuáles son las dos reacciones acopladas que se usan para poner apunto el sistema experimental?.
¿Cuál es la utilidad del DNA marcado con fluoresceína?. ¿Cómo se detecta el producto de estas
reacciones acopladas?. Describa los experimentos realizados para poner a punto la técnica (Figs. 1 y 2).
7. ¿Qué es la trehalosa y cuál es su importancia?
8. ¿Cuál es la vía metabólica a cuyo estudio se aplica la técnica desarrollada?
9. Describa la Fig. 3.
10.¿Cuáles son las conclusiones alcanzadas respecto al funcionamiento de esta vía metabólica? ¿Es
posible generalizar estas conclusiones a otras vías metabólicas?.
TRABAJO CIENTÍFICO Nº2:
Chauve, M, Mathis, H, Huc, D, Casanave, D, Monot, F, Lopes Ferreira, N (2010). Comparative kinetic
analysis of two fungal -glucosidases. Biotechnology for Biofuels, 3:3. doi:10.1186/1754-6834-3-3
1. Escriba la cita bibliográfica completa
2.¿Cual es la reacción que cataliza la beta-glucosidasa?
3.¿Qué sustrato artificial se utiliza para determinar su actividad?
4.Que es la celulosa y cuál es su importancia
5.Cuál es la importancia de los biocombustibles
6. ¿Cual es el origen de las enzimas que se utilizan en este trabajo?
7.Describa el método de purificación de beta glucosidasa de T. reesei. (Comprender en detalle la fig. 1)
8.Describa las condiciones en que se trabaja para determinar los parámetros cinéticos de las enzimas
9.¿Cuales de los factores que afectan a la actividad enzimática son analizados en detalle en este trabajo?
10. ¿Cuales son los productos obtenidos a partir de cada tipo de sustrato (natural, artificial) y cómo se
cuantifican?
11. ¿Cuales son los valores de los parámetros cinéticos de ambas enzimas por cada uno de los sustratos
en ausencia de inhibidor?
63
12. ¿Por cual de los sustratos presentan mayor afinidad las enzimas estudiadas?
13. ¿Cual es el efecto de la glucosa sobre la cinética de beta glucosidasa?¿Con qué tipo de gráfico se
determinó su efecto? ¿Acual de las dos enzimas afecta más?
14. ¿Cómo se construyó el gráfico de Arrhenius y qué representa la pendiente?
15. ¿Cuál es la conclusión de este trabajo?
BIBLIOGRAFÍA ESPECÍFICA (Cinética Enzimática)
. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY.
USA. 2000.
. Harper H.A, Manual de química fisiológica. Ed. El manual moderno 1980
. Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimología. Ed Aguilar. 1967.
. Morris J., Fisicoquímica para biólogos.
. Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996.
. Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA.
México, 1995.
- Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan Vol. XXXI.
64
TRABAJO PRÁCTICO Nº 11
FOTOSÍNTESIS I
Los problemas y la guía de estudio deberán ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En
caso de necesitar aclarar dudas, los docentes estarán disponibles en sus horarios de consulta en la cátedra.
Los alumnos serán evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante el desarrollo de la experiencia
práctica (evaluación oral), sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP.
OBJETIVOS
- Valorar la importancia de la fotosíntesis como proceso necesario para la vida en el planeta
- Conocer los procesos bioquímicos y termodinámicos involucrados en el proceso.
- Comprobar algunos aspectos de la fotosíntesis por medio de experimentos.
TEMAS PARA REPASAR
- Termodinámica de las reacciones redox.
INTRODUCCIÓN
La fotosíntesis es un proceso que consiste en la transducción de energía lumínica en energía química
que lleva a la síntesis de sustancias orgánicas a partir de dióxido de carbono y agua. Este proceso puede
tener lugar tanto en células vegetales como en bacterias verde-azuladas. Los organismos capaces de
fotosintetizar se denominan fotoautótrofos (del griego: photo = luz, auto = sí mismo, troph = nutriente). A
través de la fotosíntesis estos organismos son capaces de utilizar la luz solar como fuente de energía
para la sintesis de carbohidratos en primera instancia, y luego a partir de éstos se sintetizarán todos los
otros compuestos orgánicos que conforman el cuerpo del organismo.
La ecuación global de la fotosíntesis es :
Luz
6 CO2 + 6 H2O -----------------> C6H12O6 + 6O2
Puede resolverse en dos etapas caracterizados por el tipo de reacciones que se realizan en cada una,
estas son:
 Reacciones dependientes de la luz (o reacciones claras): la energía luminosa es captada por los
pigmentos y transformada en ATP y NADPH. Simultáneamente se libera oxígeno molecular
proveniente de la ruptura de moléculas de agua (Fotólisis del agua ó reacción de Hill).
 Reacciones de fijación del carbono (o de fase oscura): llamada así porque no es necesaria la luz para
llevarse a cabo; aquí el ATP y el NADPH se emplean como fuentes de energía y poder reductor,
respectivamente, y se produce la reducción del CO2 y la síntesis de glucosa.
Fotólisis del agua:
Esta reacción se conoce como reacción de Hill:
H2O + A ----------------> AH2 + 1/2 O2
El estudio del transporte electrónico inducido por la luz comienza con el descubrimiento de R.L Hill: "La
iluminación de cloroplastos en presencia de aceptores electrónicos artificiales provocaba el
desprendimiento de oxígeno y la simultánea reducción del aceptor”.
65
En la fotosíntesis normal el aceptor es el NADP+ pero en la reacción de Hill se utiliza un aceptor
artificial por ejemplo, un colorante que al reducirse se decolora.
Integración de fotosistemas I y II en el cloroplasto.
ESQUEMA “Z”
Este “esquema en Z” muestra el transporte de electrones transferidos desde el agua (abajo a la izquierda)
hacia el NADP+ (a la derecha) en la fotosíntesis no cíclica. La posición en escala vertical de cada portador
de electrones refleja su potencial de reducción estandar. Para elevar la energía de electrones derivados
del agua al nivel energético requerido para reducir NADP+ a NADPH, Los electrones deben ser
impulsados por fotones absorbidos en PSI (Photosystem I o Fotosistema I) y PSII (Photosystem II o
Fotosistema II) (ver flechas anchas). Un fotón es requerido por un electrón de cada Fotosistema. Luego de
la excitación los electrones de alta energía fluyen corriente abajo a través de una cadena transportadora.
Los protones se mueven a través de las membranas tilacoidales durante la lisis del agua y durante el
transporte de electrones a través del complejo citocromo b6f (o cytochrome b6f) generando un gradiente de
protones que es central para la formación de ATP. La flecha punteada indica la vía cíclica de la
transferencia de electrones, donde solo esta involucrado PSI, los electrones regresan por una vía cíclica al
PSI, en lugar de reducir NADP+ a NADPH.
Dirección del flujo de electrones
Adaptado de : Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth
Publishers. 3ºEd. NY. USA. 2000.
66
GUIA DE ESTUDIO
1. Concepto de fotosíntesis.
2. Concepto de reacciones dependientes de la luz y de fijación del carbono.
3. Formas de captación y transferencia de Energía.
4. Fuerza electrón-motriz.
5. Fuerza protón motriz
6. Potencial redox.
7. Dadores y aceptores de electrones.
8. Diferencia entre mitocondrias y cloroplastos.
9. Importancia de la reacción de Hill.
10. Diferencias entre fosforilación a nivel de sustrato, fosforilación oxidativa y fotofosforilación. Ejemplos.
Rol Dual de citocromo b6f (cytochrome b6f) y citocromo c (cytochrome c) en cianobacterias como
ejemplo de transporte electrónico y fosforilación en la fotosíntesis y en la cadena respiratoria.
Estos organismos utilizan citocromo b6f, citocromo c y plastoquinonas para la fosforilación oxidativa y la
fotofosforilación. (a) En la fotofosforilación los electrones fluyen desde el agua al NADP+ (b) En la
fosforilación oxidativa los electrones fluyen desde el NADH al O2. Ambos procesos son acompañados por
el movimiento de protones a través de la membrana.
Figura tomada de: Lehninger
Principles of Biochemistry. David
L. Nelson & Michael M. Cox. Worth
Publishers. 3ºEd. NY. USA. 2000.
67
PROBLEMAS
1. Interprete el siguiente gráfico en el que se observan varios factores que afectan la velocidad de la
fotosíntesis:
*
Velocidad
de
fotosíntesis
Efecto de la intensidad de luz a:
1
2
1. 25oC y CO2 0,4%
1. 15oC y CO2 0,4%
2. 25oC y CO2 0,01%
3
Intensidad de la luz incidente
¿Qué indica la zona marcada con *?
2.Explique las causas de las interconversiones entre RuDp (ribulosa 1,5-bisfosfato) y PGA (·3fosfoglicerato) en experimentos de fotosíntesis, cuando varían la intensidad de iluminación y la
concentración de CO2.
Oscuridad
Concentración
Luz
1% CO2
0,003% CO2
RUDP
PGA
RUDP
Tiempo (min)
PGA
Tiempo (min)
3.El aparato fotosintético del alga verdeazulada contiene grandes cantidades de ficoeritrina y ficocianina,
además de la clorofila A. La ficoeritrina tiene una absorción máxima entre 480 y 680 nm; la ficocianina
a 620 nm. Sugerir la misión de estos pigmentos.
4.Ordenar las siguientes sustancias según su tendencia creciente a ceder electrones:
a)clorofila del fotosistema I, b) plastoquinona, c) ferredoxina, d) agua, e) Feofitina (pheo),
5.Ordenar las siguientes sustancia según su tendencia creciente a aceptar electrones:
a)clorofila del fotosistema II, b) P680*, c) NADP+, d) plastocianina.
6.Calcular Go´ para la reducción del NADP+ por Ferrodoxina.
68
7.Calcular la fuerza electrón-motriz expresada en voltios, registrada por un electrodo sumergido en una
solución que contiene las siguientes mezclas de NAD+ y NADH a pH=7 y 25oC, con referencia a una
semicelda de 0,00V:
a) NAD+ 1 mM y NADH 10 mM
b) NAD+ 1 mM y NADH 1 mM
c) NAD+ 10 mM y NADH 1 mM
8.Cuál es la diferencia entre las cadena transportadoras de electrones que tienen lugar en mitocondrias y
en cloroplastos? Calcule el G para la transferencia de electrones que ocurre en ambos casos y
justifique los resultados.
9.Observe y analice el siguiente gráfico. Indique el tipo de fotofosforilación y justifique su respuesta.
- - - moles de oxígeno liberado
___ moles de fosfato esterificado
Tiempo
10. Observe y analice el siguiente gráfico. Indique el tipo de fotofosforilación y justifique su respuesta.
- - - moles de oxígeno liberado
___ moles de fosfato esterificado
Tiempo
11. Suponiendo que se necesitan 8 cuantos de luz para la incorporación de una molécula de CO2 en
moléculas de glúcidos por medio de la fotosíntesis, calcule la eficiencia termodinámica en condiciones
estándar, para la síntesis de 1 mol de glucosa, si la longitud de onda de la luz utilizada es a) 400 nm y
b) 750 nm. (Energía necesaria para la síntesis de glucosa = 686 Kcal).
DATOS DE POTENCIAL REDOX: Para resolver los problemas.
Agua: +0,82 V
NADP+: -0,324 V
Ferredoxina: -0,4 V
P700: +0,4 V
P680: +0,95 V
P680*: -0,95 V
Feofitina (Pheo): -0.75 V
Plastoquinona: +0,1 V
Plastocianina: +0.13V
NAD+: -0.32V
69
12. Cuantificación de carotenoides, clorofilas y feofitinas. Una manera de valorar el nivel de estrés en los
vegetales es medir la disminución de los niveles de los distintos pigmentos presentes en las plantas.
Preparación: homogeneizar 100 mg de material vegetal en 10 mL de etanol al 96% V/V. Luego separar el
sobrenadante y en él medir la Absorbancia a 470, 665 y 649 nm para la cuantificación de carotenoides,
clorofilas a y b (Carot, Cl-a, Cl-b) respectivamente, y a 666 y 654 nm para la cuantificación de feofitinas a y
b (Feof-a, Feof-b) según el método de Wintermans y De Mots (1965).
Se extrajeron muestras de material vegetal de las sierras de Córdoba de tres puntos distintos, como se
muestra en el siguiente mapa
Se midió la absorbancia de las distintas muestras a
649 nm, resultando:
Sitio
Punto 1
Absorbancia
0,15
Punto 2
Punto 3
0,25
0,20
Teniendo en cuenta que la absortividad de la
clorofila b es de 44,65 ml.mg-1.cm-1 calcular el
contenido de clorofila en las distintas muestras de plantas y elabore una hipótesis sobre el origen de estas
diferencias encontradas en el nivel del pigmento. Qué experimento adicional debería hacer para aceptar o
rechazar la hipótesis planteada.
BIBLIOGRAFÍA
- Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY.
USA. 2000.
- Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
- Hall D.O., Rao K. Fotosíntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977.
- Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977.
- Andreo C., Vallejos R. Fotosíntesis. Serie Biología, monografía no 30 OEA, 1984.
- Molt A.S. et al. 1951, Plant Physiology, 26, 164-175.
- Torres H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioquímica General Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983.
- Harper H.A, Manual de química fisiológica. Ed. El manual moderno 1980
- Morris J., Fisicoquímica para biólogos.
- Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996.
- Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA.
Mexico, 1999.
70
TRABAJO PRÁCTICO Nº 12
FOTOSÍNTESIS II
PARTE PRÁCTICA
En caso de necesitar aclarar dudas, los docentes estarán disponibles en sus horarios de consulta en la
cátedra. Los alumnos serán evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante el desarrollo de la
experiencia práctica (evaluación oral), sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP.
Deberán concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.
OBJETIVOS
Valorar la importancia de la fotosíntesis como proceso necesario para la vida en el planeta
Conocer los procesos bioquímicos y termodinámicos involucrados en el proceso.
Comprobar algunos aspectos de la fotosíntesis por medio de experimentos.
TEMAS PARA REPASAR
- Termodinámica de las reacciones redox.
Mecánica del TP:
1º) Determinar el o los objetivos de cada experiencia práctica.
2º) Enunciar la o las hipótesis que se pondrán a prueba con cada una de las experiencias.
3º) Elaborar un protocolo de trabajo tomando en cuenta la información disponible en la Guía de TP.
4º) Desarrolar la experiencia y registrar los resultados.
5º) Discutir y fundamentar adecuadamente los resultados obtenidos. Las preguntas que se encuentran en
la guia deben ser usadas para orientar la discusión de los diferentes aspectos del problema que se
aborda con cada una de las experiencias.
6º) Exponer los resultados de la experiencia práctica utilizando un lenguaje adecuado, detallando
claramente: Objetivos, Hipótesis, Materiales y Métodos, Resultados y Discusión.
7º) Evaluación escrita al final del TP.
EXPERIENCIA Nº 1: FOTOSÍNTESIS Y LUZ. LIBERACIÓN DE O2, CONSUMO Y FIJACIÓN DE CO2.
MATERIALES:
Material vegetal: un trozo de Elodea (Elodea sp).
Solución de rojo de fenol.
Papel de aluminio.
Tubos de ensayo, tapones de goma atravesados por un tubo de 0,5 cm de diámetro, pipetas de 0,2 ml.
Fuente de luz blanca.
Soportes y gradillas.
PROCEDIMIENTO:
1. Colocar 10 ml de solución de rojo de fenol en dos tubos de ensayo e insuflar aire con una pipeta hasta
que la solución vire de color rojo a color amarillo (Ver Fig. 1).
2. Introducir en cada tubo de ensayo un trozo de Elodea.
3. Disponer los elementos en la manera indicada en la Fig. 2, teniendo en cuenta que desde el tubo de
ensayo hasta la pipeta graduada el sistema debe estar lleno de solución.
4. Marcar el nivel del líquido contenido en la pipeta.
5. Conectar la fuente de luz a 10 cm de distancia y observar la base del tallo de Elodea.
71
6. Exponer un tubo a la luz (Fig. 2) y cubrir el otro con papel de aluminio (oscuridad).
7. Observar los tubos y controlar el pH de la solución a los 45 min de iniciada la experiencia.
Fig.1
C O2
Rojo
Fig. 2
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
¿Cómo es la reacción de la que participa el dióxido de carbono disuelto en agua?
¿Qué efecto produce el desprendimiento de oxígeno en el sistema?
¿Qué función cumple el Rojo Fenol?
¿Por qué el color vira a amarillo cuando se insufla dióxido de carbono?
¿Cuál es la fuente de dióxido de carbono?
¿Cambió el pH?
¿Qué sucedería en el sistema si modificara la distancia entre la planta y la lámpara?
¿Que sucedería en el sistema en ausencia de luz?
Equilibrio del CO2 en agua:
H2O + CO2  H2CO3  HCO3- + H+  CO3= + H+
72
EXPERIENCIA Nº 2: FOTÓLISIS DEL AGUA. REACCIÓN DE HILL.
MATERIALES:
Material vegetal: hojas de Palán-Palán (Nicotiana glauca) o de espinaca (Spinacea oleracea) (50 g)
Solución de NaCl 0,035 M.
Solución de NaCl 0,35 M.
Solución de 2,6-diclorofenolindofenol 2,5 x 10-4 M
Licuadora o mortero
Atención: tanto el material vegetal como las soluciones que toman contacto con él deben mantenerse en
frío (0-4 oC) durante todo el proceso
Aislamiento de cloroplastos
Homogeneizar en licuadora 50 g de material vegetal en 100 ml de NaCl 0,35 M durante 1 min. Filtrar por
gasa doble, recoger en un vaso y mantener en baño de hielo. Tomar 30 ml del homogeneizado y
centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Decantar y eliminar el precipitado de restos celulares. Centrifugar el
sobrenadante a 4000 rpm durante 10 min. Separar el sobrenadante y resuspender el precipitado de
cloroplastos en NaCl 0,035 M (1 ml). Mantener en baño de hielo.
PROCEDIMIENTO:
2,6 di-Cl-fenolindofenol
a)
b)
c)
d)
e)
¿Porqué utiliza NaCl 0.35 M para realizar el homogeneizado?
¿Porqué utiliza NaCl 0.035 M para resuspender los cloroplastos?
¿Qué función cumple el 2,6-diclorofenolindofenol?
¿Cómo podría demostrar la producción de oxígeno?
¿Cómo podría mejorar esta experiencia?
73
BIBLIOGRAFÍA
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY.
USA. 2000.
. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
. Hall D.O., Rao K. Fotosíntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977.
. Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977.
. Andreo C., Vallejos R. Fotosíntesis. Serie Biología, monografía no 30 OEA, 1984.
. Molt A.S. et al. 1951, Plant Physiology, 26, 164-175.
. Torres H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioquímica General Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983.
. Harper H.A, Manual de química fisiológica. Ed. El manual moderno 1980
. Morris J., Fisicoquímica para biólogos.
. Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996.
. Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA.
Mexico, 1999.
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Trabajo practico Nº 13
MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN DE ENERGÍA – DISCUSIÓN DE PROBLEMAS Y
PRESENTACIÓN DE TRABAJO CIENTÍFICO
Los problemas deberán ser resueltos por los alumnos ANTES de concurrir a la clase. En caso de necesitar
aclarar dudas los docentes estrán disponibles en sus horarios de consulta, en la cátedra. Los alumnos serán
evaluados al final del TP con una evaluación escrita de similar contenido a la de los problemas en discusión .
OBJETIVOS
- Reconocer la aplicabilidad de las leyes de la Física y la Físico-Química a los sistemas biológicos.
- Analizar fenómenos biológicos desde un punto de vista termodinámico. Fotosíntesis, respiración y motores
moleculares como ejemplos.
TEMAS PARA REPASAR:
Energia libre de Gibbs; reaciones de oxido reducción; transferencia de energia en la fotosintesis; cadena respiratoria;
fuerza proton motriz; motores moleculares.
GUIA DE PROBLEMAS
1- Condiciones estándar frente a la vida real. La aldolasa cataliza la siguiente reacción en la glicólisis:
aldolasa
Fructosa 1,6-bifosfato
dihidroxiacetona fosfato + gliceraldehído 3-fosfato
El ∆G 0’ para esta reacción es de + 5,7 kcal.mol-1, mientras que el ∆G en la célula es -0,3 kcal.mol-1.
Calcular la relación entre reactantes y productos en el equilibrio y en condiciones intracelulares.
Utilizando los resultados obtenidos explicar: ¿cómo puede resultar esta reacción endergónica en
condiciones estandar y exergónica en condiciones intracelulares?
3- El pK de un ácido es una medida de su potencial de transferencia de grupos protónicos.
a) Establecer una relación ∆G 0’ y pK.
b)¿Cuál es el ∆G 0’ para la iónización del ácido acético, si su pK es de 4,8?
4- Para una fuerza protón-motriz de 0,2 V (negativa en el lado de la matriz). ¿Cuál es el valor máximo del
cociente [ATP]/ [ADP] [Pi ] compatible con la síntesis de ATP? Calcular el valor de este cociente de
tres maneras, suponiendo que el número de protones translocados por cada ATP formado es dos, tres,
y cuatro respectivamente. La temperatura es de 25ºC.
5- Cuando a las bacterias tales como E. coli se las mantiene en ayunas durante un período de tiempo
suficiente, dejan de moverse. Sin embargo, cuando estas bacterias inmóviles se colocan en un medio
ácido nuevamente comienzan a moverse. Aportar una explicación teniendo en cuenta el mecanismo de
movimiento del flagelo de una bacteria.
6- Una solución 0.10M de palmitato de sodio se separa de un volumen igual de solución 0.20M de cloruro
de sodio mediante una membrana permeable a los iones sodio y cloruro, pero no a los iones palmitato.
Calcule las concentraciones finales y el potencial de Nernst de 298 K, suponiendo comportamiento
ideal.
75
7-Las helicasas tales como la PcrA pueden utilizar una hebra sencilla de ADN como guía. En cada ciclo la
helicasa se desplaza una base en el sentido 3’-5’. Teniendo en cuenta que la PcrA en presencia de un
molde formado por una hebra sencilla de ADN puede hidrolizar ATP con una velocidad de 50
moléculas por segundo (se hidroliza una molecula por ciclo) y que la longuitud de una base de ADN es
3,4 Å. ¿Cómo es esta velocidad comparada con la velocidad de la quinesina que es de 6400 Å por
segundo?¿A qué se puede deber la diferencia de velocidad entre estos dos motores moleculares?.
OTROS PROBLEMAS (a resolver en diferentes clases Teórico Prácticas)
-1
-G (kcal.mol )
-1
-G (kj.mol )
1‐BIOENERGETICA Las concentraciones de ATP, ADP y Pi difieren según el tipo de célula, consecuentemente la liberación de energía libre para la hidrólisis de ATP será tambien diferente según el tipo de célula. Utilizando los datos de la tabla siguiente, calcular ∆G para la hidrólisis de ATP en las células de músculo, hígado y cerebro. Teniendo en cuenta que el ∆G 0’ para esta reacción es de ‐ 7,3 kcal.mol‐1, ATP (mM)
ADP (mM)
Pi (mM) Hígado
3,5
1,8
5,0 Músculo 8,0
0,9
8,0 Cerebro
2,6
0,7
2,7 36
8.4
0
35
8.2
2‐ BIOENERGETICA El gráfico siguiente muestra como el ∆G para la hidrólisis de ATP varía en función de la concentración de 8.0
34
Mg2+ (pMg=log 1/[ Mg2+ ]). 7.8
33
a) ¿Cómo afecta el descenso de [Mg2+] al ∆G para la hidrólisis 7.6
de ATP? 32
7.4
b) ¿Cómo se puede explicar este efecto? 31
7.2
30
2
3
4
5
6
7
8
pMg 2
3‐ CADENA RESPIRATORIA. Es posible determinar el lugar exacto donde actúa un inhibidor de la cadena respiratoria gracias a la técnica de punto y corte. Britton Chance diseño elegantes métodos espectroscópicos para determinar el cociente entre las formas oxidada y reducida de cada uno de los transportadores. Este cálculo es posible porque cada uno de los estados tiene un espectro de absorción característico, tal y como se ilustra en el gráfico adjunto para el caso de citocromo c. Si usted se encuentra en posesión de un inhibidor y descubre que al añadirlo a mitocondrias que respiran, los transportadores localizados entre el NADH y QH2 se encuentran más reducidos y los transportadores localizados entre el fitocromo c y el O2 se encuentran más oxidados ¿cómo actúa el inhibidor? 7‐ BIOMEMBRANAS. Supongamos que la transferencia de energía entre dos moléculas de clorofila a distantes entre sí 10 Å tiene lugar en 10 picosegundos. Supongamos que la distancia se incrementa hasta 20 Å manteniendo constantes el resto de los factores. ¿Cuánto tardará en ocurrir la transferencia de energía? 76
8‐ TRANSPORTE. Dos soluciones de igual volumen están separadas por una membrana permeable a los iones K+ y Cl‐ pero no a los iones P‐. Las concentraciones iniciales se indican a continuación: [K+] = 0.05 M [K+] = 0.15 M [Cl‐] = 0.05 M [P‐] = 0.15 M Calcule las concentraciones a ambos lados de la membrana, una vez que se establece el equilibrio. Qué lado de la membrana tiene carga positiva? Calcule el potencial de Nernst a través de la membrana si la temperatura es de 370C. 8‐ MOTORES MOLECULARES. A su máxima velocidad una molécula de quinesina se desplaza con una velocidad de 6400 Å por segundo. Teniendo en cuenta que el tamaño de la región motriz del dímero de quinesina es de 80 Å, calcular su velocidad en unidades de su tamaño por segundo. Según esta relación ¿cuál sería la velocidad correspondiente de un automóvil que tuviera una longitud de 3 metros? 9‐ MOTORES MOLECULARES Un único dominio motor de la miosina puede desarrollar una fuerza de aproximadamente 4 piconewtons (4pN) ¿Cuántas veces puede levantar su peso un dominio motor de miosina? Tener en cuenta que 1 newton = 1 kg fuerza (1kg masa m.s‐2). Considerar que la masa molecular del dominio motor es de 100 kDa. 10‐ MOTORES MOLECULARES Considérese la actividad de una única molécula de quinesina que transporta una vesícula a lo largo de un microtúbulo. La fuerza necesaria para arrastrar una partícula esférica de radio a con una velocidad ν en un medio de viscosidad  es: F= 6 π η a x  Supongamos que una esfera de 2 μm de diámetro se transporta con una velocidad de 0,6 μm. s‐1 en un medio acuoso con una viscosidad de η= 0.01 g.cm‐1. s‐1. a) ¿Cuánta es la fuerza desarrollada por la quinesina? Expresar el valor en dinas (1 dina= 1 g.cm. s‐2) b) ¿Cuánto trabajo realiza en un segundo? Expresar el valor en ergios (1 ergio=1 dina cm). c) Un motor de quinesina hidroliza aproximadamente 80 moléculas de ATP por segundo. ¿Cuánta es la energía asociada a esta hidrólisis de ATP expresada en ergios? Comparar este valor con el trabajo realizado. 77
PRESENTACIÓN DE TRABAJO CIENTÍFICO A DISCUTIR EN EL TP Nº 14
TRABAJO CIENTÍFICO:
Yasuda, R., Noji, H., Kinosita, K., & Yoshida M.. (1998). F1-ATPase Is a Highly Efficient Molecular
Motor that Rotates with Discrete Steps. Cell. 93: 1117–1124.
El docente realizará una pequeña introducción al trabajo para ayudar a la lectura y análisis del
mismo. Los alumnos deberán leer este trabajo y preparar una presentación oral para el TP Nº14.
Deberán centrarse en la respuesta a las siguientes preguntas.
1. ¿Cúal es la función del ATP sintetasa? ¿Cómo es su estructura? ¿Cuál es la función de cada una de las
subunidades?
2. ¿Qué fenómeno se observa si la parte F1 se encuentra en ausencia de la parte F0 en un medio que
contiene ATP?
3. ¿Cómo se logra experimentalmente observar la rotación γ del F1-ATPase?
4. Explicar brevemente los resultados que se observa en la Figura 2a y 2b.
5. A cuál de los experimentos que se realizaron en los T.Prácticos de la materia, se asemeja el
experimento del gráfico 2b.
78
Trabajo practico Nº 14
MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN DE ENERGÍA – DISCUSION DE PROBLEMAS Y
ANÁLISIS DE TRABAJO CIENTÍFICO
Los alumnos deberán traer preparada una presentación oral sobre el trabajo científico según las
instrucciones impartidas por el docente en el TP nro 13. Esta presentación oral y la respuesta a las preguntas
que realice el docente en el contexto de la presentación serán utilizadas para evaluar a los alumnos.
OBJETIVOS
Reconocer las distintas partes que componen la estructura de un trabajo científico. Aprender a enfocar el esfuerzo en
la comprensión de la información más relevante para el análisis crítico de un trabajo científico. Desarrollar habilidad
para interpretar datos experimentales graficados. Adquirir experiencia en la exposición oral de un trabajo científico.
BIBLIOGRAFÍA ESPECÍFICA (Bioenergética)
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY.
USA. 2000.
. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
79
EL PRINCIPIO
Los infrarealistas.
http://www.corneta.org/no_95/los_infrarrealistas_manifesto.html