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VIII CAIQ2015 y 3 JASP
INMOVILIZACIÓN DEL EXTRACTO ENZIMÁTICO DE LA
TIROSINASA DE AGARICUS BISPORUS EM MEMBRANA DE
NYLON Y ESFERAS DE QUITOSANA
V. P.S dos Santos, C. H. Mendonça, R. V.G dos Santos, F. C.S.S Mihos, A. G. Torres,
K. S. Pereira, A. M. Salgado
Escola de Química - EQ
(Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ)
Av. Horácio Macedo, 2030, Edifício do Centro de Tecnologia, Bloco E.
Cidade Universitária - CEP: 21941-909) Rio de Janeiro – RJ – Brasil
[email protected]
Resumen. Las reacciones catalizadas por la enzima tirosinasa inmovilizada
han sido aprovechadas con éxito en el desarrollo de técnicas de bioremediación de contaminantes fenólicos, síntesis de bioproductos y en
metodologías de análisis por medio de la construcción de biosensores. La
etapa de inmovilización es un paso llave para el uso de enzimas en diversas
aplicaciones, una vez que permite mejoras en las propiedades catalíticas
enzimáticas, además de permitir la reutilización del biocatalizador,
reduciendo costos. De entre los soportes utilizados para la inmovilización,
polímeros como nylon y quitosana se presentaron como opciones
económicas, simples, además de características favorables como biocompatibilidad y versatilidad. El presente trabajo tuvo como objetivo
inmovilizar la enzima tirosinasa del extracto parcialmente purificado del
macro hongo Agaricus bisporus en soportes de quitosana (esferas) y nylon
(membranas comerciales), vía ligación covalente seguida de la reticulación,
utilizando como agente de ligación al glutaraldehído. Las actividades
enzimáticas de la enzima en las formas libre e inmovilizada fueron medidas
y fueron calculados los porcentuales de eficiencia de las inmovilizaciones.
La eficiencia de inmovilización alcanzada por la membrana de nylon fue de
61,6%, aproximadamente 3 veces mayor que la obtenida por la
inmovilización en esferas de quitosana, que fue de 22,5%.
AAIQ Asociación Argentina de Ingenieros Químicos - CSPQ
VII CAIQ 2015 y 2das JASP
Palabras clave: tirosinasa, nylon, quitosana
1. Introducción
La tirosinasa (EC 1.14.18.1), también conocida como polifenoloxidase, es una
enzima bifuncional que contiene dos átomos de cobre. Cuando existe la presencia de
oxígeno molecular, la tirosinasa es capaz de catalizar reacciones de oxidación
secuenciales de sub extractos fenólicos: hidroxilación de monofenoles a o-difenoles y la
subsecuente oxidación de estos componentes a o-quinonas (Karbassi et al. 2003). Esas
reacciones pueden ser aprovechadas en diversas aplicaciones biotecnológicas en las
áreas de salud, ambiente, de alimentos y otras. Algunas de esas aplicaciones fueron
enumeradas en la tabla 1.
Tabla 1. Aplicaciones biotecnológicas de la enzima tirosinasa
Aplicación
Principio
Referencia
Determinación de fenólicos
Consumo de oxígeno
(Silva et al. 2010)
Remoción de fenólicos
Oxidación de fenoles
(Bayramoglu et al. 2013)
Determinación de ácido benzóico
Inhibición enzimática
(Kochana et al. 2012)
Desarrollo de biopolímeros
Red de proteínas ligadas
(Halaouli et al. 2006)
Producción de L-DOPA
L-tirosina como sub extracto
(Algieri et al. 2012)
En general, aplicar enzimas en procesos industriales se vuelve más atractivo cuando
estos biocatalizadores están adheridos a un soporte inerte. Así, la inmovilización de
enzimas es una etapa fundamental en la viabilidad operacional y económica de la
utilización de esos biocatalizadores (Datta et al. 2012).
Los diversos métodos de inmovilización pueden significar mejoras en las
propiedades catalíticas do biocatalizador debido a la estabilización en la reducción de
las alteraciones conformacionales en función de la exposición a factores de medio de
reacción, como temperatura, pH y solventes orgánicos, que pueden provocar la
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inactivación de la enzima (Mendes et al. 2011). Además de este factor, enzimas
inmovilizadas permiten la utilización de estos biocatalizadores posterior a una serie de
ciclos de reacción y permiten una fácil separación del producto final posterior a la
reacción, previniéndolo de la contaminación (DiCosimo et al. 2013).
Teniendo en vista las ventajas de la inmovilización de enzimas y que existen diversas
metodologías y soportes disponibles, es preferible aplicar alguno de los métodos que sea
el más adecuado desde el punto de vista de la relación costo-beneficio.
Soportes a partir de quitosana y nylon son considerados atractivos para la
inmovilización de enzimas, una vez que son de relativo bajo costo, poseen propiedades
químicas y físicas versátiles, pudiendo ser empleados de diversas formas (esferas,
membranas, fibras), además de ser atóxicos (Cao 2006; Zhou et al. 2013; Isgrove et al.
2001).
La quitosana es una molécula natural, obtenida a partir de fuentes renovables
(exoesqueleto de crustáceos o pared celular de hongos filamentosos y/o levaduras),
definida como copolímero de 2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose y 2-acetamida-2desoxi-D-glicopiranose, con propiedad antifúngica en temperatura ambiente. Esa
propiedad, aliada al hecho de ser biodegradable y biocompatible, hace de esa
nanopartícula un vehículo con grande potencial para inmovilizar activos biológicos
(Schwartz 2008). Su estructura espacial, sin embargo, está relacionada a la forma en la
cual ella se encuentra en estado sólido, o sea, es encontrada en estructuras diferentes
cuando analizada en formas diferentes (hidratada, anhidra, como complejos o sales de
quitosana). Independientemente de la forma encontrada, este polímero contiene en su
estructura grupos funcionales reactivos – amino (NH2) e hidroxila (OH) (Yao et al.
2011)(Figura 1).
Figura 1. Estructura química del quitosano (Solov’eva et al. 2013)
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Poliamidas son un grupo de polímeros que reciben el nombre genérico de nylon. Son
materiales que poseen elevada resistencia eléctrica, química y térmica. El nylon 66 es
uno de los más utilizados en inmovilización de biocatalizadores. La hidrólisis ácida
parcial de la superficie de nylon aumenta la presencia de grupos amino y
consecuentemente la capacidad de fijar proteínas (Figura 2) (Ahmadi et al. 2014).
Figura 2. Estructura química del nylon 66
Este trabajo tiene como objetivo inmovilizar la enzima tirosinasa, presente en el
extracto parcialmente purificado del macro hongo Agaricus bisporus, utilizando como
soporte membranas de nylon 66 y esferas de quitosana, por medio de ligación covalente
seguida de la reticulación, utilizando glutaraldehído como agente de ligación.
2. Métodos
2.1. Preparación del extracto enzimático de la tirosinasa
Procedimiento modificado de Kameda et al. (2006). 500 g de cuerpos fructíferos de
Agaricus bisporus con 1 L acetona helada. Después de filtración a vacío, el residuo de
seta fue congelado por 24 horas, resuspenso con 100 mL de tampón fosfato 0,1 M pH 6
y congelado por otras 24 horas. Después del descongelamiento, el residuo fue
centrifugado a 4000 rpm por 10 minutos, dos veces consecutivas, y los sobrenadantes
(extractos enzimáticos) sometidos a purificación parcial secuencial con sulfato de
amonio (0-20%, 20-40%, 40-60%) (Scopes 1994) en baño de hielo, a 0 °C, sobre
agitación por 60-90 minutos. Después, fueron centrifugados a 9000 rpm y a 2 °C,
durante 30 minutos. Los precipitados de cada intervalo fueron re suspensos en 5 mL de
tampón fosfato de sódio pH 6, a una temperatura de -6°C.
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2.2 Determinación de la actividad enzimática
La medida de la actividad enzimática del extracto de tirosinasa libre e inmovilizada
fue realizada siguiendo el procedimiento adaptado de Campos et al. (1996). Para la
enzima libre, el extracto enzimático fue diluido 1:10 en solución tampón de fosfato de
sodio 0.1 M pH 6 y adicionado a 5.5 mL de la solución del tampón fosfato de sodio 0.2
M a pH 6 e 1.5 mL de solución del sustrato L-tirosina 1.2 mM. La mezcla fue agitada en
vortex por 3s, llevada al espectrofotometro para análisis, donde la variación de la
absorbencia resultante de la reacción de la enzima del extracto enzimático con el
sustrato L-tirosina fue leída en 280 nm, durante 10 minutos. Para la enzima
inmovilizada, la solución tampón de L-tirosina fue adicionada al inmovilizado y
alícuotas de 1 mL fueron retiradas a cada minuto para lectura espectrofotométrica,
durante 10 minutos. La actividad enzimática total (U) fue calculada según la ecuación
(1).
U = Abs2 − Abs1)x100xDE)/T2 − T1)xVE
Ecuación (1)
Dónde, Abs1: absorbencia inicial
Abs2: absorbencia final
T1 : tiempo inicial
T2 : tiempo final
VE : volumen de solución enzimática
DE : factor de dilución de la solución enzimática
2.3 Inmovilización de los extractos enzimáticos de la tirosinasa
La tirosinasa fue inmovilizada en dos tipos de soportes: esferas de quitosana y
membranas de nylon 66, por medio de ligación covalente seguida de la reticulación,
ambas con glutaraldehído (Figura 3).
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Figura 3. Representación esquemática de la inmovilización. A) Hidrólisis con HCl para generar grupos amino(-NH2))
en la superficie de soporte. B) Activación con glutaraldehído (GA) 0.5%. C) Incubación de soporte activado con el
extracto enzimático. D) Reticulación con glutaraldehído 1%. Para la inmovilización con esferas de quitosana el
procedimiento fue realizado a partir de la etapa B).
Inmovilización covalente-reticulación en membrana de nylon. Membranas de
nylon 66 (0.45 µm, 47 mm, Sigma-Aldrich) fueron hidratadas por 24h en agua des
ionizada. En seguida, fueron hidrolizadas en HCl 3M por 2h y lavadas con agua des
ionizada 3x. Las membranas fueron activadas en solución de glutaraldehído 0.5% por
2h y, posterior al lavado con agua des ionizada 3x, se adicionaron 6 mL de extracto
enzimático (3600 U) por 1 h, seguida por la adición de glutaraldehído, obteniendo la
concentración final de 1%, por 30 minutos. Las membranas fueron lavadas con agua des
ionizada para retirar el exceso de glutaraldehído y las enzimas no inmovilizadas, siendo,
en seguida, almacenadas en tampón fosfato de sodio 0.1M pH 6, à 4°C, hasta su uso.
Inmovilización covalente-reticulación en esferas de quitosana. Esferas de
quitosana fueron preparadas con base en el procedimiento modificado reportado por
Zhou et al. (2013). 2 g de quitosana de médio peso molecular fueron adicionados en 100
mL de solución de ácido acético 5% (v/v), bajo agitación, por 24 horas. La solución fue
por gotas por medio de un puntero de plástico de aproximadamente 1 mm, acoplada a
una bomba peristáltica, en 1000 mL de solución de NaOH 2 M e Etanol (4:1)(Figura 4).
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Figura 4. Síntesis de esferas de silicón
Las esferas del biopolímero fueron dejadas en esa solución bajo agitación por 24
horas. Posterior a este período, fueron filtradas y lavadas con agua des ionizada hasta
que o pH de las aguas de lavado alcanzaran neutro (pH 7.0). Los diámetros de las
esferas quedaron entre 1,5 e 1,8 mm. En seguida, 10 g de esferas de quitosana fueron
activadas con solución de glutaraldehído 0.5% por 2h. Las esferas de quitosana
activadas fueron lavadas con agua des-ionizada 3x. A los 3 g de esferas activadas, se
adicionó 6 mL de extracto enzimático (3600 U) por 1 h, seguida de la adición de
glutaraldehído, obteniendo la concentración final de 1%, por 30 minutos. Las esferas
fueron lavadas con agua des ionizada para retirar el exceso de glutaraldehído y enzimas
no inmovilizadas, siendo, en seguida, almacenadas en tampón fosfato de sodio 0.1M pH
6 à 4°C.
Eficiencia de inmovilización. La eficiencia de las inmovilizaciones fue determinada
por medio de la ecuación 2:
n% = Us|Ui)x100
Donde,
Ecuación (2)
Us= unidades de actividad enzimática total presente en el soporte
Ui= unidades de actividad utilizadas en la inmovilización
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3 Resultados y discusion
3.1 Eficiencia de los métodos de inmovilización
De acuerdo con los resultados de inmovilización descritos en la Tabla 1, la
inmovilización covalente-reticulación fue el método más eficiente, con 61,6 % de
actividad enzimática recuperada en relación a la carga enzimática utilizada en la
inmovilización (3600 U), utilizando bajas concentraciones de glutaraldehído, más que
fueron suficientes para activar los grupos amino de soporte, generados por la hidrólisis
parcial con HCl.
En el trabajo de Boshoff et al. (2003), el extracto parcialmente purificado de la
enzima tirosinasa fue inmovilizado por ligación covalente cruzada en membranas de
nylon hidratadas no hidrolizadas en ácido. El porcentual de actividad enzimática
recuperada fue de 30%.
Tabla 1 – Resultados de los métodos de inmovilización en relación a la actividad
recuperada y eficiencia de la inmovilización:
Método de inmovilización
Us
n%
Covalente-reticulación/ membrana nylon 66
2220 ± 47,1
61,6
Covalente-reticulación/ esferas de quitosana
813 ± 37,1
22,5
Por otro lado, la inmovilización utilizando esferas de quitosana (3 g) presentó
eficiencia de inmovilización baja en relación a la membrana. La concentración de
glutar-aldehído utilizada puede no haber sido suficiente para promover la activación de
los grupos amino en la superficie de la quitosana, ocasionando baja inmovilización de la
enzima tirosinasa y consecuente menor actividad enzimática recuperada (Chen et al.
2013). En el trabajo de Chuang (2005), la enzima tirosinasa purificada fue inmovilizada
covalentemente en 1 g de esferas de quitosana activadas con 7,5% de solución de
glutaraldehído, lo que resultó en 13% de actividad enzimática recuperada.
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4 Conclusiones
En el presente estudio, la tirosinasa del extracto enzimático de Agaricus bisporus, fue
inmovilizada por ligación covalente seguida de la reticulación, utilizando como agente
de ligación el glutaraldehído, teniendo como soportes membranas de nylon 66 y esferas
de quitosana. Para los parametros de inmovilización probados, la mayor eficiencia de
inmovilización fue alcanzada cuando fueron utilizadas las membranas de nylon como
soporte. Se obtuvieron eficiencias, aproximadamente, 3 veces superiores a las obtenidas
cuando la inmovilización se dio en esferas de quitosana. La hidrólisis que ocurre en la
superficie de la membrana de nylon es la subsecuente activación de esa superficie con
glutaraldehído antes de la reticulación promovieron un aumento de 50% en la eficiencia
de inmovilización, cuando comparada con la adsorción física seguida da reticulación.
Agradecimientos: Los autores agradecen al CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) por el apoyo y las becas concedidas.
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