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Resumen: V-041
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Escherichia coli productor de toxina Shiga
en medias reses y carnes molidas bovinas*
1
3
1
Cicuta, María E. - Deza, Natalia - Roibón, Walter R.
1
4
2
Benitez, María C. - Ramírez, Gabriela V. - Arzú, R. O.
1.Cátedras de Microbiología - 2. Cátedra de Bromatología (FCV/UNNE),
Sgto. Cabral 2.139, Corrientes. Tel/Fax 03783- 425753 – 420854, Interno 165. E-mail: [email protected]
3.Servicio Fisiopatogenia , Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”,
Av. Vélez Sarsfield 563 (1281), Buenos Aires.E-mail: [email protected]
4.SGCYT/UNNE
ANTECEDENTES
Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC), es un patógeno emergente transmitido por alimentos,
asociado a casos esporádicos y a brotes de diarrea con o sin sangre, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico
(SUH) (Paton & Paton (1998).Desde su identificación como patógeno en 1982, STEC O157:H7 ha ocasionado una
serie de brotes, especialmente en Canadá, Japón, Reino Unido y Estados Unidos (Bettelheim, 2003; Karmali, 1989).
Los rumiantes en general, y el ganado vacuno en particular, han sido señalados como los principales reservorios de
STEC, el ganado ovino es también excretor de estos microorganismos (Padola et al., 2004; Blanco et al., 2004; Gómez
et al., 2002). Distintos alimentos como carne molida y productos cárnicos crudos o insuficientemente cocidos,
hamburguesas, embutidos fermentados, lácteos no pasteurizados, mayonesa, jugos de manzana no pasteurizados y
vegetales tales como lechuga, brotes de soja y alfalfa, entre otros, han sido señalados como fuente de contaminación en
casos esporádicos o brotes asociados a STEC, la bacteria es resistente a los ácidos y puede sobrevivir en alimentos
fermentados (Gómez et al., 2002). El ganado vacuno no es un huésped específico de STEC, en heces de animales sanos
se pueden aislar distintios serotipos de STEC O157 y no-O157 y un mismo animal puede portar más de un serotipo
(Hussein & Bollinger, 2005). Otras formas de transmisión son: la contaminación cruzada durante la preparación de los
alimentos, el contacto directo del hombre con animales, y persona a persona, por la ruta fecal-oral, debido a las bajas
dosis infectivas que posee este grupo bacteriano, ya menos de 100 bacterias por gramo de alimento puede causar
enfermedad (Paton & Paton, 1998; Karmali, 1989).
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método selectivo y sensible que amplifica regiones
específicas de un gen. Para minimizar tiempo y materiales, los cebadores o primers pueden ser combinados en una
reacción única (PCR múltiple) que puede detectar varios genes en una sola muestra (Watterworth et al., 2005; Paton &
Paton, 1998). Esta reacción ha significado un considerable avance sobre otros métodos de PCR para identificar STEC y
la mayoría de sus genes marcadores de virulencia incluyendo las variantes de la toxina Shiga (Osek, 2003). Esta técnica
ha sido validada por diversos autores (Leotta et al., 2005; Pollard et al., 1990) para el rápido diagnóstico de STEC
basada en la detección de los genes stx1, stx2 y rfbO157 para la confirmación de cepas STEC O157 y no- O157 a partir
de cultivos. El desarrollo de este método ha permitido la identificación simultánea de los tipos enterotoxigénicos
(ETEC), enteropatogénicos (EPEC), enterohemorrágicos (EHEC) y enteroinvasivos (EIEC) de E. coli (Rappelli et al.,
2001). Con esta técnica y tan sólo 12 horas de enriquecimiento en caldo, un mínimo de 0,5 unidades formadoras de
colonias (UFC) por gramo de carne molida puede ser detectada (Witham et al, 1996).
Si bien la mayoría de los estudios están orientados a la detección de E. coli O157, en la actualidad aumentaron
los esfuerzos para detectar los diferentes serotipos de STEC no-O157 (Bettelheim 2000, 2003) .En España (Blanco et
al., 2003), detectaron 13% de STEC en 455 muestras de carne cruda, aislando 1% de E. coli O157:H7 y 12% de STEC
no-O157. En Argentina se analizaron 279 muestras de carne, detectándose STEC O157:H7 en 3,8% de muestras de
carne picada, 4,8% de muestras de chorizo fresco y 3,3% de muestras de chorizo seco (Chinen et al., 2001). En el año
2003 se pudo establecer por primera vez en Argentina la asociación entre un caso esporádico de SUH y el consumo de
hamburguesas caseras contaminadas por STEC O157:H7 (Rivas et al., 2003a,b).
Visto que los perfiles de virulencia de Escherichia coli aisladas de hamburguesas y carne molida se
corresponden con los obtenidos de terneros y bovinos adultos (Parma et al.2000) y Argentina, con 300 casos por año
de SUH, tiene uno de los valores más altos registrados con una tasa de incidencia de 12,5/100.000 niños menores de 5
años (López et al., 1997; Gianantonio et al., 1973 y Rivas et al., 1996), el propósito del presente trabajo fue determinar
la presencia de E. coli productor de toxina Shiga en medias reses bovinas de plantas faenadoras y carnes procesadas en
lugares de expendio de las mismas, de las provincias de Chaco y Corrientes del nordeste argentino.
* Corresponde al PI 20/03: Escherichia coli verotoxigénicas, con especial referencia a O157:H7, en medias reses y
carne molida bovinas del nordeste argentino(SGCYT/UNNE, Res. N° 638/2003-CS)
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MATERIALES y MÉTODOS
En el período comprendido entre mayo de 2004 y julio de 2006 se analizaron 240 muestras de carne molida y
147 hisopados de reses bovinas. Cada unidad de carne picada se conformó de acuerdo con la normativa del Servicio
Nacional de Sanidad Animal y Calidad Agroalimentaria (SENASA, Circular 3496/2002) de porciones representativas de
los lotes de producción, de 150 g cada una, de las cuales se pesaron 25 g en 225 ml de caldo tripticasa soya. La
recolección de los hisopados se realizó mediante el uso de técnicas no destructivas, siguiendo las mismas normas, con
una plantilla de papel de estraza descartable, que cubrió una superficie de 100 cm2 o sea un cuadrado de 10 cm de lado,
en cuatro zonas: nalga, ijada, pecho y cogote. Se frotó un hisopo embebido en caldo peptonado (0,1%) estéril + cloruro
de sodio (0,85%), en forma vertical, luego horizontal y por último diagonalmente, cubriendo la totalidad de esa
superficie. Todas las muestras fueron enriquecidas en agua peptonada con cefixima (Bagó, 0,05 mg/l) a 37°C durante 6
hs., y posteriormente aisladas en agar MacConkey (Merck). La caracterización de las colonias fermentadoras de lactosa
se realizó mediante la utilización de citrato de Koser (Oxoid) y la producción de lisina decarboxilasa en agar lisina
hierro (Britania). Con esta identificación previa se hicieron las pruebas de crecimiento en presencia de telurito de
potasio, fermentación de sorbitol, y detección de β-glucuronidasa 11.
Los aislamientos de Escherichia coli se enriquecieron en caldo tripticasa de soja (Difco) a 37ºC por 6 hs y
luego repicados en agar MacConkey sorbitol (SMAC) (Difco). Las placas de SMAC se incubaron a 37°C durante 18-24
hs. Como tamizaje se realizó la técnica de PCR múltiple de la zona de crecimiento confluente, para detección de los
genes stx1 y stx2, usando los oligonucleótidos descriptos por Pollard et al. (1990) y el gen rfbO157, usando los
oligonucleótidos descriptos por Paton & Paton (1998). Los aislamientos stx1 y/o stx2 positivos se identificaron por
técnicas bioquímicas estándares serotipificaron con antisueros de E.coli O y H (Ørskov & Ørskov, 1984) y
caracterizaron feno-genotípicamente (Chinen et al., 2001; Rivas et al., 2003a,b)
Caracterización fenotípica y genotípica de los aislamientos. El gen eae fue detectado por PCR (Karch et al.,
1993); las cepas STEC eae-negativas se analizaron para determinar la presencia del gen saa (Paton & Paton, 1998), el
gen EHEC-hly se identificaró por PCR (Schmidt et al., 1995) y la hemólisis debida a EHEC-enterohemolisina se
observaró en placas de agar sangre con glóbulos rojos desfibrinados de oveja. El antibiotipo fue determinado según el
método de Kirby Bauer para: ácido nalidixico, amikacina, ciprofloxacina, ampicilina, cloranfenicol, colistin,
estreptomicina, gentamicina, nitrofurantoína, tetraciclina y trimetoprima-sulfametoxazol (NCCLS Standards Methods
2004).
Subtipificación de los aislamientos. Las variantes de stx2 se determinaron por análisis de polimorfismo de
longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) de los productos de amplificación obtenidos por PCR de una región de
la subunidad B de la toxina.(Tyler et al., 1991).
DISCUSIÓN de RESULTADOS
Se confirmaron bioquímicamente como Escherichia coli, 190 cepas (Cuadro 1), 134 (70,5%) de las cuales
fueron aisladas de carnes molidas (n= 240) y 56 (29,4%) de reses bovinas (n= 147).
Cuadro 1: Caracterización bioquímica de 190 cepas de Escherichia coli aisladas de carnes molidas e hisopados de reses
bovinas de las provincias de Corrientes y Chaco (mayo 2004 a julio 2006).
Muestra (aislamientos/n)
Carne molida (134/240)
Res bovina
(56/147)
Sorbita (+) Sorbita (-)
63
71
46
10
Telurito(+)Telurito (-)
120
14
55
1
β+
(n=36) 30
(n=22) 20
β6
2
Referencias:
Sorbita (+): Fermentación de sorbitol
Sorbita (-): No fermentación de sorbitol
Telurito (+): Crecimiento en presencia de telurito de potasio
Telurito (-): Ausencia de desarrollo en presencia de telurito de potasio
β+: Presencia de la enzima β-glucuronidasa
β-: Ausencia de la enzima β-glucuronidasa
Del 55,8% de las carnes molidas (134/240) se aisló E. coli mientras que sólo del 38% (56/147) de las reses.
Ello fue esperable debido a las normas sanitarias que rigen para la res (lavado con agua potable, frío y desecación de la
superficie) comparado con el procesamiento de las carnes molidas, donde, al destruir las fascias protectoras, aumenta la
superficie de contaminanción.
Una sola cepa aislada de carne molida e identificada como C37a, fue caracterizada como E. coli STEC noO157:H7, OR:HNT, stx2vh-a (Figura 1), negativa para los marcadores de virulencia accesorios: eae, EHEC-hlyA y saa,
fermentadora de sorbitol, β-glucuronidasa positiva, no desarrollando en presencia de telurito de potasio y sensible a
todos los antibióticos ensayados. Otra cepa proveniente de hisopado de res, referencia R40b, de cinco días de
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conservación en cámara fue caracterizada como E. coli O157 (Figura 2), no fermentadora de sorbitol, β glucuronidasa
positiva y desarrollando en presencia de telurito de potasio.
1
2
3
4
stx2 (+)
1
1000pb
2
3
4
5
346 pb (stx2)
259 pb (rfbO157)
Stx2
0157
130 pb (stx1)
Stx1
Figura1.
Productos de amplificación por PCR para la detección de los genes
stx1, stx2 y rfbO157. Línea 1: E. coli OR:HNT stx2 cepa aislada
de carne molida (C37a). Línea 2: control negativo E. coli ATCC
25922 sin factores de virulencia. Línea 3: control positivo E. coli
EDL933 stx1/stx2/rfbO157. Línea 4: control de reactivos (mezcla
sin templado). Línea 5: Amplicón de control positivo
Figura 2.
Productos de amplificación por PCR para la
detección de los genes stx1, stx2 y rfbO157.
Línea 1: E. coli O157, cepa aislada de hisopado
de res (R40b). Línea 2: control positivo, E. coli
EDL933 stx1/stx2/rfbO157. Línea3: control de
reactivos (mezcla sin templado). Línea 4:
marcador
de
tamaño
molecular.
CONCLUSIONES
Debido a que el tipo 2 de toxina Shiga (stx2) es el principal responsable de la falla renal en el SUH, (Wen et
al. 2006; Brooks et al., 2005) es necesario extremar los controles higiénico-sanitarios de derivados bovinos, en especial
carne molida, para que no constituyan riesgo en los consumidores.
Cepas stx2 como la de este trabajo, han sido predominante en varios estudios llevados a cabo en Argentina
sobre bovinos y sus productos, en especial carnes molidas y hamburguesas (Blanco et al., 2004, Gómez et al. 2002,
Gioffre et al., 2002) y en Australia (Brett et al. 2003). Sin embargo Mercado et al, (2004), hallaron un 60% de STEC
no- O157 productoras de toxina Shiga stx1, en 15 cepas aisladas de 12 muestras de materia fecal diarreicas de terneros
de establecimientos pampeanos argentinos.
La prevalencia de STEC no-O157 en los Estados Unidos es mayor de lo que se sospechaba, por esta razón, a
partir de enero de 2002, la American Society for Microbiology Public and Scientific Affairs Board Committee on
Agriculture and Food Microbiology recommendó al U.S. Department of Agriculture Food Safety and Inspection
Service (FSIS) la necesidad de incluir los serotipos no-O157 STEC (Parck et al., 2002).
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400 pb
300 pb
200 pb
100 pb
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