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DESCUBRIENDO LA ESTRUCTURA DE
LAS PROTEÍNAS
Lucía Pérez Coello
A alumna Lucía Pérez Coello, de 2º de
bacharelato do I. E. S. Otero Pedrayo de
Ourense, estivo durante o verán do 2009
no IBCM (Instituto de Bioloxía Celular e
Molecular de Oporto), participando no
programa
Estancias
Científicas
(ESCIVE), organizadas en España pola
Fundación Española para la Ciencia y la
Tecnología (FECYT).
A CONTINUACIÓN PRESÉNTANOS O TRABALLO
DESENVOLVIDO DESPOIS DA SÚA ESTANCIA.
ESCIVE
OBJETIVO: impulsar el contacto de
jóvenes de entre 15 y 17 años con el
trabajo
cotidiano
en
centros
y
departamentos de investigación españoles
y portugueses.
IBMC
http://www.youtube.com/wa
tch?v=cehkhV6AIlA&fea
ture=player_embedded
MECANISMOS DE ADAPTACIÓN
CELULAR
Instituto
Biología
Molecular
Celular
SEÑAL E
IMAGEN
BIOMATERIALES
BIOLOGÍA MOLECULAR Y
ESTRUCTURAL
BIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN E
INMUNOLOGÍA
GENÉTICA HUMANA Y DOLENCIAS
GENÉTICAS
NEUROBIOLOGÍA BÁSICA Y
CLÍNICA
ESCIVE – Ciencia Viva
2009
Descubriendo la
estructura de las
proteínas
Lucía Pérez Coello
Felipe Demígio Fernandes Pereira
Objetivo
• Estudiar la estructura de las proteínas;
• Comprender su función;
• Determinar los mecanismos de
funcionamiento e interacción con otras
moléculas.
Lisozima
• Enzima
• Estructura tridimensional
determinada por primera vez por
David Phillips, en 1965.
• Se encuentra en las lágrimas, saliva
y moco humanos.
• Producida por varios organismos.
• Destruye la pared celular de las
bacterias.
Estrutura primária da Lisozima
Pasos para determinar
estructuras de
proteínas
1. Producción de
proteínas
• Clonación
• Expresión (Escherichia coli)
• Purificación
Cromatografia
• Filtración en gel
• Intercambio iónico
• Afinidad
2. Cristalización
Las proteínas, como muchas moléculas, pueden ser
llevadas a formar cristales cuando son colocadas en
condiciones apropriadas. Para que cristalice, la proteína
purificada es sometida a una precipitación lenta a partir
de una disolución acuosa.
ENSAIOS DE
CRISTALIZACIÓN
CONDICIONES DE
CRISTALIZACIÓN
MEJORA DE
LOS CRISTALES
OPTIMIZACIÓN
Métodos de cristalización
• Gota colgante
• Gota sentada
•Diálisis
•Difusión en gel
Diagram of hanging drop method. Reservoir solution (blue) usually
contains buffer and precipitant. Protein solution (red) contains the same
compounds, but in lower concentrations. The protein solution may also
contain trace metals or ions necessary for precipitation of particular
proteins (McRee, 1993).
• Preparamos 3 disoluciones (de concentraciones diferentes) que
contengan Lisozima en 0,1 M NaAc pH 4.8
• Disolución reservorio: 1 ml de 10% (m/v) NaCl, 0,1 M NaAc pH 4,8
e 25% (v/v) Etilenoglicol
• La gota de la lámina contiene: 6-7 L de disolución de Lisozima y
4-3 L de disolución reservorio (volumen total de 10 L)
•Ponemos las
láminas sobre los
pozos y los sellamos
con silicona
• Los cristales deben
crecer dentro de 1-2
días y estar
preparados para
enfriamiento
criogénico.
30 mg/mL
(L)
1
8+2
A
7+3
B
6+4
C
5+5
D
20 mg/mL
2
3
10 mg/mL
4
5
6
NUESTROS
CRISTALES
Próximos pasos
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/co
mmons/7/73/X_ray_diffraction.png
Se obtiene una muestra
y se somete a
enfriamiento criogénico
para evitar que se
desestabilice.
Difractómetro
Montaje del cristal
3. Difracción
Ley de Bragg :
n= 2d sin 
Construyendo el modelo
Los mapas de densidad electrónica son el resultado final
del experimento de difracción. Su interpretación en
términos de un modelo molecular es la primer tarea del
cristalográfo.
Estructuras
en 3D
Lysozyme
http://lysozyme.co.uk/lysozymestructure.php
Presentación del trabajo realizado