Download Detección de una cepa de Escherichia coli productor de

Resumen: V-023
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005
Detección de una cepa de
Escherichia coli productor de verotoxina*
Cicuta, María E. - Deza, Natalia - Roibón, Walter R. - Pereyra, D.
Benitez, María C. - Arzú, Ricardo O. - Boehringer, Silvia I.
Cátedra de Microbiología, FCV/UNNE
Sgto. Cabral 2.139, Corrientes Tel/Fax 03783- 425753 – 420854, Interno 165. E-mail: [email protected]
Servicio Fisiopatogenia, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
Av. Vélez Sarsfield 563 (1281), Buenos Aires.E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
El desarrollo de metodologías moleculares para la detección de microorganismos patógenos en alimentos, ha
permitido el mejoramiento en el diagnóstico y determinación de riesgos en salud pública asociados con el consumo de
los mismos.
Escherichia coli productor de verotoxina (ECVT) o toxina Shiga (STEC) se presenta asociado a la aparición de
síndrome urémico hemolítico (SUH). En Argentina, se estima que el 10% de los niños infectados con STEC
evolucionan a SUH. También se observaron evidencias de transmisión alimentaria por carnes mal cocidas.
Análisis retrospectivos de alimentos asociados con brotes de colitis hemorrágicas han revelado que la dosis
infectiva es muy baja; menos de cien bacterias. Entre 0,3 y 15 bacterias por gramo de ECVT O157:H7 fueron
detectadas en varios lotes de carne de vacuno congelada implicada en un brote importante ocurrido en EE.UU. En un
salami asociado con otro brote se detectaron de 0.3 a 0.4 células por gramo (Doyle, 1997).
Con tal motivo en el presente proyecto se propuso determinar la presencia de estos tipos bacterianos
verotoxigénicos a partir de hisopados superficiales de reses bovinas y diferentes partidas de carnes molidas listas para
expendio al consumidor provenientes de diversos establecimientos de las ciudades de Resistencia y Corrientes.
La caracterización final de estas cepas fue realizada en el Servicio de Fisiopatogenia del Instituto Nacional de
Enfermedades Infecciosas “Dr. Carlos G. Malbrán” utilizando PCR Múltiple para detectar los genes codificantes de las
toxinas Shiga y rfbO157. Se realizó también PCR para determinar el gen codificante de enterohemolisina (EHEC-hlyA)
y el gen eae que codifica la proteína intimina, todos atributos de virulencia de cepas enterohemorrágicas (EHEC), una
de las cuales es la O157:H7.
MATERIALES Y METODOS
El método de aislamiento utilizado en 107 muestras de hisopados de res y 66 de carne molida fue preenriquecimiento en agua peptonada con cefixima (37°C, 6 hs), repique en agar Mac Conkey y tipificación de las
colonias fermentadoras de lactosa a través del desarrollo en citrato de Simmons y en Lysine Iron Agar (LIA). Con esta
identificación previa se hicieron las pruebas de crecimiento en presencia de telurito de K, fermentación de sorbitol, y
detección de β-glucuronidasa. Conociendo que una de las características del serotipo O157:H7 es ser negativa a estas
dos últimas pruebas, pero debido a que otras cepas toxigénicas son positivas a las mismas, las 75 estirpes confirmadas
bioquímicamente como E. coli, 39 de las cuales fueron aisladas de reses bovinas y 36 de carnes molidas, se conservaron
en agar blando (0,4%) para su posterior tipificación molecular. La misma fue realizada en el Servicio de Fisiopatogenia
del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas “Dr. Carlos G. Malbrán”.
Los aislamientos fueron incubados en caldo tripiticasa de soya a 37ºC por 4 hs y luego en agar MacConkey
sorbitol (SMAC) a 37ºC por 18 hs. Se tomó muestra de la zona de cultivo confluente de la placa de SMAC, para la
extracción de ADN y posterior realización de la PCR múltiple para la detección de los genes stx1, stx2 y rfb O157 gen
involucrado en la biosíntesis del lipopolisacárido O157 (Paton et al,2001; Leotta et al, 2005). Los factores de virulencia
eae, saa (adhesina descripta en los STEC eae negativos, Karch et al, 2000) y EHEC-hly, de los aislamientos STEC
positivos, fueron caracterizados por PCR según lo descripto por Karch et al (1993), Paton et al (2001) y Schmidt et al
(1995). Las variantes de stx2 se determinaron por análisis de polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción
(RFLP) de los productos de amplificación obtenidos por PCR de una región de la subunidad B de la toxina según Tyler
et al , 1991. La detección del antígeno lipolisacárido se realizó con antisueros específicos O (Orskov, 1984). El
antibiotipo fue determinado según el método de Kirby Bauer para:
* Corresponde al PI 20/03: Escherichia coli verotoxigénicas, con especial referencia a O157:H7, en medias reses y
carne molida bovinas del nordeste argentino(SGCYT/UNNE, Res. N° 638/2003-CS)
Resumen: V-023
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005
ácido nalidixico, amikacina, ciprofloxacina, ampicilina,
cloranfenicol, colistin, estreptomicina, gentamicina,
nitrofurantoína, tetraciclina y trimetoprima-sulfametoxazol(NCCLS Standards Methods 2005). La hemolísis debida a
EHEC-enterohemolisina se detectó en placas de agar sangre con glóbulos rojos desfibrinados de oveja según lo
descripto por Lothar et al (1989).
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
De las 75 cepas analizadas sólo una, aislada de carne molida, resultó ser stx2-vha, no O157, móvil, eae (-),
EHEC- hlyA (-), sensible a todos los antibióticos testados, fermentadora de sorbitol, no desarrollando en presencia de
telurito y poseyendo la enzima β glucuronidasa, datos acordes con la no pertenencia al serotipo O157.
PCR Múltiple (rfb0157/stx1/stx2)
346 pb (stx2)
C37a C37a
259 pb (rfbO157)
2
1
933
control
positivo
130 pb (stx1)
stx2 (+)
PCR eae
PCR Enterohemolisina
C37a
1551 pb (EHEC-hlyA)
C37a
864 pb (eae)
1
1
2348/68
control
positivo
32511
control
positivo
eae (-)
PCR saa
saa (-)
C37a
119 pb (saa)
434-1
Control
positivo
Control negativo
(sin templado)
E-hlyA (-)
Resumen: V-023
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005
Determinación de la variante stx2 (PCR-RFLP)
285pb
216pb
285pb
285pb
161pb
933
control
stx2 only
C37a
159pb
124pb
124pb
80/69pb
216pb
161pb
136pb
126pb
80/69pb
80/69pb
32511
control
stx2vh-a
93016
control
stx2vh-b
CONCLUSIONES
Se ha puesto especial énfasis en Escherichia coli productor de verotoxina (ECVT) perteneciente al serogrupo
O157, particularmente O157:H7, que ha estado asociado con la mayoría, pero no todos los brotes comunicados. Sin
embargo, son numerosos otros serotipos como en este caso, que han sido aislados de tanto pacientes en idénticas
condiciones a aquéllas causadas por las cepas O157 (diarrea con o sin sangre, disentería, enterocolitis, colitis
hemorrágica, necrótica, ulcerativa, edema intestinal), como así también de alimentos diversos, animales y medio
ambiente (Bettelheim, 2000).
BIBLIOGRAFÍA
1.
Bettelheim K.A. (2000) Serotypes of verotoxin-producing Escherichia coli reported in the literature apart
from
those
belonging
to
serogroup
O157.
MicroBionet.http://www.microbionet.com.au/frames/feature/vtec/intro.htm
2.
Beutin L, Montenegro MA, Orskov F, Orskov I, Prada J. Zimmermann S, Stephan R. (1989) Cloos
association of Verotoxin (Shiga-like toxin) production with enterohemolysin production in strains of
Escherichia coli. J Clin Microbiol. 1989; 27:2559-2564.
3.
Doyle,
4.
Karch H, Bohm H, Schmidt H, Gunzer F, Aleksic S, Heesemann J. (1993) Clonal structure and
pathogenicity of Shiga-like toxin-producing, sorbitol-fermenting Escherichia coli O157:H7. J. Clin.
Microbiol.; 31: 1200-5.
5.
Leotta GA, Chinen I, Epszteyn S, Miliwebsky E, Melamed IC, Motter M, Ferrer M, Marey E, Rivas M.
Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección de Escherichia coli productor de toxina
Shiga. Revista Argentina de Microbiología. 37: 1-10 2005.
6.
Lothar et al (11989) J Clin Microbiol., 27:2559-64.
M.P.
(1997).
Escherichia
coli
O157.
En:
Food
Microbiology.
ASM
Press.
Resumen: V-023
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005
7.
National Committee for Clinical Laboratory Standards (2004).Performance standards for antimicrobial
disk susceptibility tests, 8th ed., vol. 24, no. 1. Approved standard M100-S13. National Committee for
Clinical Laboratory Standards, Wayne, P.A.
8.
National Committee for Clinical Laboratory Standards (2004). Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing; Thirteenth Informational Suplement. 8th ed., vol. 24, no. 1. Approved standard
M100-S13. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, P.A..
9.
Orskov F, Orskov I. (1984) Serotyping of Escherichia coli. In T. Bergan (ed), Methods in Microbiology,
Academic Press, London, 14: 43 112 .
10. Paton AW, Srimanote P, Woodrow MC, Paton JC. (2001) Characterization of
Saa, a novel
autoagglutinating adhesin produced by locus of enterocyte effacement-negative Shiga-toxigenic
Escherichia coli strains that are virulent for humans. Infect. Immun. 69: 6999-7009.
11. Paton A, Paton J. (1998) Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using
Multiplex PCR assays for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and rfbO157. J.
Clin. Microbiol. 36: 598-602.
12. Schmidt H, Beutin L, Karch H. (1995) Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of
Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933. Infect. Immun. 63: 1055-61.
13. Tyler SD, Johnson WM, Lior H, Wang G, Rozee KR. (1991) Identification of verotoxin type 2 variant B
subunit genes in Escherichia coli by the polymerase chain reaction and Restriction fragment length
polymorphism. J. Clin. Microbiol. 29: 1339-43.