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PID 9049
Detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga a partir de bovinos,
agua ambiental y muestras clínicas (Gualeguaychú, Entre Ríos)
Tanaro J.D.*; Leotta G.A.**; Lound L.H.*; Deza N.**; Ledri S.E.*; Carbonari C.**; Piaggio M.C.*;
Rivas M..**
Autores: * Facultad de Bromatología UNER (Gualeguaychú, Argentina); ** Servicio de Fisiopatogenia INEI ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” (Buenos Aires, Argentina)
Contacto: [email protected]
Resumen
Desde setiembre/2005 hasta agosto/2006 se investigó Escherichia coli productor de toxina Shiga
(STEC), en 288 muestras de hisopados rectales bovinos y 79 de cursos de agua de un
establecimiento rural próximo al casco urbano de la ciudad de Gualeguaychú, y en heces diarreicas
con evidencia de sangre de 30 niños que concurrieron en ese mismo período al hospital local. En
135 (46,9%) de las muestras animales, se detectaron los genes stx1 y/o stx2, en tanto que en 9
(3,1%) se detectó la presencia de los genes rfbO157, stx1 y/o stx2, y se aislaron 11 cepas que portaron
los genes rfbO157, stx1 y/o stx2. En 26 (32,9%) de las muestras de agua, se detectaron los genes stx1
y/o stx2, y en 4 (5,1%), rfbO157/stx1 y/o stx2, y se aislaron 4 cepas STEC, dos portadoras del gen stx2,
una de stx1/stx2 y una de stx2/rfbO157/eae/ehxA/fliCh7. No hubo aislamientos de STEC en muestras
clínicas dentro del lapso en estudio. Se observó una marcada diferencia entre las cepas obtenidas
del agua y de los bovinos en lo que respecta a la frecuencia del serotipo O157:H7, y a la portación
de factores de virulencia. No se aislaron cepas en un tercio de las muestras acuáticas positivas al
tamizaje por PCR. Se confirmó en bovinos criados a campo una importante prevalencia de STEC.
En el presente muestreo no pudo verificarse ningún clúster de origen mixto (animal y ambiental) de E.
coli O157, pero sí la presencia de dos cepas STEC no-O157 (O124:H19) con patrón XbaI-PFGE
indistinguible aisladas a partir de hisopos rectales y el agua con un intervalo de 5 meses con genotipo
stx1/stx2/saa/ehxA. Algunos patrones XbaI-PFGE identificados en el presente estudio fueron idénticos
a los perfiles de cepas aisladas de humanos, alimentos y fuentes de origen animal incluidas en la
Base de Datos de PulseNet Argentina.
Palabras clave: Escherichia coli, toxina Shiga, agua, bovinos, SUH.
I. Introducción
Escherichia coli es un comensal habitual del intestino de animales de sangre caliente. Pero
también es el agente productor de infecciones urinarias más frecuentes, puede causar sepsis y
meningitis neonatal y, como patógeno gastrointestinal, exhibe una diversidad de mecanismos
patogénicos. Las cepas que provocan enfermedad diarreica se clasifican actualmente en seis
diferentes categorías basadas en los factores de virulencia que portan, en los mecanismos de
patogenicidad, los síndromes clínicos que generan, y los antígenos somáticos y flagelares. Para
establecer algunas de ellas se apela a técnicas microbiológicas sofisticadas que exceden la
capacidad de diagnóstico de los laboratorios microbiológicos de rutina.
E. coli enterohemorrágico (EHEC) es un subgrupo dentro de E. coli productor de toxina Shiga
(STEC), que además de la capacidad de producir toxinas, poseen adhesinas para colonizar el
intestino y otros factores de virulencia.
Para establecer las diferencias en la virulencia de las cepas STEC, Karmali et al. (2003)
establecieron cinco seropatotipos basándose en la incidencia de los distintos serotipos en
+6enfermedad humana, y la relación de los diferentes serotipos con perfiles genéticos
característicos. Los seropatotipos más virulentos están asociados a brotes epidémicos y a
enfermedad humana severa, consistente en microangiopatías trombóticas. Estas son desórdenes
oclusivos microvasculares que se caracterizan por la agregación sistémica o intrarrenal de plaquetas,
con trombocitopenia y lisis de eritrocitos. En el síndrome urémico hemolítico (SUH), los trombos
fibrino-plaquetarios se depositan predominantemente en la circulación renal (Elliott y Nichols, 2001).
Universidad Nacional de Entre Ríos. ISSN 2250-4559. Eva Perón 24; 3260 FIB Concepción del Uruguay, Entre Ríos, Argentina.
Tel: 54-03442-421558/421530, http://www.revistacdyt.uner.edu.ar/suplemento/
En la púrpura trombótica trombocitopénica (PTT), la agregación microvascular generalizada de las
plaquetas produce isquemia en distintos órganos, con predominio del cerebro.
El fenómeno de emergencia de nuevos patógenos se relaciona con múltiples factores:
cambios ambientales, tecnológicos, socioculturales y a la evolución misma de los microorganismos.
La virulencia está asociada a la presencia de ciertos genes que pueden adquirirse por transferencia
horizontal de elementos genéticos móviles (plásmidos, fagos lisogénicos, etc.) y por evolución de islas
de patogenicidad cromosómicas, de modo que aparecen ventajas adaptativas.
Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) emergentes, en particular, están
asociadas a múltiples cambios globales:
crecimiento poblacional y pobreza, urbanización
desordenada, incremento del comercio, nuevos productos alimenticios y tecnologías de
procesamiento, el uso de sistemas de distribución rápida de alimentos, cambios de hábitos y
tendencias de consumo, la existencia de poblaciones especialmente susceptibles.
Escherichia coli O157:H7 fue reconocido entre los agentes de enfermedades transmitidas por
alimentos (ETA) emergentes cuando se asoció este serotipo con dos brotes de colitis hemorrágica en
1982 (Centers for Disease Control, 1982). Luego se observó que compartiendo similar potencial
patogénico existen más de 150 serotipos.
La aparición de este patógeno con particulares características, como una baja dosis infectiva
y tolerancia a los ácidos, condujo a una revisión de los conceptos aceptados sobre
tiempo/temperatura y acidez para preservar los alimentos de gérmenes nocivos y dio origen a una
nueva legislación. En 1994, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) obligó a
etiquetar los alimentos en relación al manejo sanitario de productos cárnicos y avícolas, y luego
reglamentó el sistema de Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP), requiriendo que
muchas compañías incluyan EHEC al identificar los peligros en sus planes HACCP. La nueva
legislación otorgó a USDA competencia para retirar productos del mercado y se realizaron grandes
decomisos por detección de E. coli O157:H7.
En mayo de 2004 se incluyó en el Código Alimentario Argentino el artículo 156 tris y se
modificaron los artículos 255 y 302, que contemplan la detección de E. coli O157:H7/NM en 5
muestras de 65 g cada una, en productos preparados a base de carne picada una vez cocidos, en
carne picada fresca y chacinados frescos, recomendando utilizar la metodología validada por
USDA/FSIS.
Escherichia coli O157:H7 tiene alto impacto en nuestro país. El SUH post-entérico es endémico
en Argentina. La incidencia estimada oscila entre 9,2 y 13,9 casos por cada 100.000 niños menores
de 5 años, con una mortalidad de 3,4% (2005), y más de 7.000 casos han sido registrados desde
1965. En fechas recientes se ha visto un aumento de casos en adultos y jóvenes.
Los costos económicos son muy altos, e incluyen tanto los de internación como la atención
posterior de los pacientes con secuelas, la pérdida de días laborales de los adultos, etc. Un estudio
realizado en el Hospital Nacional de Pediatría “Prof. Dr. Juan P. Garrahan” (Caletti, María Gracia,
Servicio de Nefrología, Hospital Garrahan, 2006) demostró el elevado costo para tratar 213 casos de
SUH durante el año 2005. Por otro lado, existen consecuencias comerciales en la exportación de
productos agropecuarios.
Las enfermedades causadas por STEC son zoonosis, más precisamente ántropo-zoonosis,
enfermedad humana que puede transmitirse de animales a personas. La vía de infección es fecaloral. La muy baja dosis infectiva -10 a 100 bacterias por gramo de alimento- permite la transmisión
por contacto directo con animales y la interpersonal. A diferencia de Shigella (con la cual comparte
poseer una muy baja dosis infectiva), los brotes ocurren sin extenderse al resto de la comunidad, y
dentro de las Enfermedades Emergentes, se la considera de aquéllas que causan brotes
autolimitados. La ecología de este patógeno no ha terminado de comprenderse en su totalidad
aunque hay también muchos ítems aceptados sobre la vía de transmisión y el reservorio:
- Los vehículos alimenticios son muy diversos (productos cárnicos insuficientemente cocidos,
vegetales crudos, jugos no pasteurizados, etc.).
- Su baja dosis infectiva permite la infección por contacto de portadores, posiblemente la principal vía
que infecta a los lactantes.
- Tiene una peculiar resistencia, que permite su supervivencia en alimentos ácidos (embutidos
fermentados, etc.)
- El principal reservorio de la bacteria son los rumiantes (aunque hay portadores humanos y
animales).
En distintos países, entre los que se incluye a la Argentina, se realizaron numerosos estudios
sobre la prevalencia de STEC que permitieron confirmar el rol del ganado vacuno como principal
reservorio. La bacteria no es patógena para el ganado, con excepción de casos en neonatos bovinos.
La colonización es de menos de 2 meses de duración y la portación fecal es más frecuente en el
TANARO, J.D. et al. Detección de Escherichia coli
…
ganado joven (2 a 24 meses) que en el ganado adulto. Las ovejas y las cabras también son
reservorios de STEC, pero además se los ha encontrado en forma transitoria en multitud de animales
silvestres y de corral, como cerdos, caballos, aves e inclusive mascotas habituales como perros y
gatos.
El agua es uno de los vehículos de transmisión de STEC al ser humano, en forma directa o
indirecta (Hrudey et al., 2003; Geldreich et al., 1992; Swerdlow et al., 1992). Puede sobrevivir en
vegetales frescos contaminados por la fertilización de los cultivos con materia fecal animal utilizada
como abono, o por agua de regadío contaminada. Pero también puede ser ingerida desde aguas
recreacionales. En el 2003, ocurrió un brote en la ciudad de Paraná, Entre Ríos, donde cuatro niños
que se bañaban en una pileta presentaron diarrea sanguinolenta (uno con SUH), pudiéndose aislar E.
coli O157:H7.
¿Cuánta importancia tiene el agua en la permanencia del patógeno en el reservorio? Las aguas
superficiales contaminadas con las heces del ganado son una vía de diseminación entre los animales.
Tradicionalmente, la presencia de E. coli en agua se consideró como un indicador de contaminación
fecal reciente (Standard methods for the examination of water and wastewater. 1998), suponiendo la
difícil supervivencia en el ambiente extraintestinal. Sin embargo, hoy se sabe que esta bacteria puede
permanecer en fase estacionaria durante largos periodos de tiempo en el medio ambiente, para lo
cual estarían implicados genes como el rpoS, que codifica para el Factor σ (Sigma), que controla
regulones específicos que se activan en determinadas condiciones de estrés (Paton et al., 1998a).
Esto ha conducido a proponer al medio acuático como un potencial reservorio de E. coli (Lee Lang
et al.,1994; Grant et al.,1996; Kurokawa et al.,1999). Debe, además, considerarse que los fagos libres
en el medio acuático son un reservorio de los genes de virulencia.
Existe un consenso sobre la dificultad de lograr la erradicación completa de los animales
portadores de STEC, entre otras causas debido a la naturaleza transitoria de la infección en un rodeo
y a la dificultad en la detección en las heces animales con bajos números de STEC (Caprioli et al.,
2005). Se han hecho diversas recomendaciones acerca de la sanitización de los abrevaderos como
forma de prevenir el contagio. Esas estrategias válidas, donde los animales tienen restringido su
movimiento, pueden ser muy poco efectivas en otros contextos de producción donde los animales se
desplazan libremente. Por ejemplo, en el área donde se realizó este estudio, con charcos o lagunas
accesibles a los animales.
II. Objetivos
-Aislar y caracterizar durante un año cepas STEC en bovinos de engorde en un establecimiento del
Departamento Gualeguaychú, y en cursos de agua en la misma área de cría.
-Aislar y caracterizar eventuales cepas de STEC de origen clínico en el Departamento citado.
III. Materiales y métodos
III.1. Área de estudio y período de muestreo
El campo en el cual se realizó el estudio tiene una superficie de 80 hectáreas. Ubicado entre la
ciudad de Gualeguaychú, de la cual está separado por un parque y el río homónimo, y el municipio de
Pueblo General Belgrano. En las proximidades se encuentra un centro turístico termal.
Hay dos pequeños cursos de agua, uno dentro del campo y otro por afuera, pero que por el
declive del terreno recibe las escorrentías posteriores a las precipitaciones pluviales.
Los animales se crían con un sistema de pastoreo diurno en áreas de delimitadas por
alambradas eléctricas y suplementos dietéticos (granos, fibras y núcleo proteínico) que se
proporcionan en corrales de encierro nocturno. El número permanente de bovinos es de unos 150, los
cuales se compran en forma aleatoria en subastas, según criterios de conveniencia comercial. En
general se trata de animales en torno a los dos años de edad, que permanecen en el establecimiento
hasta alcanzar un peso mínimo de unos cuatrocientos kilogramos, luego de lo cual son faenados en
un frigorífico local.
El muestreo se realizó en el curso de un año, desde septiembre de 2005 hasta agosto de 2006.
III.2. Procesamiento de las muestras
La búsqueda de E. coli O157:H7/NM se basó en lo que se considera la técnica Gold Standard,
la separación inmunomagnética (IMS), y se usaron caldos de enriquecimiento adicionados de
inhibidores de otros gérmenes asociados. Para el aislamiento de colonias presuntivas se utilizaron
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dos medios sólidos, uno cromogénico, O157:H7 ID™ (bioMerieux, Marcy-l’Etoile, Francia), y agar
MacConkey sorbitol (Biokar) adicionado de telurito de potasio y cefixima (TC-SMAC) (bioMerieux)..
La búsqueda de STEC, a partir de colonias presuntivas en placas de agar MacConkey, se basó
en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) como medio de tamizaje y para establecer los
diversos factores de virulencia.
Macrorrestricción y electroforesis de campo pulsado
Esta metodologia (Strockbine et al., 1989) permite observar el polimorfismo genético existente
en una población bacteriana, a través de diferencias en los patrones de restricción del ADN
genómico. Se basa en la utilización de enzimas de restricción de corte poco frecuente, que generan
diez a veinte fragmentos grandes (de 40 a 500 kb), los cuales son luego separados por la aplicación
de campos eléctricos alternados durante la electroforesis. En este trabajo se utilizó el protocolo
estandarizado de la red PulseNet América Latina, que usa como marcador molecular Salmonella
Braenderup H9812. El análisis de los patrones moleculares individuales se realizó con el programa
informático BioNumerics versión 3.0 (Applied Maths BVBA, Kortrijk, Bélgica) y en la interpretación se
siguieron los criterios de Tenover (número de bandas de diferencia para definir clonalidad) (Tenover
et al., 1995).
III.2.1. Muestras de ganado bovino
a. Tamaño y distribución de las muestras
Para establecer el número de animales a estudiar se utilizó el programa Epi Info versión 6 (Dean et
al., 1996). Para disponer de una muestra estadísticamente significativa se asumió una prevalencia de
STEC O157 del 10% (Meichtri et al., 2004, Hancock et al., 1994, Keene et al., 2006), un nivel de
confianza del 95%, y un error del 5%, sobre una población constante de 150 animales por estación. El
tamaño de muestra calculado fue de 72 animales por estación. Las muestras fueron tomadas en el
primer mes de cada estación. En el transcurso del año de estudio (septiembre/2005-agosto/2006) se
analizaron un total de 288 muestras.
b. Obtención de las muestras
Las muestras se obtuvieron mediante hisopados rectales (Rice et al., 2003).
c. Procesamiento
Se estriaron por agotamiento placas de agar MacConkey, las cuales fueron incubadas a 37ºC durante
24 h. Luego los mismos hisopos fueron colocados en tubos con 15 ml de caldo EC modificado
(Biokar) con novobiocina 20 mg/l (Sigma Chemical co. St. Louis, USA) (ECm+N) e incubados a 42ºC
por 24 h. Posteriormente, se realizaron pools cada tres de los caldos enriquecidos, y se procesó 1 ml
de éstos acorde con la metodología basada en la separación inmunomagnética (Wright et al.,1994).
Para la detección de E. coli O157 se utilizaron perlas inmunomagnéticas (DYNABEADS® DYNAL,
Compiàgne, Francia). Finalmente, se obtuvieron 100 µl del concentrado, los cuales fueron sembrados
por agotamiento en placas de O157:H7 ID™ (bioMerieux, Marcy-l’Etoile, Francia), y agar MacConkey
sorbitol (Biokar) adicionado de telurito de potasio y cefixima (TC-SMAC) (bioMerieux). Una vez
obtenidos los aislamientos presuntivos, se realizaron las siguientes pruebas: agar hierro tres azúcares
(T.S.I.) (Biokar), medio sulfuro-indol-movilidad (S.I.M.) (Laboratorio Britania, Buenos Aires, Argentina)
y seroagrupamiento O157 presuntivo en portaobjetos utilizando antisuero específico provisto por el
Servicio Sueros y Antígenos (INPB – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”).
Paralelamente, se realizaron pools de diez colonias presuntivas de las placas de MAC en un tubo con
tritón 1X, a la vez que se repicaron en una placa de agar MacConkey grillada. Cada pool y una
ansada de la zona confluente de la primer estría fueron analizados por PCR múltiple para la detección
de los genes stx1, stx2, y rfbO157 (Leotta et al.,2005). Se utilizaron los cebadores diseñados por Pollard
et al. (Pollard et al.,1990), que amplifican un fragmento de 130 pb de la región del gen stx1,
correspondiente a la subunidad B para Stx1, y un fragmento de 346 pb de la región del gen stx2,
correspondiente a la subunidad A para Stx2, y los cebadores diseñados por Paton et al. (Paton et al.,
1998b), que amplifican un fragmento de 259 pb del gen rfbO157 correspondiente a una proteína
involucrada en la síntesis del LPS O157. En la Figura 1 se presentan las secuencias de cada uno de
los cebadores utilizados. A partir de las placas grilladas, y por PCR múltiple, se identificaron las
colonias portadoras del gen rfbO157 de cada uno de los pools positivos (Figura 1).
TANARO, J.D. et al. Detección de Escherichia coli
…
Tabla 1. Secuencia de cada uno de los cebadores utilizados
Figura 1. Procesamiento de las muestras colectadas de bovinos
________Hisopado rectal ________
↓
↓
Placa de MAC a 37ºC 24 h
15 ml ECm+N a 42ºC 24 h
↓
↓
IMS a 1 ml
↓
TC-SMAC + ID ó CHR
Colonias presuntivas
↓
Caracterización fenotípica y genotípica ←
PCR-múltiple
PCR-múltiple
Zona de confluencia + pooles
hasta obtener cepas aisladas
↓
Ciencia, Docencia y Tecnología Suplemento | Año III | Nº 3 | 2013
III.2.2. Muestras de agua ambiental
a. Obtención de las muestras y procesamiento
Entre septiembre de 2005 y agosto de 2006 se tomaron 79 muestras de agua. La frecuencia de
muestreo fue semanal, eligiendo en los días lluviosos, dos o más puntos correspondientes a
pequeños vertederos que drenan el agua que se acumula en el campo en estudio. Las muestras se
tomaron con hisopos de Moore (OPS, 1997), los cuáles se colocaron en los cursos de agua, de a
pares y durante 24 h. Los hisopos de cada punto de muestreo fueron paralelamente colocados in situ
en frascos con 100 ml de caldo ECm+N (Biokar) y de caldo EC. Luego, fueron transportados hasta el
laboratorio, donde se incubaron, respectivamente, a 42ºC y a 37ºC durante 24 h.
La búsqueda, el aislamiento y la caracterización de E. coli O157:H7/NM y de cepas STEC se
realizó a partir del caldo enriquecido según la metodología descripta en el punto III.2.1.c. (Figura 2).
Figura 2. Procesamiento de las muestras de agua ambiental
________Hisopos de Moore_______
↓
↓
100 ml EC a 37ºC 24 h
100 ml ECm 42ºC 24 h
↓
↓
Placa de MAC a 37ºC 24 h
Zona de confluencia + pooles
hasta obtener cepas aisladas
↓
IMS a 1 ml
↓
TC-SMAC + ID ó CHR
colonias presuntivas
↓
Caracterización fenotípica y genotípica ←
PCR-múltiple
III.2.3. Muestras clínicas
a. Obtención de las muestras y procesamiento
Se estudiaron todas las muestras fecales pediátricas provenientes de niños con diarrea
sanguinolenta que concurrieron al hospital Centenario de Gualeguaychú en el lapso mencionado de
muestreo. El procesamiento se resume en la Figura 3.
Figura 3. Procesamiento de las muestras clínicas
Diarreas con sangre eventuales durante un año (+ AH ó T ó FR)
________________________(Transporte em Cary Blair)_______________
↓
↓
↓
Placa EMB
15 ml ECm+N a 42ºC 24 h
Placa MAC
Inc. a 37ºC 24 h
IMS a 1 ml
Inc. a 37ºC 24 h
↓
↓
↓
Placa SMAC (grillada)
Placa SMAC (por agotamiento)
PCR múltiple
↓
↓
de zona confluente
Confirmación bioquímica
← colonias presuntivas
y pooles hasta
obtener cepas aisladas
↓
↓
Caracterización fenotípica y genotípica
AH: Anemia hemolítica
T: Trombocitopenia
FR: Fracaso renal
III.3. Caracterización de los aislamientos
TANARO, J.D. et al. Detección de Escherichia coli
…
III.3.1. Caracterización fenotípica
Se realizó mediante: a) características tintoriales, morfológicas y bioquímicas (Edwards y Ewing,
1984); b) serotipificación de antígeno somático O157 y flagelar H7; c) citotoxicidad específica en
células Vero, y d) sensibilidad a antibióticos.
Se realizaron las siguientes determinaciones: catalasa, citocromo oxidasa (Mac Faddin, 1980), rojo de
metilo (Becton Dickinson), Voges Proskauer (Becton Dickinson), agar triple azúcar hierro (Britania), βD glucuronidasa (MUG) (Lab. Biokar), β-galactosidasa (Laboratorio Britania, Buenos Aires,
Argentina), utilización de citrato (Britania) y de acetato (Britania), producción de pigmento (Britania),
urea (Becton Dickinson), lisina decarboxilasa (agar lisina hierro, Britania), ornitina decarboxilasa
(Britania), indol (agar sulfuro indol movilidad, Britania), movilidad (agar sulfuro indol movilidad,
Britania), y producción de enterohemolisina mediante la prueba de hemólisis en agar sangre ovina
suplementada con cloruro de calcio (Sigma) (Beutin et al.,1989). Cada aislamiento fue inoculado en
caldo base rojo de fenol (Becton Dickinson) conteniendo 1% de los siguientes carbohidratos (ICN
Biomedicals Inc, Costa Mesa, EE.UU.): glucosa, lactosa, sacarosa, rafinosa, ramnosa, sorbitol,
dulcitol y celobiosa.
A los aislamientos identificados como E. coli portadores del gen rfbO157 y seroagrupamiento O157
positivo, se les realizó la serotipificación confirmatoria utilizando antisueros somático (O157) y flagelar
(H7), según la metodología propuesta por Ørskov y Ørskov (1984). Previo a la serotipificación flagelar,
se realizó la estimulación de la movilidad en medio de Craigie (Manual de Procedimientos para la
detección de Escherichia coli O157 y no-O157 en alimentos por separación inmunomagnética y PCR.
Servicio Fisiopatogenia. Dpto. de Bacteriología. INEI – ANLIS. 2005). Los antisueros fueron provistos
por el INPB – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”.
Para estimular la producción de las toxinas, en el ensayo de citotoxicidad con células Vero, se usó el
sobrenadante y el extracto del periplasma celular (Karmali et al., 1985), utilizando anticuerpos
monoclonales específicos para Stx1 y Stx2 (Mab 13C4 and BC5BB12, respectivamente), provistos
por la Dra. N. A. Strockbine, del Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, EE.UU.
(CDC).
Se determinó la susceptibilidad de los aislamientos a diferentes antimicrobianos mediante la técnica
de difusión en agar (según normas recomendadas por CLSI/NCCLS (Clinical and Laboratory
Standards Institute/ National Committee for Clinical Laboratory Standards). Se utilizaron los siguientes
antimicrobianos (Laboratorio Britania): ampicilina (AMP), ampicilina-sulbactama (AMS), piperacilina
(PIP), piperacilina-tazobactama (P/T), cefalotina (CEF), cefoxitina (CXT), cefuroxima (CFU),
cefotaxima (CTX) ó ceftriaxona (CRO), ceftacidima (CAZ), cefepime (CFP), imipenem (IMP) o
meropenem (MER), ácido nalidíxico (NAL), norfloxacina (NOR) o ciprofloxacina (CIP), trimetoprimasulfametoxazol (TMS), nitrofurantoína (NIT), gentamicina (GEN) o amicacina (AKN), cloranfenicol
(CMP), fosfomicina (FOS), tetraciclina (TET).
III.3.2. Caracterización genotípica
Se realizó mediante PCR para la detección de los genes eae, ehxA, saa, fliCH7, y las variantes de Stx
por PCR-RFLP. Se utilizaron los cebadores propuestos por Karch et al. (1993), que amplifican un
fragmento de 864 pb de la región conservada del gen eae para EPEC y EHEC. Los cebadores
propuestos por (Schmidt et al., 1995), que amplifican un fragmento de 1551 pb del gen ehxA que
codifica para la enterohemolisina (EHEC-hly). Los cebadores propuestos por Paton et al. (2001), que
amplifican un fragmento de 119 pb del gen saa. Los cebadores propuestos por Gannon et al.(1997),
para amplificar un fragmento de 625 pb del gen fliCh7. En la Figura 1 se presentan las secuencias de
cada uno de los cebadores utilizados. Se procedió de acuerdo a los protocolos puestos a punto en el
Servicio Fisiopatogenia (Manual de Procedimientos “Detección de Escherichia coli O157 y no-O157
en alimentos por separación inmunomagnética y PCR”. 2005. Servicio Fisiopatogenia. Dpto. de
Bacteriología. INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Buenos Aires, Argentina).
Para la caracterización genotípica de stx2 se utilizó la técnica de PCR-análisis del polimorfismo de
longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP) (16c), obtenidos por restricción enzimática con
Haelll, Rsal y Ncil del amplicón correspondiente a una PCR que utiliza cebadores que amplifican un
fragmento de 285 pb de la región del gen correspondiente a la subunidad B para stx2 y para las
variantes stx2vh-a y stx2vh-b. Simultáneamente a la PCR mencionada, se realiza una segunda PCR.
Ambas difieren en que la segunda amplifica a partir de los genes stx2vh-a y stx2vh-b, y la primera a partir
de los genes stx2, stx2vh-a y stx2vh-b, de modo que nos permite discernir según obtengamos los dos
amplicones (285 y 385 pb) o uno solo (285), si existen variantes o se trata de stx2, en cuyo caso no se
procede al segundo paso consistente en la digestión enzimática.
Para determinar stx1 y stx1c por PCR-RFLP, se utilizaron oligonucleótidos iniciadores que amplifican
un fragmento de 282 pb de la región del gen correspondiente a la subunidad B para stx1 y stx1c. Luego
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se determinó la variante de stx1 por análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de
restricción obtenidos con HhaI del producto de amplificación de 282 pb.
IV. Resultados
IV.1. Muestras de ganado bovino
IV.1.1. STEC
Sobre un total de 288 muestras de hisopados rectales de origen bovino, en 135 (46,9%) se detectó la
presencia de los genes stx1 y/o stx2 por PCR.
En la primera estación muestreada (primavera/2005) el tamizaje por PCR fue positivo en 17/65
(26,2%) muestras, y en las siguientes fue de 31/69 (44,9%), 36/73 (49,3%), y 51/81 (63,0%),
respectivamente.
En todas las muestras bovinas positivas al tamizaje por PCR se logró un buen porcentaje de
recuperación de cepas, que fue para cada estación de 88,2% (15/17), 83,9% (26/31), 77,8% (28/36),
y 88,2% (45/51) (Tabla 2 y Figura 4).
Tabla 2. Muestras de origen bovino positivas y negativas al tamizaje por PCR para los genes
stx1 y/o stx2 con o sin aislamientos.
Primavera
Verano
Otoño
Invierno
Total
A
15
26
28
45
114 (39,6%)
B
2
5
8
6
21 (7.3%)
C
48
38
37
30
153 (53,1%)
Total
65
69
73
81
288
Ref.:
A. Muestras donde se detectaron los genes stx1 y/o stx2 con aislamiento de las cepas
B. Muestras donde se detectaron los genes stx1 y/o stx2 sin recuperación de las cepas
C. Muestras donde no se detectaron los genes stx1 y/o stx2
Figura 4. Porcentaje de detección de los genes stx1 y stx2 y de recuperación de cepas STEC de
las muestras bovinas
En 114 muestras sobre las 135 positivas al tamizaje por PCR, se lograron aislar 121 cepas que
portaron los genes stx1 y/o stx2, de las cuales 28 (23,1%) portaban stx1, 68 (56,2%) stx2. y 25 (20,7%)
de stx1 y stx2 simultáneamente (Tabla 3).
IV.1.2. STEC O157
Sobre un total de 288 muestras de hisopados rectales de origen bovino, en 9 (3,1%) se detectó la
presencia de los genes rfbO157, stx1 y/o stx2 por PCR.
TANARO, J.D. et al. Detección de Escherichia coli
…
En ninguna muestra se detectó el gen rfbO157 en la primera estación muestreada
(primavera/2005),. En las tres estaciones subsiguientes, las muestras con el gen rfbO157 acompañado
de los genes stx1 y/o stx2 (STEC O157) en relación a las totales donde se detectó el gen rfbO157
(incluyendo las no toxigénicas) fue de 1/2, 4/4, y 9/11, respectivamente.
En total, se aislaron 11 cepas que portaron los genes rfbO157, stx1 y/o stx2; de las cuáles 5
(45,5%) portaban stx2 y 6 (54,5%) stx1 y stx2 simultáneamente (Tabla 3).
IV.1.3. Caracterización fenotípica de los aislamientos
a. Características tintoriales, morfológicas y bioquímicas (Tabla 4)
Todos las cepas de E. coli aisladas de muestras bovinas fueron morfológicamente cocobacilos o
bacilos, gram negativo, crecieron en agar MacConkey redujeron el nitrato y dieron positivos la prueba
del rojo de metilo. El 97% produjo indol, un 98% decarboxiló lisina y un 81% ornitina. La movilidad se
observó en el 95% del total.
Ninguno dio positivo a la prueba de citocromo oxidasa, fenilalaninadeaminasa, arginina dehidrolasa,
ni produjo ácido sulfhídrico, acetoína, ni pigmento.
Un 95% fermentó lactosa, un 75% rafinosa, un 84% sorbitol, 97,5% fue β-galactosidasa positivo, y un
79% β-glucuronidasa positivo. Un 56% fue hemolítico.
La totalidad de los aislamientos de E. coli O157 fueron lactosa positiva en agar MacConkey,
citocromo oxidasa negativa y β-galactosidasa positiva. En agar TSI, todas las cepas fueron
fermentadoras y generadoras de gas, pero no productoras de ácido sulfhídrico. En el medio SIM,
todas las cepas fueron indol positivo, ácido sulfhídrico negativo, y una cepa no exhibió movilidad a las
24 h. Ninguna cepa produjo pigmento, y todas fueron positivas a la reacción de acidez persistente con
rojo de metilo, y decarboxilaron lisina y ornitina. Todas las cepas fueron negativas para las pruebas
de: producción de acetoína (VP), fenilalanina deaminasa, arginina dehidrolasa, ureasa, utilización de
citrato como única fuente de carbono, y fermentación de sorbitol. Diez cepas fueron β-D
glucuronidasa negativas. Siete cepas (63,6%) fermentaron rafinosa, pero ninguna dulcitol y Lrhamnosa, por lo tanto pertenecieron al biotipo C. Diez cepas (90%) produjeron enterohemolisina.
Ciencia, Docencia y Tecnología Suplemento | Año III | Nº 3 | 2013
b.Serotipificación
La serotipificación de las cepas STEC no-O157 no fue posible por requerir recursos económicos con
los que no se contaba. Diez de las 11 cepas que fueron positivas para el antígeno somático O157
fueron positivas a la prueba de aglutinación para la detección del antígeno H7, previa estimulación de
la movilidad.
c. Citotoxicidad específica en células Vero
En siete cepas portadoras de los genes stx1 y stx2 se confirmó la expresión de las toxinas Stx1 y Stx2
mediante la observación de citotoxicidad específica en células Vero. Tres cepas portadoras del gen
stx2 no produjeron efecto citopático en dicha línea celular. Una de las cepas no pudo caracterizarse
porque perdió viabilidad.
d. Sensibilidad a antibióticos (Tabla 5).
Todas las cepas identificadas como E. coli O157 fueron sensibles a: aminopenicilina sulbactama, El
5% fue resistente a ampicilina, 8% a piperacilina, 3% a cefalotina, 2% a ácido nalidíxico y a
tetraciclina.
Todas las cepas fueron sensibles al resto de los antibióticos que probados.
TANARO, J.D. et al. Detección de Escherichia coli
…
IV.1.4 .Caracterización genotípica de los aislamientos
En la Tabla 6 se presenta la frecuencia de genotipos detectados en las cepas STEC aisladas de
muestras de origen bovino y ambiental. En las 121 cepas de origen bovino, la frecuencia de genotipos
fue la siguiente: stx2 (36 cepas, 29,8%), stx2-saa-ehxA (24, 19,8%), stx1/2- saa-ehxA (17, 14,1%), stx1eae-ehxA (16, 13,2%), stx1 (10, 8,3%), stx1/2- rfbO157- eae-ehxA-fliCh7 (6, 5%), stx2- rfbO157- eae-ehxAfliCh7 (4, 3,3%), stx2-eae-ehxA (2, 1,7%), stx1-eae (1, 0,8%), stx1-ehxA (1, 0,8%), stx2- rfbO157- eae (1,
0,8%), stx2- ehxA (1, 0,8%), stx1/2 (1, 0,8%), y stx1/2-eae-ehxA (1, 0,8%).
El gen stx2 presentó numerosas variantes y asociaciones las cuales fueron en orden de frecuencia:
stx2 (33 cepas), stx2c (27 cepas), stx2d2 (15 cepas), stx2c + stx2d2 (6 cepas), 2+ stx2d2 (4 cepas),
2+ stx2c (2 cepas). Tres cepas resultaron no tipificables (NT). Las 52 cepas que portaban el gen stx1
tuvieron una única variante stx1.
IV.2. Muestras obtenidas de agua ambiental
IV.2.1. STEC
Sobre un total de 79 muestras de origen acuático, en 26 (32,9%) se detectó la presencia de los genes
stx1 y/o stx2 por PCR (Tabla 8).
Entre septiembre/2005 y agosto/2006, el tamizaje por PCR del muestreo mensual fue positivo en:
octubre/2005 66,7% (8/12), diciembre/2005 10% (1/10), enero/2006 50% (2/4), febrero/2006 28,6%
(2/7), marzo/2006 80% (4/5), junio/2006 28,6% (2/7), julio/2006 28,6% (2/7), agosto/2006 35,7%
(5/14). De las 26 muestras positivas al tamizaje, por PCR solamente en 4 (15,4%) se recuperaron los
aislamientos, respectivamente (Tabla 8 y figura 6).
De las 4 muestras positivas al tamizaje, por PCR se lograron aislar 4 cepas de las cuales tres
portaban stx2, y una stx1 y stx2 simultáneamente (Tabla 6).
IV.2.2. STEC O157
Sobre un total de 79 muestras de agua, en 4 (5,1%) se detectó la presencia de los genes rfbO157,
stx1 y/o stx2 por PCR (Tabla 9), una en diciembre/2005, dos en marzo/2006, y una en agosto/2006.
De estas muestras positivas al tamizaje solo se logró un aislamiento de una cepa, portadora de los
genes rfbO157 y stx2.
Ciencia, Docencia y Tecnología Suplemento | Año III | Nº 3 | 2013
Tabla 8. Muestras de origen acuático positivas y negativas al tamizaje por PCR para los genes
stx1 y/o stx2 con o sin aislamientos.
A
B
C
Total
SEPT
OCT
NOV
DIC
ENE
FEB
MAR
ABR
MAY
JUN
JUL
AGO
TOTAL
0
0
5
5
1
7
4
12
0
0
1
1
0
1
9
10
0
2
2
4
2
0
5
7
0
4
1
5
0
0
4
4
0
0
3
3
0
2
5
7
0
2
5
7
1
4
9
14
4 (5,1%)
22 (27,8%)
53 (67,1%)
79
Ref.:
A. Muestras donde se detectaron los genes stx1 y/o stx2 con aislamiento de las cepas
B. Muestras donde se detectaron los genes stx1 y/o stx2 sin recuperación de las cepas
C. Muestras donde no se detectaron los genes stx1 y/o stx2
Observaciones: El número de muestras tomadas mensualmente estuvo influido por limitaciones de índole meteorológico
Figura 6. Porcentaje de detección de los genes stx1 y stx2 y recuperación de cepas STEC de
muestras de agua
TANARO, J.D. et al. Detección de Escherichia coli
…
IV.2.3. Caracterización fenotípica de los aislamientos
a. Características tintoriales, morfológicas y bioquímicas (Tabla 3)
Los 4 STEC aislados de muestras de agua fueron morfológicamente cocobacilos o bacilos, gram
negativo, crecieron en agar MacConkey redujeron el nitrato y dieron positivos a la prueba del rojo de
metilo, produjeron indol, decarboxilaron lisina y ornitina, y resultaron móviles. Fermentaron lactosa,
rafinosa, y fueron β-galactosidasa positivo. Ninguno dio positivo la prueba de citocromo oxidasa,
fenilalaninadeaminasa, arginina dehidrolasa, ni produjo ácido sulfhídrico, acetoína, ni pigmento.
Las tres cepas STEC no-O157 fermentaron sorbitol, presentaron actividad β-glucuronidasa, y
dos resultaron hemolíticas. La cepa STEC O157 no fermentó sorbitol, no tuvo actividad βglucuronidasa, fue hemolítica, y se clasificó dentro del biotipo C (fermentó dulcitol y ramnosa).
b. Serotipificación
La serotipificación de los STEC no-O157 no fue posible por requerir recursos económicos con los que
no se contaba. La cepa que fue positiva para el antígeno somático O157 también lo fue a la prueba
de aglutinación para la detección del antígeno H7, previa estimulación de la movilidad.
c. Citotoxicidad específica en células Vero.
No se realizó
d. Sensibilidad a antibióticos
Todas las cepas fueron sensibles a los antibióticos que se probaron.
IV.2.4. Caracterización genotípica de los aislamientos
De las 4 cepas STEC aisladas, dos portaron solo el gen stx2 (una la variante stx2c y la otra stx2), una
los genes stx1, stx2, (variantes stx1 y stx2, respectivamente), saa, y ehxA y una los genes stx2, rfbO157,
eae-ehxA, y fliCh7. Esta última cepa presentó las variantes stx2+ stx2c (Tabla 6).
De las muestras de agua se aislaron E. coli O157 no toxigénicas; no así de las de los bovinos (Tabla
7).
IV.3. Muestras clínicas
No se realizaron aislamientos de STEC a partir de muestras clínicas en esta área geográfica, dentro
del lapso en estudio.
IV.4. Análisis de la diversidad genética y relación clonal
Por PFGE, los 18 aislamientos pertenecientes al serotipo O157:H7 se diferenciaron en 8 patrones
XbaI-PFGE conteniendo entre 16 y 21 bandas comprendidas en el rango de 36 – 582 kb. Todos
tuvieron un porcentaje de similitud igual o mayor a 75%. Se detectaron aislamientos con patrones de
restricción XbaI-PFGE idénticos*, los cuales fueron agrupados como grupo de aislamientos altamente
relacionados genéticamente o “clusters”. Se observaron 4 clusters y 4 cepas con patrones XbaI-PFGE
diferentes. Dos de éstas tenían un 85% de similitud con alguno de los clusters, respectivamente
(Figura 7 y Tabla 9).
Ciencia, Docencia y Tecnología Suplemento | Año III | Nº 3 | 2013
Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-98.3%]
PFGE-XbaI
100
95
90
85
80
75
PFGE-XbaI
795/06
796/06
845/06
794/06
1030/06
980/06
612/06 8
841/06 1.2.3
841/06 16b
841/06 2
867/06 31
867/06 31b
867/06 36
489/06 16
867/06 1.2.3
867/06 26
867/06 2b
848/06
1030/06 12
Figura 7: Patrones obtenidos por XbaI-PFGE de 18 aislamientos pertenecientes al
serotipo O157:H7
Tabla 9: Origen de las cepas E. coli O157 analizadas por PFGE
Fecha:
Origen:
Cepas
13/08/06
A: Canaleta de la bomba de agua
795/06
13/08/06
A: Arroyo externo
796/06
04/07/06
A: Vertedero Izquierdo
845/06
08/11/06
A: Arroyo externo
1030/06 – ∆12
05/10/06
A: Arroyo externo
980/06
02/05/06
Clusters
#I
# II
612/06 (8)
10/07/06
B
B
10/07/06
B
841/06 (16)b (16,17,18)
10/07/06
B
841/06 (2)
17/07/06
B
867/06 (31)
17/07/06
B
867/06 (31)b
17/07/06
B
867/06 (36) (34-35-36)
17/07/06
B
867/06 (1-2-3)
17/07/06
B
867/06 (26) (25,26,27)
17/07/06
B
867/06 (2)b
841/06 (1-2-3)
# III
# IV
Cepas independientes
13/08/06
A: Vertedero derecho
794/06
18/04/06
A:
489/06 (16)*(13,14,15)
04/07/06
A: Canaleta de la bomba de agua
848/06
08/11/06
A: Arroyo externo
1030/06 - ∆11
Referencias: A: cepas de origen acuático; B: cepas de origen bovino;
TANARO, J.D. et al. Detección de Escherichia coli
…
V. Discusión
La prevalencia de STEC en bovinos productores de carne de unos dos años de edad hallada
en este trabajo fue de 39,6%, en tanto que la prevalencia de STEC O157 en bovinos fue de 3,1%. La
comparación de estos valores con los múltiples informes existentes en la bibliografía se dificulta por
los distintos métodos de muestreo empleados y por la forma en que los autores expresan sus
resultados, y por el tipo de metodología utilizada en el procesamiento de las muestras.
Se observó una marcada diferencia en el número de cepas recuperadas en las muestras de
origen ambiental y animal, posterior a la detección por PCR múltiple (Tablas 1 y 8). Mientras que en
los hisopados rectales bovinos, las muestras donde se detectaron los genes stx1 y/o stx2 sin lograrse
aislamientos fueron el 7,3%, en el agua ambiental fueron el 27,8%. Esta dificultad para recuperar
cepasde muestras del medio acuático ambiental con tamizaje positivo podría atribuirse a que se
encuentren en un estado estacionario y en bajo número.
Todas las cepas de origen acuático fueron sensibles a los antibióticos ensayados. Las de
origen bovino fueron sensibles en general, exhibiendo cierta resistencia: a ampicilina (5%), a
cefalotina (2,5%), a ácido nalidíxico, nitrofuranos, gentamicina y tetraciclina (2%), a trimetoprimasulfametoxazol y piperacilina (1%). Dos cepas fueron resistentes simultáneamente a ampicilina más
cefalotina, y a ampicilina más tetraciclina.
También se observó una marcada diferencia entre las cepas obtenidas del agua y de los
bovinos en lo que respecta a la frecuencia del serotipo O157 y la asociación con el antígeno H7, y la
portación de factores de virulencia.
La variante prevalente en las STEC O157 obtenidas en este estudio fue stx2c, presente en el
100% de las cepas. En cambio, en las STEC no-O157, la variante predominante fue stx2, seguida de
stx2d2, y en último lugar stx2c.
Con excepción de una cepa bovina que solo tenía el gen eae, el resto de las cepas
toxigénicas portaron simultáneamente los genes eae, ehxA y fliCh7, entrando en la definición de
EHEC que hace la OMS (World Health Organization, 1997). El hecho de que la mayor proporción de
las cepas portaran el gen que codifica Stx2, toxina 100 a mil veces más potente que Stx1 muestra el
potencial riesgo sanitario, considerando que en Argentina el genotipo prevalente asociado a SUH es
stx2+stx2c. Puede observarse, además, que más de la mitad de las cepas bovinas pueden incluirse
dentro del seropatotipo A de Karmali et al. (2003), caracterizado por su alta incidencia en enfermedad
severa humana y su frecuencia común en la ocurrencia de brotes.
En el presente muestreo no pudo verificarse ningún clúster de origen mixto (animal y
ambiental) de E. coli O157, pero sí la presencia de dos cepas STEC no-O157 (O124: H19) con patrón
XbaI-PFGE indistinguible (clon) aisladas a partir de hisopos rectales y el agua con un intervalo de 5
meses con genotipo stx1/stx2/saa/ehxA.
Algunos patrones XbaI-PFGE identificados en el presente estudio fueron idénticos a los
perfiles de cepas aisladas de humanos, alimentos y fuentes de origen animal incluidas en la Base de
Datos de PulseNet Argentina.
También, hemos podido constatar fuera del período en estudio (Tanaro et al., 2002), la
presencia de cepas toxigénicas en los pequeños cursos de agua donde se realizó el muestreo y en
aguas abiertas del Río Gualeguaychú frente al casco urbano en zonas recreativas.
VI. Conclusiones
• Se confirmó, en bovinos destinados al consumo interno criados a campo, una prevalencia de
STEC O157 más alta que la descripta en trabajos previos realizados en Argentina, y se corroboró
una prevalencia de STEC semejante a la obtenida por otros autores.
• Los STEC fueron aislados de los bovinos en forma creciente durante el período muestreado y no
siguieron el patrón habitual de mayor prevalencia en los meses cálidos.
• La presencia de E. coli O157:H7 en bovinos se verificó en forma intermitente, durante el período
muestreado
• A diferencia de las muestras de origen animal, en las de origen acuático en un tercio de las
mismas donde se detectó por PCR los genes de las toxinas, las cepas no pudieron ser
recuperadas.
• Se aisló del medio acuático una sola cepa de E. coli O157:H7 productora de Stx2, que no estaba
relacionada genéticamente con las cepas bovinas.
• Hubo un importante número de cepas de E. coli O157 no toxigénicas aisladas de agua ambiental,
en contraste con las obtenidas de los animales, las cuales fueron todas STEC.
Ciencia, Docencia y Tecnología Suplemento | Año III | Nº 3 | 2013
• Los resultados del presente estudio refuerzan la hipótesis de estiércol como una fuente de
contaminación y la necesidad de establecer estrategias de control antes de la cosecha para
reducir la transmisión de este grupo de agentes patógenos.
VII. Referencias bibliográficas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
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Ciencia, Docencia y Tecnología Suplemento | Año III | Nº 3 | 2013