Download Establecimiento de Líneas Celulares para el desarrollo de

Establecimiento de Líneas Celulares
para el desarrollo de vacunas
antitumorales y desafío de modelos
animales
Becario/Bolsista
Alejandro Antonio Torres Riquelme
Estudiante de Bioquímica
Universidad de Santiago de Chile
Orientador
Marcio Chaim Bagjelman
Laboratorio de Vectores Virales
Relatório Técnico-Científico apresentado
como requisito parcial exigido no 23º Programa
Bolsas de Verão do CNPEM - Centro Nacional
de Pesquisa em Energia e Materiais.
Campinas, SP, 2014
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
Indice
Agradecimientos ··············································································· 3
Resumen ························································································ 4
Abstract ························································································· 5
Índice de Figuras ··············································································· 6
Indice de Tablas ················································································ 6
1. Capítulo 1: Introducción ····································································· 7
1.1. Cáncer ····················································································· 7
1.1.1. Historia
1.1.2. Características Principales
1.1.2.1.
Mantención de señales proliferativas
1.1.2.2.
Evasión de señales anti-proliferativas
1.1.2.3.
Evasión de la Muerte Celular
1.1.2.4.
Inmortalidad replicativa
1.1.2.5.
Inducción de Angiogénesis
1.1.2.6.
Invasión y metástasis
1.1.2.7.
Evadir destrucción inmune
1.1.3. Terapias Actuales
1.2. Inmunoterapia ·········································································· 15
1.2.1. Modificación genética de cultivo de células y ensayos n vivo
2. Capítulo 2: Desenvolvimiento ···························································· 17
2.1. Objetivos ················································································ 17
2.1.1. General
2.1.2. Específicos
2.2. Materiales y Metodología ····························································· 17
2.2.1. Vectores plasmidiales y Producción de partículas virales
2.2.2. Cultivo Celular
2.2.2.1.
Curva de selección con G418
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2.2.2.2.
Titulación de los vectores virales
2.2.2.3.
Transfección de células 4T1
2.2.2.4.
Determinación de producción de GM-CSF mediante ELISA
2.2.2.5.
Evaluación de los clones mediante Citometría de flujo
2.2.2.6.
Mantención de clones B16
2.2.3. Modelo Animal e Inyección de vacunas
2.2.3.1.
Establecimiento del modelo de tumor B16
2.2.3.2.
Inyección de vacunas
3. Resultados y Discusión ···································································· 25
3.1. Cultivo celular ·········································································· 25
3.1.1. Curva de Selección
3.1.2. Titulación de los Vectores Virales
3.1.3. Establecimiento de Clones 4T1
3.1.4. Expresión de GM-CSF,41bbL y OX40 de células B16
3.2. Modelo Animal e Inyección de vacunas ············································ 24
4. Conclusión ··················································································· 32
5. Referencias ·················································································· 33
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Agradecimientos
La generación de este trabajo investigativo no podría ser posible sin el
apoyo y confianza que el Centro Nacional de Investigación en Energía y
Materiales (o por sus siglas en portugués, CNPEM) así como el constante apoyo,
dedicación y guía del Comité gestor del proyecto, el Sr. Roberto Medeiros. Cabe
destacar también la guía, comprensión y tutoría del Dr. Marcio Bajgelman, que
sin su apoyo, dedicación y orientación, el transcurso del proyecto tampoco
hubiera tenido el desarrollo que se logró hasta el momento.
Podemos destacar también la participación de los distintos integrantes del
laboratorio de Vectores Virales, de entre los que se destacan Andrea Johanna
Manrique Rincón, Anna Carolina Pereira Vieira de Carvalho, Camila Marques
Beraldo e Igor Frederico de Souza Custodio, que gracias a su constante apoyo,
carisma y ayuda durante el transcurso de este proyecto, no solo hicieron más
grato el ambiente del día a día, sino también la formación de un equipo de
investigación capaz de interactuar mas allá de los que es el trabajo de por si, por
lo tanto les estoy completamente agradecido por el grato pasar de los 2 meses en
los cuales fui aceptado en este laboratorio.
No menos importante son los compañeros becarios, los cuales hacían el
día a día más ameno y tranquilo, ya que con su convivencia y constantes
actividades juntos pudimos entendernos mejor no solo como científicos y
estudiantes, sino también como personas, sin dejar de lado la independencia que
tenemos cada uno con nosotros mismos al igual que con ellos.
Estoy agradecido también con mis padres y mi familia, que sin su apoyo
no estaría acá, debido a que ellos fueron los responsables de mi crianza y
educación.
Labor Omnia Vincit y Labor Laetitia Nostra, lemas del colegio en donde
egresé y la universidad en donde realizo mis estudios actuales. Ambos lemas
importantes en lo que refiere al fortalecimiento personal como profesional,
debido a que el trabajo no solo nos lleva lejos, sino también forma parte de
nosotros, y lo seguirá siendo mientras sigamos trabajando duro por lo que
queremos y necesitamos.
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Resumen
Los tratamientos convencionales para combatir el cáncer se basan
principalmente en la remoción quirúrgica de estos, y la terapia coadyuvante
mediante la radioterapia y la quimioterapia. Sin embargo estos recursos
utilizados no presentan una forma selectiva de eliminar las células tumorales, por
lo cual generan efectos secundarios, además de la existencia de múltiples
canceres que son resistentes a este tipo de tratamiento debido a su agresividad y
su inestabilidad genómica. En este sentido, el desarrollo de nuevas estrategias
terapéuticas capaces de eliminar selectivamente al cáncer ha estado en boga por
los últimos años. Uno de estos tratamientos corresponde a la Inmunoterapia, la
cual tiene como fin estimular el sistema inmune del mismo paciente y eliminar
las células tumorales que han generado metástasis. Este tipo de tratamiento se
encuentra en un aumento en su popularidad y avances tecnológicos.
En este proyecto participamos en el desarrollo de líneas celulares que
contienen los inmunomoduladores 41bbL, OX40L y GM-CSF, a partir de la
transducción viral de la línea parental 4T1, derivada de cáncer de mama murino.
Por otra parte también se participo en la ejecución de ensayos que implican la
experimentación con animales, para las pruebas de otras líneas celulares que
contienen los mismos inmunomoduladores. Estas líneas celulares B16 derivan de
células de melanoma murino, los cuales pueden simular el modelo de metástasis
pulmonar
Las líneas celulares 4T1 podrán se clonadas y utilizadas en experimentos
posteriores en el LNBio. El experimento realizado con la línea células B16 se
encuentra actualmente en curso y su resultado podrá contribuir para el desarrollo
de nuevos enfoque para el desarrollo de vacunas antitumorales.
Keywords: Melanoma, Cáncer de Mama, Inmunomoduladores, Inmunoterapia
41bbL, OX40L, GM-CSF, Modelos Animales.
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Abstract
The conventional treatments for cancer are primarily based on the surgical
removal of the tumor and adjuvant therapy with radiotherapy and chemotherapy.
However, these resources lack specificity to eliminate tumor cells, and may
induce adverse effects. In addition, there are multiple cancers that are resistant to
this type of treatment because of its aggressiveness and genomic instability. In
this sense, the development of new therapeutic strategies that provide enhanced
specificity for cancer has been in vogue in recent years. One such treatment is the
immunotherapy, which is intended to stimulate the patient's immune system to
detect and eliminate tumor cells that have metastasized in a selective manner.
Last findings and technological advances have contributed to increase popularity
of immunotherapy among the best in class approaches for new cancer treatments.
In this project we contributed to development of cell lines containing the 41bbL,
OX40L and GM -CSF immunomodulators from viral transduction 4T1 parental
line derived from murine breast cancer. Moreover also participated in the
execution of in vivo studies, testing for other cell lines containing the same
immunomodulators. These cell lines are derived from B16 mouse melanoma
cells, which can simulate a lung metastases model
The 4T1 cell lines may be cloned and used in subsequent experiments at LNBio.
The experiment performed with the cell line B16 is ongoing and the result may
contribute to the development of new approaches for tumor vaccines.
Keywords: Melanoma, Breast Cancer, immunomodulators, Immunotherapy,
41bbL, OX40L, GM-CSF, Animal models
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Índice de Figuras
 Figura 1 Características Principales del cáncer
8
 Figura 2 Características Emergentes del cáncer
12
 Figura 3 Curva de titulación de los vectores pCL-41bbL y OX40L
mediante Citometría de Flujo.
25
 Figura 4 Curva de titulación del Vector pCL-GM-CSF mediante
selección con G418.
26
 Figura 5 Ecuación para la determina la concentración de partículas
virales por mililitro
27
 Figura 6 Evaluación de la expresión de 41bbL y OX40L de las
células 4T1 mediante Citometría de Flujo.
27
 Figura 7 Evaluación de la expresión de GM-CSF de las células 4T1
mediante ELISA.
27
 Figura 8 Citometría de flujo de los clones recombinantes B16
41bbL.
28
 Figura 9 Citometría de flujo de los clones recombinantes B16
OX40L.
28
Índice de Tablas
 Tabla 1 Orden de las muestras del ensayo de ELISA
23
 Tabla 2 Resultados del ensayo de ELISA
29
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Capítulo 1: Introducción
1.1 Cáncer
1.1.1 Historia
El cáncer es una enfermedad caracterizada por la aparición de múltiples masas en
el cuerpo de un organismo, también denominados tumores, los cuales se
encuentran compuestos por células que han perdido sus características naturales
y han sufrido un proceso de transformación. Esta transformación celular lleva a
que estas se dupliquen indeterminadamente y formando estas masas que aparecen
en los distintos tejidos del organismo(Hajdu, 2011a).
Debido a que en la actualidad las enfermedades infecciosas están controladas, el
cáncer se ha transformado en la principal causa de muerte en los seres
humanos(Hajdu, 2011a).
Esta enfermedad se catalogó por primera vez en la antigua Grecia por Hipócrates,
refiriéndose a diferentes tipos de la enfermedad como cárcinos y carcinomas (en
referencia a los cangrejos), de entre los diferentes tipos de neoplasias que
diagnosticó. Entre los diferentes canceres que diagnostico se encuentran los
canceres de piel, mama, cérvix, colon y estomago. Tres siglos después de los
descubrimientos de Hipócrates, Aulus Cornelius Celsus, un medico romano
inspirado en los trabajos médicos de la antigua Grecia y Egipto, catalogo
enfermedades que consistían en masas de tejido que aparecían principalmente en
la parte superior del cuerpo de los pacientes, describiendo también diferentes
estadios de la enfermedad, llamando a la primera fase de la enfermedad como
cacoethes (del griego antiguo, κακός (kakos, “mal”) + ἦθος (ēthos, “disposición,
naturaleza”) el cual era el único estadio en donde definió que se podría realizar
un tratamiento(Hajdu, 2011a).
Un milenio y medio después, durante el siglo XVI en el renacimiento, diferentes
científicos como Galileo o Isaac Newton realizaron estudios por primera vez
utilizando el método científico para buscar el origen de esta enfermedad, así
como avances anatómicos en el desarrollo de la enfermedad, en donde Gaspard
Aselli se destaco por el descubrimiento del sistema linfático, donde
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RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
posteriormente se descubrió la gran importancia que tenia para el desarrollo del
cáncer, principalmente de la participación de este en los procesos de metástasis.
En el siglo XVII, Nicolaes Tulp propuso que la enfermedad era un veneno que
mataba lentamente el cuerpo, lo que llevo a diferentes médicos, como Sennert, a
la conclusión que esta enfermedad era contagiosa, llevando a que los enfermos de
cáncer fueran excluidos de los hospitales por miedo al contagio, conclusión que
posteriormente resulto ser falsa(Hajdu, 2011b).
En el año 1902, un zoólogo alemán llamado Theodor Boveri postuló que el
origen del cáncer debía estar asociado a algún tipo de desregulación génica dada
en células normales del organismo, llevando a la formación de la patología,
mientras realizaba ensayos de generación de células con múltiples cromosomas
en anemonas. Este trabajo fue recientemente traducido, debido que en su tiempo
no tuvo un mayor impacto en la sociedad científica, sin embargo es un enfoque
bastante acercado a lo que se conoce en la actualidad con respecto al genoma de
las células malignas(Boveri, 2008).
Actualmente se ha descubierto que no existe un solo tipo de cáncer, sino que
existen diferentes tipos con características particulares para cada tipo, así como
Figura 1 Principales características del cáncer.(D. Hanahan & Weinberg, 2011) figura representativa de
las diferentes características principales del cáncer, ente ellas la Mantención de las Señales Proliferativas,
Evasión de los supresores de la Proliferación, Evasión de la Muerte Celular, Inducción de Angiogénesis,
Activación de Invasión y Metástasis, y la Inmortalidad Replicativa.
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diferentes tipos de desregulaciones génicas y metabólicas que permiten la
progresión de la enfermedad. El descubrimiento en la antigüedad, su
clasificación, mas todos estos tipos de canceres y diferentes modelos
desarrollados en animales para el estudio de la enfermedad, han contribuido al
descubrimiento y la búsqueda de terapias más efectivas en la lucha contra el
cáncer.
1.1.2. Características principales
Desde los años 50 en adelante se ha intentado descubrir las principales
características de las células maligna, para así dar un mejor enfoque a posibles
tratamientos contra la enfermedad, llevando a diferentes investigaciones que
explicaban las deficiencias que presentaban las células malignas. El año 2000, los
autores Douglas Hanahan y Robert A. Weinberg(D. Hanahan & Weinberg, 2011)
describieron 6 características principales del cáncer, en lo cual, 11 años más
tarde, se descubrió otra característica principal.
1.1.2.1.
Mantención de Señales Proliferativas
En un ambiente celular normal, se mantiene una homeostasis constante para la
mantención e integridad del tejido de los órganos, sin embargo, cuando existe
daño del tejido afectando su integridad, en una etapa posterior a que el sistema
inmune innato tomara acción sobre el tejido, se generan una diversidad de
señales de proliferación que permiten la división de las células endoteliales y
fibroblastoides, las cuales recuperan la integridad del tejido dañado. Cuando se
pierde el control de las señales Proliferativas, tanto extra como intracelularmente,
se genera la proliferación descontrolada de las células, lo que conlleva a la
formación de tumores en el tejido. Estas señales celulares pueden generarse
mediante diferentes tipos de mutaciones en el genoma de una célula, de entre lo
que cabe destacar son las mutaciones en las vías de señalización de las rutas
EGF’s (Proteínas de la familia de GTPasas Ras)(Davies & Samuels, 2010;
Witsch, Sela, & Yarden, 2010), así como la de receptores que responden a estas
señales proliferativas (Her-2/Neu)(Witsch et al., 2010), e incluso factores de
transcripción acoplados a pro
-catenina). La
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generación de estas señales de manera constante en el citoplasma de manera
descontrolada genera el fenotipo principal del cáncer.
1.1.2.2.
Evasión de señales anti-proliferativas
Un sistema de señalización no es independiente de un sistema de control, debido
a que por cualquier motivo en el cual se active, incluyendo la activación
accidental, el sistema estaría condenado a responder completamente a este
estímulo. Por esta razón los sistemas biológicos cuentan con distintos sistemas de
control para la regulación de las distintas señales intracelulares, para que cuando
una señal supere cierto nivel de umbral, el sistema responda correctamente. Entre
los principales sistemas de control existentes, entre los que cabe destacar en su
participación en la regulación del ciclo celular, se encuentran la proteína
Retinoblastoma (Rb) y el gen TP53 (codifica el factor de transcripción
p53)(Burkhart & Sage, 2008). No menos importantes son las proteínas de
adhesión celular, las cuales al interaccionar con proteínas de adhesión de otras
células producen la señalización de detención del ciclo celular, manteniendo la
célula en un estado quiescente. Entre estos sistemas se encuentran los sistemas de
E-caderinas, las cuales al interaccionar entre sí en distintas células, mantiene bcatenina en el citoplasma, manteniendo el estado quiescente, lo cual es
denominado inhibición por contacto. Cuando estas interacciones entre las células
se pierden, se permite que se generen señales de proliferación. Una gran cantidad
de canceres contienen este tipo de mutaciones(Curto, Cole, Lallemand, Liu, &
McClatchey, 2007).
1.1.2.3.
Evasión de la Muerte celular
Uno de los mecanismos principales por el cual las células evitan la
transformación maligna es la apoptosis, este sistema se encuentra principalmente
mediado por la proteína p53, ya mencionada anteriormente. Al generarse daño en
el DNA y no poder ser reparado, la proteína p53 se acumula, permitiendo la
transcripción de proteínas esenciales en la iniciación de la apoptosis (ej. PUMA,
Bax, etc.), en la mayoría de los canceres, se ha visto que p53 se encuentra
mutado, no solamente en su función de reclutar la maquinaria de reparación del
DNA, sino también en su acción como factor de transcripción, llevando a su
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acumulación en el citoplasma y el núcleo celular, permitiendo que el cáncer se
desarrolle sin llegar a la vía de la apoptosis(Hamzehloie, Mojarrad, Hasanzadeh
Nazarabadi, & Shekouhi, 2012).
1.1.2.4.
Inmortalidad replicativa
En 1961, Leonard Hayflick definio que existia un numero limitado de divisiones
que una celula podia realizar, llamando a esta cifra el limite de Hayflick(Hayflick
& Moorhead, 1961). Este descubrimiento se hizo al contar el numero estimado
de veces que celulas embrionarias se dividian en cultivo celular, siendo este entre
unas 40 a 60 veces(Hayflick, 1965), posteriomente se descubrio que el proceso
involucrado correspondia al acortamiento de los telomeros(Olovnikov, 1996).
Los telomeros son secuencias tandem de hexanucleotidos no codificantes
presentes en los extremos de los cromosomas, los cuales se acortan en cada
proceso de mitosis, llegando a un punto en donde estos desaparecen, llevando a
la celula a un estado latente conocido como senescencia replicativa(Hayflick,
1965). En el cancer no se produce un acortamiento de los telomeros debido a que
se activa una enzima denominada telomerasa, la cual es responsable de la
mantencion de la longitud de los telomeros. Al no haber un acortamiento de los
telomeros, se permite que las celulas se puedan dividir sin un limite
definido(Wright & Shay, 2000).
1.1.2.5.
Induccion de Angiogenesis
La angiogénesis es un proceso de generación de nuevos vasos sanguíneos y
corresponde a un proceso normal en los animales, sobretodo en procesos de
reparación de tejidos, embriogénesis, y en el caso de los mamíferos, la
generación del endometrio femenino al interior del útero. En estos procesos las
señales angiogénicas y anti-angiogenicas se encuentran bajo un estricto equilibrio
para la correcta formación de los nuevos vasos sanguíneos, en el cáncer, hay un
desequilibrio en las señales, generando que los canceres sean profusamente
vascularizados,
con
defectos
en
la estructura
normal
de
los
vasos
sanguíneos(Nagy & Dvorak, 2012), produciéndose un flujo anormal de la sangre
en los sitios del tumor, así como micro hemorragias y una alta proliferación de
las células endoteliales.
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Figura 2 Características emergentes del cáncer(D. Hanahan & Weinberg, 2011). Se representan
características que han surgido en los últimos años, las cuales representan nuevos enfoques para el
tratamiento del cáncer. Entre estas la desregulación del metabolismo Energético y la Evasión del Sistema
Inmune
1.1.2.6.
Invasión y metástasis
Una de las principales características que define al cáncer es su capacidad para
invadir tejidos, no solamente el tejido de donde se derivo, sino también la
capacidad de poder viajar por el sistema linfático a otros tejidos y crecer. Un
ejemplo clásico de esto es la capacidad del cáncer de mama de localizarse en los
pulmones y el hígado. La capacidad del cáncer de realizar este tipo de traslado
desde el tejido progenitor hasta un tejido secundario radica en el cambio de las
moléculas de adhesión que expresa, siendo N-caderinas el nuevo tipo, presente
mayoritariamente en células progenitoras de neuronas, en comparación a la Ecaderina, la cual se encuentra presente en el tejido epitelial(Cavallaro &
Christofori, 2004). Mas no solo se necesita este tipo de cambio de moléculas de
adhesión, sino también la expresión de un repertorio de enzimas degradadoras de
matriz extracelular, también denominadas proteínas ADAM, que corresponden a
un tipo de endopeptidasas capaces de degrada la matriz. Este tipo de enzimas se
ha visto que tienen una alta expresión en canceres, especialmente en cáncer de
mama, en donde además de aumentar la capacidad invasiva del tumor, también
activa una vía de proliferación común en este tipo de cáncer(Liu et al., 2006).
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1.1.2.7.
Reprogramación del metabolismo energético
El cáncer, al tener un alto índice replicativo, requiere una gran cantidad de
energía para realizar las replicaciones y la generación de biomasa que genera en
tan poco tiempo, considerando la energía necesaria que requiere los procesos de
mitosis. Una célula normalmente tiene acceso a oxigeno y glucosa, las fuentes
principales de energía para generar una gran cantidad de ATP necesario, sin
embargo, las células tumorales que se encuentran más al interior del tumor no
tienen esa cantidad de oxigeno presente en su ambiente, dado la capacidad de
difusión que tienen los gases en medios acuosos, al contrario de la glucosa, que
difunde más que el oxigeno, generando que las células tumorales necesiten de
utilizar la ruta de la glicolisis, la cual aunque no genera una gran cantidad de
ATP, es más rápido en comparación con el ciclo de Krebs. Este efecto fue
descrito por Warburg el año 1930, además de la observación que las células
cambiaban el tipo de metabolismo de aeróbico a anaeróbico incluso ante la
presencia de oxigeno(Warburg, Wind, & Negelein, 1927).
1.1.2.8.
Evasión del sistema inmune
Para permitir la progresión tumoral en un organismo, las células tumorales deben
inactivar la respuesta inmune del huésped para evitar su eliminación. Esta
función es intrínseca del sistema inmune, de poder reconocer células
transformadas debido a la presencia e una proteína mutada presentada en el MHC
a los linfocitos T, o una mayor frecuencia de los mismos péptidos debido a la
sobreexpresión de ciertas proteínas por parte de las células tumorales. La
presencia de estos antígenos tumorales alertaría al sistema inmune de la presencia
de organismos extraños, eliminando las células tumorales. Sin embargo, ciertos
canceres han generado diferentes estrategias para la evasión de la destrucción por
parte del sistema inmune, permitiendo su progresión.
1.1.3. Terapias actuales
Actualmente entre los tratamientos más efectivos y baratos que pueden
encontrarse para el tratamiento del cáncer se encuentran la escisión del tumor y
las terapias coadyuvantes, donde se encuentran la radioterapia y la quimioterapia.
Lamentablemente la detección de los tumores se realiza de una manera tardía,
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RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
debido principalmente al tamaño mínimo de un tumor para ser detectado,
llegando al punto que estos se detectan cuando estos ya han generado
metástasis(Lind, 2011). Para abordar este problema se generaron las terapias
coadyuvantes, las que tienen como objetivo eliminar las células tumorales que
han invadido otros tejidos, los cuales no son fácilmente detectables.
Entre las distintas terapias coadyuvantes podemos encontrar la radioterapia, la
que utiliza radiación ionizante para generar una gran cantidad de especies
reactivas de oxigeno para generar daño celular, debido al metabolismo acelerado
que tienen las células tumorales, así como generar diferentes mutaciones que lo
hagan inviable la mitosis celular en estas. La segunda opción de terapias
coadyuvantes es la quimioterapia, que consiste en utilizar químicos que imiten
los diferentes sustratos que una célula necesita para la generación de biomasa, y
posteriormente para realizar mitosis, o en la inhibición de una ruta biosintética
para el mismo fin(Lind, 2011).
Entre los diferentes químicos utilizados ampliamente en el tratamiento del
cáncer, podemos dividirlos en varios tipos siendo estos los agentes alquilantes,
antimetabolitos, antraciclinas e inhibidores de procesos involucrados en la
mitosis(Lind, 2011).
Los agentes alquilantes corresponden a químicos capaces de unirse al DNA,
entrecruzándolo, por lo tanto genera errores en la duplicación del DNA. Debido a
que el cáncer tiene una alta tasa de replicación, este genera una mayor cantidad
de errores al duplicarse la célula, generando células inviables que se eliminan con
el tiempo(Lind, 2011).
Los antimetabolitos corresponden a análogos de purinas y pirimidinas, los cuales
son capaces de inhibir la acción de algunas enzimas involucradas en la
biosíntesis de nucleótidos, o capaces de agregarse a la cadena nucleotídica en
formación. Dado que las células tumorales se replican de una manera más rápida
y descontrolada que el resto de las células del organismo. Este tipo de
compuestos, al unirse a la cadena, generan que la cadena se interrumpa de
manera
abrupta,
truncando
la
nueva
cadena
de
nucleótidos.
Las antraciclinas pueden participar como agentes alquilantes y antimetabolitos,
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RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
además de generar estrés oxidativo al interior de las células y la inhibición de las
topoisomerasas. Originalmente estos compuestos son producidos por la especie
Streptomyces y han sido ampliamente utilizadas para el tratamiento del
cáncer(Lind, 2011).
Entre los diferentes inhibidores de enzimas involucradas en el proceso de mitosis
podemos encontrar inhibidores de topoisomerasas, tubulinas y tirosin-kinasas.
Los inhibidores de las topoisomerasas son moléculas capaces de interactuar con
este grupo de enzimas, evitando que actúen sobre el DNA. Las topoisomerasas
son un grupo de enzimas encargadas en liberar la torsión del DNA causado en el
proceso de replicación(Lind, 2011). Los inhibidores de tubulina interactúan con
las unidades de tubulina, evitando que se armen los microtúbulos, o evitando que
se desensamblen, ya que las tubulinas participan activamente en el proceso de
mitosis, mediando la citocinesis, o división de los citoplasmas para formar las
células hijas. Las proteínas tirosin-kinasas son clave en la participación de la
transducción de señales dentro de la células, principalmente en lo que respecta a
señales de proliferación(Lind, 2011). Este tipo de proteínas se encuentra mutado
en la mayoría de los canceres, ya sea por su activación constante o su sobreexpresión, lo que llevaría a su activación. Entre estas proteínas podemos
destacara Her2/Neu, el cual se encuentra principalmente asociado a la progresión
del cáncer de mama(Lind, 2011).
Todas estas terapias se encuentran actualmente en uso debido a que es lo que ha
mostrado mejores resultados hasta el momento, además de tener un moderado
bajo costo en comparación con las técnicas en desarrollo, sin embargo no son
completamente efectivas para el tratamiento de ciertos canceres, debido a la
inestabilidad genómica, y la agresividad de estos(Douglas Hanahan, 2014).
1.2.
Inmunoterapia
Dado que las terapias actuales no tienen una gran efectividad en el tratamiento
del cáncer, diferentes nuevas estrategias se ha desarrollado con los año para
obtener mejores resultados y una mejor prognosis, una de estas estrategias se
denomina inmunoterapia(Hanna et al., 2014).
15
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
La inmunoterapia se desarrollo bajo el precepto de que el cáncer es capaz de la
evasión del sistema inmune, ya que este tiene como fin la erradicación de
organismos patógenos, así como la de células transformadas que puedan
presentar una amenaza para el organismo. El fin de esta terapia consiste en
entrenar al sistema inmune del mismo paciente para que reconozca las células
tumorales como organismos extraños, y así sean eliminadas de manera selectiva
por el repertorio celular inmune(Dayoub & Davis, 2011).
El sistema inmune se clasifica en sistema inmune innato y adaptativo, siendo el
segundo el principal blanco de activación para la inmunoterapia. Este, está
compuesto por un variado repertorio de células, incluyendo células presentadores
de antígenos, Linfocitos T cooperadores o CD4+ y los linfocitos T citotóxicos o
CD8+. Los linfocitos requieren ser activados por Células Presentadoras de
Antígenos (CPA), las cuales procesan y presentan de un péptido cargado en el
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I o II. El reconocimiento
de este complejo por el receptor linfocitario T, mas una segunda señal coestimulatoria, induce la activación de los linfocitos T. La principal función de los
linfocitos T cooperadores, es la liberación de citoquinas y quimioquinas capaces
de reclutar otras células del sistema inmune al sitio de alerta, desencadenando
una respuesta inmunológica; mientras que los linfocitos T citotóxicos pueden
destruir células afectadas por virus o agentes intracelulares mediante la liberación
de factores citotóxicos.
Una de las primeras aproximaciones en el uso de la inmunoterapia, y que ha sido
la más efectiva en la lucha contra el melanoma, es el uso de células dendríticas
autólogas cargadas con extractos tumorales, según Mendoza-Naranjo(MendozaNaranjo et al., 2007) y Nestle(Nestle et al., 1998). El análisis exhaustivo de estos
de los casos clínicos descritos ha demostrado que la población respondedora a
terapias inmune y que han detenido el avance de la enfermedad, desarrolla
coincidentemente unas respuestas hipersensibilidad de tipo retardada (DTH)
considerable frente a antígenos tumorales. La respuesta DTH es una respuesta
alérgica de tipo IV, la cual está mediada principalmente por macrófagos y
linfocitos T cooperadores. Este tipo de respuesta se caracteriza por la presencia
16
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
de un agente extraño al cuerpo, principalmente alérgenos, los cuales son capaces
de desencadenar una respuesta de las células dendríticas y macrófagos aledaños
al sitio de alerta. Posteriormente, cuando se tenga un segundo contacto con el
mismo agente, se desencadenará una respuesta inmune mediada por los linfocitos
T de memoria, los cuales reclutarán macrófagos al sitio afectado. Otro tipo de
inmunoterapia que se encuentra en desarrollo actualmente es el uso de
inmunomoduladores, siendo el GM-CSF uno de los cuales ha mostrado mejores
resultados(Dranoff et al., 1993), así como la generación de diferentes estrategias
que permitan localizar esta citoquina en el sitio de alojamiento del tumor,
generando que ocurra una localización de diferentes células del repertorio
inmune, entre ellos monocitos que, gracias a la acción de esta citoquina, pueden
diferenciarse a células dendríticas, las cuales corresponden a uno de las células
presentadoras de antígenos que genera una mejor respuesta de los linfocitos T, en
comparación a otras APCs(Lonial, 2004).
GM-CSF es una proteína la cual actúa como una señal de diferenciación celular,
además de cómo un factor quimio táctico capaz de reclutar diferentes células del
sistema inmune al sitio de alerta(Lonial, 2004). De entre los principales roles que
es relevante destaca es su rol de diferenciación células, debido a que este factor
es capaz de permitir la diferenciación de diferentes monocitos que invaden el
tejido a células dendríticas(Lonial, 2004). Estas células dendríticas comienzan
como células inmaduras altamente fagocíticas, las cuales en diferentes modelos
tumorales son capaces de fagocitar células tumorales y presentarlos a diferentes
poblaciones linfocitarias T, permitiendo su activación y que estos sean capaces
de actuar contra los tumores(Nestle et al., 1998).
Por el transcurso de los años también se ha descubierto que la presentación de
antígeno de por si no activa a los linfocitos T, sino que es necesaria la activación
de estos por la señalización mediante la interacción de diferentes moléculas coestimulatorias que poseen las células presentadoras de antígeno profesionales.
Estas moléculas permiten que los linfocitos se activen, generando que proliferen
y se diferencien a células efectoras y de memoria. Durante los últimos años se ha
observado que dos moléculas en particular, 41bbL y Ox40L, las cuales no solo
17
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
generan la activación de los linfocitos T, sino también la potencian, obteniéndose
mayor cantidad de células de memoria en comparación con una activación
normal(Croft, 2003, 2009; Rotzschke et al., 2012; Vinay & Kwon, 2012;
Waldmann, 2006).
41bbL es una proteína de superficie perteneciente a la familia de las TNF (del
inglés, Tumor Necrosis Factor) el cual se encuentra principalmente en células
dendríticas. Esta molécula es capaz de inducir la activación de los linfocitos T,
mediante la activación de la cascada por 41bb. Esta activación de los linfocitos
permite el aumento de señales de sobrevivencia de estos, mejora la proliferación,
la expresión de citoquinas por parte de las células T(Croft, 2009; Rotzschke et
al., 2012; Vinay & Kwon, 2012).
Ox40L, al igual que 41bbL, es una proteína de superficie perteneciente a la
familia de las TNF, teniendo el mismo efecto en la estimulación de los linfocitos
T que 41bbL, sin embargo, durante los últimos años se ha descubierto que la
estimulación con OX40L, además de mejorar la activación de los linfocitos T,
también permite que estos no se diferencien a linfocitos T regulatorios, los cuales
son capaces de inhibir la respuesta inmune en contra del cáncer, por lo cual es
una molécula co-estimulatoria la cual se ha utilizado en diversas investigaciones
en terapias antitumorales(Croft, 2003, 2009; Waldmann, 2006).
Nuestro equipo de laboratorio desarrollo una estrategia utilizando células
singénicas de melanoma y cáncer de mama, las cuales después de ser
transfectadas con virus recombinantes para estas moléculas y posteriormente
irradiadas, son capaces de expresar estas moléculas inmunomoduladoras de
manera constitutiva sin generar un nuevo tumor, permitiendo su uso como un
posible modelo de vacuna antitumoral.
1.2.1. Modificación genética de cultivo de células y ensayos in vivo
Las células tumorales presentan tolerancia en receptores singénicos por ser
bajamente inmunogénicas. La modificación genética de las células tumorales
para la expresión de inmunomoduladores puede ser utilizada como estrategia
para inducir una respuesta antitumoral.(Dranoff et al., 1993) De esta forma, las
células tumorales singénicas modificadas pueden ser retro introducidas en
18
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animales que reciben tumores parentales, ocasionando la detección y eliminación
de metástasis por el sistema inmune. Los vectores retrovirales posibilitan la
transferencia estable de cassetes de expresión para células de interés, siendo
quela modificación genérica puede perpetuar la progenie celular. En este trabajo
utilizamos vectores retrovirales derivados del virus de la leucemia murina de
Moloney (MoMuLV) los cuales fueron generados por el grupo de Ingeniería de
Vectores y Desarrollo de Estrategias de Terapia Génica y producidos por el
Laboratorio de Vectores Virales del LNBio/CNPEM.la plataforma retroviral
utilizada se basa en el sistema pCL que posibilita la producción de partículas
virales defectuosas, las cuales carecen de la capacidad de replicación.(Bajgelman,
Costanzi-Strauss, & Strauss, 2003; Naviaux, Costanzi, Haas, & Verma, 1996)
2. Desenvolvimiento
2.1.
Objetivos
2.1.1. General
 Establecer líneas celulares y evaluar su efecto en modelos animales
2.1.2. Específicos
 Desarrollar 3 tipos de linajes celulares (OX40L, 4-1BBL y GM-CSF)
 Desafiar Animales con líneas celulares singénicas como vacuna
antitumoral
2.2.
Materiales y Metodología
2.2.1. Vectores plasmidiales y Producción de partículas virales
Los vectores plásmidos que codifican inmunomoduladores fueron clonados por
los de Ingeniería y Desarrollo de Estrategias vectores para la terapia génica, el
grupo LNBio / CNPEM. Los vectores PCL-41BBL y PCL-OX40L fueron
construidas por Camila M. Beraldo interna PUE. El vector PCL-GM-CSF fue
clonado por Arthur Mauro, un estudiante de la IC. Preparaciones virales fueron
producidas por Anna P.V. Carvalho, técnica del LVV.
2.2.2. Cultivo Celular
2.2.2.1.
Curva de Selección con G418
La línea células 4T1 se mantuvo en cultivo en medio RPMI 1640 suplementado
con Suero Fetal Bovino (SFB) al 10%. Al llegar a confluencia del 80%, se
19
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colectaron mediante tripsinización (tripsina al 0,1%). Se contaron las células en
placa y se sembraron 5x104 células por pocillo en una placa de 6 pocillos, se dejo
incubando con medio RPMI 1640 suplementado con SFB 10% por la noche a
37°C, 5% CO2 para la correcta adhesión de las células. En el día siguiente a la
siembra, se cambio el medio por 2 mL de medio RPMI suplementado fresco, y se
ución stock de G418 a 100mg/mL. La
placa se incubo a 37°C, 5% CO2 por 4 días con un seguimiento constante de la
células en su interior, al 4to día se cambio el medio por medio fresco y se agrego
las mismas cantidades de G418 para la curva de selección. La placa se reviso al
7mo día para determinar la concentración letal de G418.
Posteriormente se realizo el mismo ensayo anterior, cambiando las cantidades
agregadas de la solución stock de G418 100mg/mL, agregando esta vez 0; 0,5; 1;
2; 4 y 8 L. los pocillos se revisaron según el procedimiento anterior.
Titulación de los vectores virales
La línea celular 3T3/NIH se mantuvo en cultivo en medio DMEM 10% de SFB.
Al llegar a confluencia del 80%, se colectaron mediante tripsinización (tripsina al
0,1%). Se sembraron 5x104 células por pocillo en una placa de 24 y 6 pocillos, se
dejo incubando con medio DMEM suplementado con SFB 10% por la noche a
37°C, 5% CO2 para la correcta adhesión de las células. Al día siguiente se
contaron nuevamente las células de un pocillo de la placa de 24 pocillos,
posteriormente se cambio el medio por DMEM 10% SFB con polybrene (PB), se
inocularon 5 y 50L de los vectores retrovirales recombinantes pCL-41bbL;
pCL-OX40L y pCL-41bbR, se incubaron por la noche a 37°C; 5% de CO2. Al
día siguiente se cambio el medio y se dejo incubando un día para el análisis por
citometría de flujo. En la placa de 6 pocillos se cambio el medio por medio
DMEM 10% SFB con PB, posteriormente se inocularon concentraciones 0;
1:1,5x106; 1:1,5x105; 1:1,5x104; 1:1,5x103 del vector retroviral recombinante
pCL-GM-CSF
de una solución stock diluida 1000 veces (3L en 3mL de
medio), al último pocillo se le agrego 50L de la solución stock. Se incubo por la
noche a 37°C; 5% de CO2. Al día siguiente se cambio el medio por medio
20
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
DMEM 10% SFB 800g/mL de G418 y se realizo un seguimiento de las
colonias recombinantes.
Para el análisis por citometría de flujo de las células transfectadas con los
vectores retrovirales pCL-41bbL;pCL-OX40L y pCL-41bbR se colectaron las
células mediante tripsinización (tripsina 0,1%) y se agrego la suspensión de cada
placa a diferentes tubos de citometría de flujo, se inactivo la tripsina con 2mL de
medio DMEM 10% SFB, se centrifugaron los tubos a 400g por 5 minutos, se
descarto el sobrenadante y se agregaron 2 mL de medio IF(PBS con SFB al 5%),
se centrifugo nuevamente a 400g por 5 minutos, se descarto el sobrenadante
dejando 100L en cada tubo. Se agregaron 0,5L de los anticuerpos anti-41bbL
PE; anti-OX40L PE y anti41bbR PE (ebioscience), se incubaron a 4°C por 20
minutos, se agregaron 2mL de medio IF, se centrifugo a 400g por 5 minutos y se
descarto el sobrenadante, dejando 500L en cada tubo.
Transfección de células 4T1
Se sembraron 5x104 células por pocillo de la línea celular 4T1 en una placa de 6
pocillos, se dejo incubando con medio RPMI 1640 suplementado con SFB 10%
por la noche a 37°C, 5% CO2 para la correcta adhesión de las células. Al día
siguiente a la siembra, se cambio el medio por 2 mL de medio RPMI con PB, se
inocularon 150L del vector viral recombinante pCL-GMCSF
a la primera
placa; 3L del vector viral recombinante pCL-41bbL y 7L del vector viral
recombinante pCL-OX40L y se dejo incubando la placa por la noche a 37°C, 5%
CO2. Al día siguiente se cambio el medio por RPMI 1640 10% SFB 200g/mL
de G418. Se dejo incubando por 4 días o hasta que las células alcanzaran
confluencia de 80% en la los pocillos, posteriormente fueron colectadas mediante
tripsinización y cambiadas a una placa de 100mm con medio RPMI 1640 10%
SFB 200g/mL de G418.
2.2.2.2.
Determinación de producción de GM-CSF mediante ELISA
Se realizo un ensayo de ELISA para determinar la concentración de GM-CSF
mediante el kit DuoSet ELISA, se realizo según las especificaciones del
fabricante.
21
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
2.2.2.3.
Evaluación de los clones mediante Citometría de Flujo
Para el análisis por citometría de flujo de las células transfectadas con los
vectores retrovirales pCL-41bbL;pCL-OX40L y pCL-41bbR se colectaron las
células mediante tripsinización (tripsina 0,1%) y se agrego la suspensión de cada
placa a diferentes tubos de citometría de flujo, se inactivo la tripsina con 2mL de
medio DMEM 10% SFB, se centrifugaron los tubos a 400g por 5 minutos, se
descarto el sobrenadante y se agregaron 2 mL de medio IF(PBS con SFB al 5%),
se centrifugo nuevamente a 400g por 5 minutos, se descarto el sobrenadante
dejando 100L en cada tubo. Se agregaron 0,5L de los anticuerpos anti-41bbL
PE; anti-OX40L PE y anti41bbR PE (ebioscience) , se incubaron a 4°C por 20
minutos, se agregaron 2mL de medio IF, se centrifugo a 400g por 5 minutos y se
descarto el sobrenadante, dejando 500L en cada tubo.
2.2.2.4.
Mantención de clones B16
La línea celular B16 recombinante con los vectores pCL-GMCSF; pCL-OX40L;
pCL-41bbL y células facilitadas por Dranoff (B16 recombinante que expresa
GM-CSF) se mantuvo en cultivo en medio DMEM 10% de SFB. Al llegar a
confluencia del 80%, se colectaron mediante tripsinización (tripsina al 0,1%). Se
llevaron a una suspensión de 5x106 células por mL y se prepararon para la
inyección de vacunas. Se realizo una citometría de flujo a las líneas B16 41bbL y
Ox40L para confirmar la expresión de los inmunomoduladores.
2.2.2.5.
Determinación de producción de GM-CSF mediante ELISA
La línea celular B16 recombinante con los vectores pCL-GMCSF se mantuvo en
cultivo en medio DMEM 10% de SFB. Al llegar a confluencia del 80%, se
colectaron mediante tripsinización (tripsina al 0,1%). Se sembraron 1x106 células
por pocillo en una placa de 100mm, se dejo incubando con medio DMEM
suplementado con SFB 10% por 48 horas a 37°C, 5% CO2. Posteriormente se
colectó 1mL del sobrenadante y se congelo a -80°.
Se realizo un ensayo de ELISA para determinar la concentración de GM-CSF
mediante el kit DuoSet ELISA, se realizo según las especificaciones del
22
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
fabricante. El orden de las muestras utilizadas para la medición se encuentra
especificado en la Tabla 1. Los ensayos de ELISA fueron planeados y realizados
por la alumna de Doctorado Andrea M. Rincón.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
Std 500
Std 500
Std 500
Std 250
Std 250
Std 250
Std 125
Std 125
Std 125
Std 60
Std 60
Std 60
B
Std 30
Std 30
Std 30
Std 15
Std 15
Std 15
Std 7,5
Std 7,5
Std 7,5
C
Std 0
F10
(1:10)
DR
(1:100)
Std 0
F10
(1:10)
DR
(1:100)
Ox40LA
F10
(1:100)
Gpool
(1:1)
Ox40LB
F10
(1:100)
Gpool
(1:1)
Ox40LC
F10
(1:100)
Gpool
(1:1)
41bbLA
41bbLB
41bbLC
E
Std 0
F10
(1:10)
DR
(1:100)
G1(1:1)
G1(1:1)
G1(1:10)
G1(1:10)
G1(1:10)
DR(1:1)
Gpool
(1:10)
G1(1:10
0)
Std 3,3
F10
(1:1)
DR(1:10
)
Gpool
(1:100)
G1(1:1)
DR(1:1)
Gpool
(1:10)
G1(1:10
0)
Std 3,3
F10
(1:1)
DR(1:10
)
Gpool
(1:100)
F
DR(1:1)
Gpool
(1:10)
G1(1:10
0)
Std 3,3
F10
(1:1)
DR(1:10
)
Gpool
(1:100)
G2
G2
G2
D
G
G3
G3
G3
G4
G4
G4
G5
G5
G5
G6
G6
G6
H
G7
G7
G7
G8
G8
G8
G9
G9
G9
G10
G10
G10
Tabla 1 Orden de las muestras en el ensayo de ELISA para la determinación de la producción de GM-CSF
por parte de los clones recombinantes. Std: Estándar proveído por el kit; F10: Línea células B16 F10; DR:
Línea Celular de Dranoff; G(x): clon N°x.
2.2.3. Modelo Animal e Inyección de vacunas
2.2.3.1.
Establecimiento del modelo de tumor B16
Se utilizaron ratones de la cepa C57BL/6 de 6 a 12 semanas, obtenidas del
bioterio de CNPEM. Los animales fueron mantenidos con alimentación ad
libitum, bajo un ciclo de luz y oscuridad. Los protocolos se encuentran sometidos
al comité de ética del centro.
La línea celular B16 se mantuvo en cultivo en medio DMEM con SFB al 10% a
37 °C con un 5% de CO2 en placas de 100 x 20 mm. Al llegar a un 80% de
confluencia, éstas fueron colectadas mediante tripsinización, la cual fue
inactivada con DMEM 10% SFB. Las células fueron lavadas con PBS y se
suspendieron a 1x107 células/mL en PBS.
La suspensión de células de la línea B16, se utilizó para inducir la aparición de
tumores en ratonas de la cepa Balb/c, las cuales fueron inyectadas en el torrente
sanguíneo de los ratones mediante la inyección caudal utilizando 1x106 células.
Los ratones fueron observados diariamente, registrando su actividad y su estado.
2.2.3.2.
Inyección de vacunas
La línea celular B16 recombinante con los vectores pCL-GMCSF; pCL-OX40L;
pCL-41bbL y células facilitadas por Dranoff (B16 recombinante que expresa
23
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
GM-CSF) se mantuvo en cultivo en medio DMEM 10% de SFB. Al llegar a
confluencia del 80%, se colectaron mediante tripsinización (tripsina al 0,1%). Se
llevaron a una suspensión de 5x106 células por mL, se irradiaron 2 veces por un
periodo de 11,4 minutos a 25 gray, se centrifugaron a 400g por 5 minutos, se
resuspendieron a una cantidad total de 5x106 células por mL en un tubo falcon de
15mL.
Después del establecimiento del modelo de tumor B16, se comenzó el
tratamiento de manera al azar de manera al azar en los diferentes ratones, el
grupo fue inyectado con una cantidad establecida de los clones B16
recombinantes establecidos para la inyección nombrados anteriormente. Los
ratones fueron inyectados los días en los días 1, 4 y 7 post establecimiento del
modelo. El primer grupo de ratones fue inyectado con 5x105 células de Dranoff,
el segundo grupo fue inyectado con los clones B16 pCL-GMCSF establecidos
por el laboratorio. Un tercer grupo fue inyectado con el clon B16 pCL-GMCSF
en la primera inyección, B16 pCL-OX40L en la segunda y B16pCL-41bbL en la
tercera inyección. Se monitorearon todos los grupos diariamente desde el día del
establecimiento del modelo tumoral. Este procedimiento se encuentra aprobado
por el comité de bioética del Centro. La inyección de células tumorales, la
irradiación de GVAX y manejo de los animales fueron hechos por el estudiante
de doctorado Andrea M. Rincón, con la participación e intervención del becado
de verano.
3. Resultados y Discusión
El objetivo principal de este trabajo investigativo es el establecimiento de una
línea celular que pueda ser utilizada como posterior vacuna para el tratamiento
del cáncer, de lo cual pudimos obtener los siguientes resultados.
3.1.
Cultivo Celular
3.1.1. Curva de Selección
Al realizar la sensibilidad de las células 4T1 se encontró que la concentración
mínima de toxicida
3.1.2. Titulación de los Vectores Virales
24
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
Para determinar la titulación de los diferentes vectores virales se observo la
citometría de flujo en busca de poblaciones de células 3T3/NIH 41bbL+, OX40L+
y 41bbR+, el que fue utilizado como control. En estos histogramas se observaron
poblaciones positivas en la expresión de las proteínas 41bbL y OX40L, siendo un
43,5% de las células que expresan 41bbL y 24,7% de células que expresan
OX40L, según se puede observar en la Figura 3. Al utilizar la ecuación
representada en la Figura 5, utilizando los parámetros observados en la
citometría de flujo, pudimos observar que la titulación de partículas virales por
parte de los diferentes vectores virales eran 9,7 x 106 para el vector pCL-41bbL y
5,4 x 106 par el vector pCL-Ox40L.
Figura 3 Curva de titulación de los vectores pCL-41bbL y OX40L mediante Citometría de Flujo.
Podemos observar una población positiva del 43,5% de las células que expresan con 41bbL y un 27,4%
que expresan OX40L. La cantidad de virus total corresponde a 9,7x10 6 CFU/mL para el vector pCL41bbL; y 5,4x106 CFU/mL para el vector pCL-OX40L.
En el caso de la titulación del vector viral pCL-GM-CSF se mantuvieron las
células bajo selección con G418 por 9 días, en donde al noveno día las células
fueron fijadas para su posterior registro de las colonias presentes en cada placa.
Se lograron observar
dilución 1:1000 del virus según se observa en la Figura 4, siendo esta la primera
dilución en la cual se obtuvieron colonias, es la dilución en donde el virus
alcanza a tener efectividad, por lo cual, según la ecuación mostrada en la Figura
25
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
5 podemos concluir que obtuvimos una titulación de 2x106 partículas virales por
micro litro.
1
2
4
#
1
2
3
4
5
6
5
Vol vírus
0
1uL
10uL
100uL
1000uL
50uL
Diluicion colonias
0
0
1000
2
1000
10
1000
>100
1000 Confluente
1
Confluente
3
6
título (cfu/mL)
0
2x10(6)
Figura 4 Evaluación de la expresión de GM-CSF de las células 4T1 mediante ELISA. Se muestra en la
figura que el pool de células 4T1 transducidas con el vector pCL-GM-CSF presenta una expresión alta del
inmunomodulador
Figura 5 Ecuación utilizada para el cálculo de la concentración de partículas virales. P: Porcentaje de
células positivas para la proteína expresada; Negative: Células negativas para el control; #Cells: N° de
células el dia de la transducción; Vol: volumen de virus( L); Dilución de virus en Stock.
2.3.3. Establecimiento de clones 4T1.
Después de transducir las células 4T1 con los diferentes vectores lentivirales, se
procedió a la selección de clones recombinantes mediante el cultivo con el
antibiótico G418, de las cuales se evaluó la expresión de los inmunomoduladores
que contenían los vectores lentivirales utilizados, en los cuales se determino que
una baja cantidad de las células presentes en el pool expresaba la proteína 41bbL,
siendo este un 10% de células positivas de la población total según se observa en
la Figura 6. Al analizar el pool de células 4T1 transfectadas con el vector pCLOX40L, se encontró que un 20,7% de las células son positivas en la expresión de
la proteína OX40L, según se observa en la Figura 6.
26
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
Figura 6 Evaluación de la expresión de 41bbL y OX40L de las células 4T1 mediante ELISA. En la figura
se muestra que hasta un 10% de células 4T1 pCL-41bbL son positivas en la expresión de la proteína
41bbL en su superficie, mientras que un 20,7% de las células 4T1 pCL-OX40L son positivas en la
expresión de la proteína OX40L.
Al analizar la expresión de GM-CSF mediante el ensayo de ELISA por parte del
pool celular 4T1 pCL-GM-CSF, se determino que la expresión llega a alcanzar
270 ng/mL,según se obseva en la Figura 7, una cantidad menor a la línea celular
de Dranoff.
Figura 7 Evaluación de la expresión de GM-CSF de las células 4T1 mediante ELISA. Se
muestra en la figura que el pool de células 4T1 transducidas con el vector pCL-GM-CSF
presentan una expresión alta del inmunomodulador
27
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
2.3.4. Expresión de GM-CSF, 41bbL y OX40L
Al establecer la línea celular B16 pCL-GMCSF, necesitamos saber la expresión
de esta citoquina por parte de las células recombinantes, por lo cual se realizó un
ensayo de ELISA para determinar su expresión. De esto se obtuvo que la
concentración de GM-CSF por parte de las línea establecidas en el laboratorio
era mucho menor que la línea celular establecida por Dranoff, según se muestra
en la Tabla 2. Aun así estas células del clon G4 fueron utilizadas en la inyección
de la vacuna antitumoral, ya que este clon tuvo la mayor cantidad de producción
de GM-CSF, se utilizo un control en donde se inyectaron células de Dranoff para
comparar con los resultados.
Al revisar que los clones de la línea celular B16 41bbL y OX40L utilizados para
el tratamiento aun expresaran los inmunomoduladores correspondientes, se
realizo una citometría utilizando los anticuerpos anti-41bbL PE y anti-OX40L
PE. En esta se observo la expresión constitutiva de las proteínas, con un mínimo
de 99,4% en las células B16 41bbL y un mínimo de 96,3% en las células B16
OX40L, según se muestran en las figuras 8 y 9.
Entre las principales razones por las cuales se utilizaron los métodos fue
dependiente al tipo de expresión de los inmunomoduladores utilizados.
La citometría de flujo consiste en una técnica en donde la muestra pasa por una
aguja, la cual es capaz de pasarlas célula por célula y es llevado a una fuente de
luz laser, la cual es capaz de emitir a diferentes longitudes de onda de excitación,
además de diferentes detectores a 180° del emisor o Forward Scatter (FSC), el
cual permite medir el tamaño de cada una de las células, y otros detectores
puestos a diferentes ángulos del laser emisor o Side Scatter (SSC) el cual permite
medir la complejidad y granulosidad de las células que son excitadas, además de
diferentes detectores que permiten medir a longitudes de onda de emisión, lo que
permite medir diferentes marcas fluorescentes que contenga la célula. Este
método se utiliza principalmente para medir diferentes subpoblaciones celulares
extraídas de algún tejido, además de poder medir poblaciones que se encuentren
marcadas con algún anticuerpo especifico para alguna proteína que se encuentre
tanto en la membrana como en el interior de la célula(Jaroszeski & Radcliff,
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RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
1999). Al contrario, en el caso de que una de las proteínas que quiera ser medida
en el exterior de la célula es necesario un ensayo diferente, entre los cuales el
ensayo de ELISA es el más adecuado.
El ensayo de ELISA (del ingles: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) es un
protocolo para la medicion de diferentes proteinas o moleculas de alto peso
molecular especifico, mediante el marcaje con anticuerpos monoclonales los
cuales son capaces de reconocer la molecula de manera especifica, a este
anticuerpo denominado primario se le une posteriormente un anticuerpo capaz de
reconocer el segmento constante del anticuerpo primario, este segundo
anticuerpo se denomina secundario y se encuentra conjugado a una enzima
reportera, la cual es capaz de catalizar una reaccion de un sustrato cuyo producto
puede ser fluorescente o coloreado, el cual se mide mediante un
espectrofotometro, permitiendo la deteccion de su concentración. Este anticuerpo
secundario es capaz de unirse en varios epitopes del segmento constante de la
cadena pesada del anticuerpo primario, permitiendo la amplificacion de la señal
para la detección de la molecula(Lequin, 2005; Yalow & Berson, 1960).
Tabla 2 Resultados de la medición de GM-CSF de los clones B16pCL-GM-CSF mediante ensayo de ELISA. Se
pueden observar los diferentes clones, en donde solamente el clon G4 tuvo una mayor expresión en comparación con
los otros clones generados, aun así es una cantidad 10 veces menor en comparación con la línea celular de Drannof.
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RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
Figura 8 Citometría de flujo de los clones recombinantes B16 41bbL. Se puede observar en la figura que
un porcentaje mayor a 99% de las células B16 expresa constitutivamente la proteína 41bbL.
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RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
Figura 9 Citometría de flujo de los clones recombinantes B16 OX40L. Se puede observar en la figura
que un porcentaje mayor a 99% de las células B16 expresa constitutivamente la proteína OX40L.
Modelo Tumoral B16 y Vacunas
Hasta el momento no se han visto resultados con respecto a la inyección de
los tumores sin embargo, algunos ratones han desarrollado puntos negros en
la cola, lugares en donde se realizo la inyección intravenosa de estos tumores,
lo que representa que el tumor se encuentra en proceso de crecimiento al
interior de los ratones.
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RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
Las células tumorales B16 y 4T1 fueron modificadas utilizando vectores
retrovirales recombinantes construidos por el grupo de Ingeniería de Vectores y
Desarrollo de Estrategias de Terapia Génica, conforme Citación en Materiales y
métodos. Las partículas virales fueron generadas por el laboratorio de Vectores
Virales, conforme descrito en literatura.(Bajgelman et al., 2003; Naviaux et al.,
1996)
4. Conclusión
El objetivo de este proyecto era desarrollar actividades relacionadas con la línea
de investigación desarrollada el grupo de Ingeniería y Desarrollo de Estrategias
para la Terapia Génica, del LNBio, CNPEM. Por cerca de dos meses hemos sido
capaces de participar en los experimentos relacionados a biología molecular,
cultivo de bacterias, cultivos celulares y en la experimentación in vivo.
En las técnicas de biología molecular hemos participado de preparación de
plásmido y en los mapas de restricción de los vectores utilizados para la
producción de partículas virales utilizados en este estudio. Por otra parte, también
hemos hecho algunas pruebas de clonación vectores plásmidos que aún se
encuentran en curso.
En el cultivo de células, que se inició el establecimiento de tres nuevas líneas
celulares 4T1, derivadas de cáncer de mama murino. Estas líneas fueron
transducidas con vectores retrovirales para efectuar transferencia de casetes de
expresión de genes que codifican inmunomoduladores. La selección de células
4T1 transducidas con retrovirus pCL-41BBL, pCL-OX40L y pCL–GM-CSF. La
selección de células OX40L y 41BBL se evaluaron mediante citometría de flujo,
y las células seleccionadas con GM-CSF son evaluadas mediante ELISA. Estas
células serán utilizadas posteriormente por nuestro grupo para generar clones que
muestran alta expresión del transgén y se pueden usar para el desarrollo de la
modulación inmune anti-tumoral específica.
Además de llevar a cabo experimentos in vitro, también tuvimos la oportunidad
de supervisar la aplicación de un experimento in vivo, participando en la
preparación de las células tumorales, la vacuna de células y la inyección de los
animales. El experimento llevado a cabo el objetivo de verificar la acción
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RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM
sinérgica de inmunomoduladores en combinación. El experimento está en curso y
se incluirán los resultados en una futura versión de este informe, en el caso de
contar con el tiempo necesario.
En resumen, la estadía en este programa de becas de verano presentó una intensa
experiencia científica, lo que contribuye al desarrollo y adquisición de nuevos
conocimientos y el desarrollo de nuevas tecnologías para el grupo de
investigación.
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