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Órgano de difusión científica y tecnológica del CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL DURANGO
5(2): 124-127, 2013
ANÁLISIS PRELIMINAR DE LA DEGRADACIÓN DE LAS VITELINAS EN LA
EMBRIOGÉNESIS TEMPRANA DE Dactylopius coccus COSTA
Arturo Ramírez-Cruz
Instituto Politécnico Nacional, Centro de
Educación Continua, Unidad Morelia. 58190.
Morelia, Michoacán
Correo electrónico: [email protected]
RESUMEN
Mediante electroforesis en geles de poliacrilamida, bajo condiciones
desnaturalizantes, se realizó un análisis preliminar sobre la degradación de las vitelinas
realizada por los embriones tempranos de la grana cochinilla Dactylopius coccus. Se
observó que los embriones, desde la etapa de blástula temprana hasta al menos la
etapa de la anatrepsis tardía, no realizaron ningún tipo de degradación de las vitelinas,
lo que sugiere que estas proteínas deben ser degradadas y, en consecuencia, utilizadas
por los embriones de esta especie, hasta etapas muy avanzadas de su desarrollo
embrionario.
PALABRAS CLAVE: Desarrollo embrionario, grana cochinilla, proteínas hemolinfáticas.
ABSTRACT
Through polyacrylamide gel electrophoresis, under denaturing conditions, a
preliminary analysis of vitellins degradation accomplished by early embryos of
cochineal insect Dactylopius coccus was realized. It was observed that embryos since
stage of early blastula until, at least, the stage of late anatrepsis, did not realize any type
of vitellins degradation, which suggest that these proteins must be degraded, and in
consequence, utilized by the embryos until advanced stage of its embryonic
development.
KEY WORDS: Cochineal insect, embryonic development, hemolymphatic proteins.
INTRODUCCIÓN
Las vitelinas son una serie de lipoglicoproteínas presentes en el huevo de los
insectos, formando parte de lo que se denomina como vitelo. Éstas se originan de las
vitelogeninas, un grupo de glicolipoproteínas sintetizadas en el cuerpo graso,
transportadas por la hemolinfa, que ingresan por endocitosis al huevo en desarrollo
durante la llamada vitelogénesis (Hagedorn y Kunkel, 1979; Raikhel y Dhadialla, 1992),
siendo por ello proteínas de origen materno. Las vitelinas representan entre el 60 y 90 %
de las proteínas solubles del huevo de los insectos (Hagedorn y Kunkel, 1979). Durante
el desarrollo embrionario, las vitelinas deben ser enzimáticamente degradadas para
poder proporcionarle al embrión proteínas, lípidos y carbohidratos, principalmente
(Sander et al., 1985).
La grana cochinilla Dactylopius coccus Costa (Hemiptera: Dactylopiidae) es el
insecto del cual se extrae el colorante rojo ácido carmínico. Este colorante actualmente
tiene una gran variedad de usos en diferentes industrias, entre ellas la farmacéutica, la
alimenticia, la de los cosméticos, y la textil, entre otras (Méndez-Gallegos et al., 2003).
Debido a la importancia que representa D. coccus, hasta hace sólo pocos años
ha tomado interés el estudio de algunas de las proteínas halladas en su hemolinfa, tal es
el caso de la profenoloxidasa (Hernández-Hernández et al, 2003), la óxido nítrico
sintasa (García-Gil de Muñoz et al, 2007), las lipasas (García-Gil et al 2008), las
vitelogeninas y las vitelinas, de las cuales, las vitelinas en los huevos de esta especie, se
ha encontrado que están formadas por al menos tres subunidades proteínicas, cuyos
pesos moleculares son de 48, 51 y 53 kilodaltones (kDa), respectivamente (RamírezCruz, 2007). Por otra parte, se sabe que D. coccus es una especie ovovivípara (Llanderal
y Nieto, 2001) y que todo el desarrollo embrionario se realiza intraováricamente
(Ramírez-Cruz y Llanderal-Cázares, 2010).
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Con la finalidad de contribuir al conocimiento de la
biología de esta importante especie, el objetivo de este trabajo
fue realizar un análisis preliminar de la degradación de las
vitelinas efectuada por los embriones tempranos de D. coccus,
desde la etapa de blástula temprana hasta la etapa de la
anatrepsis tardía.
MATERIALES Y MÉTODOS
El método de crianza para la obtención de las hembras
adultas de D. coccus, se describe en Ramírez-Cruz et al. (2008).
Para determinar la dinámica de la degradación de las vitelinas, se
emplearon embriones obtenidos de los ovarios de hembras
adultas de 15 (n=4), 25 (n=4) y 30 (n=3) días de edad
postemergencia, ya que se sabe que a los 15 días, sus ovarios
contienen embriones en etapas tempranas de la segmentación
(blástulas tempranas); a los 25 días, presentan desde blástulas
medias, hasta embriones en anatrepsis temprana, mientras que
a los 30 días de edad, sus ovarios contienen principalmente
embriones en anatrepsis tardía (Ramírez-Cruz, datos sin
publicar). Los ovarios fueron procesados para su estudio
mediante la técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida
bajo condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) (Bollag y
Edelstein, 1992; Gersten, 1996), para lo cual éstos se obtuvieron
mediante la disección de las hembras adultas en solución de
Ringer para insectos (Martínez, 2002); después cada par de
ovarios se colocó por separado en tubos Eppendorf de 0.5 mL.
Para obtener un extracto de los ovarios, éstos se trituraron
dentro de los tubos con una varilla delgada de vidrio. Una parte
de cada uno de los extractos se usó para calcular su
concentración de proteínas mediante el método de Bradford,
usando albúmina sérica bovina como patrón (Bio-Rad Protein
Assay®). La parte restante del extracto de cada tubo se mezcló
junto con 10 L de una solución de los inhibidores de proteasas,
conteniendo EDTA 1M (sal disódica del ácido etilen diamino
tetracético), pHMB 1M (ácido para-hidroximercuribenzoico) y
PMSF 0.33 M (fenil metil sulfonil fluoruro) (Maizels et al., 1991) y
se centrifugó a 3000-4000 revoluciones por minuto durante
cinco minutos. Después cada sobrenadante se recuperó en otro
tubo Eppendorf de 0.5 mL, y se le adicionó en proporción 1:1 el
regulador de muestra 2x, conteniendo solución reguladora Tris
(hidroximetil) aminometano-HCl; solución de (SDS) dodecil
sulfato de sodio al 10%; 2-mercaptoetanol; glicerol; azul de
bromofenol. Se calentaron las muestras a 95°C durante 10
minutos, para posteriormente almacenarse a -20°C hasta su
utilización. Los corrimientos electroforéticos se realizaron en
condiciones desnaturalizantes con SDS y 2-mercaptoetanol,
aplicando 5 L de cada muestra sobre geles de poliacrilamida al
7.5 % (Gersten, 1996) y con un voltaje de 200 voltios durante 1
hora. Los marcadores de peso molecular usados fueron: Miosina
(200 kDa); -galactosidasa (116 kDa); fosforilasa B (97 kDa);
albúmina sérica (66 kDa); ovoalbúmina (45 kDa) (Bio-Rad SDSPAGE Weight Standars®). Finalmente los geles se tiñeron con
azul de Coomasie al 0.2% y se destiñeron con una mezcla de
metanol, ácido acético y agua; el cálculo de los pesos
moleculares de cada una de las fracciones proteínicas se realizó
graficando los Rf de los marcadores de peso molecular contra el
logaritmo de su peso molecular (Bollag y Edelstein, 1992).
RESULTADOS.
Los patrones electroforéticos de los embriones en
etapa de blástula temprana (15 días de edad postemergencia de
las hembras adultas), mostraron claramente las tres fracciones
proteínicas correspondientes a sus vitelinas cuyos pesos
moleculares son de 48, 51 y 53 kDa (Figura 1); la fracción
proteínica de 48 kDa fue la más tenue por ser la de menor
concentración con relación a las otras dos fracciones
proteínicas. Desde esta edad se observan además dos bandas
proteínicas muy tenues y menores a 45 kDa, cuyos pesos
aproximados son de 32 y 38 kDa, respectivamente (Figura 1).
Figura 1. Patrones electroforéticos de embriones
contenidos en ovarios de hembras adultas de Dactylopius
coccus, de 15, 25 y 30 días de edad postemergencia. 48, 51 y 53,
corresponden a pesos moleculares (kDa) de subunidades
proteínicas de las vitelinas; 35 y 38 corresponden a pesos
moleculares (kDa) de subunidades proteínicas embrionarias.
PM: marcadores de peso molecular en kDa.
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Por otra parte, los patrones electroforéticos de las tres
fracciones vitelínicas observados desde blástulas medias hasta
la anatrepsis temprana (25 días de edad postemergencia de las
hembras adultas) fueron semejantes a los observados a los 15
días de edad; las tres fracciones vitelínicas se observaron sin
cambios aparentes, y tampoco hubo aparición de nuevas bandas
proteínicas menores a 48, 51 o 53 kDa, que sugirieran proteólisis
de dichas proteínas (Figura 1).
Del mismo modo, los patrones electroforéticos de las
tres fracciones vitelínicas de los embriones en anatrepsis tardía
(30 días de edad postemergencia de las hembras adultas),
tampoco mostraron cambios en lo referente a dichas proteínas
(Figura 1), las cuales se mantienen hasta esta edad
aparentemente intactas, es decir, sin señales de degradación
enzimática embrionaria.
DISCUSIÓN
Las tres fracciones proteínicas de 48, 51 y 53 kDa,
correspondientes a las vitelinas de D. coccus (Ramírez-Cruz,
2007), se aprecian claramente en los patrones electroforéticos
de las blástulas tempranas presentes en los ovarios de D. coccus
de 15 días de edad. Por otra parte, las bandas proteínicas de 32 y
38 kDa que se observan a partir de esta edad (y hasta el día 30 de
edad), no corresponden a productos de degradación temprana
de las vitelinas, ya que los vitelófagos (las células encargadas de
la degradación del vitelo) en los embriones de los insectos se
presentan a partir de la etapa de blástula tardía (Klowden, 2007);
dichas bandas proteínicas corresponden más bien a proteínas
embrionarias. Por otra parte, a pesar de que los ovarios de las
hembras adultas de D. coccus presentan embriones en etapas de
blástula tardía (a los 25 días de edad) o incluso etapas tan
avanzadas como la anatrepsis tardía (a los 30 días de edad),
tampoco fue posible detectar proteólisis de las vitelinas, lo cual
indica que al menos hasta la anatrepsis tardía, los embriones de
D. coccus no hacen uso de las vitelinas como fuente de proteínas
para su metabolismo, y que dicha degradación debe realizarse
sólo hasta etapas muy avanzadas de su embriogénesis, tal como
sucede en el hemíptero Rhodnius prolixus Stal (Triatominae),
para el que se ha determinado que las vitelinas comienzan a ser
usadas por el embrión hasta muy avanzado su desarrollo (al
finalizar la catatrepsis), cuando una degradación alta de sus
vitelinas se realiza dentro del tubo digestivo (Oliveira et al.,
1989).
Se sabe que en general, durante la embriogénesis
temprana en insectos y en otros artrópodos, las reservas
proteínicas del vitelo permanecen prácticamente intactas, y que
es hasta las últimas fases de su desarrollo cuando el embrión
realiza un notable uso de dichas reservas, e incluso aún en las
etapas postembrionarias recién emergidas, cantidades
apreciables de vitelo permanecen sin ser utilizadas (Sander et
al., 1985; Yamashita e Indrasith, 1988; Valle, 1993). Sin embargo,
esto no es una regla, ya que en el caso de los embriones de
Drosophila melanogaster Meigen (Diptera, Drosophilidae), cuya
embriogénesis dura tan sólo 24 horas (Campos-Ortega y
Hartenstein, 1985), la degradación de las vitelinas comienza
poco después de que el huevo ha sido fecundado (Bownes y
Hames, 1977); esta degradación tan temprana seguramente se
debe a la extremadamente breve duración de su desarrollo
embrionario.
A pesar de que la mayor parte de las reservas de vitelo
en el huevo de los insectos son de naturaleza proteínica
(alrededor del 90 % de la proteína total del huevo), éstas son las
últimas reservas en ser utilizadas, siendo los carbohidratos y los
lípidos las primeras fuentes energéticas en ser metabolizadas
por el embrión (Sander et al., 1985); particularmente se sabe
que en el lepidóptero Antheraea mylitta Drury (Saturnidae), los
carbohidratos son usados principalmente durante el desarrollo
embrionario temprano (gastrulación y blastocinesis) y los lípidos
se utilizan durante el desarrollo embrionario tardío
(histogénesis y crecimiento) (Pant et al., 1979). Algo semejante
ocurre en el lepidóptero Heliothis virescens (Fabricius)
(Lepidoptera), en el que los lípidos y carbohidratos se usan
durante todo el desarrollo embrionario como fuente importante
de energía, mientras que las proteínas sólo se usan de manera
muy limitada (Cohen y Patana, 1985). En este sentido, Sander et
al. (1985), indicaron que el uso tardío de las reservas proteínicas,
como fuente de energía durante la embriogénesis en los
insectos, posiblemente se debe a los problemas que implica la
acumulación de los desechos nitrogenados producto del
metabolismo oxidativo de las proteínas.
CONCLUSIONES
Durante la embriogénesis temprana de D. coccus, al
menos hasta la etapa de la anatrepsis tardía, no hay indicios de
que sus embriones realicen proteólisis de sus vitelinas, lo cual
indica que el embrión aún en esta etapa no hace uso de estas
proteínas como fuente proteínica para su desarrollo; ello sugiere
que esas proteínas son usadas durante etapas más tardías de su
desarrollo embrionario. Es necesario profundizar en este
estudio para conocer el momento y la dinámica precisos de la
degradación proteolítica de las vitelinas durante la
embriogénesis de D. coccus, así como los mecanismos
implicados en ello.
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