Download maestría con especialidad en inmunología

INMUNOTERAPIA GÉNICA PARA
EL CONTROL DE LA
TUBERCULOSIS
INVESTIGADORES PARTICIPANTES
Alejandro Francisco Cruz
Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición "Salvador Zubirán", México
Dulce Adriana Mata Espinosa
Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición "Salvador Zubirán", México
Zhou Xing
Universidad de McMaster, Canadá
Rogelio Enrique Hernández Pando
Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición "Salvador Zubirán", México
SECRETARÍA DE SALUD
SERVICIO SOCIAL EN INVESTIGACIÓN EN SALUD
PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN INCMNSZ
Fondo: Sectoriales Salud
Modalidad: Programa Conjunto de investigación en tuberculosis México-Canadá
Estado de investigación: 50% de desarrollo
Aprobación previa para otro pasante: NO
PANTALLA GENERAL
Título:
Inmunoterapia génica para el control de la tuberculosis
Institución:
Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición “Salvador Zubirán”.
Departamento de Patología, Sección de Patología Experimental.
Demandas específicas:
Fenómenos y respuesta inmunológica en tuberculosis
Breve Descripción:
La tuberculosis pulmonar (TB) es una de las causas principales de muerte por un agente infeccioso en el mundo, su
tratamiento es prolongado y exige la administración de cuando menos tres antibióticos, lo cual provoca abandono
prematuro con recidivas y emergencia de bacterias multidrogorresistentes (MDR). La vacuna BCG es la única
actualmente en uso en los seres humanos y no ha sido eficiente pues la protección conferida es muy irregular
El presente es un proyecto entre la Universidad de McMaster y el Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutrición, su
característica principal es una sólida interacción complementaria en el área de modelos experimentales de TB,
generación de nuevas vacunas, biología de citocinas y terapia génica. El objetivo es desarrollar nuevos tratamientos y
vacunas basados en terapia génica. Las vacunas (adenovirus que expresan antígenos inmunodominantes de
Micobacterium tuberculosis) y los agentes inmunoterapeúticos (adenovirus que expresan citocinas) serán desarrolladas
en Canadá, mientras que su eficiencia será evaluada en modelos experimentales en México. Dichos modelos reproducen
las condiciones inmunológicas y ambientales de los países subdesarrollados, que es en donde mas se necesita de vacunas
y tratamientos eficientes en contra de la tuberculosis.
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1. Adenovirus recombinantes que codifican a interleucina-12, una
nueva forma de inmunoterapia en la tuberculosis experimental.
RESUMEN
Introducción:
La emergencia de cepas multidrogoresistentes y la carencia de compromise debido a los largos
tratamientos con antibióticos han motivado al diseño de nuevas abordajes terapéuticos para el mejor control de la
tuberculosis pulmonar. Uno de los abordajes es la inmunoterapia, la cual consiste en estimular al sistema immune para el
mejor control de la enfermedad. Como ya es conocido, la participación de la respuesta Th-1 es esencial en el control de
la infección micobacteriana, nosotros empleamos terapia génica basada en adenovirus recombinantes que expresan IL12 (Ad-IL12) como una nueva forma de inmunoterapia en la tuberculosis pulmonar experimental. IL-12 es una citocina
proinflamatoria la cual estimula linfocitos T y células natural killer para la liberación de IFN la cual induce la
expresión de moléculas del MHC class II y la producción de TNF y su receptor, ambas citocinas promueven la
expresión de iNOS y la producción de óxido nítrico, estimulando la actividad bactericida de los macrófagos.
Métodos: Una sola dosis de 1x108 pfu de Ad-IL12 fue administrada por vía intratraqueal un día antes de la infección
con 2.5x105 bacterias de la cepa H37Rv. Los ratones fueron sacrificados a diferentes tiempos 1, 3, 7, 14, 21, 28, 60, 90,
120 y 150 dias. El grupo control recibió adenovirus que expresa proteína verde fluorescente (Add170-3). La eficiencia
terapéutica de Ad-IL12 fue determinada por la cuantificación de las unidades formadoras de colonias (UFC) en los
homogenados de pulmón, la histomorfometria y la expresión de las citocinas determinadas por RT-PCR en tiempo real.
Resultados: En comparación con el grupo control, la administración de Ad-IL12 significativamente disminuye la carga
bacilar y el daño tisular (neumonía), también Ad-IL12 induce expresiones altas de IFN (P≤ 0.05), TNF (P≤ 0.06) e
iNOS comparadas con el control (Add170-3).
Conclusión: Nuestros resultados presentan que la administración de
Ad-IL12 un día antes de la infección,
eficientemente controlan la tuberculosis pulmonar experimental, lo que sugiere que esta es una nueva forma
prometedora de terapia.
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OBJETIVO
Evaluar el efecto de adenovirus recombinantes que codifican a IL-12 (AdIL-12), administrados un día antes de la
infección con micobacterias de la cepa H37Rv en un modelo de tuberculosis pulmonar.
INTRODUCCIÓN:
La emergencia de cepas multidrogoresistentes y la falta de compromiso a los largos tratamientos con antibióticos han
motivado al diseño de nuevas terapias para el mejor control de la tuberculosis pulmonar. Uno de los nuevos abordajes es
la inmunoterapia, la cual consiste en estimular al sistema immune para el mejor control de la enfermedad. Como ya es
conocido, la participación de la respuesta Th-1 es esencial en el control de la infección micobacteriana, nosotros
utilizamos terapia génica basada en la administración de adenovirus recombinantes que expresan IL-12 (Ad-IL12) como
una nueva forma de inmunoterapia. IL-12 es una citocina proinflamatoria la cual estimula linfocitos T y células natural
killer para la liberación de IFNy la cual induce la expresión de moléculas del MHC clase II y la producción de TNFa y
su receptor, ambas citocinas promueven la expresión de iNOS y la producción de óxido nítrico, estimulando la actividad
bactericida de los macrófagos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los adenovirus recombinantes Ad-IL12 y Addl70.3 fueron construidos y evaluados por el Dr.Xing. Una sola dosis de
1x108 pfu de Ad-IL12 fue administrada por vía intratraqueal (i.t.) un día antes de la infección con 2.5x105 bacterias de la
cepa H37Rv. Los ratones fueron sacrificados a diferentes tiempos 1, 3, 7, 14, 21, 28, 60, 90, 120 y 150 días. El grupo
control recibió adenovirus que no expresa el transgen (Addl70.3). La eficiencia terapéutica de Ad-IL12 fue determinada
por la cuantificación de las unidades formadoras de colonias (UFC) en los homogenados de pulmón, la histomorfometria
y la expresión de las citocinas determinadas por RT-PCR en tiempo real.
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RESULTADOS
Figura 1. Curva de sobrevida de animales tratados con AdIL12 o Addl70.3 un día antes de la infección con
M.tuberculosis. A grupos de animales se les administró una sola dosis, vía intratraqueal (i.t.) con 1x108 pfu de AdIL12
(cuadros negros) o Addl70.3 (cuadros blancos) un día antes de ser infectados con M.tuberculosis cepa H37Rv.
Figura 2. Efecto de la administración de AdIL12 en ratones infectados con M.tuberculosis sobre la carga bacteriana. A
grupos de animales se les administró una sola dosis, vía i.t. con 1x108pfu de AdIL12 (cuadros negros) o Addl70.3
(cuadros blancos) un día antes de ser infectados con M.tuberculosis cepa H37Rv. La carga bacteriana de los ratones
tratados con AdIL-12 se mantiene disminuída con respecto a los ratones que recibieron el adenovirus control. Los datos
son la media ± DE. Los asteriscos representan una significancia estadistica (P≤0.05). El experimento se realizó por
duplicado.
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Figura 3. Efecto de una sola administración de AdIL-12 sobre la expresion de citocinas e iNOS en pulmones de ratones
infectados con la cepa H37Rv de M. tuberculosis. Los ratones fueron tratados un día antes de la infección con
M.tuberculosis con una sola dosis de AdIL-12 1x108pfu/ratón (cuadros negros), o con el control AdGFP 1x108 pfu/ratón
(cuadros blancos). La expresión génica se determinó por tiempo real. Los resultados son la media ± DE. Los asteriscos
representan una significancia estadistica (P≤0.05), en TNFa la P≤0.06.
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Figura 4. Morfometría de pulmones de ratones infectados con la cepa H37Rv de M. tuberculosis tratados un día antes
con AdIL-12 o Addl70-3 . Porcentaje del pulmón ocupado por neumonía. Los ratones sanos fueron tratados con 1x108
pfu/ratón de AdIL-12 (barras negras) o con el control Addl70-3 (barras blancas) al día siguente fueron infectados con
M.tuberculosis. Los datos son la media ± DE de tres animales. El experimento se realizó por duplicado.
CONCLUSION
La administración de una sola dosis por vía intratraqueal de AdIL12 evita que aumente la carga bacilar en ratones
infectados con micobacterias como consecuencia del mantenimiento de la inmunidad Th-1 protectora, evitando además
el daño tisular.
La terapia génica con AdIL12 mantiene la respuesta inmune protectora y controla la tuberculosis pulmonar producida
por la cepa H37Rv de Mycobacterium tuberculosis.
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2. Inmunoterapia génica mediante un adenovirus recombinante que
codifica para el factor estimulante de la colonia de granulocitos y
macrófagos (AdGM-CSF) en el control de la tuberculosis
pulmonar experimental
RESUMEN
El modelo experimental de tuberculosis pulmonar (TB) con ratones Balb/c muestra una respuesta inmune inicial de
células T helper tipo 1 (Th1) que controla temporalmente el crecimiento micobacteriano. La progresión de la
enfermedad se acompaña de disminución de los niveles de citocinas proinflamatorias como interferón (IFN)-γ, factor de
necrosis tumoral (TNF)-α, y la enzima óxido nítrico sintasa indu cible (iNOS). Esta pérdida del control del crecimiento
micobacteriano se acompaña de retraso en la activación de células dendríticas (DCs). La administración intratraqueal de
una sola dosis de un adenovirus recombinante que codifica para el factor estimulante de la colonia de granulocitos y
macrófagos (AdGM-CSF) un día antes de la infección con M. tuberculosis (Mtb), se relacionó con disminución
significativa de la carga bacteriana pulmonar, aumento del número de DC activadas y mayor expresión de TNF-α , IFNγ, e iNOS. Cuando AdGM-CSF se administró en una etapa crónica de la enfermedad, los ratones también mostraron
menor carga bacteriana pulmonar. Del mismo modo, una sola administración de AdGM-CSF en otro modelo
experimental, con ratones hembra B6D2F1 (C57BL/6J X DBA/2J) infectados con una dosis baja de Mtb que produce
una infección crónica similar a la latente y que permite inducir su reactivación mediante la administración de
corticosterona, se detectó una carga bacteriana pulmonar muy baja posterior a la inmunosupresión. El mismo efecto se
observó en ratones sanos convivientes con ratones infectados con bacterias de virulencia media y alta en un modelo de
transmisibilidad. GM-CSF es una citocina importante para la protección inmune contra Mtb y la terapia génica con
AdGM-CSF aumenta la inmunidad protectora cuando se administra en una dosis única en enfermedad progresiva, y
cuando se utiliza para prevenir la reactivación de la infección latente o la transmisión.
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INTRODUCCIÓN
Con más de 1.7 millones de muertes anuales en el mundo, la tuberculosis (TB) es la principal causa de muerte por un
agente infeccioso y una de las causas más importantes de mortalidad en pacientes infectados con el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH).1 Aunque la quimioterapia es eficaz y está disponible, el tratamiento de la TB es largo
e incluye varios antibióticos que se traduce en falta de apego, reincidencia, toxicidad y aparición de cepas resistentes a
múltiples fármacos (MDR). Mycobacterium tuberculosis (Mtb) produce una enfermedad progresiva o infección latente,2
de hecho, en áreas de alta endemicidad, la infección ocurre por primera vez en la infancia y en la mayoría de los casos se
controla. Sólo el 10% de estas infecciones primarias conducen a enfermedad progresiva.2,3 Sin embargo, algunos bacilos
permanecen en los tejidos en una etapa latente no replicante o lentamente replicante durante el resto de la vida del
individuo. La TB latente (TBL) es clínicamente asintomática, y en los países con baja o moderada prevalencia, la
mayoría de los casos de TB activa surgen como resultado de la reactivación latente del bacilo.2,3 Se estima que un tercio
de la población mundial es portadora de Mtb latente, por lo que millones de casos de reactivación se prevén para los
próximo años.4
Los pacientes con TB pulmonar son la fuente más importante para la transmisión de Mtb, siendo la capacidad infectante
del caso índice y la cercanía del contacto los determinantes del riesgo de infección. Los contactos en el hogar,
principalmente los niños expuestos a adultos con TB, son de alto riesgo de infección el cual aumenta con el grado de
contacto.5,6 Evitar la convivencia con el caso índice sería la estrategia más adecuada para interrumpir la transmisión y el
desarrollo posterior de TB, aunque otra alternativa más ampliamente usada es la quimioprofilaxis con isoniazida (INH)
pero con los inconvenientes de ser prolongada (6 a 12 meses),7,8 con bajas tasas de finalización, riesgo de reinfección,9 y
selección de cepas MDR.10 Por ello, es importante desarrollar nuevas estrategias terapéuticas más eficaces para el
tratamiento de la TB activa, con menor toxicidad, así como nuevas terapias para prevenir la reactivación de TBL y
proteger los contactos sanos contra la transmisión de Mtb.
El factor estimulante de la colonia de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) es una citocina pleiotrópica capaz de inducir
efectos sobre la supervivencia, proliferación y diferenciación de precursores de mieloide y no mieloide.11 Por otra parte,
GM-CSF ejerce una función fisiológica específica que regula el reemplazo del surfactante en el pulmón, una función
mediada por los macrófagos alveolares (AM).11 GM-CSF regula la respuesta inflamatoria en contra de infecciones
pulmonares mediante la activación de la cinasa y el factor de transcripción Jak-STAT, e induce la expresión del factor
regulador de interferón 5 (IRF5). La alta expresión de IRF5 condiciona la activación de los macrófagos clásicos (M1) o
macrófagos inflamatorios;12 y la deficiencia absoluta o relativa de GM-CSF produce una disfunción severa de los AM
que genera un fenotipo de proteinosis alveolar pulmonar (PAP) y alteraciones en la inmunidad del huésped.13 La
administración exógena de GM-CSF en aerosol induce aumento del número de AM.14 Por lo tanto, GM-CSF tiene un
papel específico en la fisiología pulmonar y en el control de infecciones intracelulares, tales como la TB, ya que además
es capaz de inducir la producción de IL-12, el TNF-α e IFN-γ.11,12 La sobreexpresión pulmonar de GM-CSF mediante la
administración local de un adenovirus recombinante que codifica para esta citocina (AdGM-CSF) induce la
diferenciación y activación tempranas de las células dendríticas (DC) con función inmunoestimulante potente.15,16 Esto
es importante, teniendo en cuenta que en modelos experimentales murino de TB pulmonar se produce un retraso en el
reclutamiento y maduración de las DC en pulmones y ganglios linfáticos del mediastino, que aparentemente contribuyen
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a la evasión de la respuesta inmune del hospedero contra Mtb.17,18 De este modo, GM-CSF puede ser un importante
mediador en la respuesta inmune protectora contra Mtb y blanco para la inmunoterapia. El objetivo del presente estudio
fue determinar en un modelo murino de tuberculosis pulmonar progresiva del efecto de la administración intratraqueal
de AdGM-CSF, así como su efecto preventivo de la reactivación de la TB en un modelo murino de infección similar a
la LTB y su posible papel en la prevención de la infección en ratones sanos convivientes con animales tuberculosos en
un modelo de transmisibilidad.
RESULTADOS
Cinética de expresión génica endógena de GM-CSF durante la tuberculosis pulmonar progresiva
Cuando los ratones Balb/c son infectados por vía intratraqueal (IT) con una dosis alta de la cepa de referencia de Mtb
(H37Rv), se observa una fase inicial de control temporal del crecimiento bacilar y asociado a una elevada expresión de
TNF-α e IFN-γ, así como la formación de granulomas. Después de tres semanas de infección, se observa una fase de
progresión de la enfermedad caracterizada por la alta carga bacteriana pulmonar, daños tisular (neumonía progresiva),
menor producción de TNF-α e IFN-γ, y alta expresión de citocinas tipo Th-2 como IL-4 e IL-13.19,20 A fin de investigar
el papel potencial de GM-CSF en la TB experimental, la cinética de expresión génica se determinó mediante qRT-PCR.
Después de la infección con Mtb se observa un aumento progresivo con un máximo pico en el día siete posinfección,
seguido por disminución progresiva siendo el día 120 cuando se observa el nivel más bajo (fig. 1a). La
inmunohistoquímica (IHQ) y la morfometría automatizada mostraron que durante el curso de la infección la principal
fuente celular de GM-CSF fue el epitelio bronquial y bronquiolar, el día 1 al 14 posinfección el 10-20% de las células
epiteliales respiratorias mostraron una fuerte inmunotinción para GM-CSF con un nivel máximo promedio en el día 21
(90%) pero con menor tinción por célula, posteriormente se observó disminución hasta el día 120 con 30% de estas
células positivas (fig. 1b). Se observaron AM positivos para GM-CSF en el intersticio alveolo-capilar en el día 14 y
durante la infección en los días finales 60 y 120 (10-14%). Los granulomas en los días 60 y 120 también mostraron
macrófagos positivos para GM-CSF (figs. 1b-d).
Determinación de la mejor dosis de AdGM-CSF para inducir la expresión génica de GM-CSF en los pulmones de los
ratones sanos
Tres dosis diferentes de AdGM-CSF fueron administrados por vía intratraqueal en ratones sanos BALB/c para definir
aquella que indujera la mejor expresión génica de GM-CSF. Se observó que la expresión de GM-CSF fue dosis
dependiente, con la dosis de 1x108 ufp la de mayor expresión del transgén (fig. 2a). El grupo de ratones que recibieron el
adenovirus vacío (Addl70-3) no mostraron niveles basales detectables del RNAm que codifica para GM-CSF (figs.
2b,c). La fuente celular de GM-CSF inducida por AdGM-CSF fue determinada mediante IHQ. En el primer día
postratamiento se detectó la presencia de la proteína en el epitelio bronquiolar que mostró una inmunotinción fuerte
específica para GM-CSF. No se observó positividad para GM-CSF por IHQ en el grupo control con Addl70-3 en ratones
sanos (figs. 2b-d).
Efecto de la administración de AdGM-CSF un día antes de la infección en el modelo murino de tuberculosis pulmonar
progresiva
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Teniendo en cuenta el bajo porcentaje de células positivas para GM-CSF durante la infección temprana, dos
experimentos independientes se realizaron para evaluar el efecto de la administración de IT de AdGM-CSF o el vector
control Addl70-3, un día antes de la infección IT con Mtb H37Rv. El efecto inmunoprotector de AdGM-CSF se
determinó por el cambio en la carga bacteriana pulmonar, y histomorfometría de daño tisular (porcentaje de área
neumónica) y el número y tamaño de granulomas. Una dosis única de AdGM-CSF (1x108pfu) administrado un día antes
de la infección indujo una disminución significativa de la carga bacteriana de el día 14 posinfección hasta el final del
experimento (día 120) (fig. 3a). En cuanto a los cambios histológicos, los animales que recibieron AdGM-CSF
mostraron significativamente menor neumonía y mayor número y tamao de granulomas que los ratones tratados con
Addl70-3 (figs. 3b-f).
En los modelos experimentales de TB pulmonar hay retraso en la activación de DCs.17 Considerando que GM-CSF es un
factor importante que promueve la activación de DC, este efecto puede ser el mecanismo celular que explica la
protección inmune mediada por AdGM-CSF. Para este fin, se determinó mediante citometría de flujo el número de DC
activadas (MHCII+ CD11c+ CD86+) de suspensiones celulares de pulmón en cada día de la cinética de sacrificios
posinfección. Los ratones tratados con AdGM-CSF mostraron significativamente mayor número de DC activadas el día
7 posinfección en comparación con el grupo tratado con Addl70-3, en donde se confirmó la presencia retrasada de DC
activadas hasta el día 21 posinfección (fig. 4a) . Ambos grupos mostraron una disminución progresiva del número de
DC activadas durante las etapas tardías de la enfermedad, pero los animales tratados con AdGM-CSF mostraron una
mayor tendencia, aunque no significativa, de estas células en comparación con los animales control.
GM-CSF induce la diferenciación local y activación de AM,14 y esto podría ser otro mecanismo de acción sobre otra
célula presentadora de antígeno profesional (APC) observada en los ratones tratados con AdGM-CSF. La alta expresión
del antígeno F4/80 se ha asociado con la presencia de macrófagos inflamatorios, acompañada de sobrexpresión de
MHCII, CD80, CD11b, y aumento de la producción de NO e IL-12.21,22 De manera similar, F4/80 se ha relacionado con
la formación temprana de granulomas inducida por BCG.23 Mediante IHQ para el marcador F4/80 se determinó la
cinética de la presencia activa de macrófagos en los diferentes compartimentos histológicos (intersticio alvéolo-capilar,
áreas perivasculares y peribronquiales) y de las lesiones (neumonía y granulomas). En comparación con el grupo
control, los ratones tratados con AdGM-CSF mostraron en el área perivascular una presencia significativa temprana y
mayor de AM F4/80+ en los días uno y tres, seguido de un número elevado pero no significativo en los días siguientes
(fig. 4b). En la región peribronquial, con excepción de los días 7 y 28, un número significativamente mayor de células
F4/80+ se observaron en el grupo tratado con AdGM-CSF, mientras que en el área intersticial, con excepción de día 120,
la población de AM F4/80+ fue significativamente mayor en el grupo tratado con AdGM-CSF (fig. 4b). En cuanto a las
lesiones pulmonares, en las áreas neumónicas hubo un mayor número de AM F4/80+ en el grupo tratado AdGM-CSF,
siendo significativa en el día 60 (figs. 4b,c), mientras que los granulomas de este grupo mostraron mayor y temprana
presencia de estas células seguido por una disminución progresiva hasta el final del experimento, pero que mantuvo un
número más alto que el grupo de control (figs. 4b,d).
En la tuberculosis humana y murina, la inmunidad protectora es mediada por la respuesta tipo Th-1 (IFN-γ, IL-12) y por
medio de macrófagos activados que producen TNF-α y óxido nítrico (NO) a través de la actividad de la enzima NO
11
sintasa inducible (iNOS).24 GM-CSF promueve la producción de citocinas tipo Th-1.11,12 Por lo tanto, otro mecanismo
involucrado en la posible actividad terapéutica de AdGM-CSF es la inducción de una mayor respuesta Th-1. Los
pulmones de cada grupo de tratamiento fueron homogeneizados para extracción total de mRNA y posterior
retrotranscripción y PCR en tiempo real (qRT-PCR) y así cuantificar la transcripción de GM-CSF, IFN-γ, IL-12, TNF-α
e iNOS. En comparación con el grupo control, los ratones tratados con AdGM-CSF mostraron una mayor transcripción
de GM-CSF que se inició al mismo tiempo de la transcripción de IL-12 (fig. 5a). De manera similar, una transcripción
temprana y significativamente mayor de IFN-γ, TNF-α, e iNOS se observ
ó en el grupo tratado con AdGM -CSF,
mostrando sus mayores niveles de transcripción los días 21 y 90 posinfección (fig. 5a). La expresión celular de GM-CSF
fue evaluada por IHQ. En el grupo tratado con AdGM-CSF, el epitelio bronquial y bronquiolar mostraron una
inmunotinción fuerte para GM-CSF en diversos días examinados, mientras que el grupo control mostró una
inmunotinción mucho más débil (fig. 5b). Los animales tratados con AdGM-CSF mostraron positividad para la
inmunotinción contra GM-CSF los días uno y tres posinfección en los neumocitos tipo II a diferencia de los AM que
fueron negativos en esos días pero que mostraron una positividad más intensa en días posteriores, lo que sugiere que
estas células, junto con el epitelio respiratorio, son las fuente más importante de producción de GM-CSF. Por el
contrario, los pulmones del grupo control mostraron positividad para GM-CSF hasta el día 14 posinfección en los
neumocitos tipo II y AM (Fig. 5c). En los granulomas, los ratones tratados con AdGM-CSF mostraron macrófagos
positivos para GM-CSF con distribución heterogénea, predominantemente en la periferia del granuloma hasta el día 28
posinfección. Una distribución similar se observó en el grupo control pero hasta el día 60 posinfección (fig. 5d).
Efecto terapéutico de la administración de AdGM-CSF en la etapa crónica de la TB pulmonar
Una vez establecido el efecto de la inducción de una respuesta inmune protectora por la administración temprana de
AdGM-CSF, y debido a que la mayoría de los casos de TB pulmonar se encuentran en una fase activa o crónica de la
enfermedad, se analizó el posible papel terapéutico en la etapa crónica de la infección tuberculosa en el modelo murino.
Dos grupos de ratones fueron infectados IT con una dosis alta de Mtb. H37Rv (2.5x105). Se mantuvieron por 60 días
para establecer la enfermedad crónica. Una dosis única de AdGM-CSF o Addl70-3 (1x109pfu) fue administrada IT 60
días posterior a la infección con Mtb. Se observó una significativa disminución de la carga bacteriana los días 14 y 28
postratamiento (74, 88 días posinfección) en comparación con el grupo control Addl70-3 (fig. 6a). Respecto a la
histomorfometría de la neumonía, no se observó diferencia significativa entre los grupos tratados (figs. 6b,d,e), mientras
que el tamaño de los granulomas en el grupo tratado con AdGM-CSF fue significativamente mayor respecto el control
en los días 14 y 28 postratamiento (fig. 6c,f,g)
Efecto de la administración de AdGM-CSF en la reactivación de la infección tuberculosa latente (TBL)
Cuando ratones hembra B6D2F1 son infectados por vía intratraqueal con una dosis baja de Mtb cepa H37Rv, se produce
una forma crónica de TB similar a la infección latente. Este modelo se caracteriza por una carga bacteriana pulmonar
baja y estable (menos de 500 UFC) sin pérdida de peso o daño tisular, tampoco se presenta reactivación espontánea o
muerte. Si se administra corticosterona en el agua de bebida (5 a 7 meses post-infección), hay reactivación de la
enfermedad manifestada por incremento del crecimiento micobacteriano y neumonía progresiva. Este modelo de
infección latente fue utilizado para determinar si la expresión transgénica de GM-CSF mediante la administración de una
sola dosis de AdGM-CSF, 7 meses después de la infección, podría prevenir la reactivación. Un mes después de la
12
administración de AdGM-CSF se indujo la reactivación con cortisona en el agua de bebida durante un mes. La carga
bacteriana pulmonar y la histopatología fueron evaluadas 9 meses después de la infección. Los ratones tratados con
AdGM-CSF mostraron significativamente menor carga bacteriana y menor área neumónica que los ratones que
recibieron el vector control (Addl70-3; figs. 7a, b).
Efecto de la administración de AdGM-CSF en ratones sanos convivientes con ratones con TB activa
Nuestro modelo se basa en la transmisibilidad por la convivencia entre ratones sanos e infectados. Este modelo fue
utilizado para determinar si la administración de una sola dosis de AdGM-CSF era capaz de prevenir la transmisión e
infección de ratones sanos convivientes con animales enfermos ya sea con una cepa de Mtb de virulencia moderada
(H37Rv) o altamente virulenta (Beijing 900-1000). El grupo tratado con Addl70-3 representa el control negativo,
mientras que el grupo tratado con isoniazida (INH) que representa la quimioprofilaxis convencional representa el grupo
control positivo. Los cultivos de los homogeneizados de pulmón de ratones sanos (contactos) tratados con AdGM-CSF o
INH no mostraron crecimiento Mtb tras dos meses de covivienda con ratones infectados con la cepa H37Rv (fig. 8a) o
con la cepa Beijing (fig. 8b) de Mtb. En contraste, los ratones sanos tratados con Addl70-3 mostraron cargas bacilares
pulmonares tras dos meses de convivencia, siendo mayor el número de UFC en el grupo conviviente con ratones
infectados con la cepa altamente virulenta Beijing 900-1000. Adicionalmente, se determinó la prueba cutánea de
hipersensibilidad retardada (DTH) a antígenos de micobacterias en los ratones sanos o contactos tras dos meses de
convivencia con los ratones infectados. Los ratones tratados con Addl70-3 contactos de animales infectados con la cepa
H37Rv mostraron DTH significativamente mayor que los ratones tratados con INH o AdGM-CSF (Fig. 8c).
Interesantemente, los ratones sanos tratados con INH o Add170-3 convivientes con animales infectados con la cepa
altamente virulenta o Beijing mostraron significativamente mayor DTH que los ratones tratados con AdGM-CSF. No se
observó diferencia entre los grupos controles (fig. 8d).
13
FIGURAS
Figura 1. Cinética de la GM-CSF durante la tuberculosis pulmonar progresiva. (A) Tres pulmones de ratones
infectados con Mtb en día indicado se obtuvieron para extraer el mRNA total y determinar la transcripción del gen que
codifica para GM-CSF por qRT-PCR. (B-D) La expresión de la proteína GM-CSF se detectó por inmunohistoquímica
(IHQ) y el porcentaje de células positivas se determinó por morfometría automatizada en los compartimentos del
pulmón indicados, se muestran figuras histológicas representativas de cada compartimento a la derecha de los gráficos
de morfometría. La barra de escala representa a 20 µm. Todos los valores son el promedio ± SD de dos experimentos
independientes con al menos tres ratones por grupo.
14
Figura 2. Expresión de GM-CSF después de la administración intratraqueal de diferentes dosis de adenovirus
recombinantes. (A) Grupos de tres ratones sanos fueron tratados con la dosis indicada de AdGM-CSF (barras negras) o
el adenovirus control Addl70-3 (barras blancas), y sacrificaron después de 1 y 7 postratamiento, los pulmones se
utilizaron para determinar la transcripción del gene que codifica para GM-CSF por qRT-PCR. (B) La expresión de la
proteína GM-CSF fue detectada por IHQ, los pulmones fueron obtenidos después de un día de tratamiento IT con 1x108
ufp (unidades formadoras de placas) de AdGM-CSF, se observa inmunotinción fuerte en el epitelio de las vías
respiratorias. (C) En contraste, los pulmones de ratones tratados con la misma dosis de Addl70-3 no muestra
inmunotinción. La barra de escala representa 60 µm.
15
Figura 3. Efecto de una sola administración de AdGM-CSF un día antes de la infección en el modelo murino de
TB pulmonar progresiva. (A) Grupos de ratones fueron tratados con una sola dosis de AdGM-CSF (barras negras) o
del control Addl70-3 (barras blancas) un día antes de la infección IT con una dosis alta de Mtb H37Rv, tres ratones
fueron sacrificados a los días indicados y los pulmones fueron utilizados para determinar la carga bacteriana por
unidades formadoras de colonias (ufc). Se observa una disminución significativa de las ufc en el grupo tratado con
AdGM-CSF. (B) Morfometría que muestra un porcentaje significativamente menor de la superficie pulmonar afectada
por la neumonía en los animales tratados con AdGM-CSF. (C) El número de granulomas en los días 14, 21 y 28
posinfección fue significativamente mayor en el grupo tratado con AdGM-CSF. (D) El tamaño de los granulomas
obtenido por morfometría automatizada muestra mayor tamaño en los días 28 y 120 posinfección en el grupo tratado con
AdGM-CSF. (E) Imágenes representativas de la histopatología de los pulmones de los ratones tratados con Addl70-3
muestra extensas zonas de la neumonía después de 120 días de la infección con Mtb. (F) Pulmón de ratón tratado con
AdGM-CSF muestra inflamación escasa. (G) Granulomas pequeños en los ratones tratados con Addl70-3. (H)
16
Granulomas más grandes en el ratón tratado con AdGM-CSF. Las barras de escala representan 60 µm en (E) y (F), y 20
µm en (G) y (H). Todos los valores carga bacteriana e histomorfometría son medias ± SD de dos experimentos
independientes con un mínimo de tres ratones por grupo, *p <0.05.
17
Figura 4. Efecto de una sola administración de AdGM-CSF en la inducción de la activación de células dendríticas
y macrófagos alveolares en el modelo murino de TB pulmonar progresiva. (A) Grupos de ratones fueron tratados
18
con AdGM-CSF (símbolos negros) o Addl70-3 (símbolos blancos) un día antes de la infección con Mtb H37Rv, se
obtuvieron los pulmones para hacer suspensiones celulares y determinar el número de células dendríticas (DCs)
activadas por citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales y específicos conjugados contra MHCII-FITC,
CD11c-APC, y CD86-PE; el tratamiento con AdGM-CSF induce mayor número de células dendríticas activadas en un
tiempo más temprano. (B) Se realizaron cortes pulmonares incluidos en parafina para detectar el marcador de
macrófagos F4/80 por IHQ, y obtener el porcentaje de células inmunopositivas en los diferentes compartimentos de
pulmón indicados así como en sus zonas de lesión tisular (neumonía y granulomas). (C-D) Imágenes representativas de
la IHQ de macrófagoss F4/80+ en los grupos de tratamiento indicados y de las regiones pulmonares indicadas. Hay más
células F4/80+ en los animales tratados con AdGM-CSF, la barra de escala representa a 20 µm. Los resultados se
expresan como media y ±SD de al menos tres ratones por cada día indicado y por grupo de tratamiento en dos
experimentos independientes.
19
Figura 5. Efecto de una sola administración de AdGM-CSF en la inducción de la transcripción de citocinas y la
enzima iNOS en el modelo murino de TB pulmonar progresiva. (A) Grupos de ratones infectados por vía IT con una
dosis alta de Mtb para inducir la TB progresiva fueron tratados un día antes con AdGM-CSF (símbolos negros) o
Addl70 3-(símbolos blancos), y sus pulmones se utilizaron para extraer mRNA total y cuantificar por qRT-PCR la
20
expresión de las citocinas que se indican. Los animales tratados con AdGM-CSF mostraron una mayor transcripción de
citocinas e iNOS. (B) Imágenes representativas de la IHQ para detectar la expresión celular de GM-CSF en animales
tratados con AdGM-CSF o AddI70-3 en los diferentes tiempos indicados y en las diferentes regiones pulmonares
indicadas: (B) epitelio bronquial, (C) intersticio alveolocapilar, (D) granulomas; las células más inmunoteñidas se
observan en los animales tratados con AdGM-CSF, siendo mayormente en el epitelio de las vías respiratorias, la barra de
escala representa 20 µm. Los resultados se expresan como media ± SD de dos experimentos independientes con un
mínimo de tres ratones por grupo, *p<0,05.
21
Figura 6. Efecto de una sola administración de AdGM-CSF dos meses después de la infección con Mtb en el
modelo murino de TB pulmonar progresiva. (A) Grupos de ratones fueron tratados IT con una dosis de 1x109pfu de
AdGM-CSF (barras negras) o del vector control Addl70-3 (barras blancas) dos meses después de ser infectados IT con
Mtb H37Rv. Tres ratones fueron sacrificados en los días indicados para determinar la carga bacteriana por unidades
formadoras de colonias (ufc). Se observa una disminución significativa de las ufc en el grupo tratado con AdGM-CSF en
los días 14 y 28 postratamiento (74 y 88 días posinfección respectivamente). (B) Histomorfometría automatizada del
porcentaje de neumonía, no se observa diferencias significativas. (C) Histomorfometría de los granulomas, se observa
mayor tamaño en los días 14 y 28 postratamiento (74 y 88 días posinfección respectivamente) en el grupo tratado con
AdGM-CSF. (D y F) Imágenes representativas de la histopatología pulmonar (neumonía y granuloma, respectivamente)
del grupo tratado con AdGM-CSF 28 días posteriores al tratamiento (88 días posinfección con Mtb). (E y G) Imágenes
representativas de la histopatología pulmonar (neumonía y granuloma, respectivamente) del grupo tratado con Addl70-3
28 días posteriores al tratamiento (88 días posinfección con Mtb). Todos los valores carga bacteriana e histomorfometría
son medias ± SD de dos experimentos independientes con un mínimo de tres ratones por grupo, *p <0.05.
22
Figura 7. La administración de AdGM-CSF impide la reactivación de la TBL. (A) Los ratones fueron infectados
con dosis bajas de Mtb H37Rv para inducir una infección crónica similar a la infección latente y después de 7 meses los
animales fueron tratados con una dosis de 1x108pfu de AdGM-CSF (barras negras) o Addl70 3-(barras blancas),
posteriormente se les adminsitró cortisona en el agua de bebida diaria por un mes para inducir la reactivación de la
enfermedad, los animales tratados con AdGM-CSF mostraron menor carga pulmonar y (B) menor neumonía. Los
resultados se presentan como medias ±SD a partir de dos experimentos independientes con un mínimo de tres ratones
por grupo, *p <0.05.
23
Figura 8. Efecto de la administración de AdGM-CSF en la prevención de la transmisión. Grupos de ratones fueron
infectados con la cepa de virulencia media Mtb H37Rv (A) o con una cepa de Mtb hipervirulenta Beijing 900-1000 (B),
y se pusieron a convivir con ratones sanos tratados con isoniazida (INH; barra rayada), AdGM-CSF (barra negra) o
Addl70 -3 (barra blanca).Dos meses después de convivencia, se determinó la DTH y se obtuvieron los pulmones para
cuantificación de unidades formadoras de colonias. En comparación con los animales tratados con Addl7-3, los
pulmones de los animales tratados con INH o AdGM-CSF no se obtuvo crecimiento micobacteriano. (C) DTH
significativamente mayor en el grupo tratado con Addl70-3 en comparación con el grupo tratado con INH y AdGM-CSF
después de dos meses de conviviencia con ratones infectados con Mtb cepa H37Rv. (D) DTH significativamente mayor
en los grupos tratados con Addl70-3 e INH en comparación con el grupo tratado con AdGM-CSF después de dos meses
de conviviencia con ratones infectados con la cepa altamente virulenta Beijing. Todos los valores son promedio ±SD de
dos experimentos independientes con un mínimo de tres ratones por grupo, *p <0.05.
24
DISCUSIÓN
GM-CSF se identificó por primera vez en el pulmón murino posterior a la administración de lipopolisacárido seguido de
su capacidad para estimular la proliferación de células de la médula ósea y generar colonias de granulocitos y
macrófagos.27 Curiosamente, los ratones con deleción homocigótica del gen que codifica para GM-CSF se desarrollan
normalmente sin alteraciones significativas de la hematopoyesis, pero es muy importante el desarrollo de anomalías
pulmonares, como la acumulación extensa de fosfolípidos del surfactante pulmonar y una mayor susceptibilidad a
infecciones bacterias y por hongos oportunistas.13 Así, GM-CSF tiene importantes actividades de regulación fisiológicas
e inmunológicas en el pulmón, como el aumento de la actividad mieloperoxidasa de los neutrófilos,28 y la estimulación
de la diferenciación y activación de macrófagos, y expresión de TLR-4 (Toll-like receptor 4) así como activación de
células T.29 De hecho, la mayoría de los efectos de GM-CSF mediadas por las células T parecen ser ejercidas
indirectamente a través de las células presentadoras de antígeno (APC). En cuanto a su participación en las infecciones
contra micobacterias, se ha observado que los ratones que carecen de GM-CSF mueren rápidamente con necrosis severa
tras la infección por aerosol de Mtb, debido a una incapacidad para montar un respuesta Th1.30 Nuestros resultados
confirman este hecho y extienden estas observaciones, mostrando una importante progresiva expresión protectora de
GM-CSF durante la infección temprana con picos de expresión en el día 7 y mantenimiento de altos niveles hasta el día
28, lo que coincide con la capacidad limitante del crecimiento micobacteriano a través de una respuesta inmune
protectora predominante Th-1.19, 20
GM-CSF puede ser producido por una amplia variedad de células, incluyendo macrófagos, fibroblastos, células
endoteliales, células T, células epiteliales y mesoteliales entre otras.31 En estas células, los antígenos bacterianos y las
citocinas inflamatorias, tales como IL-1, IL- 6, y TNF-α son potentes inductores.32, 33 Por lo tanto, estos factores deben
contribuir a la alta expresión observada de este factor de crecimiento, teniendo en cuenta que todas estas citocinas en
este modelo experimental se producen preferentemente durante el primer mes después de la infección. Así mismo,
durante las etapas tardías de la enfermedad, en este modelo experimental, hubo una disminución progresiva de la
expresión de GM-CSF, que muestra su nivel más bajo en el día 120 después de la infección, etapa progresiva que
coincide con pérdida del control del crecimiento micobacteriano y aumento de las citocinas de tipo Th2.20 La expresión
de GM-CSF puede ser inhibida por IL-10 e IL-434 o glucocorticoides.35 Estos factores anti-inflamatorios podrían estar
relacionadas con la disminución de GM-CSF durante la enfermedad avanzada, cuando en existe una significativa
disminución de la respuesta inmune protectora en coexistencia con un extenso daño tisular, granulomas de pequeño
tamaño si los hay, y alta carga bacteriana.19, 20
La significativa participación de GM-CSF en la contención de la infección por Mtb es respaldada por los actuales
resultados obtenidos tras la administración de una sola dosis de adenovirus recombinante que codifica para esta citocina,
un día antes de la infección por Mtb. Esta administración resultó eficaz para la expresión transgénica y traducción
temprana de GM-CSF en el epitelio respiratorio y producción, que indujo cuatro veces más activación de DCs y
significativamente mayor transcripción de factores inmunes protectores como TNF-α, IL-12, IFN-γ e iNOS, lo que
condicionó también mayor número y tamaño de los granulomas así como mayor presencia significativa de macrófagos
25
F4/80+, menor área de neumonía y permanente disminución de la carga bacilar. Así, demostramos que GM-CSF es un
factor protector altamente significativo para la inducción de una respuesta inmune eficiente durante la infección
temprana, y estos resultados sugieren el uso de adenovirus recombinantes que codifican esta citocina como una forma
potencial de inmunoterapia.
Las citocinas que intervienen en la activación de los linfocitos Th1 han sido utilizadas clínicamente como una forma de
inmunoterapia que aumenta la actividad antimicobacteriana a través de la activación de los linfocitos T, DCs, y AMs. A
este respecto, el uso de citocinas recombinantes, tales como el IFN-γ36 o IFN-α en aerosol,37 junto con antibióticos, ha
resultado en mejoría clínica para los pacientes con TB. Existen evidencias que demuestran que la terapia génica basada
en un adenovirus que codifica para IFN-γ en la etapa progresiva de la enfermedad resulta en un control exitoso de los
ratones infectados con cepas resistentes a los antifímicos de primera linea.38 Por otra parte, las vacunas basadas en
vectores virales recombinantes que codifican antígenos de micobacterias han demostrado gran eficacia en modelos
experimentales de TB, y también han demostrado que la vía respiratoria es la vía de administración más favorable para
inducir una respuesta inmune protectora eficaz contra infecciones respiratorias,39 que se potencia cuando se usa GMCSF como factor adyuvante.40 De hecho, la administración de GM-CSF o la inducción de su expresión han sido útiles en
el tratamiento de otras infecciones pulmonares como la aspergilosis,41 por Chlamydia trachomatis42 y neumonía
neumocóccica.43 Por otra parte, la administración de GM-CSF recombinante humano inhalado ha demostrado ser eficaz
en el tratamiento de la proteinosis alveolar y con un excelente perfil de tolerabilidad en voluntarios sanos.44 Nuestros
resultados demuestran que existe una importante participación terapéutica de la administración de GM-CSF en la etapa
crónica de la enfermedad demostrada por una disminución de la carga bacteriana pulmonar y mayor tamaño de
granulomas, sin embargo, debido a que para inducir este nivel de protección hubo que aumentar la dosis diez veces, es
posible que la fuerte inducción inflamatoria sea la responsable de la ausencia de diferencias significativas en la
histomorfometría de la neumonía. Estos resultados abren la posibilidad de estudio a profundidad de la participación
adyuvante de GM-CSF en la terapia antifímica convencional y para casos drogorresistentes.
Actualmente, no hay datos disponibles sobre el uso profiláctico de GM-CSF para aumentar la defensa
antimicobacteriana del huésped principalmente en los pacientes inmunodeficientes. En consonancia con esto, una
desventaja es que las citocinas recombinantes son de alto costo y tienen una vida media corta in vivo lo que dificulta su
aplicabilidad y hace pensar que son de poca rentabilidad. Considerando lo anterior, nuestro estudio muestra que el uso
de una sola dosis de adenovirus recombinantes que codifican para GM-CSF es muy eficiente y eficaz para inducir la
expresión del transgene que se acompaña de la inducción de una respuesta inmune protectora. Ambos vectores
adenovirales AdGM-CSF y Addl70-3 han sido bien caracterizados, y se ha demostrado que su presencia en el pulmón se
limita temporalmente a 12-14 días45 e infectan esencialmente el epitelio respiratorio que resulta en niveles de GM-CSF
detectables en el pulmón hasta la tercera semana posadministración, sin evidencia de incremento sérico cuando se
administra en ratones sanos. Esta expresión transitoria es importante, teniendo en cuenta que los ratones transgénicos
que sobreexpresan GM-CSF muestran acumulación de macrófagos, ceguera y daños tisular severos en diferentes
órganos;46 así como incremento significativo de muchas citocinas y mediadores de la inflamación, sin la capacidad de
focalizar la respuesta antimicobacteriana de células T y macrófagos en los sitios de infección,30 lo que sugiere que la
expresión elevada y permanente de GM-CSF conduce a defectos en la regulación de citocinas y quimiocinas. Por lo
26
tanto, el exceso sistémico de GM-CSF no necesariamente induce una respuesta Th1 protectora y se necesita un control
muy preciso de esta citocina para combatir las infecciones. En cuanto a Addl70-3, no induce niveles detectables de GMCSF y no induce inflamación viral importante.45
Nuestros resultados experimentales sugieren que el efecto inmunoestimulante de GM-CSF promueve no sólo la
protección contra la tuberculosis primaria, sino también la prevención de la reactivación de la TBL. En comparación con
los ratones tratados con Addl70-3, una dosis única de AdGM-CSF fue capaz de prevenir la reactivación después de la
inmunosupresión inducida por la administración de cortisona en el agua de bebida diaria de ratones con infección
latente, similar a la humana. Estos resultados preclínicos ofrecen una alternativa para los futuros ensayos inmunoterapéuticos en personas de alto riesgo para impedir la reactivación de la TBL, tales como pacientes con enfermedades
reumatológicas tratados con anti-TNF-α,47 o pacientes con VIH/SIDA que pueden desarrollar TB después de una
infección primaria o por reactivación de TBL.
Otro escenario clínico para la aplicación clínica potencial de citocinas como GM-CSF a través de la terapia génica es la
profilaxis a corto plazo necesaria en personas sanas contactos de enfermos con TB bacilífera. La OMS recomienda el
cribado de los familiares contactos de un caso índice de TB para identificar personas infectadas o susceptibles de serlo,
principalmente en niños menores de 6 años de edad, con el fin de suministrar el tratamiento quimioprofiláctico
inmediato para los sujetos que no han desarrollado la enfermedad o que no han sido infectadas.1 Actualmente la única
alternativa profiláctica adicional a la vacuna BCG para prevenir la TB es la quimioprofilaxis con INH en cuyo caso debe
ser administrada por lo menos seis meses con el inconveniente ampliamente conocido de su potencial hepatotoxicidad.
Una revisión sistemática sobre la profilaxis de la TB en adultos infectados con VIH mostró que la INH redujo la
incidencia de TB en los sujetos con DTH positivo, pero fue ineficaz en las personas con DTH negativo, lo que sugiere
que la quimioprofilaxis no impide primaria infección.7 Nuestros resultados en el modelo de transmisibilidad confirman
este hecho, particularmente en los animales convivientes con ratones infectados con la cepa hipervirulenta Beijing, ya
que la DTH de los ratones contacto que recibieron quimioprofilaxis con INH no mostraron ninguna diferencia
estadísticamente significativa en comparación con los ratones tratados con el vector control Addl70-3, lo que confirma
que INH no previno la infección primaria, pero de manera eficiente inhibe el crecimiento de Mtb al no encontrarse
evidencia de UFC en el cultivo. En contraste, la administración de AdGM-CSF fue más eficaz para prevenir la
transmisión evidenciado con una DTH estadísticamente menor sin UFC detectables en el cultivo en la convivencia tanto
con ratones onfectados con Mtb de virulencia media o hipervirulenta. Estos resultados están de acuerdo con los ensayos
clínicos que han demostrado que la administración de INH como quimioprofilaxis en los niños que viven en zonas
endémicas de TB no reduce el riesgo de infección, enfermedad o muerte debido a TB.48 Sin embargo, la INH ha
mostrado eficacia para la prevención de la TB activa en personas que tuvieron contacto previo con pacientes con TB.49
Cada vez hay mayor evidencia de la prevalencia de TB debido a enfermedades inmunosupresras, y considerando que se
estima que un tercio de la población mundial padece TBL se prevee que existirán muchos casos de TB activa por
reactivación. Si adicionalmente analizamos el aumento de la aparición de cepas de Mtb MDR y XDR vemos imperiosa
la necesidad de desarrollar nuevas formas de tratamiento que se fundamenten en la estimulación de una respuesta
inmune protectora capaz de prevenir la transmisibilidad, la reinfección, y ayuden a resolver la enfermedad crónica
27
establecida. La era de la medicina moderna que inició con los antibióticos está terminando y la investigación básica y
pre-clínica debe dirigirse al estudio de nuevas alternativas factibles que mejoren el apego al tratamiento al mismo tiempo
que demuestren mejor perfil de tolerancia y menor toxicidad así como menor probabilidad de resistencia. La
inmunoterapia basada en adenovirus no replicativos recombinantes que codifican para GM-CSF podría ser útil para
prevenir la infección en los contactos sanos cercanos de pacientes con TB, prevención de la reactivación de la TBL, y
como coadyuvante en el tratamiento de la TB crónica.
28
MATERIAL Y MÉTODOS
Modelo murino de TB pulmonar progresiva y administración de adenovirus recombinantes
El modelo murino de TB pulmonar ha sido ampliamente caracterizado en estudios previos. El adenovirus recombinante,
no replicativo, que codifica para GM-CSF (AdGM-CSF) y su control o vector vacío (Addl70-3) fueron caracterizados
previamente. Ratones BALB/c de 8 a 10 semanas de edad, fueron anestesiados con sevofluorano y posteriormente
recibieron una sola dosis intratraqueal (IT) de adenovirus (1x108 PFU/ratón) que expresa la citocina (AdGM-CSF) o el
adenovirus control (Addl70-3), un día antes de ser infectados de la misma forma con 2.5x105 bacterias viables de la cepa
H37Rv de Mtb, suspendidas en PBS. Los ratones infectados fueron mantenidos en grupos de diez en cajas con
microaisladores conectados a presión negativa. Los ratones se sacrificaron mediante exsanguinación bajo anestesia en
los días 1, 3, 7, 14, 21, 28, 60, 90 y 120 posinfección, para obtener los pulmones y hacer estudios bacteriológicos,
histológicos y de biología molecular.
Para los ensayos de tratamiento en la fase crónica de la enfermedad, ratones BALB/c de 8 a 10 semanas de edad, fueron
anestesiados con sevofluorano y posteriormente infectados IT con 2.5x105 bacterias viables de la cepa H37Rv de Mtb,
suspendidas en PBS. Una vez establecida la infección crónica tuberculosa, dos meses después de la infección, los
ratones fueron anestesiados con sevofluorano y posteriormente recibieron una sola dosis IT de adenovirus (1x109
PFU/ratón) AdGM-CSF o el adenovirus control Addl70-3. Los ratones fueron sacrificados mediante exsanguinación
bajo anestesia en los días 15 y 30 postratamiento (75 y 90 días posinfección respectivamente).
Determinación de las unidades formadoras de colonias en pulmones infectados
Un pulmón de cuatro ratones, por día de sacrificio, fueron usados en dos experimentos independientes. Los pulmones se
homogeneizaron con un politrón (Kinematica, Luzern, Suiza) en tubos estériles y en un volumen final de 1 ml de PBStween 80 al 0.05%. Tres o cuatro diluciones de cada homogeneizado fueron sembradas por duplicado en placas con agar
Bacto Mediabrook 7H10 (laboratorios difco, Detroit MI) enriquecido con ácido oleico, albúmina, catalasa y dextrosa
(Becton, Dickinson y Compañía, Sparks, MD). El número de colonias fue contado después de 14 y 21 días de sembrado.
Preparación de tejido para el estudio histológico y morfométrico
Para el estudio histológico, tres pulmones se perfundieron IT con etanol absoluto. Las secciones parasagitales de los
órganos, fueron embebidas en parafina, cortadas en 3 µm y teñidas con hematoxilina y eosina. El área de los granulomas
fue medido en micras cuadradas, y se hizo el conteo del número de granulomas por pulmón. El porcentaje del área de
pulmón afectado por neumonía fue determinado utilizando un analizador de imágenes (Q Win Leica, Milton Keynes,
UK). Las mediciones fueron tomadas a ciego, y los datos fueron reportados como la media ±DE de 3 ratones diferentes
para cada tiempo de dos diferentes experimentos.
Inmunohistoquímica (IHQ) para F4/80 y GM-CSF
29
Los mismos tejidos embebidos en parafina, se utilizaron para IHQ, los cortes de 5 µm, se obtuvieron en laminillas
cargadas con poli L-lisina. Para desparafinar, las laminillas se colocaron a 60-70°C por 20 min, después se incubaron 5
min en xileno; se cambió 5 veces el medio siguiendo la secuencia: xileno-alcohol (1:1) - alcohol absoluto - alcohol 96%
- H2O. Una vez hidratadas, se bloqueó la peroxidasa endógena, con H202 10% en metanol. Los lavados se realizaron con
HCN1x-tween 20. Se delimitaron las zonas de tejido y se agregó 100 µl de HCN1X-suero universal al 2%. Las
laminillas se incubaron 30 min en cámara húmeda. Las laminillas se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-F4/80
conjugado con biotina (Cat. 13-4001-82, eBioscience) durante 12 horas a temperatura ambiente. Se lavaron y se
agregaron 100 µl por tejido del complejo AB/HRP (Vectasin), y se incubaron 30 min para ser reveladas con 100 µl de
diaminobencidina/H2O2 (0.004 g de diaminobencidina + 10 ml HCN1x + 4 µl H2O2); se lavaron y se contrastaron con
hematoxilina. La tinción para GM-CSF, se ocupó un anticuerpo primario monoclonal anti-GM-CSF (Cat. 71165, Santa
Cruz Biotechnology), y posteriormente, se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con biotina (Cat. A10517,
Invitrogen) por 1 h, se lavaron, y el revelado se hizo con base al mismo procedimiento anterior.
Extracción de mRNA total y retrotranscripción (RT)
Tres pulmones por grupo, por día de sacrificio, fueron colocados en 2 ml de medio RPMI (Invitrogen life Technologies,
Carisbad, CA) conteniendo 0.5 mg/ml de colagenasa tipo 2 (Worthington, Lakewood NJ), e incubado por 1 hr a 37ºC;
después el pulmón fue macerado y se hizo pasar a través de un colador estéril de 70 µm (BD Biosciences, Bedford, MA).
La suspensión celular fue centrifugada a 1500 rpm por 1min a 4ºC y lavada con medio RPMI. El sobrenadante fue
removido y las células rojas fueron lisadas con 1 ml de buffer de lisis (cloruro de amonio 0.34M, EDTA 0.12mM y
carbonato de potasio 1mM), finalmente las células fueron lavadas y centrifugadas bajo las mismas condiciones. Se
contaron 5x106 células, y se les agregó 350 µl del buffer RLT (Qiagen, Hilden Alemania) con β-mercaptoetanol. Se aisló
el RNA usando el minikit RNeasy (Qiagen, Hilden Alemania); pasando la muestra a través de una columna, se
centrifugó a 14000 rpm por 1min a 4ºC. El RNA unido a la columna, se lavó con 700 µl de 2 buffers del mini kit
RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania), finalmente se eluyó con 50 µl de agua libre de RNAsas. El RNA fue tratado con
una unidad de DNasa (Invitrogen life technology, Carisbad CA) por cada microgramo de RNA. La calidad y cantidad
del RNA, también fueron evaluadas por espectrofotometría (260nm/280nm) y geles de agarosa. El cDNA fue sintetizado
utilizando el kit omniscript RT (Qiagen, Hilden, Alemania) y oligo dT (Promega corporation Madison WI) y 100ng de
RNA. La expresión de gliceraldehido-3-fofato deshidrogenasa (G3PDH) fue determinada por RT-PCR convencional, los
cDNAs fueron amplificados con la DNA Polimerasa Hot Start Taq (Qiagen, USA).
PCR de tiempo real (qPCR)
La PCR en tiempo real fue desarrollada utilizando el equipo 7500 real time PCR system (Applied Biosystems, USA). Se
utilizaron 100 ng de cDNA, 12.5 µl de la mezcla Quantitect SYBR Green PCR (Qiagen,USA). (QuantiTect SYBR Green
PCR Buffer: contiene Tris-Cl, KCl, (NH4)2SO4, 5 mM MgCl2, pH 8.7; la mezcla de dNTP´s (dATP, dCTP, dGTP,
dTTP/dUTP); SYBR green I y ROX), 50 pmol del iniciador sentido y 50 pmol del iniciador antisentido. La formación
de un sólo producto de PCR y el tamaño esperado del amplicón se confirmaron por electroforesis del producto de PCR.
Las curvas estándar de productos de PCR cuantificados y diluidos, así como controles negativos, se incluyeron en cada
corrida de PCR. Los iniciadores específicos fueron diseñados utilizando el programa Primer Express (Applied
Biosystems,
USA)
para
los
CCGGAATGCCATTCCTGTTA
siguientes
-3´,
blancos:
iNOS:
G3PDH:
5´-GGCGCTCACCAAAACATCA-3´,
5´-AGCGAGGAGCAGGTGGAAG-3´,
5´5´-
CATTTCGCTGTCTCCCCAA-3´, TNFα: 5´-TGTGGCTTCGACCTCTACCTC-3´, 5´-GCCGAGAAAGGCTGCTTG-
30
3´, IFNg: 5´-GGTGACATGAAAATCCTGCAG-3´, 5´-CCTCAAACTTGGCAATACTCATGA-3´, GM-CSF: 5'GCCATCAAAGAAGCCCTGAA-3',
GGATGGAAGAGTCCCCCAAA-3',
5´-GCGGGTCTGCACACATGTTA-3',
5´-GCTCTGCGGGCATTTAACAT-3´.
Las
IL12:
condiciones
usadas
5'fueron:
desnaturalización inicial a 95ºC for 15 min, seguidas por 40 ciclos a 95ºC por 20 seg, 60ºC o 58ºC por 20 seg, 72ºC por
34 seg. El número de copias mRNA de cada citocina estuvieron relacionadas con un millón de copias de mRNA
G3PDH.
Citofluorometría
Se utilizaron suspensiones celulares de pulmón para evaluar las poblaciones de DC activadas como se describió
previamente, los anticuerpos utilizados fueron fluoresceina isotiocianato (FITC) Anti-I-A ⁄I-E- (MHC–CII-FITC clona
269), aloficocianina anti-CD11c (CD11c-APC clona HL3), ficoeritrina (PE) anti-CD86; Pharmingen, BD. Las muestras
fueron evaluadas en el equipo FACS Calibur utilizando el software CellQuest (BD. Biosciences). Los datos colectados
fueron analizados con el software flowjo 6.1.
Modelo murino experimental de TB latente (TBL)
El modelo murino de tuberculosis pulmonar latente ha sido bien caracterizado previamente. Tres grupos, de cinco
ratones hembras B6D2F1 (C57BL/6J X DBA/2 J) de 8 semanas de edad, se infectaron IT con 4000 bacterias viables
cepa H37Rv. Se estableció la latencia por un periodo de 7 meses. Después de este periodo, cada grupo de ratones fue
tratado IT con AdGM-CSF (1x108 pfu), Addl70-3 (1x108 pfu), o PBS. Se esperó un mes antes de iniciar la
administración de cortisona en el agua de bebida (3 mg/L) por un mes más. Se sacrificaron bajo anestesia para obtener
los pulmones y realizar estudios de UFC e histomorfometría.
Modelo murino experimental de transmisibilidad
El modelo de transmisibilidad ha sido descrito previamente. Cuatro grupo de cinco ratones fueron tratados con AdGMCSF (1x108 pfu IT), Addl70-3 (1x108 pfu IT), INH (0.2 mg/día intragástrica), o PBS. Cada uno de estos grupos, por
separado, cohabitaron en la misma caja con cinco ratones infectados IT con 2.5x105 bacterias H37Rv; mientras que, otra
serie de cuatro grupos con igual tratamiento, cohabitaron con cinco ratones infectados IT con 2.5x105 bacterias
hipervirulentas de la cepa Beijing. Las cajas con microaisladores estaban conectadas a presión negativa. Se sacrificaron
cinco ratones por grupo de tratamiento, uno y dos meses después de la convivencia, para obtener los pulmones y
determinar UFC. La reacción de hipersensibilidad retardada (DTH), con 20 µg de antígeno micobacteriano en 40 µl de
PBS intradérmicamente en el cojinete, se determinó un día antes del sacrificio con un micrómetro de precisión. La
medición se expresó como el porcentaje del cambio entre la medición basal y 24 horas después de la administración del
antígeno.
Estadística
El análisis de varianza de una vía (ANOVA), fue usado para comparar las posibles diferencias en la carga bacilar y en la
morfometría. Las diferencias significativas se buscaron entre el grupo control y el grupo de ratones tratados con AdGMCSF, así como el grupo que recibió el tratamiento con INH para el caso del modelo de transmisibilidad. Se utilizó el
software SPSS 12.0 para Windows XP. Las diferencias entre los grupos tratados para el PCR tiempo-real fueron
determinadas utilizando la prueba t-Student. La significancia fue aceptada a un valor de p<0.05.
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