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MAPEO ASOCIATIVO DE LA
RESISTENCIA A ENFERMEDADES DEL
TALLO Y LA VAINA EN GERMOPLASMA
AVANZADO DE ARROZ
Juan Rosas
ALAG – 12 de octubre de 2016
Montevideo, Uruguay
Contenido
 Arroz en Uruguay, importancia de Sclerotium oryzae y
Rhizoctonia oryzae sativae
 Resistencia cuantitativa a S.o. y R.o.s. y generalidades de
GWAS
 Evaluación de métodos de Inoculación
 GWAS para Enf. del Tallo y la Vaina





Genotipado
Fenotipado
Análisis de asociación (GWAS scan)
Análisis con modelo multi-loci
Búsqueda de genes candidatos
 Resumen y perspectivas futuras
El Arroz para Uruguay, Uruguay para el Arroz
 7% de los ingresos
 Cultivares nacionales
USD x106
 3er. producto de
exportación
 7mo. exportador mundial
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Soybeans
Meat
Rice
Wheat
2009 2010 2011 2012
 Altos rendimientos
t x106
Country Average Yield in 2010 (t/ha)
Top Ten World Rice Exporters
10000
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
Principales limitantes de la producción arrocera
Abióticos:
-
 Sequía, condicones del suelo
-
 Temperaturas extremas
Arroz irrigado
Uso extendido de buenas prácticas de
manejo agronómico
Cultivares adaptados a bajas
temperaturas
Bióticos (enfermedades producidas por hongos):
1. Bruzone (quemazón de hojas y cuello, - Nuevos cultivares resistentes
- Introgresión de genes de
Pyricularia oryzae)
2. Enfermedades de vaina y tallo
A nivel mundial:
Rhizoctonia solani (Rs)
resistencia a P. oryzae
Uruguay (áreas subtropicales):
Sclerotium oryzae (S.o.)
Rhizoctonia oryzae-sativae (R.o.s.)
-
Cultivares actuales susceptibles
Daños causados por S.o. y R.o.s.
S.o.
• Muerte del tejido interno del tallo
• Debilitamiento y vuelco
• Deficiente traslocación de nutrientes
• menor rendimiento (hasta 20%)
• mala calidad industrial.
R.o.s.: Si alcanza la panícula en etapa
reproductiva, puede causar severa esterilidad.
Debilitamiento y vuelco.
Se forman nuevos esclerocios que sobrevivirán hasta el
siguiente ciclo del cultivo
Solución provisoria: Fungicidas
Susceptibilidad genética = Dependencia de fungicidas = mayores
costos = impacto negativo en ambiente y mercados
Resistencia genética a
enfermedades de V&T es la mejor
estrategia económica y ambiental
Evaluación de la Resistencia a S.o. y R.o.s
 Diversidad de métodos de inoculación en invernadero
reportados para patógenos similares (R. solani)
 Resultados contradictorios en aplicaciones a S.o.
 No hay reportes para R.o.s.
Conociendo al enemigo
Sclerotium oryzae (Cattaneo)
Pudrición del
Tallo (S.o.)
sinónimos: Magnaporthe salvinii
Leptosphaeria salvinii
Nakataea oryzae
Ascomycota / Magnaporthaceae /
Nakataea
Manchado
Confluente de
las Vainas
(R.o.s.)
Rhizoctonia oryzae-sativae (Mordue)
sinónimos: Ceratobasidium oryzae-sativae
Ceratobasidium sativae
Basidiomycota / Ceratobasidiaceae /
Ceratobasidium
Ciclo de las enfermedades V&T
• Estructura de resistencia y
dispersion: esclerocios (micelio
compactado)
• Sobreviven 1 a 2 años en suelo,
agua o rastrojos.
Inóculo e invasión del huésped
• Los esclerocios flotan en agua de riego y
contactan tallos
• El contacto con el tallo estimula la germinación
de los esclerocios
• Desarrollo de micelio
• Formación de apresorio, ruptura de tejido del
hospedero
• Hifas invaden tejido del hospedero
Síntomas
• Primeros síntomas en etapa de macollamiento
• S.o.: Manchas oscuras (marron-negro)
• R.o.s.: Lesiones ovales con centro
verde-gris rodeado de borde marrón
Avance de la enfermedad
• S.o.: Hifas invaden horizontalmente las vainas
interiores, penetrando hacia el centro del tallo, atacando
enzimáticamente y provocando la muerte del tejido
vegetal.
• R.o.s.: La invasión avanza verticalmente por
las vainas exteriores, las manchas “confluyen”
Genética de la Resistencia a S.o. y R.o.s
S.o.:
•
•
Herencia cuantitativa (Ferreira & Webster 1975)
No hay genes mayores en O. sativa. RILs con introgresiones
de O. rufipogon (Ni et al 2001):
–
QTL in ch. 2, AFLP marker TAA/GTA167 45% phen. var.
–
QTL in ch. 3, RM232 - RM251 40% phen. var.
No fueron exitosos en germoplasma local
(P.Blanco, com.pers)
R.o.s.:
•
Probablemente herencia cuantitativa
Búsqueda de QTL
Bi-parental
• Requiere generar poblaciones
• Menor diversidad alélica
• Menor precision (menos meiosis)
GWAS en germoplasma adaptado
• Usa poblaciones preexistentes
• Considera la diversidad existente en el
germoplasma de interés
• Recombinaciones históricas
• SNP “listos para usar” (background
adaptado)
•Requiere corregir por estructura de
población
GWAS scan
y  Xb  Ku  e
y: vector de medias fenotípicas ajustadas
X: vector de valores alélicos del SNP
b: efecto del SNP (a estimar) // Test de Wald para rechazar b = 0 // -log10(p)
K: Matriz de incidencia de efectos aleatorios.
u : vector de efectos aleatorios (coeficientes de coancestría de los genotipos,
a predecir)
Var(u) = Gs2u
e: vector de efectos residuals
Var(e)=Is2
-log10(p)
e
umbral de significancia
Price et al., Nature Genetics 38, 904 - 909 (2006)
Malosetti et al., Genetics 175:879-889 (2007)
position
Limitaciones del GWAS
-log10(p-value)
QTL 1 ?
QTL 2 ?
Loci or position
• Efecto Beavis (sobre-estimación de efectos y PVE)
Modelo multi-locus
(considerando todos los
QTL en un mismo modelo)
Modelo multi-locus
y  Xb  Ku  e
y: vector de medias fenotípicas ajustadas
X: matriz de incidencia de efectos fijos (QTL)
b: vector de efectos de QTL (a estimar)
K: Matriz de incidencia de efectos aleatorios.
u : vector de efectos aleatorios (coeficientes de coancestría de los genotipos,
a predecir)
Var(u) = Gs2u
e: vector de efectos residuals
Var(e)=Is2e
-log10(p)
QTL
Búsqueda de genes candidatos
-log10(p-value)
QTL
http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/
Análisis genético de la resistencia a S.o. y R.o.s.
Población de
mapeo
(germoplasma
adaptado)
Datos
genotípicos
crudos (GBS)
Imputación de
datos faltantes
Datos fenotípicos
crudos (Inv. y
Campo)
Identificación de
QTL (modelo
multi locus)
Análisis de
Asociación
(GWAS scan)
Medias fenotípicas
ajustadas (Inv. y
Campo)
Genes
candidatos
Resumiendo…
•
•
El arroz es uno de nuestros principales rubros de
exportación. Uruguay es uno de los principales exportadores
de arroz.
Los cultivares más usados en Uruguay son susceptibles a
Sclerotium oryzae (S.o.) y a Rhizoctonia oryzae-sativae
(R.o.s.), lo que genera pérdidas de hasta 20%.
•
La mejor estrategia es la resistencia genética.
•
La resistencia a S.o. y R.o.s. es cuantitativa (QTL)
•
No está claro el mejor método para evaluar resistencia a
So/Ros
Modelos adecuados de GWAS permiten corregir estructura y
Multi-loci para estimar mejor la contribución de cada QTL y
su aplicabilidad en MAS
•
Objetivos
General: Identificar QTL para mejoramiento de la resistencia a S.o. y R.o.s. en una
población de germoplasma avanzado de arroz uruguayo .
Específicos / Artículos:
I.
II.
Metodología de inoculación (Artículo 1).
a.
Identificación del mejor método de inoculación
b.
Aplicación del método en fenotipado de la población en ensayos de invernadero
Identificación de QTL de resistencia a S.o. y R.o.s. en invernadero y campo
(Artículo 2).
Evaluación de Métodos de Inoculación
•
Pobl.
Métodos evaluados
Genotipa
do
Imput.
Fenotipado
Método
Descripción
Multilocus
GWAS
scan
Medias
Fenot.
I
Discos de agar 5-mm con micelio
en la base del tallo
II
Cajones inundados con
esclerocios en la superficie del
agua
III
Suspensión de esclerocios en
CMC viscosa
IV
Suspensión de esclerocios en
CMC viscosa cubierto con
aluminio
V
Tallos cortados en tubo de ensayo
con agua y esclerocios
Genes
candidato
s
Métodos de Inoculación
•
Material vegetal
Cultivar
Subsp.
Origen
R.o.s.
S.o.
El Paso 144
Indica
Uy
Int
Int
INIA Olimar
Indica
Uy
Int
Int
Tetep
Indica
Vietnam
?
Res
INIA Tacuari
Trop. Jap.
Uy
Int
Int
Parao
Trop. Jap.
Uy
Int
Int
Lemont
Trop. Jap.
US
?
Sus
Métodos de Inoculación
•
•
Condiciones de invernadero
•
Temperatura: 28/18 °C día/noche
•
80/90% humedad relativa
•
Régimen de luz: 12 h
Aislamientos
•
R.o.s.: muestra de suelo tras cultivo de INIA Tacuarí en UEPL 2001
•
S.o.: muestra de planta cultivar Samba cv. en UEPL 2011
•
Diseño experimental: DCA, 6 rep. UE: maceta con 4 plantas
•
Analisis:
Modelo con factores de diseño
Comparación basada en
Yij    g i  e ij
2
s
H2  2 G 2
sG se r
sHeG22
Métodos de Inoculación
• Mejor método: I discos de agarosa con micelio, para ambos hongos
s2G
s2R
H2
I (disco de agar)
1.35 (0.32)
0.56 (0.13)
0.94 (0.02)
II (cajones inundados)
0.94 (0.25)
0.61 (0.16)
0.90 (0.04)
III (CMC)
0.73 (0.29)
1.05 (0.30)
0.81 (0.10)
IV (CMC+aluminio)
1.31 (0.34)
1.00 (0.28)
0.89 (0.05)
V (tallos en tubos)
0.92 (0.66)
2.04 (0.34)
0.73 (0.13)
s2G
s2R
H2
I (disco de agar)
0.03 (0.02)
0.06 (0.01)
0.75 (0.16)
II (cajones inundados)
0.07 (0.06)
0.20 (0.06)
0.67 (0.26)
III (CMC)
0.00 (0.05)
0.31 (0.08)
0.05 (0.66)
IV (CMC+aluminio)
0.16 (0.21)
0.69 (0.25)
0.58 (0.24)
V (tallos en tubos)
1.25 (1.45)
5.24 (1.19)
0.59 (0.38)
Sclerotium oryzae (S.o.)
Rhizoctonia oryzae-sativae(R.o.s.)
Métodos de Inoculación
• Correlación entre métodos de inoculación, poca interacción
S.o.
R.o.s
.
Fenotipado en Invernadero
• 3 exp. para R.o.s., 2 exp. para S.o.
• Población: 641 líneas avanzadas INIA
• 316 indica
• 325 tropical japonica
• Inoculación con Método I (discos de agar)
• Mismas condiciones y aislamientos
• Diseño experimental:
• DBCA aumentado (de Federer), 12 bloques
• Testigos repetidos: El Paso 144, INIA Olimar, Tetep, Parao, INIA Tacuarí y Lemont
• UE: maceta con 4 plantas
• Ancho de tallo medido como covariable.
Fenotipado en Campo
• Misma población que en invernáculo
• 2010, 2011, 2012: Datos históricos del PM
DBCA, 3 rep, infección natura. Testigos:
El Paso 144, INIA Olimar, Parao, INIA Tacuarí
• 2013:
Diseño a-lattice, 6 rep, inoculación artificial
• Mismos aislamientos que los usados en invernadero.
• Testigos repetidos: El Paso 144, INIA Olimar, Tetep, Parao, INIA Tacuarí y Lemont
• UE: “hill plots” con ~10 plantas adultas
• Tiempo de floración medido como covariable.
Resultados Fenotipado en Invernadero
•H2 medias y altas. Interacción GxE interaction.
Resultados Fenotipado en Campo (R.o.s.)
•H2 media a baja. Interacción GxE. Líneas superiores a testigos
H2=0.42
H2=0.15
H2=0.06
H2=0.43
Resultados Fenotipado en Campo (S.o.)
•H2 media a alta. Menor interacción GxE. Líneas superiores a testigos.
H2=0.50
H2=0.24
H2=0.45
H2=0.72
Genotipado
Pobl.
632 líneas avanzadas del programa MG INIA
311 tr. japonica
Genotipad
o
Imput.
Fenotipado
Multilocus
GWAS
scan
Medias
Fenot.
321 indica
129.648 marcadores SNP
Imputación con algoritmo FILLIN
(TASSEL 5- Swarts et al., 2013)
Genes
candidato
s
•
•
•
•
Filtrado de SNP
Marcadores con > 50 % datos perdidos
Genotipos con > 50 % datos perdidos
Marcadores monomórficos
Marcadores con frecuencia alélica < 0.01
137.034 SNP
44.604 SNP tr.jap.
92.430 SNP ind.
Estructura de la población
• PCA:
PC1: 50% variación indicajaponica
PC2: 5% variación dentro de
japonica
Indica
indica
Estructura en Indica ssp.
• PCA:
2 grupos de líneas
cruzadas con INIA
El Paso 144
Olimar,
sobrerrepresentadas
INIA Olimar
FLAR
PC1 = 38%
PC2 = 17%
INIA
Estructura en Japonica ssp
• PC1 = 24%
• PC2 = 22%
L5287
EEA 404
INIA Tacuari
GWAS scan - Modelo
Pobl.
Genotipa
do
Imput.
Fenotipado
Multilocus
GWAS
scan
Medias
Fenot.
Genes
candidato
s
Opción “Eigenstrat” (matriz Q a partir de
valores del PCA), implementado en la
función GWAS.analysis del paquete
lmem.gwaser (R software):
y  Xb  Qv  e
y: vector de medias fenotípicas ajustadas
X: vector de valores alélicos del SNP
b: efecto del SNP (a estimar)
K: Matriz de incidencia de efectos aleatorios.
u : vector de efectos aleatorios (coeficientes de coancestría de los genotipos, a predecir)
Var(u) = Gs2u
G = var-cov a partir de PC significativos
e: vector de efectos residuals
Var(e)=Is2e
Gutiérrez et al., R package v. 0.1.0 (2016)
Price et al., Nature Genetics 38, 904 - 909 (2006)
Malosetti et al., Genetics 175:879-889 (2007)
Modelo multi-locus
Pobl.
Paquete EMMREML (R software)
Genotipa
do
Imput.
Fenotipado
Multi-locus
GWAS
scan
Medias
Fenot.
Genes
candidato
s
y  Xb  Qv  e
y: vector de medias fenotípicas ajustadas
X: matriz de incidencia de efectos fijos (QTL)
b: vector de efectos de QTL (a estimar)
K: Matriz de incidencia de efectos aleatorios.
u : vector de efectos aleatorios (coeficientes de coancestría de los genotipos, a predecir)
Var(u) = Gs2u
G = var-cov en base a PC significativos
e: vector de efectos residuals
Var(e)=Is2e
Akdemir et al. Genetics Selection Evolution 47:38 (2015)
Price et al., Nature Genetics 38, 904 - 909 (2006)
Malosetti et al., Genetics 175:879-889 (2007)
GWAS scan - Resultados
Japonica
Jap
R2 > 0,6
Ind
5 QTL
R.o.s.
Campo
7 QTL
3 QTL
6 QTL
3 QTL
R.o.s.
Invernadero
S.o.
Campo
S.o.
Invernadero
8 QTL
7 QTL
9 QTL
Indica
Multi-locus - Resultados
Japonica
trait QTL PVE
trait QTL PVE
R.o.s.
Field
4
43%
R.o.s.
Field
1
4%
R.o.s
GH
2
21%
R.o.s
GH
5
33%
S.o.,
Field
2
18%
S.o.,
Field
3
14%
S.o.,
GH
1
18%
S.o.,
GH
4
5%
Indica
Genes Candidatos – Resultados – Ej: Japonica
Japonica
Resumen y perspectivas futuras
• Importancia de fenotipado para identificación de QTL relevantes (no
escape)
• Modelo conjunto (multi-locus) estimación más conservadora de efectos y
PVE
• PVE 0,04 – 0,43 % vs. H2 0,06 - 0,50 (ensayos PMG)
• QTL significativos „enriquecidos‟ en genes vinculados a resistencia
Proximamente:
• Validación de SNP seleccionados en nueva población de 1000 líneas
avanzadas del PMG
• Incorporación de SNP validados a chip para MAS
• Cruzamientos con genotipos portadores de alelos favorables
Proyecto Mapeo Asociativo en
Arroz Uruguayo + FPTA
Coordinación
Victoria Bonnecarrere
Mejoramiento
Pedro Blanco
Fernando Pérez de Vida
Fitopatología
Sebastián Martínez
Fernando Escalante
Bioinformática
Silvia Garaycochea
Schubert Fernández
Genotipado
Victoria Bonnecarrere
Wanda Iriarte
Bioestadística (F.Agron.)
Lucía Gutierrez (Wis)
Gastón Quero
Natalia Berberián
Juan Rosas
Cornell University
Susan McCouch
Jean-Luc Jannink
Eliana Monteverde