Download Tinciones en Microbiología Tipos a) Simples: utilización de un solo

Tinciones en Microbiología
Tipos
a) Simples: utilización de un solo tinte con el cual podemos evaluar solamente la
morfología.
 Las tinciones simples es cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se
utiliza un solo colorante.
b) Compuestas ó especiales: constituidas por 2 ó más tintes o reactivos y sirven para
clasificar las bacterias u observar sus características especiales.
c) Positivas: se observa teñida la célula sobre un fondo claro.
d) Negativas: El fondo se tiñe de oscuro para observar la célula o estructuras
refringentes.
Tinciones compuestas.
1. Tinción de Gram
Principio: Composición de la pared celular de las bacterias, las bacterias G+ está
compuesta por varias capas de peptidoglicanos, las bacterias G- tienen una membrana
externa con un componente estructural único que son los lipopolisacáridos.
Las bacterias G+ retienen el cristal-violeta después de la decoloración y aparecen de color
azul intenso (purpura), las bacterias G- no son capaces de retener el cristal-violeta después
de la decoloración y son teñidas de rojo con safranina.
Pasos:
a. Preparar la extensión del cultivo: En un portaobjetos limpio, libre de grasa, y con un
asa bacteriológica colocar una pequeña cantidad de la colonia bacteriana. a. Muestra
solida: colocar solución salina previamente a colocar la colonia, igual en muestra
semisólida. b. Muestra liquida: colocar la colonia directamente.
b. Dejar secar al aire, luego fijar la preparación pasando la placa rápidamente por el
mechero (2 ó 3 veces)
La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede
llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La
fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias. Este
procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana
extendida y seca, a través de una llama de un mechero. La fijación por calor
preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras
internas. La fijación química con agentes como etanol, formaldehído y ácido acético
entre otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras celulares.
c. Agregar violeta cristal durante 20 a 30 segundos (Colorante primario), enjugar con
agua seguidamente.
d. Agregar yodo Gram durante 40 a 60 segundos (mordente), enjuagar con agua
seguidamente
e. Agregar alcohol acetona y enjuagar con agua inmediatamente (decoloración,
disuelve lípidos de la pared de G- )
f. Agregar safranina durante 20 segundos, enjuagar con agua seguidamente.
Mónica Guzmán
Facultad de Medicina de la Universidad de Panamá
Noviembre 2016
2. Tinción de Moeller (esporas)
Principio: Se suspende una bacteria del genero Bacillus, evidencia capsula incolora en un
contraste morado.
Pasos:
a. Se prepara el extendido de la muestra
b. Se deja secar y se fija con calor
c. Se tiñe con carbol-fuschina hasta llenar por completo el portaobjetos
d. Pase un mechero por debajo de la placa calentando hasta que vea que se emiten
vapores y sin dejar que hierva por 3 minutos. Si la placa se va secando, ir agregando
más tinte hasta cumplir el tiempo. (Se calienta el tinte para que penetre la espora
que contiene dipecolinato de calcio)
e. Se enjuaga con agua y se coloca ácido sulfúrico al 1% por 2 minutos (decolorante
para retirar el carbol-fuchina)
f. Se enjuaga con agua y se tiñe finalmente con azul de metileno por 1 minuto
g. Dejar secar
Las esporas permiten a las bacterias pasar a un estado latente en condiciones ambientales
adversas. Su principal componente es Ca2+ fijado a ácido dipicolínico. El calor después de
la tinción con carbol-fuscina con permite que rompa la estructura que protege la espora para
que así pueda penetrar el colorante. Con el lavado de agua se retira todo tinte que se adhirió
a la bacteria, para después teñirse con azul de metileno.
Resalta de color rojo la espora y de color azul, la bacteria.
Club de Informática Médica y Telemedicina (Universidad de Panamá). Tinción de Möeller. Telmeds.org [publicada
en línea]. 2009(03). [citado 23 de Nov de 2016]. Disponible en: http://www.telmeds.org/atlas/bacteriologia/tecnicasbacteriologicas/tinciones-simples-y-especiales/tincion-de-moeller/
Mónica Guzmán
Facultad de Medicina de la Universidad de Panamá
Noviembre 2016
3. Tinción de Anthony (cápsula)
Principio: Es una tinción negativa en donde vemos la cápsula no teñida sobre un fondo
morado y se visualiza la bacteria en el centro de la cápsula, esta pude ser de glicoproteínas
o polisacáridos.
La cápsula es una sustancia viscosa producida por algunas especies que la sintetizan a partir
de polipéptidos, polímeros de glucosa u otros amino azúcares que contienen nitrógeno, que
después de combinarse con el agua es segregada por todo el contorno de la pared celular
como un moco gelatinoso. Cuando la cápsula ha sido producida puede observarse en los
frotis coloreado por el método de Gram como un halo incoloro alrededor de la bacteria.
Cuando se requiere ver la cápsula con más detalle o inducir su producción se recurre a
coloraciones especiales.
Pasos:
a. Colocar leche descremada al 20% o leche litmus en un extremo del portaobjetos
b. Agregar la muestra de bacteria en la leche del borde
c. Realizar un extendido con la ayuda de otro portaobjetos
d. Se deja secar al aire (no se fija con calor ya que la leche se pega al portaobjetos)
e. Teñir por 2 minutos con violeta-cristal.
f. Lavar con sulfato de cobre.
g. Se deja secar al aire.
Las cápsulas no se tiñen normalmente con colorantes básicos como el cristal violeta o la
safranina. Tinción negativa de cápsulas en que la leche litmus se tiñe con violeta cristal
como contraste de un fondo morado con el halo transparente de la cápsula incolora.
Club de Informática Médica y Telemedicina (Universidad de Panamá). Tinción de Anthony. Telmeds.org [publicada
en línea]. 2009(03). [citado 23 de Nov de 2016]. Disponible en: http://www.telmeds.org/atlas/bacteriologia/tecnicasbacteriologicas/tinciones-simples-y-especiales/tincion-de-anthony/
Mónica Guzmán
Facultad de Medicina de la Universidad de Panamá
Noviembre 2016
4. Tinción de ácido-alcohol resistencia
Principio: Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de
Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir
aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves
(ácido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (no ácido-alcohol
resistentes).
Representación esquemática de la composición de la pared celular de las micobacterias. Imagen en color
en: www.medigraphic.com/rid
Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes patógenos:
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de la
tuberculosis y la lepra respectivamente. Estas bacterias pertenecen al Phyllum
Actinobacteria, un grupo grande y complejo de bacterias gram positivas, que incluye a la
Familia Mycobacteriaceae caracterizada por contener en sus paredes celulares un alto
contenido lipídico, ceras con una gran diversidad de ácidos micólicos, moléculas de 60 a 90
átomos de carbono. La presencia de estos lípidos, en la cara externa de la pared, hacen que
estas bacterias sean muy resistentes a la acción de compuestos químicos presentes en su
entorno, característica que se utiliza para aislar estos microorganismos: uno de los medios
más frecuentes es el Loewenstein-Jensen con verde malaquita que permite el crecimiento
selectivo de estos microorganismos.
Procedimiento
a. Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña porción de un cultivo
bacteriano con el asa de siembra estéril.
b. Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa
de siembra. Dejar secar.
c. Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.
d. Cubrir con unas gotas de fuchina fenicada y aplicar calor con un hisopo de lana
e. de vidrio, mantener 5 minutos desde el comienzo de la emisión de vapores
f. Lavar el exceso de colorante con agua.
g. Añadir unas gotas de ácido nítrico al 33% durante 30-40 segundos.
Mónica Guzmán
Facultad de Medicina de la Universidad de Panamá
Noviembre 2016
h.
i.
j.
k.
l.
m.
n.
o.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Lavar la preparación con alcohol de 96º durante 30 segundos.
Lavar con abundante agua.
Cubrir con el colorante de contraste, azul de metileno durante 1 minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Dejar secar al aire.
Añadir una gota de aceite de inmersión.
Observar con objetivo de inmersión (100 x).
Estas bacterias son resistentes al tratamiento con alcoholes y ácidos suaves conservando el
colorante fundamental, mientras que organismos que no posean esta característica son
rápidamente decolorados y pueden teñirse con el colorante de contraste en este caso azul de
metileno.
Muestra de Esputo BAAR (+) con Tinción de Ziehl Neelsen. Telmeds.org [publicada en línea]. 2009(10).
[citado 23 de Nov de 2016]. Disponible en: http://www.telmeds.org/atlas/bacteriologia/mycobacteriasnocardia-y-actinomyces/muestra-de-esputo-baar-con-tincion-de-ziehl-neelsen/
Mónica Guzmán
Facultad de Medicina de la Universidad de Panamá
Noviembre 2016
5. Tinción de azul algodón de lactofenol
El examen microscópico es de gran importancia en micología para la observación de las
diferentes especies de hongos de interés clínico. Se deben utilizar tinciones que logren
preservar la integridad de las estructuras fúngicas.
La tinción de azul algodón de lactofenol no es considerada una tinción diferencial, sin
embargo, posee características tintoriales que permiten observar cada uno de los
componentes fúngicos y apreciar fácilmente las estructuras para una adecuada
identificación.
Principio: El fenol inactiva las enzimas líticas de la célula e impide que ésta se rompa; de
igual forma, destruye la fl ora acompañante e inactiva a la célula, quitándole el grado de
patogenicidad; además, actúa como mordiente cuando se usa en combinación con
colorantes. El ácido láctico preserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio de
gradiente osmótico con relación al interior fúngico, lo que genera una película protectora.
El azul de algodón es un colorante ácido, que tiñe el citoplasma y la quitina presente en las
células fúngicas, mientras que el glicerol mantiene húmeda la preparación. Una vez
preparado el colorante, se debe colocar la muestra microbiológica en un portaobjetos por
medio de una impronta (proceso en el cual se coloca una impresión de la muestra sobre una
estructura utilizando una cinta adhesiva transparente).
Preparación de la impronta
a. Colocar el material necesario en la campana de seguridad tipo 2A.
b. Seleccionar las colonias para realizar las improntas.
c. Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente aproximadamente de 1 cm
d. Pegar los segmentos de cinta en un asa micológica.
e. Poner una gota de azul de algodón en el portaobjetos.
f. Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior de hongo.
g. Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodón y poner otra gota de azul de
algodón.
h. Poner un cubreobjetos sobre la preparación.
i. Observar en 40x.
Las estructuras fúngicas se observarán de color azul sobre un fondo blanco (Figura 8)
Fotomicrografía de hongos filamentosos con el método de azul algodón de lactofenol.
Exserohilum sp. (izquierda); Mucor spp. (derecha) (aumento 40x).
Imagen en color en: www.medigraphic.com/rid
Mónica Guzmán
Facultad de Medicina de la Universidad de Panamá
Noviembre 2016
Bibliografía
1. Luis Esaú López-Jácome, Melissa Hernández-Durán, Claudia Adriana Colín-Castro,
Silvestre Ortega-Peña, Guillermo Cerón-González, Rafael Franco-Cendejas.
(marzo, 2014) Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Obtenido de
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
2. Covadonga Vázquez, Ana Martín, Mª Isabel de Silóniz, Susana Serrano,
Departamento de Microbiología III. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad
Complutense. Madrid. (2010). Técnicas básicas de Microbiología, Observación de
bacterias.
Obtenido
de
http://revistareduca.es/index.php/biologia/article/view/819/834
Mónica Guzmán
Facultad de Medicina de la Universidad de Panamá
Noviembre 2016