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6CFE01-058
2/8
Ecología germinativa de semillas de Meum athamanticum Jacq. (Umbelliferae)
COPETE CARREÑO, E.1, HERRANZ SANZ, J.M.1, COPETE CARREÑO M.A.1 y
FERRANDIS GOTOR, P.1
1
Unidad de Botánica y Ecología. Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos. Campus universitario, s/n, 02071,
Albacete.
Resumen
Meum athamanticum está restringida a ambientes frescos y húmedos dentro de la región
fitogeográfica subatlántica-templada europea. Por ello, en Castilla-La Mancha aparece de
forma relíctica, de ahí su inclusión en el CREA en la categoría de “Vulnerable”. Así, el
conocimiento de su ecología germinativa cobra especial importancia de cara a su
conservación. Este estudio analiza el crecimiento del embrión, la emergencia de la radícula y
de las plántulas, tanto en condiciones controladas de laboratorio como en condiciones
próximas a las naturales. La longitud media inicial del embrión en semillas maduras es 0.92
mm, creciendo hasta 4.32 mm cuando la raíz está apunto de emerger. Este crecimiento tiene
lugar cuando las semillas son estratificadas un tiempo prologando a temperaturas frías propias
de los meses de invierno, alcanzando un 98% de germinación tras 4 meses a 5ºC en oscuridad.
De modo que en su hábitat natural, las plántulas no emergen hasta el inicio de la primavera
evitando el riesgo de heladas propio de zonas de montaña. Todo ello, unido a que el GA3
aumenta el crecimiento del embrión pero no llega a sustituir a la estratificación fría necesaria
para la germinación, indica que se trata de latencia morfofisiológica compleja profunda.
Palabras clave
Umbelliferae, crecimiento del embrión, germinación, ácido giberélico (GA3), Meum
athamanticum, latencia morfofisiológica.
1. Introducción
Dentro del gran grupo de las angiospermas, una de las familias mejor conocidas es
Umbelliferae Juss. (Apiaceae Lindl.), que contiene unas 3000 especies distribuidas por todo el
mundo, si bien se extienden especialmente en el hemisferio norte (Baskin et al., 1992). El
interés por profundizar en el conocimiento de la ecología germinativa de taxones incluidos en
esta familia se debe a que con frecuencia se les ha atribuido una pobre germinación
consecuencia de la latencia que presentan (Robinson, 1954), la cual está asociada a la
presencia de semillas con embriones de tipo linear subdesarrollados (Baskin & Baskin, 1998).
Sin profundizar en el tamaño del embrión, Grime et al (1981) observó que un periodo de frío
mejora la germinación en muchos taxones pertenecientes a Umbelliferae, siendo nula la
germinación postdispersión.
Otros estudios que sí contemplan el crecimiento del embrión, han servido para detectar
por un lado especies con latencia morfológica (LM), es decir, semillas cuyo embrión ha de
crecer en su interior para ser susceptibles de germinar pero que lo hacen en un periodo de
tiempo reducido (< 30 días) ya que no llevan asociada latencia de tipo fisiológico, como es el
caso de Conium maculatum (Baskin & Baskin, 1990). Por otro lado, también se incluyen
3/8
especies con latencia morfofisiológica (LMF), de esta clase se han documentado al menos tres
niveles: (1) simple no profunda en semillas de Selinum carvifolia y Angelica sylvestris
(Vandelook et al., 2007); (2) compleja no profunda en Sanicula canadensis y S. gregaria
(Hawkins et al., 2010); y (3) compleja profunda en Lomantium dissectum (Scholten et al.,
2009).
Este trabajo se centra en el estudio de los requerimientos germinativos de Meum
athamanticum, herbácea perenne restringida a ambientes frescos y húmedos dentro de la
región fitogeográfica subatlántica-templada europea. Así, su distribución alcanza cotas más
elevadas a medida que desciende latitudinalmente, de modo que en la zona centro de Europa
crece entre 550-1000 m s.n.m.; en áreas montanas y subalpinas de los Alpes entre 1500-2000
m s.n.m.; y en el sur del continente se halla en zonas alpinas entre 1400-2900 m s.n.m (Huck
et al., 2009). Por ello, en Castilla-La Mancha aparece de forma relíctica por lo que está
incluida en el Catálogo Regional de Especies Amenazadas (CREA) en la categoría de
“Vulnerable” (D.O.C.M., 2001). De modo que el conocimiento detallado de su ecología
germinativa resulta fundamental para su manejo y conservación en dicha región, a la vez que
contribuye a mejorar el conocimiento que se tiene a nivel de familia, además puede tener
cierto interés comercial para la producción de planta debido a los aceites esenciales que se
extraen de ella (Tesso et al., 2006).
2. Objetivos
El principal objetivo es averiguar cual es el nivel de LMF que poseen sus semillas, y así
desentrañar los mecanismos de ruptura de la misma, contribuyendo a mejorar el conocimiento
de los niveles de LMF presentes en Umbelliferae. Para ello, se fijan unos objetivos
específicos como son: (1) estudiar la fenología de crecimiento del embrión y emergencia de la
raíz y el tallo; (2) determinar la secuencia de temperaturas que permite el crecimiento del
embrión y la ruptura de la latencia (3) analizar el efecto del ácido giberélico (GA3) y del
almacenaje de las semillas sobre la rotura de latencia y el crecimiento del embrión.
3. Metodología
Recolección de semillas
La madurez de los frutos se produce en el verano. Así, los frutos con el mismo nivel de
madurez fueron recolectados el 16 de Agosto de 2007 y de 2008 a partir de plantas
aparentemente vigorosas y sanas que crecen en el Alto Tajo (Orea, Guadalajara; 30TXK0988,
1680m s.n.m.). Los frutos maduros fueron extendidos en el laboratorio para permitirles liberar
las semillas de forma progresiva y natural. Las semillas fueron secadas en el laboratorio (2223ºC) hasta el inicio de los ensayos de germinación que empezaron el 1 de Septiembre de
2007, momento en el que se considera que la edad de las semillas es de 0 meses.
Condiciones naturales en umbráculo
El objetivo de estos estudios es describir la fenología de crecimiento del embrión, de la
raíz y de emergencia del tallo en semillas de M. athamanticum enterradas bajo condiciones
cercanas a las del hábitat natural. Con lo cual, estas observaciones fueron realizadas en un
umbráculo desprovisto de control de temperaturas que se encuentra en las cercanías de
Albacete. El medio de cultivo en este tipo de ensayos era una mezcla esterilizada de turba y
4/8
arena (2:1 v/v). Las macetas y las bandejas que contienen las semillas fueron regadas hasta
capacidad de campo una vez por semana a lo largo del año, excepto en verano que se regaba
dos veces al mes para simular el estrés hídrico estival propio de la región Mediterránea y en
invierno debido a que el sustrato está helado.
Para determinar el crecimiento del embrión y emergencia de la raíz, el 1 de Septiembre
de 2007, varios lotes de semillas de M. athamanticum se mezclan con arena de grano fino
esterilizada y se introducen en bolsas de nylon permeables que a su vez eran enterradas en una
maceta con sustrato. Mensualmente, uno de estos lotes de semillas es desenterrado desde
Octubre hasta Marzo para calcular el porcentaje de emergencia de raíz y medir la longitud del
embrión usando una lupa equipada con un micrómetro. Así, a partir de 25 semillas se calcula
tanto la media como el error estándar al cabo de cada mes que permanecen las semillas
enterradas. En el caso, de aquellas semillas cuya raíz emerge durante el ensayo, se les asigna
una longitud de embrión equivalente a la longitud crítica, que se define como la longitud
media del embrión en 40 semillas cuya cubierta comienza a romperse para la emergencia de
la radícula pero justo antes de que tenga lugar. Así, la longitud crítica del embrión para la
germinación en M. athamanticum era 4.32 mm (SE = 0.10 mm, n = 40, rango = 2.80-5.80
mm). De igual modo, se utiliza este lote de semillas para calcular el E:S ratio crítico que es el
conciente entre la longitud del embrión y la de la semilla cuando está apunto de germinar, su
valor oscila entre 0.53 y 0.98, donde 0.53 es el E:S ratio umbral a partir de cual la radícula es
susceptible de emerger.
La emergencia de las plántulas se calcula a partir de un total de 300 semillas de M.
athamanticum sembradas en 3 bandejas (3 réplicas x 100 semillas) el 1 de Septiembre de
2007, las cuales se revisan semanalmente hasta el 1 de Mayo de 2010, de manera que las
plántulas emergentes eran contabilizadas y retiradas. El mismo experimento se realizó de
nuevo el 1 Noviembre de 2008 con semillas recolectadas en 2008.
Experimentos en laboratorio
Los ensayos se realizan en placas Petri de 9 o 16 cm, sobre dos capas de papel de filtro
que se mantiene húmedo de forma ininterrumpida a lo largo de los mismos. Estas placas se
colocan en cámaras de geminación (modelo Ibercex F-4), equipadas con un sistema de control
digital de luz y temperatura [± 0.1ºC, luz fría fluorescente blanca, 25μmolm-2s-1 (1350lux)].
En cuanto a las condiciones de iluminación, se testan dos tipos de ensayos: (1) 12h diarias de
fotoperiodo (=Luz, de aquí en adelante), es decir 12h de luz seguidas de 12h de oscuridad; (2)
oscuridad permanente (=Oscuridad, en adelante), ésta se consigue envolviendo las placas de
Petri con dos capas de papel de aluminio. Mientras que los regímenes térmicos ensayados
son: temperatura constante de 5ºC, y temperaturas fluctuantes con 12/12 h diarias de
regímenes de temperatura a 15/4, 20/7, 25/10, 28/14 y 32/18ºC. En los tratamientos
alternantes de 12/12h, la temperatura alta coincide con la fase de luz y la baja con la de
oscuridad para simular las condiciones de día/noche. La elección de las temperaturas
fluctuantes trata de aproximarse a las medias mensuales máximas y mínimas que tienen lugar
en el hábitat natural a lo largo del año. El tratamiento a 5ºC simula la temperatura de los
meses de invierno, y además es considerada óptima para muchas especies que requieren frío.
Con el fin de averiguar bajo que condiciones se produce el desarrollo del embrión, se
realiza un seguimiento mensual de la longitud del embrión en semillas testadas en luz durante
cuatro meses en tres combinaciones térmicas diferentes: (1) calor (25/10ºC), (2) frío (5ºC) y
5/8
(3) calor seguido de frío (25/10+20/7+5+5ºC). Para evaluar dicho crecimiento es necesario
calcular su tamaño inicial a partir de 25 semillas maduras hidratadas durante 24 h.
Para establecer cuales son las condiciones de temperatura, de luz y de edad óptimas para
la emergencia de la radícula en semillas con el embrión ya desarrollado, se realiza un
experimento en Septiembre de 2007 y Mayo de 2008, con semillas de 0 y 8 meses de edad,
respectivamente, y en Septiembre de 2008 con semillas de 0 meses. En cada grupo, 600
semillas se colocan sobre papel húmedo a 5ºC en luz y oscuridad durante 4 meses, y
posteriormente 100 semillas (cuatro réplicas de 25 semillas) fueron transferidas a 5, 15/4 y
20/7ºC, (estratificación en luz, incubación en luz y en oscuridad; estratificación en oscuridad,
incubación en luz y en oscuridad) durante 30 días. El recuento y retirada de las radículas
emergidas se realiza cada 3-4 días. Los porcentajes de emergencia de raíz se calculan en base
al número de semillas aparentemente viables, es decir, aquellas cuyos embriones eran blancos
y firmes. Más del 95% de las semillas eran viables.
Con objeto de evaluar el efecto del ácido giberélico sobre la rotura de latencia se
incuban 2 lotes de 100 semillas a cada una de las seis temperaturas ensayadas: 5, 15/4, 20/7,
25/10, 28/14 y 32/18ºC en luz durante 3 meses. En todas las condiciones térmicas, uno de los
lotes se humedece con agua destilada (control), mientras que el otro se riega inicialmente con
una disolución de GA3 (1000 mgl-1).
4. Resultados
Condiciones naturales en umbráculo
35
A
máxima
maximum
mínima
minimum
25
15
5
-5
100
S SO O N N D D J E F FM MA AM M J J J
07 07 07 07 08 08 08 08 08 08 08
Emergence
(%)
Emergencia(%)
B
80
N N D D J E F FM MA AM M J J J
08 08 09 09 09 09 09 09 09
DD J E F F M MA A
09 10 10 10 10
Shoot
emergence
(%)
(%)
Emergencia
tallo (%)
Longitudlength
embrión (mm)
Embryo
60
6.0
6,0
5.0
5,0
4.0
4,0
3.0
3,0
40
2.0
2,0
20
1.0
1,0
(mm)
Length
Embryodel
embrión
(mm)
Longitud
Mean daily
Temperatura
temperature
(ºC)
diaria(ºC)
media
La longitud inicial del embrión es 0.92 ± 0.03 mm y prácticamente no crece en los tres
meses de enterramiento posteriores, así la longitud del embrión en semillas desenterradas el 1
de Diciembre de 2007 es de 1.20 ± 0.04 mm (Figura 1B).
0.0
0,0
0
S SO ON ND DJ E F FM MA AM MJ J J
0707
07070707
0707
08080808
0808080808080808
08
N ND DJ E F FM MA A M MJ J J
08080808
0909
0909
0909
09090909
090909
D D J E F FMM A A M
0910101010101010101010
Figura 1. Temperatura media diaria mínima y máxima (A) y fenología del crecimiento del embrión y de la emergencia del
tallo en semillas enterradas en el suelo bajo un umbráculo en Septiembre de 2007 y de Noviembre de 2008 (B).
Sin embargo, transcurridos los meses de Diciembre y Enero con una temperatura media
de las mínimas y de las máximas de -1 y 12ºC (Figura 1A), respectivamente, el embrión
6/8
duplica su talla ampliamente alcanzado una longitud de 2.55 ± 0.11 mm, lo que supone que el
30% de los mismos supera el E:S ratio umbral a principios de Febrero.
Semillas sembradas en Septiembre de 2007 no emiten tallos a la superficie hasta
primeros de Marzo (1%), siendo el porcentaje al final de la primavera de 2008 del 12%
(Figura 1B). De modo similar, se produce un nuevo repunte en los tallos emergidos tras las
primavera de 2009, alcanzando valores próximos al 40%. Por otro lado, aquéllas semillas
sembradas en Noviembre de 2008 presentan un comportamiento afín, es decir, los primeros
tallos aparecen en Marzo (3%), siendo el porcentaje acumulado de emergencia de plántulas al
final de la primavera de 2009 del 28%.
Experimentos en laboratorio
Semillas incubadas a 25/10ºC alcanzan un E:S ratio de 0.24 tras 4 meses de
estratificación que no es significativamente (p > 0.05) mayor que el ratio inicial que es 0.17,
mientras que tras la secuencia de calor seguido de frío (25/10+20/7+5+5ºC) la relación entre
la longitud del embrión y la de la semilla es 0.58 y finalmente en el tratamiento de frío a 5ºC
es 0.73. Los porcentajes de germinación son 0, 12 y 72%, respectivamente (Figura 2).
1.0
1,0
5ºC
25/10ºC
25/10+20/7+5+5ºC
E:S ratio
0,8
0.8
(16 , 92)
(72 , 96)
(0 , 60)
0,6
0.6
0,4
0.4
(12 , 60)
(0 , 12)
(0 , 0)
0,2
0.2 (0 , 0)
(0 , 0)
(0 , 0)
(0 , 0)
(0 , 0)
(0 , 0)
0.0
0,0
0
1
2
Meses
3
4
Figura 2: Crecimiento del embrión en semillas de Meum athamanticum de 2007 estratificadas 4 meses en luz a temperatura
fría (5ºC), cálida (25/10ºC) o cálida seguida de fría (25/10+20/7+5+5ºC). Primer número entre paréntesis es el porcentaje
de germinación y el segundo es el de semillas que superan el umbral crítico. Barras verticales simbolizan el SE, n = 25.
La Figura 3 nos muestra el porcentaje de germinación en semillas que han sido
previamente estratificadas durante 3 meses a 5ºC con objeto de desarrollar el embrión y a
continuación incubadas bajo diferentes condiciones. Así, el porcentaje de germinación más
alto es de un 98% y se consigue con semillas de 2007 de 0 meses de edad incubadas a 5ºC en
oscuridad. La temperatura de incubación influye significativamente (p < 0.01) sobre el
porcentaje de emergencia de raíz, siendo la más efectiva 5ºC, seguida de 15/4 y 20/7ºC. Por
otro lado, existe variabilidad interanual ya que las semillas recolectadas en 2007 germinan
más abundantemente que las de 2008 (p < 0.01). Sin embargo, la luz carece de efecto tanto
durante la estratificación (p > 0.05) como durante la incubación; al igual que la edad de la
semilla (p > 0.05).
7/8
B. 5ºC
A. 5ºC
100
80
80
60
60
40
40
20
20
Germinación (%)
100
0
0
0
8
0
0
8
0
07
07
08
07
07
08
A. 15/4ºC
100
80
80
60
60
40
40
20
20
Germinación (%)
Edad semilla (meses)
Año de recogida
B. 15/4ºC
100
0
0
0
8
0
0
8
0
07
07
08
07
07
08
Edad semilla (meses)
Año de recogida
B. 20/7ºC
A. 20/7ºC
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
Germinación (%)
INCUBACIÓN
Luz
Oscuridad
0
0
0
8
0
0
8
0
07
07
08
07
07
08
Edad semilla (meses)
Año de recogida
Figura 3: Emergencia de raíz en semillas de Meum athamanticum estratificadas en luz (A) y en oscuridad (B) a 5ºC durante
3 meses, y a continuación incubadas a 5, 15/4 y 20/7ºC en luz y en oscuridad. Barras verticales simbolizan el SE, n = 25.
En los experimentos con GA3 (Tabla 1), las longitudes del embrión son
significativamente superiores (p < 0.05) que en el control en todas las temperaturas ensayadas
excepto 32/18ºC. Así, tras 12 semanas a 5ºC el tamaño del embrión en semillas humedecidas
con agua destilada es 3.92±0.19 mm con un 16% de emergencia de raíz, y en los ensayos con
GA3 es 5.18±0.15 mm con un 62% de semillas germinadas. A 25/10ºC el tamaño del embrión
varía de 1.38±0.06 mm en el control a 2.60±0.34 mm en el test con GA3, siendo el porcentaje
de semillas que superan el E:S ratio umbral del 40%, si bien la emergencia de radícula es
nula.
Tabla 1: Efecto del GA3 sobre el crecimiento del embrión a diferentes temperaturas. Tiempo incubación 3 meses en
condiciones de luz. El primer número entre paréntesis es el porcentaje de germinación y el segundo es el porcentaje de
semillas cuyo E:S ratio supera el valor umbral (0.53). Semillas recogidas en 2007. Letras mayúsculas diferentes indican
diferencias significativas dentro de columna y letras minúsculas indican diferencias significativas dentro de fila (p < 0.05)
Concentración
GA3
5ºC
15/4ºC
Ab
20/7ºC
Aa
25/10ºC
Aa
Aa
28/14ºC
32/18ºC
Aa
3.92±0.19 1.42±0.04 1.25±0.06 1.38±0.06
1.24±0.04 1.40±0.03Aa
(16 , 90)
(0 , 0)
(0 , 0)
(0 , 0)
(0 , 0)
(0 , 0)
5.18±0.15Bc 2.69±0.19Bb 2.79±0.46Bab 2.60±0.34Bab 1.78±0.21Bab 1.60±0.16Aa
-1
1000 (mgL )
(62 , 100)
(5 , 40)
(3 , 50)
(0 , 40)
(0 , 10)
(0 , 0)
0 (mgL-1)
5. Discusión
En la familia Umbelliferae (también conocida como Apiaceae) hay distintos tipos de
embrión: los rudimentarios son los más primitivos, seguidos de los lineares y finalmente los
espatulados serían los más avanzados (Baskin et al., 1992). En el caso de M. athamanticum,
son de tipo linear y subdesarrollado, así en el momento de la dispersión, el embrión ocupa tan
8/8
sólo un 17% de la longitud total de la semilla, mientras que en semillas apunto de germinar
ese porcentaje oscila entre un 53 y un 98% (Figura 4).
Figura 4: Crecimiento del embrión en semillas de Meum athamanticum que permite la emergencia de la radícula.
En semillas de M. athamanticum: (1) se requiere 4 meses de estratificación/incubación a
5ºC (Figura 2); (2) la edad de la semilla no influye significativamente en la germinación, de
modo que no supone un acortamiento del tiempo de estratificación fría requerido (Figura 3); y
(3) el GA3 favorece el crecimiento del embrión y la emergencia de la raíz pero no es capaz de
sustituir a la estratificación fría requerida para romper la latencia, de ahí que a pesar del GA3,
la germinación sea prácticamente nula a aquellas temperaturas alejadas del rango óptimo de
estratificación fría (0-10ºC) (Tabla 1). Todo ello indica que sus semillas poseen LMF
compleja profunda.
De modo que en su hábitat natural, semillas con el embrión subdesarrollado son
dispersadas en Agosto permaneciendo aletargadas hasta llegar los meses de invierno, en los
que tras un mes de frío se inician los mecanismos fisiológicos dentro de la semilla que
desencadenan la secuencia de rotura de latencia. Esto asegura que las plántulas no quedan
expuestas a condiciones frías extremas, ya que permanecen durante este periodo bajo tierra en
forma de semilla recibiendo los aproximadamente 90 días de estratificación fría requeridos,
de manera que la radícula no emerge hasta el mes de Marzo, asegurando que los órganos
aéreos emergen en el principio de la primavera que es considerada la estación más favorable
para el reclutamiento de plántulas, aprovechando al máximo el corto periodo de crecimiento
que se da en zonas de montaña.
6. Conclusiones
De esta investigación se concluye que las semillas de M. athamanticum tienen LMF
compleja profunda al igual que otras especies de la familia. Así como, ciertas
recomendaciones útiles para optimizar la obtención de planta a partir de semillas de M.
athamanticum (Figura 5).
HÁBITAT NATURAL
LABORATORIO (tratamientos en oscuridad)
Trasplantar los rizomas
más vigorosos
Crecimiento Embrión y emergencia de la raíz
(Marzo/Abril)
( Diciembre - Marzo)
Plantas adultas
Rizoma desarrollado
y floración
5ºC + GA3
UMBRÁCULO
2 ciclos
vegetativos
Plántula
Epicotilo emergente
(Marzo/Abril)
Semillas
con
radícula
Figura 5: Protocolo para producir plantas de Meum athamanticum a partir de semillas.
9/8
7. Agradecimientos
Estudio realizado en el marco del desarrollo del proyecto “Ecología germinativa de 12
especies de flora singular y/o amenazada con latencia morfofisiológica”, financiado por la
Consejería de Educación y Ciencia de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha.
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