Download 3. Terapia enzimática

TEMA-22.
ASPECTOS CLÍNICOS DE LA ENZIMOLOGÍA
1. Determinación de actividades enzimáticas para
el diagnostico clínico
Mejor conocimiento molecular metabolismo
Desarrollo de métodos de análisis enzimáticas
2. Herramientas analíticas
Purificación de enzimas
3. Terapia enzimática
Industria Biotecnológica
8. Inhibidores enzimáticos (Fármacos)
Conocimiento estructural y funcional
1. Determinación de actividades enzimáticas para el
diagnostico clínico
a) La enzima debe estar presente en fluido biológico
b) La enzima debe ser fácil de ensayar y automatizar la medida
c) Los valores de actividad entre individuos sanos y enfermos
deben ser significativos y debe haber buena correlación con los
valores patológicos.
d) La enzima debe ser estable
Tipos de fluidos:
Suero (Más común) y Orina
LCF, Pleura, Sinovial, etc
SUERO
1. Enzimas específicas
Enzimas su función radica en el plasma
Ej Enzimas de la coagulación, activación del complemento, metabolismo de lipoproteínas, etc
2. Enzimas no específicas
Enzimas que son secretadas por los tejidos.
Ej. Amilasas, lipasas, fosfatasas, etc.
Enzimas intracelulares.
Daño Tisular
Creatin quinasa 50.000 veces daño en el musculo.
Proliferación Celular (Neoplasia)
Aclaramiento renal deficiente
DIAGNOSTICO
Enzima específica de tejidos (Raro)
-Abundancia relativa
Fosfatasa ácida (prostata), Acetilcolinesterasa (eritrocitos)
- Patrón de enzimas característico
- Isoenzimas (LDH, Creatin quinasa..
Ciencia forense:, Adenosina deaminasa, adenilato ciclasa, aminopeptidasa, fosfatasa ácida, etc.
ENZIMOLOGIA CLÍNICA DEL INFARTO DE MIOCARDIO
Pruebas enzimáticas : Evidencia de la producción de un infarto
Seguimiento del progreso y la recuperación tras cirugía
Creatina Quinasa
Aspartato aminotransferasa
Lactato deshidrogenasa
Valor en plasma
Concentración en tejido
Velocidad del vertido
Grado de degradación
Vida media 10 –130 horas
Creatina Quinasa mas específica
Test depende del tiempo del infarto
LDH se puede diferenciar por electroforesis
Creatina quinasa
Músculo esquelético
Músculo cardiaco (Mayor concentración)
Cerebro
No en el hígado
Proteína dimérica: Hay dos tipos de monómeros M y B
Músculo M-M (99%) y M-B (1%)
Corazón MM (80-70%) y M-B (20-30%)
Cerebro B-B (100%)
Pequeño Infarto
M-B (Actividad Total apenas cambia) Inmunoblotting (B)
Lactato deshidrogenasa
Hígado, Corazón
Inmunoblotting LDH-1
Uso de sustratos específicos
LDH1/LDH2 = 0.85 Normal
>1 Enfermo
Transaminasas (ALT y AST)
Se utilizan poco actualmente
Hígado
AST/ALT (3-5)
Corazón
AST/ALT (20-25)
ENZIMOLOGIA CLÍNICA DE ENFERMEDADES HEPÁTICAS
Aspartato aminotransferasa (AST ó GOT)
Alanina aminotransferasa (AST ó GPT)
Fosfatasa alcalina
γ-Glutamil transferasa
Otras: Lactato deshidrogenasa, glutation transferasa, etc
Transaminasas
Fosfatasa alcalina
4-nitrofenil fosfato
Visible
Enfermedades hepáticas
Crónicas
Agúdas
Intermitentes
γ-Glutamil transferasa
Hepatitis
Cirrosis
Tumores
Obstrucción del conducto biliar
USO DE LAS PRUEBAS ENZIMOLÓGICAS
-Diagnóstico de enfermedades
-Seguimiento de tratamientos con fármacos (Higado metaboliza drogas)
-Seguimiento de operaciones hepáticas
TRANSAMINASAS
No específicas del plasma
Células parenquimales
Hepatitis, cirrosis
Necroticas (Hepatitis, cirrosis)
Vertido al plasma
Progreso de la enfermedad
FOSFATASA ALCALINA
No específicas del plasma
Superficie sinusoidal del células hepáticas y del conducto biliar, Osteoblastos
ISOENZIMAS
Daños en las células del conducto biliar
Ratio Fosf.Alc/Transaminasas
Hepatitis
0,2-0,6
Obstrucción del
10-20
conducto biliar
γ-GLUTAMIL TRANSFERASA
Alcoholismo crónico
Cirrosis
Incremento síntesis y en la secreción
GLUTATION TRANSFERASA
Cataliza reacciones de destoxificación
utilizando glutation
Carcinogénicos
Agentes de quimioterapia
Paracetamol
Xenobióticos
Contenido alto 5%
Vida media corta 90 min
Marcador muy rápido y sensible de daño hepático
Tiempo de la Protrombina
Función hepática
Tiempo requerido para la activación de la protrombina en Trombina
Indica grado de funcionamiento hepático
Factores de la coagulación están producidos en el hígado y secretados a la
sangre
Trombina
Cataliza el proceso de coagulación
OTRAS ENZIMAS DE INTERES CLÍNICO
α-AMILASA
Páncreas
Glándulas salivares
Suero normal
Baja actividad
Suero enfermo Pancreatitis aguda
Gran Aumento (20-30)
Diagnóstico es complicado sin la medida de la amilasa
Suero enfermo Pancreatitis aguda
Gran Aumento (20-30)
Amilasa detección en orina debido a bajo Peso Molecular
CREATINA QUINASA y FRUCTOSA BIFOSFATO ALDOLASA
Indicadores de desordenes en la musculatura esquelética
Creatina quinasa
Músculo esquelético, cardiaco, Cerebro
Distrofia muscular, Daños en el músculo, ejercicio intenso,
infarto de miocardio, daño cerebral, etc
ISOENZIMAS
Fructosa bifosfato aldolasa
Músculo esquelético (otros tejidos)
Significado clínico menor
Precaución (contaminación Glb rojos)
FOSFATASA ALCALINA
Diagnóstico de obstrucción del conducto biliar
Enfermedades de huesos
Incremento actividad en células formadoras de huesos (Osteoblastos)
Osteomalacia
Raquitismo
Hiperparatiroidismo
Enfermedad
denominada hipofosfatasia
Actividad
Crecimiento cristales de hidroxiapatito
Osteoblastos, Hígado, Intestino,
Pirofosfatos inorgánico (substrato)
No estrictamente Isoenzimas
Placenta
Modificaciones Postraduccionales
Diferenciación
Electroforesis muy complicado
Uso de inhibidores, Calor
FOSFATASA ACIDA
Localización
Hígado, eritrocitos, PROSTATA, etc
Diagnostico de carcinoma de Próstata
Precaución en el muestreo - Lábil
- Contaminación con FA de eritrocitos
Diferenciación isoformas
- Sensibilidad sustratos
- Uso de inhibidores específicos: Formaldehido
2. HERRAMIENTAS ANALÍTICAS:
USO DE ENZIMAS PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN
DE METABOLITOS
Uso de la enzima para transformar un metabolito en un producto
el cual se pude determinar analíticamente
Ventajas
La enzima es muy específica
Metabolito determinado en presencia de
otras sustancias
Evita la purificación necesaria en un análisis químico
Sustancias lábiles
Inconvenientes
El costo de la enzimas
Inmovilización
Ureasa, Tripsina, Hexoquinasa
Inmoviliza en las paredes del tubo
Análisis en continuo
Inactivación de las enzimas. Presencia de inhibidores, etc
1.
Puntos importantes para utilizar una enzima
La posición del equilibrio de la reacción. Deber ser unidirecional y rápido
Equilibrio no favorable
a) Acoplando la reacción a otra reacción enzimática
b) Trampas químicas. Ej. Glutamato deshidrogenasa
2. Utilizar gran cantidad de enzima
Depende de la Vmax y de la Km.
3. La especificidad de la enzima debe ser conocida
4. Pureza enzimática (reacciones colaterales)
Determinación de glucosa
Test tolerancia a la glucosa
Metabolismo de la glucosa
Métodos enzimáticos
1. Hexoquinasa acoplada con Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
2. Glucosa oxidasa acoplada con Peroxidasa
3. Glucosa deshidrogenasa
NADPH Cambio 340 nm
Especificidad segundo paso
Visible (Más utilizado)
Más interferencias productos
sangre
Determinación de ácido úrico
Diagnóstico de la gota
Método químico y enzimático
Actualmente sólo se utiliza el
enzimático
Absorbancia (293 nm)
Alantoina; Consumo de O2
Acoplado a peroxidasa
(H2O2)
Falta
especificidad
Determinación de urea
Test de la función renal: Suero y orina
UREA
Ureasa
Colesterol
Capacidad de filtración glomerular
Carbonato amónico.
NH4
Acoplado con glutamato DH
Determinación de colesterol y trigliceridos
Evaluar el riesgo de arterioesclerosis y de infarto de miocardio
Método químico (colorimétrico) No específico, contaminante
Esteresa
Colesterol
oxidasa
Peroxidasa
Absorción a 500 nm
Trigliceridos
Seguimiento: Diabetes
Mellitus, Nefrosis,
obstrucción biliar, etc
NADH
Otros metabolitos
Creatina
Creatina quinasa, Piruvato quinasa y Lactato deshidrogenasa
Amonio
Glutamato deshidrogenasa
Tiamina difosfato en eritrocitos
Ensayo enzimático usado para detectar una deficiencia en vitaminas
Ensayo diagnostica deficiencia en vitaminas
Malnutrición
Encefalopatía de Wernicke´s
Transquetolasa
Sujetos normales: Actividad no cambia al añadir Tiamina
Enfermos
: Actividad al añadir Tiamina
ENZIMA INMUNOENSAYO
Método indirecto para determinación de metabolitos, enzimas usadas para amplificar la señal
Hormonas, drogas,proteínas, etc
Anticuerpos son unidos a una enzima:
Identifican con un anticuerpo.
Fácilmente cuantificables
Peroxidasas
Fosfatasas. etc
Virus, cocaína, anfetaminas opiáceos, anfígenos frente a microorganismos patógenos, etc,
3. Terapia enzimática
Principales áreas de trabajo
- Eliminación de sustancias tóxicas de la sangre
- Enfermedades genéticas
- Cáncer
Degradación de tejidos necróticos usando enzimas proteolíticas (Tripsina, quimiotripsina,
Bromelaina, Hialuronidasa).
Eliminación de coágulos usando Estreptoquinasa, Uroquinasa, etc.
Tratamiento de insuficiencia pancreática (Fibrosis cística) utilizando proteasas inmovilizadas
Forma de administración
Eliminación de metabolitos (sangre)
Endógena: Estreptoquinasa
Exógena: Ureasa
Bilirrubina oxidasa
Posibilidad de usar enzimas inmovilizadas
Tratamiento de Enfermedades genéticas
Enfermedades metabólicas. Deficiencias enzimáticas
Enfermedad de Gauchers
Glucosilceramidasa
Acumula un glucocerebrosido en los macrófagos
Macrofagos no funcionales Anormalidades hepáticas, óseas, y hematológicas.
Tratamiento enzima de placentas humanas
Alto coste
Enzimas recombinantes
Pancreatitis
Extros pancreáticos (lipasas, proteasas, amilasas, etc) Microencapsulados pH 6 liberan
Fibrosis cística
Defecto genético proteína transmembrana (1/2000).
Mucosidad espesa , pulmones, estómago, etc
Conducto pancreáticos bloqueado
Igual que pancreatitis
Tubos bronquiales
Desosiribonucleasa
(Mucosidad ADN y mucopolisacaridos).
Xeroderma pigmentoso
Defecto genético
Individuos muy sensibles a la radiación UV
Defecto mecanismo reparador del ADN
Tratamiento enzimas reparadoras del ADN Aplicación tópica con liposomas
Cáncer
Asparraginasa hidroliza la asparragina
Leucemia aguda limfoblástica
Leucemia aguda granulocítica
Tumores Necesitan asparragina
Enzima en plantas, animales y bacterias
Ausente del suero de los mamiferos
Tratamiento en combinación con quimioterapia
Fuente es humana, microbiológica genera problemas de rechazo.
Glutaminasa
Serina hidratasa
Fenilalanino amonio liasa
Experimentación
posibles agentes
anticancerígenos
Leucina dehidrogenasa
Ciertos tipos de cáncer no tienen la capacidad de
sintetizar aminoácidos y los obtienen del suero
Activación de prodrogas
Prodrogas son drogas químicamente modificadas y permanecen inactivas hasta
que son específicamente activadas.
Drogas anticancerosas inhiben etapas específicas de vías metabólicas
Metrotrexato análogo estructural del ácido fólico
dihidrofolato reductasa
No se produce tetrahidrofolato
Síntesis ADN
EVITAR TOXICIDAD EN CELULAS NO CANCEROSAS
Terapia enzimática prodroga dirigida por anticuerpos ADEPT
Terapia enzimática prodroga genética dirigida GDEPT
La enzima usada para activar la prodroga es dirigida hacia el tumor
en la forma de un gen unido a un vector
4. DETECCIÓN Y SIGNIFICADO DE DEFICIENCIAS ENZIMÁTICAS
Deficiencias enzimáticas debido a problemas genéticos
Más de 400 deficiencias
Identificación de un metabolito
Ej. Fenilcetonuria
Fenilpiruvato
Biopsia del tejido y medida de la actividad
Pruebas en el ADN
FENILCETONURIA
Déficit de la Fenilalanina 4-mono-oxigenasa
Retraso mental
Prevención dieta
Detección precoz es muy importante
INHIBIDORES ENZIMÁTICOS (FÁRMACOS)
Inhibición de la hidroximetilglutaril CoA reductasa
Hipercolesterolemia familiar
Niveles de colesterol en sangre
Inhibición de la xantina oxidasa
Gota
Xantina
Niveles de ácido úrico
Metabolismo de las Purinas
Ácido úrico
Alopurinol
Aloxantina SUSTRATO SUICIDA
Inhibidor muy fuerte de la X. Oxidasa
Inhibidores antiretrovirales
nhibidores de la proteasa.
Enfermedad: HIV-1 causante del SIDA.
Enzima proteasa cataliza la ruptura de la
poliproteína que encápsula el virus.
Necesarios para completar su proceso
de replicación dando lugar a nuevos
virus
Dimero de 99 aminoacidos
Hidrólisis ácido-base: Aspartico proteasa
Centro activo en el centro
de la molécula
Inhibidores análogos del
substrato Cambio en el enlace
peptídico por un isoester
Conclusiones
Medida de actividades enzimática en diagnóstico clínico
Enzimas estimación de metabolitos
Equipamiento más sofisticado gran automatización
Variedad de enzimas puras: Tecnología de ADN
Procesos tecnológicos:
Inmovilización, Radioinmunoensayo, Inmunoensayo, etc
Terapia enzimática
Estudios estructurales
Tecnología de ADN
Diseño de inhibidores