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Sección I. Aspectos generales ISBN 9974-31-194-2 Sumario Departamento de Bacteriología y Virología Instituto de Higiene > Temas de Bacteriología y Virología Médica Biología viral Morfología y estructura bacteriana Fisiología y metabolismo bacteriano Genética bacteriana Métodos de estudio de bacterias y virus. Métodos diagnósticos Inmunidad contra los agentes infecciosos Interacciones huésped-parásito. Flora normal Infecciones de piel y tejidos blandos Infecciones respiratorias Gastroenteritis Infección urinaria Bacteriemias, sepsis y endocarditis Infecciones del sistema nervioso central Infecciones de transmisión sexual Infecciones hospitalarias Sección III. Etiopatogenia microbiológica Género Staphylococcus Géneros Streptococcus y Enterococcus Principales grupos de bacilos y cocos gramnegativos exigentes Principales grupos de bacilos gramnegativos no exigentes Principales grupos de bacilos grampositivos aerobios Bacterias anaerobias Mycobacterias Chlamydia, Mycoplasma y Rickettsia Leptospira Virus respiratorios Retrovirus y VIH Virus de las hepatitis Enterovirus Agentes virales de gastroenteritis. Rotavirus Herpesvirus Agentes de infecciones emergentes, Hantavirus, dengue, BSE Sección IV. Control de poblaciones microbianas Inmunoprofilaxis Vacunas Esterilización, desinfección y antisepsia Principales grupos de antibióticos Principales mecanismos de resistencia antibiótica Métodos de estudio de la sensibilidad antibiótica Antivirales Universidad de la República Facultad de Medicina 2da edición corregida Departamento de Bacteriología y Virología Instituto de Higiene > Temas de Bacteriología y Virología Médica Sección II. Principales procesos infecciosos 2006 Universidad de la República | Facultad de Medicina Sección I. Aspectos generales ISBN 9974-31-194-2 Sumario Departamento de Bacteriología y Virología Instituto de Higiene > Temas de Bacteriología y Virología Médica Biología viral Morfología y estructura bacteriana Fisiología y metabolismo bacteriano Genética bacteriana Métodos de estudio de bacterias y virus. Métodos diagnósticos Inmunidad contra los agentes infecciosos Interacciones huésped-parásito. Flora normal Infecciones de piel y tejidos blandos Infecciones respiratorias Gastroenteritis Infección urinaria Bacteriemias, sepsis y endocarditis Infecciones del sistema nervioso central Infecciones de transmisión sexual Infecciones hospitalarias Sección III. Etiopatogenia microbiológica Género Staphylococcus Géneros Streptococcus y Enterococcus Principales grupos de bacilos y cocos gramnegativos exigentes Principales grupos de bacilos gramnegativos no exigentes Principales grupos de bacilos grampositivos aerobios Bacterias anaerobias Mycobacterias Chlamydia, Mycoplasma y Rickettsia Leptospira Virus respiratorios Retrovirus y VIH Virus de las hepatitis Enterovirus Agentes virales de gastroenteritis. Rotavirus Herpesvirus Agentes de infecciones emergentes, Hantavirus, dengue, BSE Sección IV. Control de poblaciones microbianas Inmunoprofilaxis Vacunas Esterilización, desinfección y antisepsia Principales grupos de antibióticos Principales mecanismos de resistencia antibiótica Métodos de estudio de la sensibilidad antibiótica Antivirales Universidad de la República Facultad de Medicina 2da edición corregida Departamento de Bacteriología y Virología Instituto de Higiene > Temas de Bacteriología y Virología Médica Sección II. Principales procesos infecciosos 2006 Universidad de la República | Facultad de Medicina TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA SECCIÓN 9 I Aspectos generales 1. Biología viral 2. Morfología y estructura bacteriana 3. Fisiología y metabolismo bacteriano 4. Genética bacteriana 5. Métodos de estudio de bacterias y virus. Métodos diagnósticos 6. Mecanismos defensivos del huésped contra los agentes infecciosos 7. Interacciones huésped parásito. Flora normal >> 10 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 11 Página 11 1 Biología viral Juan R. Arbiza Introducción Hasta fines del siglo XIX se había avanzado en la etiología de muchas enfermedades infecciosas, sin embargo, quedaban muchas enfermedades en el hombre, animales y plantas en las cuales no se identificaba un microorganismo causal. En el siglo XX se descubrieron los virus como causantes de enfermedades infecciosas para las cuales no se había encontrado una bacteria, un hongo o un protozoario como responsable. Fue el desarrollo de nuevas técnicas como los cultivos celulares, el avance en la microscopía y el advenimiento, a fines del siglo XX, de técnicas de biología molecular que han permitido aislar e identificar los virus; además han permitido un avance extraordinario en el conocimiento molecular de la biología de los mismos. Sin embargo, los virólogos tienen un doble desafío para el futuro: controlar los virus que ya se conocen, para los cuales no existen fármacos o vacunas efectivas hasta el momento y; aislar, identificar, caracterizar y controlar los virus emergentes o reemergentes (virus de la inmunodeficiencia humana, Ebola, Hantavirus, etc.). Características generales Las primeras características que diferenciaron a los virus de otros microorganismos fueron: el tamaño, estimado por su capacidad de atravesar filtros que retienen a las bacterias y la incapacidad para reproducirse en medios biológicos inertes como medios de cultivo para bacterias, requiriendo para su propagación de animales o cultivos celulares. Hoy se sabe que estas características no alcanzan para diferenciar a los virus de otros agentes biológicos, dado que existen bacterias cuyo tamaño puede ser similar al de los virus más grandes y algunas bacterias como Chlamydias y Rickettsias, son parásitos intracelulares obligatorios. La organización y composición de las partículas virales ofrecen características que los diferencia de otros microorganismos. Los virus poseen un solo tipo de ácido nucleico de pequeño tamaño con respecto a otros agentes biológicos, rodeado por una cáscara o cápside formada por numerosas copias de una proteína o de un número limitado de ellas. Algunos grupos de virus presentan por fuera de la cápside una envoltura lipídica de origen celular en la que se insertan glicoproteínas. No presentan sistemas enzimáticos propios, por lo tanto no son capaces de replicarse por sí solos y requieren de células animales, vegetales o bacterias para cumplir su ciclo de reproducción; esto define su parasitismo celular obligatorio. Este tipo de reproducción particular que tienen los virus, es la característica que justifica su lugar en la escala biológica. A diferencia de las células, en el momento de su multiplicación, 12 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA los virus no aumentan de tamaño para su posterior división, por el contrario, ls partícula viral se desintegra y luego se sintetizan cada uno de sus componentes que se reúnen por ensamblaje. Esta forma de multiplicación en la cual se producen réplicas del virus progenitor, es conocida con el nombre de replicación viral y se diferencia del proceso de división celular usado por células procariotas y eucariotas. Se pueden citar dos definiciones de virus. La primera propuesta por Lwoff (1957): “entidad estrictamente celular y potencialmente patogénica con una fase infecciosa. Posee un solo tipo de ácido nucleico, es incapaz de crecer y reproducirse por fisión binaria y carecen de enzimas para producir energía”. La segunda, pertenece a Luria y Darnell (1967): “los virus son entidades cuyo genoma se replica dentro de células vivas usando su maquinaria de síntesis. Esto determina la formación de elementos especializados que permiten la transferencia del genoma viral a otras células”. VIROIDES Son virus simples constituidos por ácido ribonucleico (ARN) circular de muy bajo peso molecular, sin cápside protectora. Producen enfermedades hasta el momento conocidos exclusivamente en plantas. PROVIRUS El genoma viral se puede integrar al genoma celular por un proceso de recombinación genética, directamente en los virus ácido desoxirribonucleico (ADN) o previa transcripción inversa en los virus ARN. El genoma viral integrado al celular recibe el nombre de provirus. PRIONES Ciertos agentes causantes de afecciones degenerativas del sistema nervioso central del hombre, han sido clasificados como virus no convencionales, dado que no ha sido posible determinar una estructura similar a virus en el material infectante, ni el tipo de ácido nucleico de dichos agentes. Son extremadamente resistentes a sustancias que inactivan los virus comunes. Algunos han propuesto que corresponderían a viroides patógenos del hombre. Los priones han sido descritos en los últimos años como causantes de muchas enfermedades del sistema nervioso comentadas anteriormente, principalmente el scrapie en el ganado ovino y la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) o comúnmente conocida como síndrome de la “vaca loca”. En el hombre serían los agentes relacionados con la enfermedad de CreutzfeldJacob y Kuru. Son estructuralmente más simples que los virus y están formados solo por proteínas. Cuando se descubrieron, parecía que se podía producir una gran revolución en el conocimiento de la biología, porque la idea de que una proteína pudiera autorreplicarse sería opuesta al dogma central de que la información genética es transmitida desde el ácido nucleico a la proteína. El hallazgo de los priones y el avance en el conocimiento de su biología podrán dilucidar muchas enfermedades aún sin resolver. Muchas son las investigaciones que se realizan en estos momentos y las hipótesis propuestas para explicar la biología y permanencia de estas proteínas extremadamente resistentes a sustancias que inactivan a los virus comunes. Morfología y estructura de los virus TAMAÑO Y FORMA Existe gran variedad de tamaño y forma de los virus hasta hoy estudiados. Se puede obser- TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 13 var un tamaño entre 28 nm en los virus más pequeños denominados picornavirus (pico de pequeño) hasta 300 nm en los virus más grandes que se conocen como son los poxvirus (ver figura 1). La forma también es muy variada, pudiéndose observar formas icosahédricas o helicoidales en virus que no tiene envoltura por fuera de la cápside, hasta formas esféricas, filamentosa o pleomórficas en los virus con envoltura o muy complejos como el virus de la rabia (ver figuras 2 y 6). ESTRUCTURA Como ya se mencionó la estructura de un virus está basada en su simplicidad, a pesar de esto existe cierta diversidad que es usada para la clasificación de estos microorganismos. Virus desnudos La estructura de los virus más simples está compuesta por un solo tipo de ácido nucleico (ADN o ARN) rodeado de una cáscara proteica que se denomina cápside (del griego capsa que significa caja). De la reunión de las subunidades proteicas codificadas por el genoma viral, que se ensamblan según principios geométricos, se forman diferentes tipos de simetrías (icosahédrica o helicoidal). (Ver figura 2 y 3b) Esta estructura básica de ácido nucleico y cápside recibe el nombre de nucleocápside y constituye en los virus desnudos la partícula viral completa o virus. Esta se diferencia del término virión que es usado para las partículas virales o virus potencialmente infecciosas. Cuando se observa al microscopio electrónico una cápside viral, pueden observarse es- E. coli Poxvirus Rhabdovirus Herpesvirus Adenovirus Parvovirus 1000 nm Fig. 1 Figura 1. 14 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 2. A- Icosahedro desnudo B. Helicoidal desnudo C. Icosahedro envuelto nucleocápside nucleocápside protómeros (proteína) capsómeros (proteína) D. Helicoidal envuelto ácido nucleico espículas (glicoproteínas) envoltorio (proteínas y lípidos) tructuras morfológicas denominadas capsómeros que resultan de la unión por enlaces de las subunidades proteicas. La forma de distribución de los capsómeros así como el número de ellos depende de cada tipo de virus. Virus envueltos La estructura de las partículas virales de los virus denominados envueltos, está formada además de la nucleocápside por una envoltura de origen celular que la rodea (ver figuras 2 y 3a). Dicha envoltura se obtiene en el proceso de liberación por gemación (brotamiento) como se esquematiza en la figura 4. En ésta se insertan glicoproteínas de origen viral que reciben el nombre de espículas o glicoproteínas de superficie y que tienen un papel importante de reconocimiento de receptores específicos de la superficie celular, en el paso inicial de relación con la célula huésped para la multiplicación viral. Ácidos nucleicos El ácido nucleico que lleva la información genética y que constituye el genoma viral puede tener varias formas. Como ya se mencionó, una partícula viral tiene en su estructura un solo tipo de ácido nucleico (ADN o ARN), pero la forma de estos puede ser de doble o simple TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 15 Figura 3. a) b) cadena, segmentado o no, circular o lineal, determinando una gran diversidad de utilidad en la taxonomía viral (ver figura 5). En la figura 6 se representa un cuadro con los principales virus animales, con sus diferentes estructuras (con envoltura o sin ella, con simetría helicoidal o icosahédrica) y la composición del ácido nucleico. Estas dos características se combinan de diferentes maneras para determinar varios grupos de virus. Multiplicación viral Una partícula viral puede encontrarse en dos estados: activa o inactiva. Para demostrar el estado inactivo basta incluir una suspensión de virus en un medio de cultivo y observar que son incapaces de cumplir actividades metabólicas necesarias para su multiplicación. Se deduce de ello, que los virus carecen como ya se mencionó anteriormente de maquinaria enzimática que les permita autorreplicarse, aún cuando se les brinde nutrientes que serían adecuados para la propagación de las bacterias más exigentes. Pero si una partícula viral es incorporada a células vivas sensibles, se comporta en forma activa y por lo tanto tomará el comando de la maquinaria enzimática de la célula huésped, logrando así su replicación. 16 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Virion Membrana Plasmática Figura 4. Proteína vírica Nucleocápside DNA RNA a) a) Simple cadena Figura 5. Simple cadena b) Doble cadena b) Doble cadena c) c) Doble cadena fragmentado Circular (simple y doble cadena) La multiplicación de los virus animales, vegetales y bacteriófagos es similar en sus principios pero, cada una de ellas tiene sus particularidades. Esto se basa principalmente en las diferencias entre las células que infectan. El desarrollo del conocimiento sobre la multiplicación de los virus animales ha sido posible por el uso (en el laboratorio) de muchos sistemas de aislamiento de virus en los cuales se puede estudiar el proceso de multiplicación viral. En un principio fueron animales y huevos embrionados los sistemas más usados, pero actualmente se han sustituido por cultivos celulares que ha favorecido el conocimiento de las etapas de la multiplicación viral. Existe gran variedad de cultivos de células, cultivos primarios o líneas celulares que pueden ser subcultivadas indefinidamente. Dichas líneas se asemejan mucho a las células transformadas debido a su gran potencial de crecimiento y a su aneuploidía. Habitualmente se las usa para aislar virus, pero no se recomiendan para la producción de vacunas virales humanas, dado que los virus propagados en esas líneas pueden adquirir características genéticas oncogénicas. Los cultivos primarios resultan de la dispersión de células diploides de un tejido, por digestión enzimática de la sustancia intercelular; también son poco recomendadas para la producción de vacunas, ya que pueden tener virus latentes propios de la especie de la que provienen. Los embriones de gallina y sus anexos siguen siendo muy usados porque ofrecen diferentes 17 ENVUELTOS DESNUDOS TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA tipos celulares a los que se puede llegar por diferentes vías (intraamniótica, intraalantoidea, en saco de yema, etc.). INFECCIÓN VIRAL La infección viral puede ser productiva o, en oposición abortiva. Esta última cumple un ciclo incompleto en el que no se forman partículas virales infecciosas. Una infección productiva culmina con la generación de una progenie viral infecciosa; este proceso requiere una serie de pasos o etapas que son diferentes en los distintos tipos de virus. Las etapas fundamentales de la infección viral son: adsorción, penetración, denudación, eclipse, replicación, maduración y liberación. Adsorción Intervienen muchos factores. En principio existe una atracción por fuerzas iónicas. A pH neutro, los virus y las células tienen cargas negativas, por lo tanto son necesarios iones positivos; 18 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 7. b) Viropexis a) Fusión Cell Cell dicho requerimiento lo cumple los iones de magnesio. Otro factor importante en esta etapa es la interacción de sitios específicos de la partícula viral con receptores celulares específicos. Esto determina la especificidad de algunos virus para crecer en células de origen específico; por ejemplo: el virus de la poliomielitis solo puede crecer en células humanas y de primates. Otros virus presentan estructuras en su superficie que les permiten cumplir con esta etapa de forma muy especializada. Estas son glicoproteínas que reconocen receptores celulares específicos. Hoy se pueden aislar esos elementos como complejos virus y célula. Luego de adsorbidos a una célula, los virus pueden ser recuperados conservando sus caracteres de partícula libre potencialmente infectante. Los poliovirus pueden ser separados de las células con soluciones salinas a altas concentraciones o con detergentes; los mixovirus (virus de la gripe) que usan también una estructura especializada, se separan de las células huéspedes por acción de la neuraminidasa. Penetración La penetración de los virus una vez adsorbidos, puede realizarse de diferentes maneras, por: viropexis, penetración o fusión (ver figura 7). Viropexis Es un proceso de fagocitosis, en el que se produce una invaginación de la membrana plasmática; así el virus queda englobado en una vesícula dentro del citoplasma celular. Es el mecanismo más común de penetración de los virus. Penetración En algunos virus, la penetración acontece por simple cruce de la membrana plasmática; así la partícula viral queda directamente incluida en el citoplasma. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 19 Fusión Otro tipo de penetración se da por fusión de la envoltura viral con la membrana plasmática. También en este caso el virus es directamente incorporado al citoplasma. Denudación y eclipse En esta etapa el virus se desintegra, dejando libre su ácido nucleico que comanda su propia replicación, además de la síntesis de las proteínas necesarias para integrar nuevas partículas. La manera en la que un virus pierde la cápside y su envoltura (si la tiene), es característico de cada grupo viral. En los poliovirus parece existir una integración con los constituyentes celulares tales como los receptores. En otros virus como los poxvirus y los reovirus el proceso es más complejo. Los poxvirus pierden parte de su envoltura en las vacuolas fagocíticas, mientras que un ARN mensajero (ARNm) es sintetizado por una transcriptasa que termina con la producción de una enzima nueva que completa la denudación. Los reovirus penetran en los lisosomas donde las enzimas proteolíticas eliminan la cápside y promueven la transcripción del genoma. Los fenómenos descritos (adsorción, penetración y denudación) finalizan con la desintegración de las partículas virales, pero no siempre el proceso progresa hasta la replicación viral. Si interrumpimos el ciclo en esta etapa llamada eclipse, el ácido nucleico liberado de sus envolturas puede recobrarse por disrupción de la célula huésped, pero habría perdido su capacidad de infectar (algunos autores opinan que aún puede recobrarse intacto). Si el proceso normal continúa, comienza la replicación del ácido nucleico y la síntesis de las proteínas estructurales y no estructurales necesarias para la producción de virus. Replicación del ácido nucleico La replicación es un fenómeno muy heterogéneo porque existe mucha variedad de ácidos nucleicos de origen viral; se recordará que los hay de ADN y de ARN de una o dos hebras, segmentados o no, etc. Siempre el genoma viral es el elemento capaz de gobernar su autorreplicación y de trasmitir la información estructural y funcional a la progenie resultante de una infección. No obstante la diversidad señalada, en la replicación intervienen elementos comunes que vale la pena destacar tales como la formación de un ARNm capaz de traducir en el ribosoma celular las proteínas codificadas por el genoma viral. Además, sea cual sea el ácido nucleico, siempre se diferencian dos conjuntos de genes, los precoces y los tardíos. Los primeros serían los encargados de codificar proteínas necesarias para la copia de la molécula de ácido nucleico y, los tardíos serían los encargados de codificar las proteínas estructurales y las proteínas para el ensamblaje. La replicación puede producirse en el núcleo o en el citoplasma de la célula, eso dependerá del tipo de ácido nucleico que constituye el genoma viral. Los virus que contienen ARN se replican en el citoplasma, mientras que los que tienen ADN se replican en el núcleo; excepto el virus de la viruela que, aunque son virus ADN, su replicación se realiza en el citoplasma. Los virus ADN sintetizan por medio de una polimerasa, ARNm que pasa al citoplasma donde se producirá la síntesis proteica; de estas proteínas algunas tienen funciones estructurales y formarán los capsómeros que al unirse entre sí constituirán la cápside. Otras proteínas tendrán funciones enzimáticas, de polímeros y se introducirán en el ácido nucleico promoviendo la replicación del ADN viral. El tipo de replicación es semiconservadora y los intermediarios replicativos, serán lineales o cíclicos dependiendo si la molécula de ADN es lineal o cíclica respectivamente. Como ejemplo de virus ADN podemos citar al grupo de los herpesvirus, quienes pierden la 20 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA cápside en el citoplasma y penetran al núcleo iniciando la replicación del ácido nucleico. Hay síntesis de ARNm inducidos por el virus, enzimas relacionadas a la síntesis y fragmentación del ADN. Los pasos biosintéticos descritos pueden relacionarse con el desarrollo de cuerpos de inclusión nucleares y la formación de partículas virales. Los virus ARN tienen un interés especial por la diversidad de formas de replicación que presentan; esto depende de que el ARN pueda actuar como mensajero, denominado de polaridad positiva. De lo contrario, al ARN que posea la secuencia de bases complementarias a las del ARNm se le denomina de polaridad negativa. Cuando consideramos un ARN con polaridad positiva, éste actúa como mensajero entrando en el ribosoma celular e iniciando una traducción de polimerasas, necesarias para iniciar la replicación del ácido nucleico. Luego actuará la parte tardía del ARN traduciendo proteínas para la formación de la cápside y ensamblaje de la partícula viral. Un ejemplo de este tipo de replicación son los poliovirus, que tienen como genoma un ARN de hebra única con ácido poliadenílico en un extremo. Dicho ácido sirve inicialmente como molécula de ARNm para la síntesis de replicasa de ARN, produciéndose el intermediario replicativo de ARN, útil para la síntesis de moléculas de ARN virales de los descendientes. La replicación del ARN viral es independiente de las síntesis de ADN de la célula huésped. Por el contrario, si el ARN es de polaridad negativa, la molécula no tiene función mensajera y por lo tanto sintetiza una molécula complementaria a la original con función mensajera, que entra al ribosoma. En este grupo de virus aparece un nuevo concepto en la estructura viral porque, para sintetizar una copia se necesita una transcriptasa ARN dependiente que no se encuentra en las células. Por consiguiente, en estos virus además del genoma y las proteínas estructurales, son sintetizadas otras proteínas que luego serán incorporadas a la partícula viral. Maduración y liberación Hay virus cuya única cubierta es la cápside, virus desnudos, en oposición a los que poseen envoltura por fuera de la cápside, virus envueltos. Es conveniente considerarlos por separado en esta etapa, que es la finalización de la formación de una progenie viral. Para los virus desnudos, el fenómeno de maduración consiste en la unión de los capsómeros para formar la cápside y la posterior unión de esta con el genoma. Parece existir una diferencia en la maduración de este grupo de virus dependiendo si el ácido nucleico del genoma es ADN o ARN. Para los primeros, la síntesis del ADN se realiza con anticipación a la aparición de los elementos estructurales, mientras que para los segundos, se ha demostrado con aminoácidos radioactivos que las cadenas polipeptídicas se reúnen rápidamente en capsómeros y éstos en cápside. Además se destaca que existe concordancia con la síntesis de la molécula de ARN. La liberación en este grupo de virus depende mucho del tipo de virus y de las características de la célula huésped. Los poliovirus son liberados rápidamente de las células HeLa o HEp-2; dicha liberación se realiza por rotura de vacuolas superficiales. En los virus ADN que maduran en el núcleo, el tiempo de liberación es mayor que en el ejemplo anterior, porque la liberación se produce por autolisis celular. En los virus con envoltura, la maduración es más compleja (ver figura 4). Además de la unión del ácido nucleico con la cápside, el virus debe rodearse de la envoltura. Luego de haberse formado la cáspide, la partícula se aproxima a la membrana plasmática y se produce la evaginación de la membrana y luego el desprendimiento del brote. El brotamiento puede ser explicado por relación entre las proteínas de la membrana plasmática y la nucleocápsi- TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 21 de. Generalmente, la liberación de la partícula se produce al finalizar el brotamiento de la membrana celular. ALTERACIONES CELULARES PRODUCIDAS POR INFECCIÓN VIRAL Las células pueden responder de diferentes formas ante una infección viral: sin alteración aparente; con efecto citopático, es decir muerte de la célula por lisis celular e hiperplasia, como en los poxvirus o; solo con hiperplasia, como en la transformación viral en células malignas. Efecto citopático El efecto citopático consiste en alteraciones morfológicas de las células, que resultan en la muerte celular. Este efecto es diferente dependiendo el tipo de virus. En cultivos infectados con adenovirus, las células se redondean y se agrupan como un racimo de uvas. En cambio, las células infectadas con poliovirus también se redondean pero se retraen y se lisan liberando muchos virus. El virus sincicial respiratorio, produce fusión de las membranas celulares, originando grandes sincicios. Cuerpos de inclusión Los cuerpos de inclusión son acúmulos intracelualres de material nuevo. Algunos se producen por acumulación de viriones o de subunidades virales no reunidas. Estos cuerpos de inclusión pueden romper la estructura celular o cambiar la función y producir la muerte celular. Otros corpúsculos pueden desarrollarse en lugares donde existe síntesis viral, pero no tienen viriones detectables; por ejemplo los corpúsculos eosinófilos intranucleares en las células infectadas por virus del herpes simple. Transformación celular Algunos virus son productores de tumores o de leucemia. Pueden presentar muchos efectos en las células: estimulación de la síntesis de ADN celular (virus del polioma); alteraciones de la superficie evidenciadas por especificidades antigénicas nuevas (distintas de aquellas pertenecientes a las subunidades de los viriones); aberraciones cromosómicas y alteraciones del crecimiento celular. Este cambio de una célula normal a una maligna, ha sido llamado transformación. Bibliografía • Davis B, Dulbecco R, Ginsberg H. Microbiologia. San Pablo, Brasil Harper and Row, 3ra ed. 1985. • Fields B, Knipe D. Virology. New York. Raven Press,2nd ed.. 1990. • Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiología. 20ª ed. BsAs. Panamericana; 1994. 22 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 23 Página 23 2 Morfología y estructura bacteriana M. Pírez, M. Mota Introducción e importancia del tema En las últimas décadas se han hecho importantes avances en el estudio de la ultraestructura bacteriana, lográndose una identificación bioquímica de muchas fracciones subcelulares; estos avances han permitido ubicar a las bacterias en el reino Procaryotae. El conocimiento de las diferentes estructuras y composición ha permitido comprender como muchas bacterias se relacionan con el hombre, ya sea como integrantes de la flora normal o como agresoras para el mismo. El descubrimiento de que muchas estructuras bacterianas bien identificadas son inmunógenos importantes, permitió el desarrollo de vacunas que han sido verdaderos avances en la medicina de los últimos años. Ejemplo de ello son las vacunas contra microorganismos causantes de meningoencefalitis supurada como Haemophilus influenzae tipo b y Neisseria meningitidis (meningococo) A, B y C. El conocimiento de la composición bioquímica de las diferentes estructuras bacterianas, junto al conocimiento del metabolismo bacteriano, permite hoy la comprensión del mecanismo de acción de los diferentes antibióticos. Recientemente, los avances de la genética bacteriana hicieron posible el desarrollo de técnicas de biología molecular con aplicaciones a nivel de la investigación científica y el diagnóstico. La observación al microscopio óptico con distintas coloraciones y de los cultivos bacterianos, tienen un rol importante en la identificación de las bacterias y su ubicación taxonómica. Definición y ubicación taxonómica Las bacterias son microorganismos unicelulares que se reproducen por fisión binaria. La mayoría son de vida libre, a excepción de algunas que son de vida intracelular obligada, como Chlamydias y Rickettsias. Tienen los mecanismos productores de energía y el material genético necesarios para su desarrollo y crecimiento. Las bacterias integran el reino procariota (pro de primitivo y cariota de núcleo). Todos los organismos vivos se pueden dividir en dos tipos celulares: eucariotas y procariotas. Tienen estructuras en común como la membrana celular, los ribosomas encargados de la síntesis proteica y el ácido desoxirribonucleico (ADN) portador de la información genética. 24 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Los organismos multicelulares, animales y plantas, están constituidos por células eucariotas (eu de verdadero). Los protistas, los hongos y las algas que se organizan de forma unicelular, multicelular o en colonias (como los protistas), también poseen células eucariotas. Dentro de este esquema, las bacterias son microorganismos unicelulares procariotas. En este reino, según criterios evolutivos, diferenciamos el grupo de las eubacterias y el de las arqueobacterias. Este último comprende bacterias sin peptidoglicano como las anaerobias que viven en condiciones ácidas calientes, las que viven en condiciones salinas y las que reducen el anhídrido carbónico (CO2) a metano. Por lo tanto éstas viven en las profundidades del mar, en las aguas saladas y en las fuentes ácidas. Las eubacterias, en cambio, viven en el suelo, el agua y los organismos vivos; entre ellas se encuentran las bacterias de interés médico, las bacterias verdes fotosintetizadoras, las cianobacterias o algas verdeazules y las bacterias púrpuras fotosintetizadoras. A continuación nos referiremos a las eubacterias simplemente como bacterias. Como característica principal, los procariotas no poseen compartimientos intracelulares delimitados por membranas, por lo que carecen de membrana nuclear, a diferencia de los eucariotas. También es importante destacar que el ADN procariota es circular y cerrado, mientras que el eucariota se organiza en cromosomas individuales y se asocia a proteínas de tipo histonas. Las bacterias poseen una pared celular compuesta por peptidoglicano (a excepción de los Mycoplasmas) mientras que las células eucariotas no tienen este tipo de pared (la pared celular de los vegetales es de celulosa). La reproducción en los eucariotas puede ser tanto sexuada como asexuada, mientras que los procariotas se reproducen por división simple (forma asexuada). El tamaño de la célula eucariota es mayor que el de la procariota. Los procariotas no poseen citoesqueleto, a diferencia de los eucariotas. Otra diferencia es la presencia de fimbrias o pilis en las bacterias. Los procariotas pueden poseer flagelos, mientras que los de los eucariotas si los poseen, éstos tienen una estructura más compleja. Por último mencionar que mientras las células eucariotas se reproducen por mitosis, las células procariotas lo hacen por fisión binaria. En dicho proceso la célula crece, se forma un tabique y finalmente se desprenden dos células nuevas. En este proceso se produce también la replicación del ADN, de forma que las células hijas contienen cada una un duplicado idéntico del genoma de la progenitora. TAMAÑO El tamaño de las bacterias oscila entre las 0.5 y 3 µm, pudiendo llegar en algunos tipos a 10 µm. Las bacterias de interés médico tienen un tamaño entre 0.4 y 2 µm. Solo son visibles entonces, al microscopio óptico o microscopio electrónico. Para observarlas con el microscopio óptico se usa el objetivo de inmersión (100X), sumergiendo esta lente en una gota de aceite (aceite de inmersión) en el preparado a observar. A modo comparativo, una célula eucariota mide más de 5 µm (un eritrocito tiene un diámetro de 7µm), mientras que un reovirus mide menos de 0.1µm. Su tamaño pequeño determina una relación entre la superficie y el volumen elevada, con alta tasa metabólica. MORFOLOGÍA Microscópica La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared celular. Básicamente, se diferencian según su forma en cocos (esféricas u ovaladas), bacilos (cilíndrica o de bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral); dentro de estas últimas se encuentran: Treponema, Borrelia y Leptospira (ver figura 1). Las espirilos varían en el número de vueltas, TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 25 Figura 2. Morfología: 1. cocos; 2. diplococo; 3. cocos en cadenas; 4. cocos en racimos; 5. cocos en tetradas; 6. cocobacilos; 7. bacilos; 8. bacilos bordes redondeados; 9. bacilos bordes rectos; 10. bacilos fusiformes; 11, 12. bacilos curvos; 13 al 15. espiroquetas desde pocas (Borrelia) a muchas (Treponema). Las bacterias pueden mantenerse unidas unas con otras después de la división celular, pero conservando siempre la independencia celular. Si el plano de división es único, podemos encontrar diplococos o cocos en cadena (microorganismos del género Streptococcus). Si los planos de división son muchos, los cocos pueden agruparse en tétradas o en racimos (Staphylococcus). Los bacilos pueden ser muy cortos (cocobacilos) o muy largos. Sus extremos pueden ser redondeados o rectos; pueden estar aislados, en cadenas, en filamentos o formando letras chinas (Corynebacterium). Los bacilos curvos pueden tener forma de coma (Vibrio cholerae). La morfología bacteriana debe ser observada con el microscopio óptico o el microscopio electrónico, dado el tamaño pequeño de estos microorganismos. El más usado en el laboratorio es el microscopio óptico de campo claro, pero existen otros como el microscopio óptico de campo oscuro en los que los organismos aparecen brillantes en fondo oscuro. Este microscopio permite la visualización de bacterias difíciles de colorear como el Treponema pallidum, agente de la sífilis. Las bacterias pueden observarse sin tinción (examen en fresco) si se las coloca en glicerol o soluciones no acuosas que aumenten el índice de refracción o con tinción usando distintas coloraciones que mejoran su visualización ya que son células incoloras. Dichas tinciones se basan en la afinidad que presentan los colorantes por las estructuras bacterianas. Los colorantes catiónicos por ejemplo, son atraídos por los componentes de carga negativa como los ácidos nucleicos y los polisacáridos. Ejemplo de este tipo son: el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. 26 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA El examen en fresco no es el más usado para observar la morfología bacteriana porque las bacterias tienen citoplasma incoloro y su índice de refracción no difiere mucho del vidrio y del agua. Con esta técnica se puede verificar la existencia de bacterias y evidenciar su capacidad para moverse. El examen en fresco también puede ser usado con técnicas especiales como la tinción con tinta china que nos permite determinar la presencia de cápsula rodeando la bacteria. También puede usarse en el microscopio de campo oscuro por ejemplo para observar Treponemas o Leptospiras con su movimiento característico. Las coloraciones que se usan para teñir los preparados de bacterias, se pueden dividir en: simples, diferenciales y especiales. Las primeras, por ejemplo el azul de metileno, nos permiten observar la existencia de bacterias, su morfología, su agrupación, la presencia de esporos y la existencia de otros tipos celulares. Las diferenciales (por ejemplo la coloración de Gram y la de Ziehl Nielseen) además de lo anterior, permiten la diferenciación de las bacterias porque usan diferentes colorantes que se comportan distinto según el microorganismo en cuestión. Las tinciones especiales se usan para objetivar distintas estructuras como la cápsula, el núcleo, los flagelos, los esporos, etc. Antes de la coloración hay que realizar la preparación y la fijación del frotis. La preparación del frotis consiste en extender homogéneamente la muestra (por ejemplo un cultivo bacteriano) o una suspensión de la misma sobre una lámina. Una vez preparado el frotis debe secarse y fijarse (por ejemplo con calor). Con la fijación del frotis se pretende obtener la muerte de los microorganismos, la adhesión a la lámina y la conservación de su morfología. Después de preparar y fijar el frotis, se puede realizar cualquier tipo de coloración (simple o diferencial). La coloración de Gram es la más usada en bacteriología; debe su nombre a quién la describió en 1884. Es una coloración diferencial, dado que las bacterias pueden clasificarse según su respuesta en grampositivas o gramnegativas. Las primeras se tiñen de color azul violeta y las segundas adquieren un color rosado o rojo. La diferente reacción de las bacterias a la coloración de Gram se relaciona con diferencias fundamentales de la envoltura celular de estas dos clases de células. En el cuadro 1 se muestran los colorantes usados, su tiempo de aplicación y la diferente coloración que adoptan las bacterias grampositivas y gramnegativas en cada paso de la coloración de Gram. Cuadro 1. Tinción de Gram Solución Tiempo de aplicación Bacterias grampositivas Bacterias gramnegativas Colorante: cristal violeta 30 s Violeta Violeta Mordiente: lugol 1min Violeta Violeta Decolorante: alcohol acetona 10-15 min Violeta Incolora Colorante de contraste: safranina 1min Violeta Rosada Macroscópica La mayoría de las bacterias se multiplican rápidamente y son visibles como colonias cuando se las siembra en medios de cultivo sólidos adecuados. Requieren una incubación de aproximadamente 24 horas en una atmósfera que favorezca su desarrollo, a temperatura óptima. Existen excepciones como M. tuberculosis, que requiere para su desarrollo de dos a ocho semanas de incubación. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 27 Una colonia está constituida por los descendientes de una o unas pocas células. Las características de la colonia también dependen de la movilidad de la bacteria. El tamaño puede variar desde 0.5 mm (Haemophilus sp. o N. gonorrhoeae) a más grandes como las enterobacterias. La forma de la colonia puede ser circular (Staphylococcus), irregular o filamentosa (Bacillus). Los bordes pueden ser ondulados (característicos de los bacilos largos como Bacillus anthracis), en sierra o dentados (Yersinia pestis) o lisos (por ejemplo Proteus vulgaris o Escherichia coli). La superficie de la colonia también es orientadora y puede ser: plana, convexa, mamelonada, umbilicada (S. pneumoniae). En relación al pigmento que adquieren, éste puede ser: verde (P. aeruginosa), amarillo (S. aureus), grisáceo (N. meningitidis). También es diferente el comportamiento frente a la luz: brillante (Streptococcus) u opaca (Staphylococcus). Pueden presentar olores particulares como el frutal de P. aeruginosa o el putrefacto de los anaerobios. Por último hay que destacar la consistencia: mucoide (M), liso (S) o rugoso (R). Las colonias M tienen aspecto acuoso, brillante, propio de las bacterias capsuladas o que forman cubiertas polisacáridas como Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae. Los polímeros capsulares pueden ser específicos de grupo y son generalmente antigénicos. Entre las bacterias patógenas, las formas capsuladas suelen ser más virulentas. Por otra parte, las colonias S son de aspecto homogéneo, de textura uniforme y son características de microorganismos de tipo salvaje recientemente aislados de su hábitat natural como las enterobacterias. Las colonias R son de aspecto granulado, en general son cepas mutantes que carecen de proteínas o polisacáridos de superficie. Las formas R de enterobacterias, por ejemplo, generalmente no son virulentas, en oposición a la mayor resistencia de las bacterias procedentes de colonias S de tipo salvaje. Un cuarto tipo de colonia es la L y se asocia a la ausencia de la pared celular como resultado de la exposición a antibióticos; en general estas formas vuelven a sintetizar la pared celular una vez que el fármaco se extrae del medio. Estructura bacteriana Las diferentes estructuras bacterianas que observamos (ver figura 2) las podemos dividir, según sean constantes en las células o no, en estructuras permanentes o variables. Dentro de las primeras se destaca: la pared celular, la membrana celular, los ribosomas y el material genético. Las estructuras variables son: los flagelos, las fimbrias o pilis, la cápsula y los esporos. Figura 2. Diagrama de la pared bacteriana. Grampositiva a la derecha y gramnegativa a la izquierda 28 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Estructuras variables, son aquellos que existen en algunas bacterias pero no en todas; un mismo grupo bacteriano o una misma cepa bacteriana las puede presentar o no, dependiendo de las condiciones en donde se desarrolle. Las estructuras variables no resultan esenciales para la vida de la bacteria. Además podemos clasificar las estructuras bacterianas en internas o citoplásmicas y externas o de la envoltura celular. Dentro de las internas destacamos el material genético, los ribosomas y los cuerpos de inclusión. La envoltura celular engloba la membrana plasmática, la pared celular que la recubre, la cápsula y los apéndices como fimbrias o pilis y flagelos. Contiene los sitios de transporte para nutrientes, interviene en la relación huésped parásito, es blanco de las reacciones del sistema inmune y puede contener estructuras tóxicas para el huésped. ESTRUCTURAS INTERNAS O CITOPLASMÁTICAS Están inmersas en el citoplasma, solución acuosa y viscosa que contiene solutos orgánicos e inorgánicos y elementos especializados como los ribosomas y los cuerpos de inclusión. Material genético Ácido desoxirribonucleico cromosómico El ADN tanto procariota como eucariota se compone de dos cadenas helicoidales de nucleótidos de purina y de pirimidina, unidos entre sí por enlaces de hidrógeno, formando una doble hélice según el modelo de Watson y Crick. Las bacterias no poseen membrana nuclear, nucléolo ni aparato mitótico y nunca configuran una masa cromosómica definida. Esto las diferencia de las células eucariotas. Aunque no existe un núcleo delimitado, hay una zona nuclear o nucleoide. Su material genético está constituido por una molécula de ADN circular enrollado sobre sí mismo, asociado a proteínas básicas que no constituyen verdaderas histonas. Plásmidos Constituyen el material genético extracromosómico. Están constituidos por secuencias cortas de ADN circular bicatenario, que pueden existir y replicarse independientemente del ADN cromosómico y son heredados por las células hijas. Aunque no son esenciales para la vida de la bacteria, generalmente proveen a ésta una ventaja selectiva, por ejemplo: resistencia a los antibióticos, nuevas capacidades metabólicas, patogénicas (cuando codifican para factores de virulencia como toxinas, etc.) u otras numerosas propiedades. Pueden transferirse de bacteria a bacteria mediante un proceso denominado conjugación. Ribosomas Libres en el citoplasma, están compuestos por proteínas y ácido ribonucleico (ARN); su coeficiente de sedimentación es de 70S (a diferencia de la célula eucariota que es de 80S) con dos subunidades de 50S y de 30S. Pueden presentarse aislados o como polirribosomas, asociados a ARN mensajero (ARNm) y a ADN cromosómico. Un mismo ARNm puede ser traducido por varios ribosomas simultáneamente durante la síntesis proteica. Los ARNm bacterianos difieren en el número de proteínas para las que codifican. Algunos representan un único gen (monocistrónicos), otros, la mayoría, tienen secuencias que codifican para más de una proteína (policistrónicos). Su función es la síntesis proteica y su cantidad aumenta cuando la bacteria crece en medios TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 29 ricos. Su alto contenido de sustancias ácidas los hace sensibles a la tinción con colorantes positivos o básicos como el cristal violeta y el azul de metileno. Cuerpos de inclusión Son gránulos de material orgánico o inorgánico, algunas veces rodeados de membrana. En general funcionan como almacenamiento de compuestos energéticos que son usados como fuente de energía (polisacáridos, lípidos, polifosfatos). El glucógeno constituye el principal elemento almacenado por las enterobacterias (40% de su peso). Algunas pseudomonas acumulan carbono como ácido poli-α-hidroxibutirato y las micobacterias contienen gránulos de polifosfato. Con frecuencia las inclusiones pueden verse directamente con el microscopio de luz sin tinciones especiales. ESTRUCTURAS EXTERNAS O DE LA ENVOLTURA CELULAR Membrana celular Es una estructura vital para la bacteria. Representa una barrera que separa el interior del exterior celular. Consiste en una bicapa lipídica similar a otras membranas biológicas, compuesta por fosfolípidos anfipáticos; no posee esteroles a diferencia de las eucariotas (con la excepción de los mycoplasmas). La membrana se halla estabilizada por puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y cationes como el calcio y el magnesio que se combinan con los fosfolípidos cargados negativamente. Insertas en ella se encuentran múltiples proteínas transmembrana, que facilitan el transporte de sustancias hidrofílicas a través de ésta. Como las bacterias no poseen membranas internas todos los sistemas de fosforilación, oxidación y transporte de electrones (citocromos) para la producción de energía se encuentran a nivel de la membrana celular. Los mesosomas son invaginaciones de la membrana plasmática que forma vesículas, túbulos o lamelas. Aunque se han investigado durante años, su función exacta aún se desconoce; pueden estar involucrados en la formación de la pared celular durante la división celular o en la replicación del cromosoma y su distribución a las células hijas. Algunos autores consideran que los mesosomas son artefactos generados durante la fijación química de las bacterias para su observación en el microscopio electrónico. Es necesario realizar más investigaciones para solucionar esta polémica. La membrana celular cumple la función de barrera osmótica, tiene permeabilidad selectiva y permite el ingreso de nutrientes y la salida de desechos por mecanismos de transporte activo y pasivo. En ella se encuentran los sistemas de fosforilación oxidación y el transporte de electrones para la producción de energía; además tiene las enzimas necesarias para la síntesis de lípidos, de la pared celular (por ejemplo, el bactoprenol), de la cápsula, etc. Finalmente la membrana contiene moléculas receptoras especiales que ayudan a las bacterias a detectar y responder a sustancias químicas del medio externo. Pared celular Ubicada por fuera de la membrana plasmática, es una estructura vital para las bacterias que la poseen. Los fármacos que bloquean su formación producen la lisis y muerte de las bacterias susceptibles. Excepto los mycoplasmas todas las bacterias tienen una pared celular que les da forma y las protege de la lisis osmótica. La pared celular de muchos microorganismos patógenos tiene componentes que contribuyen a su patogenicidad. La pared puede proteger a la célula de las sustancias tóxicas y es el sitio de acción de algunos antibióticos. Después de que Christian Gram en 1884 desarrollase la tinción que lleva su nombre, se 30 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA comprobó que las bacterias podían clasificarse en dos grupos principales, según su respuesta a esta coloración. Las bacterias grampositivas se tiñen de color azul violeta y las gramnegativas adquieren un color rosa o rojo. La diferencia estructural verdadera entre ambos grupos se puso de manifiesto con el desarrollo del microscopio electrónico. La pared de una célula grampositiva está formada por una única capa homogénea de 20 a 80 nm de grosor de peptidoglicano o mureína, situada por fuera de la membrana celular. Por el contrario, la pared de la célula gramnegativa es más compleja; posee una capa de 2 a 7 nm de grosor de peptidoglicano rodeada por una membrana externa. En las microfotografías electrónicas se observa un espacio entre la membrana plasmática y la externa de las bacterias gramnegativas y, a menudo entre la membrana plasmática y la pared celular en las grampositivas. Dicho espacio se denomina espacio periplásmico y está ocupado por un gel, el periplasma. El espacio periplásmico de las bacterias gramnegativas contiene muchas proteínas que participan en la captación de nutrientes, por ejemplo enzimas hidrolíticas (proteasas, lipasas, fosfatasas, β-lactamasas) que convierten las macromoléculas en productos más pequeños que pueden ser metabolizados por la bacteria. El espacio periplásmico contiene también enzimas que participan en la síntesis del peptidoglicano y en la modificación de compuestos tóxicos que podrían lesionar la célula. En especies patógenas, también encontramos a ese nivel factores de virulencia como colagenasas, hialuronidasas y proteasas. Es posible que las bacterias grampositivas no tengan un espacio periplásmico visible y secretan enzimas denominadas exoenzimas, que corresponderían a las periplásmicas de las bacterias gramnegativas. El peptidoglicano o mureína es un gran polímero compuesto por muchas subunidades idénticas. (Ver figuras 3 Y 4). El polímero contiene dos aminoazúcares: N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico; unidos entre sí en la posición β1-4. El esqueleto de este polímero está formado por residuos alternantes de N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico. Una cadena peptídica de cuatro aminoácidos D- y L- alternantes está conectada a un grupo carboxilo del ácido N-acetilmurámico. Los tetrapéptidos de una y otra cadena de peptidoglicano se unen entre sí por puentes peptídicos. Existen diferencias en el espesor de esta capa de peptidoglicano. Las bacterias grampositivas tienen una capa gruesa de 0,02 a 0,06µm en forma de capas múltiples, mientras que las bacterias gramnegativas y las ácido alcohol resistentes tienen una capa fina de peptidoglicano, de 0,01 µm aproximadamente. En el momento de la división celular se debe formar una nueva pared celular. En la pared de la célula en división, enzimas producidas por la misma bacteria (autolisinas), forman como brechas en la “vieja pared”. (Ver figura 5). Es en esas brechas o aberturas donde se agrega el peptidoglicano de la nueva pared en formación. A nivel del citoplasma, se forma un precursor o unidad monomérica con uridin-difosfato ácido N-acetilmurámico (UDP-N-AcM). Los aminoácidos son adheridos secuencialmente al UDP-N-AcM hasta formar una cadena de pentapéptidos con dos D-alanina terminales. La segunda etapa en la síntesis de la pared celular se produce en la membrana plasmática, donde se encuentra el transportador lipídico: bactoprenol. El pentapéptido N-acetilmurámico se transfiere desde el UDP al bactoprenol y luego una molécula de N-acetilglucosamina se une al complejo pentapéptido N-AcM a través de este último. El bactoprenol transporta el bloque formado a través de la membrana plasmática. Cuando llega al espacio periplásmico estos bloques de disacáridos son colocados en las brechas ya formadas y unas enzimas denominadas ligasas unen los monómeros a una cadena de peptigoglicano en crecimiento. El paso final y fundamental para una correcta función de TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 31 Figura 3. Estructura del peptidoglicano. Diagrama esquemático de un segmento de peptidoglicano que muestra las cadenas de polisacáridos, cadenas laterales tetrapeptídicas y puentes peptídicos Figura 4. Entrecruzamientos en el peptidoglucano. Arriba: peptidoglucano de E. coli con enlace directo, típico de muchas bacterias gramnegativas. Abajo: ppetidoglucano de S. aureus. NAM: N-acetilmurámico; NAG: N-acetilglusamina; Gly: glicina 32 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA la pared es la unión de las cadenas de peptidoglicano entre sí. Dicho paso se conoce como transpeptidación y consiste en la unión de cadenas peptídicas adyacentes, mediante la formación de una unión peptídica entre una D-alanina de una cadena y una L-lisina o ácido diaminopimélico (DAP) de otra cadena. Esta reacción de entrecruzamiento se hace con la participación de transpeptidasas también denominadas penicilin binding proteins (PBP), ya que son el sitio blanco de acción de la penicilina y otros antibióticos β-lactámicos. Éstos se unen a las PBP impidiendo la transpeptidación, provocando la lisis osmótica de las bacterias. Esto se produciría aparentemente por la semejanza estructural entre la penicilina y el dímero D-ala-ala reconocido por las PBP que hace que en presencia de penicilina, las PBP se “confundan” y elaboren un complejo penicilina-enzima que resulta letal para la bacteria (en lugar del complejo D-ala-enzima). Figura 5. Diagrama de la biosíntesis del peptidoglucano. PEP, fosfoenolpiruvato; MurNAc y MN, ácido N-acetilmurámico; GlcNAc y GN, N-acetilglucosamina; C55, bactoprenol. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 33 Estructura de la pared celular de las bacterias grampositivas La gruesa pared celular de las bacterias grampositivas está constituida principalmente por peptidoglicano. Se cree que ésta gruesa capa de peptidoglicano es la determinante de que estas bacterias retengan el cristal violeta de la coloración de Gram. Sin embargo, estas células contienen también una gran cantidad de ácido teicoico: polisacáridos que se unen al ácido N-acetilmurámico o a los lípidos de la membrana plasmática. En este último caso se denomina ácido lipoteicoico. Tanto los ácidos teicoicos como los lipoteicoicos, tienen la función de estabilizar la pared celular. Además los ácidos teicoicos tienen un rol en la virulencia de estos microorganismos, porque actúan como antígenos de superficie que se unen a receptores específicos en las células del huésped. La superficie externa del peptidoglicano de las bacterias grampositivas está generalmente cubierta de proteínas. Los diferentes grupos de bacterias grampositivas y las diferentes especies difieren en la composición de sus proteínas y de ácidos teicoicos; ésto es útil para la clasificación serológica y la identificación bacteriana. Estructura de la pared celular de las bacterias gramnegativas Si observamos la pared de las bacterias gramnegativas al microscopio electrónico podemos observar tres zonas: la membrana plasmática, el espacio periplásmico que incluye una fina capa de peptigolicano y la membrana externa. Esta última, exclusiva de las bacterias gramnegativas, es una bicapa lipídica que difiere de otras membranas por su capa externa, que está constituida por una molécula anfipática: el lipopolisacárido (LPS) o endotoxina. Además del LPS, la membrana externa contiene fosfolípidos y proteínas que la unen al peptidoglicano. El LPS está constituido por tres partes: el lípido A, el polisacárido central o del core y la cadena lateral O. (Ver figura 6). La región del lípido A está inmersa en la membrana externa y el resto de la molécula del LPS sobresale de la superficie celular. El core o polisacárido central está unido al lípido A. La cadena O u antígeno O, consiste en unidades repetidas de una subunidad tetrasacárida y es muy variable en su composición entre las diferentes familias, especies y aún dentro de la misma especie de bacterias gramnegativas; en cambio, el polisacárido del core es constante para un mismo género bacteriano. El polisacárido O por su variabilidad es usado frecuentemente para la clasificación serológica de las bacterias. La mayoría de las bacterias sintetizan moléculas de LPS con un antígeno O de longitud completa, algunas especies fabrican moléculas cortas de antígeno O y otras casi no lo sintetizan. Las formas con poco o ningún antígeno O se conocen como rugosas, en oposición a las formas lisas productoras de antígeno O de tamaño completo. Macroscópicamente se observan como colonias de bordes rugosos (LPS truncado) o colonias lisas (LPS completo). Una de las funciones más importantes de la membrana externa es servir como barrera protectora. Evita o disminuye la entrada de sales biliares, antibióticos y otras sustancias tóxicas que podrían destruir o lesionar la bacteria. La membrana externa es más permeable que la plasmática y permite el pasaje de pequeñas moléculas como glucosa y otros monosacáridos. Dicho pasaje se debe a la presencia de porinas, proteínas integrales o transmembrana que forman canales estrechos por los cuales pasar moléculas menores de 600 a 700 dalton. Moléculas mayores como la vitamina B12 pueden atravesar la membrana externa por transportadores específicos. Esta membrana externa previene la pérdida de constituyentes como las enzimas periplásmicas. En la figura 7 se esquematiza la estructura de la envoltura de una bacteria grampositiva y de una gramnegativa. 34 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 6. Estructura del LPS de Salmonella. Abe, abecuosa; Gal, galactosa; Glc, glucosa; GlcN, glucosamina; Hep, h e p t u l o s a ; K D O, 2-ceto-3-desoxioctonato; Man, manosa; NAG, N-acetilglucosamina; P, fosfato; Ra, L-ramnosa. Fundamento de la coloración de Gram Es probable que la diferencia entre las bacterias grampositivas y gramnegativas se deba a la naturaleza física de sus paredes celulares. El peptidoglicano no se tiñe por sí mismo, más bien parece actuar como barrera de permeabilidad para evitar la pérdida de cristal violeta. Durante el proceso de coloración las bacterias se tiñen primero con cristal violeta y luego se tratan con yoduro para favorecer la retención del colorante. En la decoloración con etanol, se cree que el alcohol contrae los poros de la capa gruesa de peptidoglicano y se retiene el complejo colorante yoduro; así las bacterias adquieren color violeta. Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las bacterias gramnegativas es muy fina, con menos enlaces y con poros de mayor tamaño. Además, es posible que le tratamiento con alcohol extraiga suficientes lípidos de la membrana externa como para aumentar su porosidad. Por estos motivos el alcohol elimina más fácilmente el complejo cristal violeta yoduro en las bacterias gramnegativas. Funciones de la pared celular Otorga rigidez y da forma a las bacterias y las protege de la lisis osmótica. Su importancia clínica deriva de su susceptibilidad a la acción de los antibióticos, dado que éstos actúan TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 35 Figura 7. La estructura de envoltura de un microorganismo grampositivo (izquierda) y un microorganismo gramnegativo (derecha). No se muestran las cápsulas y los apéndices ni las proteínas de superficie, como la proteína M de los etreptococos. Obsérvese la cantidad 20 veces mayor peptidoglicano en el microorganismo grampositivo. La membrana externa de la envoltura del microorganismo gramnegativo muestra moléculas de polisacáridos del antígeno O cubriendo la capa externa sobre un blanco que no es propio del hombre y que es vital para la vida bacteriana (poseen toxicidad selectiva). También actúa como filtro, impidiendo el ingreso de algunas moléculas y permitiendo la entrada de metabolitos imprescindibles y agua. Contiene determinantes patogénicos, como el lípido A del LPS y estructuras antigénicas que sirven para identificar y clasificar a la bacteria (antígeno O de las enterobacterias o polisacárido C del Streptococcus sp.). Podríamos decir entonces, que la pared bacteriana es un gran mosaico de antígenos que son usados en la clasificación y en la identificación bacteriana. También antígenos de la pared celular (antígeno O del LPS y proteínas de la membrana externa), han sido ensayados como inmunógenos en la producción de vacunas; por ejemplo la vacuna antimeningocócica para el grupo B. La porción central del LPS o core, que es invariable entre las diferentes bacterias y no es tóxica, también se ha ensayado como inmunógeno. Principales efectos del lipopolisacárido o endotoxina El LPS es termoestable, resistente incluso a la esterilización con autoclave. Su actividad endotóxica se asocia al componente lipídico A, liberado cuando la célula se lisa como consecuencia de la fagocitosis o de la acción antibióticos (de ahí el nombre de endotoxina). Hoy se sabe que la gravedad del cuadro clínico depende de la cantidad de endotoxina circulante, pudiendo determinar desde un simple cuadro infeccioso con fiebre hasta sepsis, falla multiorgánica y muerte. Pequeñas cantidades de endotoxina provocan reacciones de alarma: fiebre, activación del complemento por la vía alternativa, activación de los macrófagos y estimulación de linfocitos B. En grandes dosis produce shock e incluso la muerte. Cuatro tipos de células constituyen el blanco primario de la endotoxina: los fagocitos 36 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA mononucleares (macrófagos del bazo, de la médula ósea, de los alvéolos pulmonares y de la cavidad peritoneal, monocitos de la sangre periférica y células de Kupffer), los neutrófilos, las plaquetas y los linfocitos B. Es probable que éstas células tengan receptores de endotoxina específicos. La endotoxina también actúa como pirógeno, por lo tanto causa fiebre cuando se acumula suficiente cantidad de bacterias gramnegativas en los tejidos como para hacer contacto con la circulación. La fiebre se produce porque la endotoxina induce la liberación de ciertas proteínas conocidas como pirógenos endógenos desde los fagocitos mononucleares. Los mejor conocidos son la interleuquina-1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral (TNF). Las bacterias grampositivas también inducen fiebre, pero como carecen de endotoxina, son los componentes de la pared celular los que causan liberación de la IL-1 y del TNF. La endotoxina activa el complemento por la vía alternativa. Esto trae como consecuencia la producción del complejo de ataque a la membrana, la quimiotaxis de los fagocitos (C5a fundamentalmente) y la opsonización (C3b). La activación del complemento conduce también a un aumento de la permeabilidad vascular (mediado por las anafilotoxinas C3a y C5a) y a la liberación de enzimas lisosómicas desde los neutrófilos (desgranulación). Todos estos efectos producen la respuesta inflamatoria. La endotoxina activa los macrófagos, es decir los estimula para que aumenten la producción de enzimas lisosómicas, aceleren la velocidad de la fagocitosis y secreten algunas hidrolasas hacia el medio. La acción de los macrófagos activados incluye la destrucción de ciertas células cancerosas, por lo que el estudio de los derivados de endotoxina como potenciales agentes antitumorales es un tema de muchas investigaciones. Cuando se libera la IL-1, la endotoxina induce la división de los linfocitos B. Estos maduran a células productoras de anticuerpos y aumentan la resistencia a las infecciones por aumento del nivel de anticuerpos. Cuando se administran grandes cantidades de endotoxina, se produce un shock endotóxico, con frecuencia letal, que se manifiesta por caída severa de la presión arterial y un fenómeno denominado coagulación intravascular diseminada (CID), entre otros. El CID es el resultado del depósito de trombos en los vasos de pequeño calibre, con el consiguiente daño en las áreas privadas de irrigación sanguínea; el consumo de plaquetas, así como de factores de la coagulación (II, V y VII) excede la velocidad de producción la que conduce a hemorragias internas y falla orgánica (fundamentalmente en pulmón, riñón e hígado). La endotoxina contribuye a la coagulación de la sangre de tres formas: activa el factor de Hageman o factor XII de la coagulación, quien activa la vía intrínseca de la coagulación; provoca la liberación de gránulos de las plaquetas que están involucrados en la coagulación y provoca la liberación de proteínas básicas de los neutrófilos que estabilizan los coágulos de fibrina. Hoy se cree que los mediadores claves de la hipotensión inducida por la endotoxina son el TNF y la IL-1. Un punto de vista previo sostiene que la caída de la resistencia de los vasos periféricos se debe a la acumulación de aminas vasoactivas (histamina y quinina). Las bacterias grampositivas no poseen endotoxina, pero pueden producir un cuadro similar al del shock endotóxico de las bacterias gramnegativas. Las mismas citoquinas que se liberan ante la presencia del LPS, son liberadas ante la presencia de la pared de las bacterias grampositivas, produciendo los mismos efectos. A la luz de las investigaciones actuales, los fragmentos de peptidoglicano y de ácidos teicoicos, juegan un papel semejante al del LPS. Si se inyectan a animales tienen efectos similares a los producidos por la endotoxina de los microorganismos gramnegativos. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 37 Estructura de la pared celular de las bacterias ácido-alcohol resistentes Nos referiremos como modelo de este grupo al género Mycobacterium. Además del peptidoglicano, la pared celular de las micobacterias tiene muchos glicolípidos como el complejo lipídico arabinogalactano y los ácidos micólicos, éstos últimos solo son encontrados en las Mycobacterium y las Corynebacterium spp. Esta gran cantidad de lípidos hace que las bacterias ácido alcohol resistentes no se tiñan o lo hagan mal con la coloración de Gram. Para teñirla, se recurre a coloraciones con fucsina (colorante rojo), con calentamiento del colorante y luego de este procedimiento resisten la decoloración de una mezcla de alcohol y ácido, que constituye la tinción de Ziehl Nielseen. Esta gran cantidad de lípidos de la pared, 10% del total del peso de la micobacteria, la protege de la acción deletérea de los componentes del fagolisoma y, probablemente, sea la razón por la que las micobacterias pueden sobrevivir dentro de los macrófagos. Los componentes de la pared de las micobacterias también tienen la capacidad de estimular al sistema inmune, tanto es así que se usa para aumentar la producción de anticuerpos cuando se inyecta antígenos proteicos, o sea, se usa como adyuvante. El adyuvante de Freund tiene como componente básico pared de micobacterias. De todo lo expuesto se desprende la importancia del conocimiento de las diferentes paredes celulares de las bacterias (grampositivas, gramnegativas y ácido alcohol resistentes) a la hora de estudiar mecanismos de agresión, sensibilidad a los antibióticos, taxonomía, clasificación bacteriana, identificación, etc. Cápsula Cuando existe está ubicada por fuera de la pared celular. Las bacterias producen material capsular que, cuando se asocia íntimamente a la superficie celular recibe el nombre de cápsula. Si su adherencia es débil y de grosor variable, se conoce como limo. Generalmente es de naturaleza polisacárida (a excepción de la cápsula del Bacillus anthracis que es peptídica). No es una estructura vital para la célula, su pérdida no se relaciona con la pérdida de viabilidad celular, pero sí con cambios de la morfología colonial y con la pérdida de la virulencia bacteriana. La virulencia de algunos patógenos se correlaciona con la presencia de cápsula, como por ejemplo: Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae tipo b. La cápsula protege a la bacteria de la fagocitosis, principal mecanismo de defensa que pone en juego el huésped ante la presencia de bacterias capsuladas. Una respuesta efectiva para defenderse de este tipo de bacterias implica la producción de anticuerpos que se unan específicamente a la cápsula facilitando la opsonización y la fagocitosis. De su capacidad antigénica se desprende el uso de la cápsula para la producción de diferentes vacunas que estimulan la formación de anticuerpos específicos. Ejemplos de ellas son las vacunas: anti neumocócica, anti Haemophilus influenzae tipo b y anti meningocócica A, B y C. Las bacterias que producen cápsula forman en los medios sólidos colonias acuosas, mucoide (M) o lisas (S), en cambio, las cepas rugosas (R) no producen cápsula. La pérdida de la capacidad de formar cápsula por mutación S a R se correlaciona con la pérdida de la virulencia y el aumento de la susceptibilidad a la destrucción por los fagocitos; aunque no afecta la viabilidad. Muchas cepas bacterianas producen cápsula o limo cuando son aisladas en cultivo por primera vez a partir de un huésped. Con los reaislamientos sucesivos, dejan de producirla, lo que indicaría que la presencia de la cápsula no ofrece ventaja selectiva in 38 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA vitro. Su producción está regulada genéticamente, de forma que las bacterias la presentan cuando es necesaria para la supervivencia dentro del huésped. La presencia de cápsulas también se puede demostrar por tinción negativa con tinta china. La tinta china no penetra la cápsula pero delimita un contorno refringente alrededor del cuerpo bacteriano en un fondo oscuro. Los antígenos capsulares son muy útiles en la clasificación e identificación de diferentes bacterias, por ejemplo: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, etc. Fimbrias o pilis Son estructuras filamentosas, proteicas, que se diferencian de los flagelos por su diámetro (menor a 8 nm) y por no poseer estructura helicoidal; no cumplen funciones de movilidad. Son estructuras variables, no vitales para las bacterias que las poseen. Los pili comunes cumplen funciones de adherencia a receptores específicos y superficiales, esto es importante en las especies de relevancia clínica porque median la adherencia de muchas bacterias a determinados epitelios, jugando un papel fundamental en la colonización. Por ejemplo, las cepas de Neisseria gonorrohoeae patógenas son aquellas que poseen fimbrias que se adhieren específicamente al epitelio uretral del hombre o al epitelio del cérvix uterino de la mujer. Las cepas de E. coli capaces de causar infección urinaria tienen fimbrias que les permiten adherirse específicamente al epitelio del aparato urinario. También la E. coli enteropatógena (EPEC) tiene fimbrias que le permiten adherirse al epitelio intestinal para luego producir los cambios que determinarán la diarrea. Existen otras estructuras llamadas pilis sexuales que son más largos y poca cantidad (dos o tres por célula). Estos intervienen en el intercambio genético entre bacterias, de allí su nombre. El apareamiento de dos bacterias y la transferencia de ADN a través del pili sexual se conoce como conjugación. Se transfiere material genético de una célula donadora (que posee un plásmido F que codifica el pili sexual, entre otras cosas) a una receptora. En general el material transferido es un plásmido o una porción de cromosoma movilizada por un plásmido. Una vez unidas las bacterias los pilis sexuales se retraen, permitiendo que las células se unan y pase el ADN de la donadora a la receptora, formándose una verdadera unión (puente) entre las membranas de las células para el pasaje del ADN. La célula receptora está estrechamente emparentada con la donadora y posee un receptor específico para los pilis sexuales. Flagelos y filamentos axiales Los flagelos son filamentos proteicos, helicoidales, delgados y rígidos, de longitud y diámetro uniforme, responsables de la movilidad de la bacteria. Los flagelos son tan delgados que no pueden observarse directamente con un microscopio de campo claro, deben teñirse con técnicas especiales para aumentar su grosor. La estructura detallada de un flagelo puede verse solo con el microscopio electrónico; así es que se ha demostrado que el flagelo bacteriano está compuesto de tres partes: el filamento, el gancho y el cuerpo basal. El primero sobresale de la superficie de la bacteria y se une a ese nivel con el gancho, que está fijo al cuerpo basal. Éste último está anclado en la membrana plasmática y está compuesto por un cilindro y dos o más juegos de anillos contiguos a la membrana plasmática, el peptidoglicano y, en las bacterias gramnegativas, a la membrana externa (ver figura 8). El filamento tiene forma de hélice rígida y la bacteria se mueve cuando ésta gira, como las hélices de un barco. La dirección de la rotación flagelar determina la naturaleza del movimiento bacteriano: la rotación de los flagelos en dirección contraria a las agujas del reloj TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 39 Figura 8. Esquema comparativo de la estructura del flagelo en gramnegativas permite el movimiento de avance, mientras que la rotación en el sentido de las agujas del reloj hace que las células den vueltas. Los flagelos pueden variar en número, desde uno a cientos. Las especies bacterianas difieren por sus modelos de distribución de flagelos. Las monotricas (trichous: pelo) tienen un solo flagelo que si se sitúa en un extremo de la bacteria y se denomina polar. Las bacterias anfitricas (amphi: en ambos lados) tienen un flagelo en cada polo bacteriano. En cambio, las lofotricas (lopho: mechón) poseen un grupo o penacho de flagelos en uno o ambos extremos. Por último, en las bacterias peritricas (peri: alrededor), los flagelos se distribuyen uniformemente en toda la superficie bacteriana. Los modelos de distribución de los flagelos son útiles para identificar a las bacterias. Los flagelos no son necesarios para la vida bacteriana. Su síntesis está regulada por las necesidades nutricionales o el estado energético y ocurre por la adición de monómeros de flagelina al extremo distal de los flagelos en crecimiento. La síntesis del filamento es un ejemplo excelente de autoensamblaje, es decir que la información necesaria para construir el filamento está en la propia estructura de la subunidad de flagelina; no colaboran enzimas especiales u otros factores. Las bacterias flageladas pueden buscar nutrientes o evitar los tóxicos siguiendo los gradientes; la función flagelar se debe a respuestas quimiotácticas y la energía para el movimiento proviene de una corriente de protones. La movilidad y, por lo tanto, la presencia de flagelos, constituye un factor de virulencia. El antígeno flagelar recibe el nombre de antígeno H. Las bacterias flageladas reaccionan con antisueros específicos para flagelos, provocando una aglutinación típica. Las espiroquetas (Treponemas, Leptospiras y Borrelias) se mueven en onda helicoidal; dicho movimiento les permite penetrar en medios viscosos. Estas bacterias tienen filamentos axiales que no se extienden de un polo a otro de la célula, sino que se originan en polos opuestos y se superponen en el centro de la célula, sin presentar conexiones entre sí. 40 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA ESPOROS Algunas bacterias grampositivas pueden formar una estructura especial inactiva de resistencia, denominada endospora o espora. Se desarrollan dentro de células bacterianas vegetativas (por eso la denominación de endospora) de los géneros Bacillus y Clostridum entre otros. Estas estructuras son resistentes a situaciones vitales estresantes como el calor, la desecación, la radiación ultravioleta, los ácidos y los desinfectantes químicos. Debido a su resistencia y al hecho de que varias especies de bacterias formadoras de esporas son agentes patógenos peligrosos, las esporas tienen gran importancia en microbiología alimentaria, industrial y médica. El conocimiento de estas formas altamente resistentes al calor (pueden sobrevivir a la cocción durante una o más horas) fue esencial para el desarrollo de métodos adecuados de esterilización para medicamentos, alimentos, medios de cultivo microbiológicos, etc. En el ambiente las endosporas permiten la supervivencia de las bacterias cuando la humedad o los nutrientes son escasos. Se pueden observar con el microscopio óptico y electrónico. Como las esporas son impermeables a la mayoría de los colorantes, se observan como áreas incoloras dentro de las células coloreadas. Existen además coloraciones especiales para teñir los esporos. La situación de la espora en la célula madre o esporangio, es característica para una especie bacteriana determinada, siendo esto importante para la identificación de la bacteria. Las esporas pueden estar en el centro de la bacteria (C. perfringens), próxima a un extremo o subterminal (C. botulinum) o en el extremo, terminales (C. tetani). A veces la espora es tan grande que deforma el esporangio (C. botulinum). Dentro de una célula vegetativa se produce una espora única, que se diferencia de la célula madre en su morfología y composición, en el aumento de la resistencia a los ambientes adversos y en la ausencia de actividad metabólica evidente. El proceso incluye la formación de numerosas cubiertas y la captación de calcio con síntesis de ácido dipicolínico. Al final de la esporulación queda una partícula deshidratada que contiene ADN genómico. Ese ADN se vuelve resistente a la desecación, al calor extremo, a la radiación y al ataque por la mayoría de las enzimas y agentes químicos. Pueden permanecer en esta forma por años o convertirse nuevamente en la forma vegetativa idéntica a la que les dio origen; este proceso recibe el nombre de germinación de la espora. La germinación se produce por el calentamiento suave o la presencia de nutrientes determinados; la espora capta agua, se hincha, se desprenden sus cubiertas y se forma la célula vegetativa idéntica a la original. El ciclo vital de una bacteria productora de esporos se ilustra en la figura 9. La estructura de la espora es compleja y se distinguen de afuera hacia adentro: el exosporio, capa delicada y delgada; la cubierta, compuesta por muchas capas de proteínas, puede ser gruesa; la corteza, constituida por peptidoglicano modificado, con menos enlaces que en la célula vegetativa, puede ocupar la mitad del volumen celular; la pared celular de la espora rodeando al protoplasto y el protoplasto, conteniendo las estructuras celulares normales como ribosomas y un nucleoide. Aún no se ha determinado por que la espora es tan resistente al calor y otros agentes letales. El 15% del peso seco de la espora consiste en ácido dipicolínico que forma complejos con iones de calcio. Quizá el complejo dipicolinato cálcico estabilice los ácidos nucleicos de las esporas. Recientemente se han descubierto en endosporas, proteínas pequeñas, solubles en ácido que se unen específicamente al ADN, lo saturan y lo protegen del calor, la radiación, la desecación y las sustancias químicas. La deshidratación del protoplasto parece ser muy importante en la resistencia al calor. La corteza puede eliminar osmóticamente el agua del protoplasto y proteger así a la célula del calor y la radiación. En resumen, la resistencia TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 41 Figura 9. Esquema del proceso de esporulación al calor de las endosporas se produce por: estabilización del ADN por dipicolinato cálcico y proteínas solubles en ácido, deshidratación del protoplasto y mayor estabilidad de las proteínas celulares en bacterias adaptadas a crecer a temperaturas elevadas, entre otras. La formación de esporas, esporogénesis o esporulación, comienza cuando cesa el crecimiento debido a una falta de nutrientes. Los cambios que ocurren durante la esporulación son el resultado del cese de la función de ciertos genes vegetativos y de la expresión de nuevos genes. La formación de esporos se regula negativamente: la célula elabora un represor; a partir de algún componente del medio, que impide la iniciación de la esporulación. Cuando este compuesto se agota, se libera la inhibición y se inicia la esporulación. El factor específico que regula la iniciación de la esporulación es el trifosfato de guanosina (GTP). La disminución del pool de GTP es suficiente para iniciar la esporulación en algunas especies bacterianas estudiadas. La transformación de esporas inactivas en células vegetativas es casi tan compleja como la esporulación. Se producen tres fases: activación, germinación y crecimiento. La primera es un proceso reversible que se produce generalmente por calentamiento o por sustancias químicas. Una endospora no germinará satisfactoriamente, incluso en un medio rico en nutrientes, si no ha sido activada. En la germinación termina el estado de reposo de la espora. Es un proceso irreversible desencadenado por la exposición del esporo activado a algunos nutrientes y otros estimulantes (alanina, otros aminoácidos, nucleósidos y glucosa). Se caracteriza por hinchazón de la espora, rotura o absorción de la cubierta de ésta, pérdida de la resistencia al calor y otros factores estresantes, pérdida de la refractariedad, liberación de los componentes de la espora y aumento de la actividad metabólica. Por último, en el crecimiento, el protoplasto de la espora sintetiza nuevos componentes, emerge a partir de los restos de la cubierta de la espora y se transforma nuevamente en una bacteria activa. 42 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Bibliografía • Prescott, Harley, Klein. Microbiología. Mc Graw-Hill Interamericana de España. 4ª ed. 1999. • Schaechter M, Medoff G, Eisenstein BI, Guerra H. Microbiología. Mecanismos de las enfermedades infecciosas. Ed Panamericana. 2ª ed. Buenos Aires 1993 • Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiología. 20ª ed. BsAs. Panamericana; 1994. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 43 Página 43 3 Fisiología y metabolismo bacteriano G. Varela, G. Grotiuz Las bacterias son los organismos más pequeños que tienen la maquinaria requerida para el crecimiento y la replicación. Están compuestas, como las células eucariotas, por proteínas, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, entre otros. Estas macro-moléculas pueden formar parte de estructuras celulares más complejas, como la pared celular y la membrana plasmática. El crecimiento bacteriano se define como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de la célula. Es un proceso complejo que supone la replicación de todas las estructuras y componentes celulares a partir de nutrientes exógenos. El conocimiento de la fisiología y del metabolismo bacteriano tiene algunas aplicaciones prácticas. En principio permite conocer el modo de vida y el hábitat de diferentes especies bacterianas. El ser humano actuando como huésped, ofrece una variedad de nichos ecológicos que se diferencian entre sí por aspectos físicos y químicos (temperatura, concentración de oxígeno, pH, presión osmótica, etc.), en los cuales pueden crecer y multiplicarse distintas especies bacterianas según sus requerimientos nutricionales, ambientales y atmosféricos. Además, permite formular medios de cultivo para el aislamiento e identificación de los patógenos participantes. Desde un enfoque terapéutico, nos permite conocer y entender el modo de acción de algunos antibióticos que bloquean una vía metabólica o la síntesis de alguna macromolécula esencial para la bacteria. El término metabolismo se refiere al conjunto de reacciones químicas que se producen en la célula y tiene tres funciones específicas. La primera es obtener energía química del entorno y almacenarla, para luego usarla en diferentes funciones celulares. La segunda es convertir los nutrientes exógenos en unidades precursoras de los componentes macromoleculares de la célula bacteriana. Y la tercer función es formar y degradar moléculas necesarias para cumplir funciones celulares específicas, por ejemplo: movilidad y captación de nutrientes. El metabolismo se produce por secuencias de reacciones catalizadas enzimáticamente y se divide en anabolismo y catabolismo. El proceso por el cual la célula bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como anabolismo y resulta en la producción de nuevo material celular; también se denomina biosíntesis. La biosíntesis es un proceso que requiere energía, por lo tanto las bacterias deben ser capaces de obtenerla de su entorno para crecer y, eventualmente, multiplicarse. El conjunto de reacciones degradativas de los nutrientes para obtener energía o para convertirlos en unidades precursoras de la biosíntesis, se conoce como catabolismo. Así, hemos visto dos tipos de transformaciones químicas que ocurren simultáneamente en la bacteria, por lo tanto el metabolismo es el resultado colectivo de ambas reacciones. 44 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Las catabólicas resultan en la liberación de la energía química contenida en los nutrientes, mientras que las anabólicas la consumen. Por lo tanto, la energía liberada como resultado de las reacciones de oxidación reducción del catabolismo, debe ser almacenada y transportada de alguna manera. Una de ellas es como compuestos con uniones fosfato de alta energía; dichos compuestos luego se usan como intermediarios en la conversión de la energía conservada en trabajo útil. El compuesto fosfato de alta energía más importante en los seres vivos es el trifosfato de adenosina (ATP). Éste se genera en la célula bacteriana por dos procesos diferentes: fosforilación a nivel del substrato y fosforilación oxidativa. Metabolismo productor de energía En los seres vivos, la utilización de la energía potencial contenida en los nutrientes se produce por reacciones de oxidación reducción. Químicamente la oxidación esta definida por la pérdida de electrones y, la reducción por la ganancia de los mismos. En bioquímica, estas reacciones frecuentemente incluyen también la transferencia de átomos enteros de hidrógeno, por lo tanto se conocen con el nombre de reacciones de deshidrogenación. En las reacciones de este tipo hay sustancias que ceden electrones (dadoras) y otras que los aceptan (aceptoras). En las bacterias de interés médico los sistemas de oxidación reducción transforman la energía química de los nutrientes en una forma biológicamente útil; dichos procesos incluyen la fermentación y la respiración. En la primera, tanto la molécula dadora como la aceptora de electrones, son compuestos orgánicos. En cambio, en la respiración hay un aceptor final exógeno, que cuando es el oxígeno se denomina respiración aerobia y cuando es un compuesto inorgánico, respiración anaerobia. FERMENTACIÓN En ésta los electrones pasan del dador, un intermediario formado durante la degradación del substrato, hacia un aceptor constituido por algún otro intermediario orgánico también generado durante el catabolismo del substrato inicial. Por lo tanto, este proceso de oxidación reducción no requiere el aporte exógeno de un aceptor final de electrones. Aunque hay distintos tipos de fermentaciones, todas llevan a una oxidación parcial de los átomos de carbono del substrato inicial y liberan, por lo tanto una pequeña parte de la energía potencial contenida (Ver figura 1). El rendimiento energético de este proceso es menor que el de la respiración. En las bacterias se encuentran las tres vías centrales del metabolismo intermediario de los hidratos de carbono: la glucolítica o de Embden Meyerhof Parnas, la de pentosa fosfato o shunt de las pentosas y la de Entner-Doudoroff. La vía glucolítica que degrada la glucosa se divide en tres etapas principales. La primera es preparativa, con reacciones que no son de oxidación reducción, sin liberación de energía y con formación de dos intermediarios de tres átomos de carbono cada uno. En la segunda etapa, sí ocurren reacciones de oxidación reducción con liberación de energía, formación de ATP por fosforilación a nivel del substrato (el ATP se genera en un paso enzimático específico) y producción de dos moléculas de piruvato. En la tercer etapa, nuevamente ocurren reacciones de oxidación reducción y se generan los productos finales de la fermentación, que varían según la bacteria en cuestión. Solo una pequeña parte de la energía libre que potencialmente puede derivar de la degradación de una molécula de glucosa queda disponible por esta vía, dado que los productos finales son compuestos en los que el carbono se encuentra todavía en estado reducido. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 45 Figura 1. Rol central del piruvato en las fermentaciones Por cada molécula de glucosa que entra a esta vía, se forman cuatro moléculas de ATP y como se consumen dos en la primer etapa, el balance neto es de dos moléculas de ATP por cada molécula de glucosa fermentada. El destino final del metabolito clave, el piruvato, depende de los procesos empleados para la regeneración del dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD) a partir del dinucleótido de nicotinamida adenina reducido (NADH) y así mantener el equilibrio de oxidación reducción. Aunque la vía glucolítica es la más importante en las células eucariotas y procariotas, no es la única. La vía de las pentosas es una ruta multifuncional para la degradación de hexosas, pentosas y otros hidratos de carbono. Para los fermentadores heterolácticos es la principal fuente productora de energía, aunque la mayoría de las bacterias usan esta vía como fuente de dinucleótido de nicotinamida adenina fosfato reducido (NADPH) y de pentosas para la síntesis de nucleótidos. La vía de Entner-Doudoroff es la ruta principal para la degradación de la glucosa en las bacterias aerobias estrictas como Neisseria y Pseudomonas. Como sucede en la vía de las pentosas, aquí solo se produce una molécula de ATP por molécula de glucosa degradada. El ácido pirúvico derivado de la glucosa, es un compuesto clave en el metabolismo fermentador de los hidratos de carbono. En su formación, el NAD es reducido a NADH y éste 46 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA debe oxidarse nuevamente a NAD para alcanzar el equilibrio final de oxidación reducción. Las bacterias se diferencian de las células eucariotas por la forma en que eliminan el piruvato; en las bacterias la oxidación incompleta es la regla y se acumula gran cantidad de metabolitos finales de la fermentación. El estudio y el conocimiento de las fermentaciones bacterianas tiene importancia práctica, porque proporciona productos industriales que son útiles en el laboratorio para identificar las diferentes especies. Entonces, según los productos finales, tenemos diferentes tipos de fermentación: alcohólica, homoláctica, heteroláctica, del ácido propiónico, ácido mixta, de butanodiol y del ácido butírico. Fermentación alcohólica Es el tipo de fermentación más antigua que se conoce. Produce etanol a partir de glucosa. Aunque ciertas bacterias producen alcohol, éste es elaborado por otras vías. Fermentación homoláctica Todos los miembros del género Streptococcus, Pediococcus y muchas especies de Lactobacillus fermentan la glucosa fundamentalmente a ácido láctico con poca acumulación de otros productos finales. En esta reacción el piruvato se reduce a ácido láctico por acción de la enzima láctico deshidrogenasa, actuando el NADH como dador de electrones. Esto ocurre en la tercer etapa de la vía glucolítica. Fermentación heteroláctica En este tipo de fermentación solo la mitad de la glucosa se convierte en ácido láctico, el resto se transforma en una mezcla de anhídrido carbónico (CO2), ácido fórmico, ácido acético, etc. En esta fermentación se emplea fundamentalmente la vía de las pentosas y se produce en las bacterias del género Leuconostoc y Lactobacillus. Fermentación del ácido propiónico Es característica de algunas bacterias anaerobias como el Propionibacterium (bacilo grampositivo, no esporulado). Este tipo de fermentación tiene la ventaja de que genera una molécula más de ATP. Fermentación ácido mixta Es característica de la mayoría de las enterobacterias. Bacterias como Shigella, Salmonella y E. coli fermentan las hexosas a través del piruvato a ácido láctico, ácido acético, ácido succínico y ácido fórmico. Fermentación de butanodiol Varias bacterias como Enterobacter, Serratia y Bacillus producen 2,3-butanodiol durante la fermentación de la glucosa. Este deriva de la condensación de dos moléculas de piruvato en una molécula neutra de acetoína que luego es reducida a 2,3-butanodiol. Fermentación del ácido butírico Se ve en bacterias del género Clostridium (bacilo grampositivo, anaerobio y esporulado). Si bien hasta ahora nos hemos referido solo a la fermentación de hidratos de carbono como procedimiento para obtener energía, debemos destacar que otros compuestos orgánicos pueden ser fermentados, por ejemplo: aminoácidos (alanina, glicina). En Clostridium proteolíticos, la fermentación de aminoácidos más característica es la reacción de Stickland. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 47 Anteriormente hemos discutido el metabolismo de los hidratos de carbono en ausencia de un aceptor externo de electrones y hemos visto que solo una pequeña parte de la energía potencial contenida en el substrato es liberada. Esto se debe a que la diferencia entre los potenciales de oxidación reducción entre la molécula dadora inicial y la aceptora final es muy pequeña. Otras bacterias tienen la capacidad de oxidar completamente el substrato inicial a CO2 por el proceso conocido como respiración. RESPIRACIÓN Es el proceso por el cual un substrato es oxidado completamente a CO2 y agua, con participación de una cadena de electrones ubicada en la membrana plasmática, en la cual el aceptor final es el oxígeno molecular u otro compuesto inorgánico (nitratos, sulfatos, anhidrido carbónico, etc.)–anaerobia–. Los primeros pasos en la respiración de la glucosa son idénticos a los de la glucólisis, pero mientras en esta última el piruvato es convertido en productos finales de la fermentación (ácido láctico, ácido propiónico, etc.), en la respiración es oxidado completamente a CO2 mediante el ciclo de Krebs (ver figura 2). Por cada molécula de piruvato oxidada en este ciclo, se generan tres moléculas de CO2. Al igual que en la fermentación, los electrones generados en el ciclo de Krebs, pasan a coenzimas que tienen NAD. Sin embargo, en la respiración aerobia, los electrones del NADH son transferidos al oxígeno para regenerar NAD a través de un sistema transportador, en lugar de cederlos al piruvato. SISTEMAS TRANSPORTADORES DE ELECTRONES Y GENERACIÓN DE TRIFOSFATO DE ADENOSINA Estos sistemas están compuestos por transportadores (carriers) de electrones, asociados a la membrana plasmática y tienen dos funciones básicas: aceptar electrones de un donador y cederlos a un aceptor y conservar energía liberada durante ese transporte en forma de ATP por fosforilación oxidativa. Existen varios tipos de enzimas de oxidación reducción y proteínas transportadoras de electrones, entre los que se destacan las NAD-deshidrogenasas, las flavoproteínas y los citocromos. Las flavoproteínas contienen un derivado de la riboflavina como grupo prostético que se reduce y se oxida alternativamente. La riboflavina, conocida como vitamina B2, es necesaria como factor de crecimiento por algunas bacterias. Los citocromos son proteínas que tienen anillos porfirínicos con hierro y también se oxidan y se reducen alternativamente. Hay diferentes tipos de citocromos que se distinguen por sus potenciales de reducción. Se los designa con letras a, b, c, etc. También están las quinonas, sustancias liposolubles relacionadas con la vitamina K, que participan en el transporte de electrones. Para entender como se genera el ATP durante el transporte de electrones, debemos recodar su orientación con respecto a la membrana plasmática de la célula bacteriana. La cadena está ubicada como ya dijimos en la membrana plasmática, de tal modo que durante el proceso de transporte hay una separación física entre protones y electrones. Los protones quedan fuera de la célula, mientras que los electrones quedan dentro de ésta; en consecuencia se genera un gradiente de pH y un potencial eléctrico a través de la membrana plasmática, estando el lado externo ácido y cargado positivamente y el interno alcalino y cargado negativamente. A pesar de su tamaño pequeño, ni los hidrogeniones, ni los hidróxidos atraviesan libremente la membrana; por lo tanto, el equilibrio no puede establecerse espontáneamente. Dicho estado energético de la membrana plasmática, similar a una batería, puede ser usado por la célula para realizar un trabajo útil, por ejemplo, movilidad o síntesis de ATP. Para la síntesis de ATP un componente fundamental del proceso es una ATPasa de membrana; enzima que cataliza 48 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 2. Ciclo de Krebs la reacción reversible entre difosfato de adenosina (ADP) y ATP. Operando en una dirección y usando el gradiente de protones generado durante el transporte, dicha enzima cataliza la formación de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico. Existe una variedad de agentes químicos llamados desacopladores que inhiben la síntesis de ATP durante el transporte de electrones sin alterar el propio proceso de transporte. Ejemplos de estos agentes son el dicumarol y el dinitrofenol. Son sustancias liposolubles que impiden la formación del gradiente de pH y el eléctrico, favoreciendo el pasaje de protones a través de la membrana; de este modo inhiben la síntesis de ATP. La polimixina B (un antibiótico) se adhiere específicamente a la superficie externa de la membrana, alterando su estructura y propiedades osmóticas. Se produce entonces la pérdida de metabolitos y la inhibición de algunos procesos bioquímicos que tienen lugar a ese nivel, como el transporte de electrones y la síntesis de ATP, entre otros. Otras sustancias, por ejemplo: cianuro o azida de sodio, bloquean el propio sistema de TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 49 transporte y se denominan inhibidores. Tanto los desacopladores como los inhibidores son venenos celulares que actúan en células eucariotas y procariotas. BALANCE ENERGÉTICO DE LA RESPIRACIÓN El resultado neto de las reacciones del ciclo de Krebs es la oxidación completa del piruvato a CO2 con formación de cuatro moléculas de NADH y una de dinucleótido de flavinadenina (FADH). El NADH y el FADH pueden ser oxidados nuevamente por el sistema transportador de electrones. Un total de 15 moléculas de ATP son sintetizadas en cada vuelta del ciclo, Figura 3. Glucólisis 50 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA por lo tanto, dado que cada molécula de glucosa rinde dos de piruvato, 30 moléculas de ATP son sintetizadas por cada molécula de glucosa que entra al ciclo de Krebs (ver figura 3). Esto, sumado a las seis moléculas de la reoxidación del NADH y las dos del vía glucolítica, da un total de 38 moléculas de ATP por molécula de glucosa respirada. Además de sus funciones como mecanismo generador de energía, el ciclo de Krebs sirve como productor de metabolitos claves para la biosíntesis. La reducción del oxígeno forma radicales libres que son muy tóxicos para la bacteria. Entre los más importantes se encuentra el superóxido. Éste es eliminado por las bacterias aerobias y tolerantes del oxígeno, por la enzima superoxidodismutasa que cataliza la formación de peróxido de hidrógeno, también tóxico. El peróxido de hidrogeno es degradado por enzimas como catalasa y la peroxidasa, a oxígeno molecular y agua. Estas enzimas están ausentes en las bacterias anaerobias estrictas, explicando en parte la susceptibilidad que tienen al oxígeno. En las bacterias aerobias obligadas, el oxígeno es el aceptor final de electrones. Sin embargo, las bacterias anaerobias facultativas pueden usar, en ausencia de oxígeno, otros compuestos inorgánicos como aceptores finales de electrones, por ejemplo: nitrato, fumarato, sulfato, etc. REGULACIÓN DEL METABOLISMO Cada reacción metabólica está regulada no solo con respecto a otras reacciones, sino también con respecto a la concentración de nutrientes en el medio. La regulación se realiza a diferentes niveles: en la actividad enzimática y en la síntesis de las enzimas. En la primera, regulación de la actividad enzimática, se produce: activación de enzimas alostéricas, inhibición por retroalimentación, activación alostérica y cooperatividad. La inducción enzimática y la represión por productos finales, son mecanismos de regulación de la síntesis de enzimas. En las bacterias anaerobias facultativas la fermentación (como única vía de producción de energía) es bloqueada en presencia de oxígeno, asegurando que el suministro de energía se produzca por respiración, que consume menos glucosa y acumula menos lactato. En este fenómeno denominado efecto Pasteur, la enzima fosfofructoquinasa es activada o inhibida según la relación entre el ATP y el ADP, regulando así el consumo de glucosa. Este es un ejemplo de regulación de la actividad enzimática por una enzima alostérica. El ejemplo clásico de regulación de la síntesis de enzimas lo constituye el operón lactosa. Hay tres enzimas que participan en la utilización de la lactosa (ß-galactosidasa, galactósido permeasa y galactósido transacetilasa), las cuales tienen un promotor único. En ausencia de lactosa, la transcripción para estas enzimas está bloqueada por un represor que se une al promotor inhibiendo la acción de la ARNpolimerasa. Cuando se agrega lactosa al medio, ésta se une al represor, bloqueando de este modo su unión al promotor y permitiendo la acción de la ARNpolimerasa y la síntesis de las tres enzimas anteriormente mencionadas. Crecimiento bacteriano Puede ser definido como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de la célula. Las condiciones físicas y químicas del medio donde el microorganismo se encuentra afectan marcadamente sus actividades. La comprensión de como influye el ambiente sobre el crecimiento nos ayuda a explicar la distribución de los microorganismos en la naturaleza y hace posible diseñar estrategias que favorezcan el crecimiento o que nos permita controlarlo. Las bacterias como grupo, son extremadamente versátiles y tienen gran capacidad para utilizar una amplia gama de nutrientes que van desde compuestos inorgánicos simples, a compuestos TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 51 orgánicos más complejos. Los nutrientes se pueden dividir en dos clases: esenciales, sin los cuales la célula no puede crecer y no esenciales, se usan cuando están presentes pero no son indispensables. Algunos nutrientes son usados solo como precursores de macromoléculas celulares, otros solo como fuente de energía sin ser incorporados directamente al material celular y otros cumplen las dos funciones al mismo tiempo. También se pueden clasificar como macro y micronutrientes según la cantidad requerida. MACRONUTRIENTES El carbono es el mayor constituyente de la célula bacteriana, por lo tanto no llama la atención que requiera más carbono que cualquier otro nutriente. Según la forma en que lo usa, existen fundamentalmente dos tipos de bacterias: autótrofas y heterótrofas. Las primeras son capaces de sintetizar todos sus componentes orgánicos a partir de compuestos inorgánicos como el CO2. Como ejemplo de este grupo citamos las bacterias del suelo, que carecen de interés médico. En cambio, las heterótrofas usan sustancias orgánicas como fuente de carbono. En este grupo se encuentran todas las bacterias de interés médico. La glucosa, por ejemplo, es usada como fuente de carbono y de energía. También existen bacterias que pueden usar otras sustancias orgánicas como fuente parcial o exclusiva de carbono. Entre las bacterias más versátiles se encuentran las del género Pseudomonas, muchas de las cuales pueden usar más de cien compuestos orgánicos. Después del carbono, el elemento más abundante en la célula es el nitrógeno que representa entre el 12 y el 15% del peso seco. Es el constituyente principal de las proteínas y los ácidos nucleicos. La mayoría de las bacterias son capaces de usar el amonio como fuente de nitrógeno, mientras que otras pueden usar los nitratos. La reducción de nitratos, se puede lograr por dos mecanismos diferentes: reducción asimiladora, en la cual se reduce por la vía del nitrito y reducción desasimiladora, donde el nitrato sirve como aceptor final de electrones. La primera está bastante extendida entre las bacterias, mientras que la segunda solo es común en bacterias anaerobias y anaerobias facultativas. El fósforo es usado para la síntesis de ácidos nucleicos y de fosfolípidos. La mayoría de las bacterias lo usan en forma inorgánica como fosfato (PO4=). Los fosfatos orgánicos si bien están distribuidos ampliamente en la naturaleza, para ser usados deben ser atacados primero por fosfatasas, enzimas que clivan estos compuestos liberando el fósforo inorgánico. MICRONUTRIENTES Aunque requeridos en cantidades muy pequeñas, los micronutrientes son importantes para la nutrición de la bacteria. Entre estos destacamos el cobalto, el cobre y el manganeso. FACTORES DE CRECIMIENTO Son sustancias que deben ser aportadas preformadas, porque la bacteria que los requieren no pueden sintetizarlos a partir de los nutrientes ya sea por falla o ausencia de una vía metabólica determinada. Estas sustancias incluyen vitaminas del complejo B, aminoácidos, purinas y pirimidinas. Las bacterias que no necesitan factores de crecimiento, se denominan prototróficas y, las que sí los requieren, auxotróficas para ese factor. REQUERIMIENTOS ATMOSFÉRICOS Y AMBIENTALES Oxígeno Las exigencias de oxígeno de una bacteria en particular, reflejan el tipo de metabolismo pro- 52 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA ductor de energía. Según su relación con el oxígeno, existen bacterias: anaerobias obligadas, anaerobias facultativas, aerobias obligadas y microaerófilas. De las primeras (anaerobias obligadas), existen las estrictas y las aerotolerantes. Las bacterias anaerobias obligadas estrictas, crecen en ausencia de oxígeno, el cual es muy tóxico e incluso letal cuando la exposición es breve. Las segundas (aerotolerantes) también crecen solo en ausencia de oxígeno, pero toleran su presencia un poco más que las anteriores; por ejemplo: Clostridium sp. Las bacterias anaerobias facultativas, son capaces de crecer en presencia o en ausencia de oxígeno. Ejemplo de éstas son las bacterias de la familia Enterobacteriaceae. Las aerobias obligadas, requieren oxígeno para su desarrollo. Dentro de este grupo se encuentran la Pseudomonas. Por último, las microaerófilas crecen mejor con presiones de oxígeno bajas (3 a 5%); las concentraciones altas (21%) inhiben su crecimiento. En las bacterias aerobias, anaerobias facultativas y anaerobias aerotolerantes, la enzima superoxidodismutasa impide la acumulación del radical superóxido; esta enzima está ausente en los anaerobios estrictos. El peróxido de hidrógeno formado por la acción de la superoxidodismutasa es destruido con rapidez por la enzima catalasa o peroxidasa, como ya se mencionó. En el laboratorio de microbiología los requerimientos atmosféricos de oxígeno, pueden determinarse cultivando la cepa en caldo tioglicolato. Este medio contiene muchos nutrientes, siendo un caldo de enriquecimiento apropiado para casi todas las bacterias de interés médico. El ácido tioglicólico actúa como agente reductor que disminuye el potencial redox del medio, generando un gradiente de concentración de oxígeno a lo largo del tubo. En la superficie del medio, la concentración es similar a la atmosférica y va disminuyendo gradualmente hasta que en el fondo del tubo no existe oxígeno disuelto. Las bacterias aerobias estrictas podrán crecer en la superficie del caldo, las microaerófilas crecerán en la franja inmediata que está debajo de la superficie. Las anaerobias facultativas crecerán en todo el tubo, mientras que las anaerobias lo harán en el fondo del mismo. Anhídrido carbónico Algunas bacterias como Neisseria y la Brucella, tienen muchas enzimas con baja afinidad por el CO2 y requieren una concentración más elevada (10%) de la que habitualmente está presente en la atmósfera (0.03%). Estos requerimientos atmosféricos mencionados deben ser tenidos en cuenta cuando se realiza el cultivo de estas bacterias. Potencial de oxidación reducción Es un requerimiento físico del medio de cultivo. Éste es un factor crítico para determinar si se desarrollará o no el inoculo sembrado en dicho medio. Para la mayoría de los medios de cultivo en contacto con el aire, el potencial de oxidación reducción es de +0,2 a +0,4V, a pH 7. Las bacterias anaerobias obligadas son incapaces de crecer a menos que el potencial sea tan bajo como -0,2V. Para establecer dichas condiciones en un medio de cultivo se puede eliminar el oxígeno, recurriendo a sistemas de cultivo anaerobio o agregando al propio medio compuestos que contengan sulfidrilo, por ejemplo el tioglicolato de sodio. Temperatura Es uno de los factores ambientales más importantes que influyen en la proliferación y mantenimiento de la vitalidad de los microorganismos. Cada bacteria tiene su propia temperatura mínima por debajo de la cual no puede proliferar, temperatura óptima en la cual el crecimiento es mas rápido y temperatura máxima por encima de la cual no puede multiplicarse. Así, es TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 53 posible distinguir tres grupos de microorganismos según el rango de temperatura en el que es posible su multiplicación: psicrófilas, crecen entre -5 y 30ºC, temperatura óptimo de 15ºC; mesófilas, crece entre 10 y 45ºC, con el óptimo a los 30ºC y termófilas, que crecen entre 25 y 80ºC, con el óptimo en 55ºC. En el laboratorio se puede determinar la temperatura óptima de crecimiento, sembrando el microorganismo en estudio en un medio de cultivo adecuado e incubándolo a diferentes temperaturas, para después evaluar los rendimientos obtenidos en las distintas condiciones. Si bien la mayoría de los microorganismos de interés medico son mesófilos, pueden existir diferencias entre las temperaturas de crecimiento óptimas de los mismos, siendo para la mayoría de 35 a 37ºC. Concentraciones de hidrógeno Cada microorganismo tiene un rango de pH en cual puede crecer y un pH óptimo bien definido. Según en el pH que se obtenga mayor rendimiento, encontramos microorganismos acidófilos, neutrófilos (la mayoría de interés médico) y alcalófilos, que crecen bien en pH ácidos, neutros y alcalinos respectivamente. Para la mayoría de las bacterias de interés médico, el pH óptimo es de 7,2 a 7,6. Sin embargo, hay microorganismos humanos como M. tuberculosis que resisten valores muy bajos de pH. Como los microorganismos al multiplicarse y realizar sus funciones metabólicas, suelen modificar el pH del medio, éste puede prepararse con amortiguadores de pH (buffer), los cuales mantiene el pH relativamente constante. Condiciones osmóticas y disponibilidad de agua El agua es un requerimiento esencial para todo ser vivo y la disponibilidad de ésta es un factor importante que afecta el crecimiento de los microorganismos en sus ambientes naturales. Esta disponibilidad no depende solamente del contenido de agua que haya en el ambiente, porque algunas sustancias y superficies pueden absorber moléculas de agua y por consiguiente reducir la disponibilidad en el ambiente. Las sales y los azúcares disueltos en agua, condicionan la disponibilidad de la misma porque las moléculas de agua se asocian y no quedan disponibles para ser usadas por los microorganismos. La disponibilidad de agua se expresa generalmente como actividad acuosa o potencial de agua. Generalmente los microorganismos se encuentran en ambientes con menor cantidad de solutos que en el interior celular, por lo tanto el agua tiende a entrar a la célula por osmosis. Por el contrario, si se encuentran en medios de baja actividad acuosa, el agua tenderá a salir de la célula, por lo tanto perderá agua. Así, encontramos microorganismos que pueden crecer en altas concentraciones salinas (halófilos) como las que están en el agua de mar, en altas concentraciones de azúcar (osmófilos) como las que hay en una jalea o en ambientes muy secos (xerófilos). Estos generalmente captan agua de dichos ambientes, gracias a las altas concentraciones de solutos en su interior. La concentración de solutos con actividad osmótica dentro de la célula bacteriana es superior a la concentración del exterior celular. Con excepción de las bacterias del género Mycoplasma y de las formas lister (L) que no tienen pared celular, la mayoría de las bacterias tienen tolerancia osmótica que les permite soportar grandes cambios de osmolaridad. Captación de nutrientes La concentración de solutos en el interior de una célula bacteriana es mayor que en el medio 54 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA extracelular. Esto es aplicable tanto al medio natural como a la mayoría de los medios de cultivo usados en el laboratorio. La principal barrera para el paso de solutos entre la célula y el medio externo es la membrana celular. Las bacterias están rodeadas de membranas semipermeables, compuestas por una mezcla compleja de proteínas, lípidos y glucoproteínas, que restringen el ingreso de la mayoría de los solutos. Sin embargo, tienen sistemas que permiten el transporte de sustancias pequeñas a través de dichas membranas. Las moléculas de mayor tamaño primero deben ser degradadas a moléculas más pequeñas por enzimas (exoenzimas) producidas por la propia bacteria y secretadas al exterior celular. En las bacterias gramnegativas estas exoenzimas se encuentran fundamentalmente en el espacio periplásmico (espacio virtual ubicado entre la membrana externa y la membrana plasmática), mientras que en las bacterias grampositivas están ancladas en la membrana plasmática. Dichas enzimas son activas sobre: proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos, entre otros. Bacterias como S. aureus, S. pyogenes, y C. perfringens, elaboran algunas de estas enzimas que contribuyen a la virulencia, destruyendo los componentes vitales de los tejidos del huésped infectado. Pueden ser constitutivas (se sintetizan siempre) o inducibles (se sintetizan solo cuando está presente su substrato). Con excepción del agua y el amonio que ingresan a la célula por difusión pasiva en respuesta a un gradiente de concentración a ambos lados de la membrana, el resto de los metabolitos lo hacen por sistemas de transporte más específicos. Tanto las porinas, como los canales de maltosa, no requieren consumo de energía. Los primeros son sistemas inespecíficos que permiten el ingreso de moléculas pequeñas (peso molecular menor o igual a seis mil dalton). Las porinas son proteínas ubicadas en la membrana externa de las bacterias gramnegativas, que forman canales o poros permitiendo el pasaje de las moléculas pequeñas e hidrofílicas. En la difusión facilitada, una proteína asociada a la membrana celular facilita el equilibrio a ambos lados de la misma, actuando en conjunto con una quinasa citoplasmática dependiente de ATP. Estas proteínas de membrana se denominan permeasas y muchas son inducidas por el substrato a ser transportado. Cuando la sustancia es fosforilada por la quinasa citoplasmática, queda atrapada dentro de la célula. La difusión facilitada se parece a la difusión simple, porque el substrato se mueve por un gradiente de concentración (de mayor a menor), por lo tanto el propio proceso de transporte no requiere energía. La diferencia que tiene con la difusión pasiva, es que está mediada por una proteína transportadora, es más rápida y tiene mayor especificidad de substrato. El transporte activo permite que los solutos ingresen a la célula en contra de un gradiente de concentración, consumiendo energía metabólica. Como ejemplo citaremos al sistema de la ß-galactósido permeasa, mediante el cual la lactosa (disacárido) es concentrado dentro de una bacteria como E. coli. El transporte de la lactosa se produce por una permeasa específica (proteína M); dicha reacción implica gasto de energía. La energía se usa para disminuir la afinidad de la permeasa por la lactosa en la parte interna de la membrana celular, favoreciendo su rápida liberación dentro del citoplasma. Si la generación de energía es bloqueada por el agregado de azida de sodio al sistema, la permeasa cataliza la difusión facilitada de la lactosa, cesando el transporte cuando la concentración del disacárido sea la misma a ambos lados de la membrana. En medios aerobios y a pH neutro, la baja concentración de hierro no permite alcanzar un desarrollo óptimo. Las bacterias han desarrollado varios sistemas para obtener cantidades adecuadas de dicho elemento. Los sideróforos son ligandos de bajo peso molecular cuya función es suministrar hierro a la célula. Aunque existe una variación importante en la estructura de TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 55 los distintos tipos de sideróforos conocidos, la mayoría son de dos tipos: catecoles: la enterobactina es la más estudiada; e hidroximatos: producidos por algunos hongos. La enterobactina es un poderoso quelante que E. coli produce rápidamente cuando existe déficit de hierro y la secreta al medio externo. Crecimiento de las poblaciones bacterianas El paso esencial para iniciar el estudio de una cepa bacteriana, es el cultivo. Este paso es importante para proveer de una población de bacterias que puedan ser analizadas mediante pruebas bioquímicas, serológicas, genéticas y de susceptibilidad a los antibióticos. El cultivo es el proceso de propagación de los microorganismos en el laboratorio, que se obtiene aportando las condiciones ambientales adecuadas y los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano. Debemos recordar que algunas de las bacterias que causan infecciones en seres humanos no son capaces de crecer en medios artificiales inertes. Es necesario conocer cuales son los requisitos básicos de la bacteria en cuestión para su cultivo en el laboratorio (nutrientes, requerimientos atmosféricos y ambientales), así como los requisitos del o de los tipos bacterianos que se necesite recuperar. La siembra de un material que contiene bacterias en un medio sólido adecuado con la técnica de aislamiento permite, luego de un período adecuado de incubación, la recuperación de millones de bacterias agrupadas en colonias aisladas. Éstas pueden ser aisladas nuevamente en un nuevo medio para obtener un cultivo puro. El crecimiento se define como el aumento del número de bacterias en una población determinada (ver figura 4). Es importante diferenciar entre el crecimiento de una célula individual y el de una población. Dicho crecimiento celular es el resultado del aumento del tamaño de la célula, seguido de su división. El crecimiento de una población, en cambio, es el resultado del aumento del número total de células, que puede ser cuantificado directamente (contando el número de células) o indirectamente (por ejemplo, midiendo la masa celular). El recuento de células totales puede determinarse por recuento microscópico en una cámara con áreas de volumen conocido, contando las células por unidades. Este recuento, considera la totalidad de las células presentes en la muestra (viables y no viables). Para realizar un recuento de las células viables, es necesario hacer un cultivo en medio sólido para contar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) presentes en un volumen conocido de la Figura 4. Curva de crecimiento bacteriano 56 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA muestra. Dicha técnica puede realizarse por siembra en la superficie de un medio apropiado o por siembra incorporada en agar. El crecimiento de las poblaciones bacterianas en un sistema de cultivo cerrado (sin entrada ni salida de los componentes del sistema), está limitado por el agotamiento de los nutrientes o bien por la acumulación de productos tóxicos del metabolismo. Cuando las bacterias se siembran en el laboratorio en un medio líquido (por ejemplo en un tubo de ensayo), se trata de un sistema cerrado de cultivo. Si se toman muestras a intervalos regulares en diferentes tiempos de incubación y se realiza un recuento del número de células viables por mililitro de cultivo, la representación gráfica de los datos (conteo de células viables en función del tiempo) dará la curva de crecimiento característica que consta de cuatro fases: latencia, exponencial, estacionaria y muerte. FASE DE LATENCIA Las bacterias transferidas de un cultivo en fase estacionaria a un medio fresco, sufren un cambio en su composición química antes de ser capaces de iniciar la multiplicación. Hay aumento de los componentes macromoleculares y de la actividad metabólica, casi sin división celular, asociado a un incremento de la susceptibilidad a los agentes físicos y químicos. Por lo tanto, la mal llamada fase de latencia implica intensa actividad metabólica. FASE EXPONENCIAL Las células se dividen a velocidad constante, determinada por la naturaleza intrínseca de la bacteria y por las condiciones del medio. Existe gran aumento del número total de células viables, que puede ser expresado en forma exponencial. Próximo al final de esta fase, se produce la liberación de exotoxinas por las bacterias que las producen. FASE ESTACIONARIA Eventualmente el agotamiento de los nutrientes o la acumulación de productos tóxicos determina el cese del crecimiento. Hay pérdida de células por muerte, la cual es balanceada por la formación de nuevas células. Cuando esto ocurre, el conteo total de células aumenta levemente aunque el de las bacterias viables permanece constante. Hacia el final de esta etapa, puede ocurrir la esporulación en aquellas bacterias que poseen este mecanismo de resistencia. FASE DE MUERTE Luego de la fase estacionaria, la tasa de muerte se incrementa, el número de bacterias viables disminuye rápidamente y, por lo tanto la curva de crecimiento declina. Las características de la curva de crecimiento pueden variar, dependiendo de las características propias del microorganismo, del estado metabólico del inoculo, del medio de cultivo y de las condiciones de incubación. Las condiciones físicas y químicas del medio donde el microorganismo crece afectan las actividades de éstos. La comprensión de cómo influye el ambiente en el crecimiento, nos ayuda a explicar la distribución de los microorganismos en la naturaleza y hace posible diseñar métodos que permitan estudiar y controlar el crecimiento bacteriano. Además, existen sistemas de cultivo abiertos que son poco usados en el laboratorio de microbiología clínica. El cultivo continuo (con aporte y salida de nutrientes y requerimientos a una tasa constante), permite mantener a las bacterias en una misma fase de crecimiento TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 57 durante un largo período de tiempo (por ejemplo en la fase estacionaria o en la exponencial). Dicha técnica es interesante por ejemplo para los procesos productivos. Medios de cultivo Son una mezcla equilibrada de nutrientes requeridos a concentraciones que permiten el crecimiento de los microorganismos. Deben contener todos los nutrientes necesarios en cantidades apropiadas a los requerimientos de los microorganismos y en condiciones de pH, presión osmótica, oxígeno disuelto, etc., adecuados para el crecimiento. Aunque los diferentes microorganismos tienen distintas propiedades fisiológicas y requerimientos nutricionales, la composición química de las células es constante en todo el mundo vivo. Los medios más simples están compuestos por una base mineral se puede suplementar con una fuente de carbono, de energía, de nitrógeno y con algún factor de crecimiento requerido. Los medios deben esterilizarse antes de ser usados. Esta esterilización generalmente se realiza con calor húmedo, pero algunos medios con componentes sensibles al calor pueden filtrarse. Existen muchos medios con diferentes utilidades que pueden ser clasificados de la siguiente manera. Según su consistencia en: líquidos, semisólidos y sólidos. Los medios sólidos son usados para el aislamiento bacteriano, mientras que los líquidos son útiles para el enriquecimiento de una población bacteriana de interés. Según su composición: definidos (de composición química conocida, medios simples) y complejos (con agregados de sustancias no definidas, por ejemplo extracto de levadura). Según la cantidad de nutrientes: pobres (por ejemplo el agar simple) y ricos (por ejemplo el agar sangre). También pueden clasificarse en medios: diferenciales, que permiten diferenciar algunas propiedades distintivas del grupo bacteriano (por ejemplo el uso de lactosa en agar CLED); y selectivos, que permiten el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros (por ejemplo el Mac Conckey para la selección de bacterias gramnegativas). También existen los medios especiales para el transporte de muestras o cepas, o aquellos específicos para identificar alguna vía metabólica determinada. Bibliografía • Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. editors. Bailey & Scott´s. Diagnostic Microbiology. 11th. ed. St. Louis, Missouri. Mosby. 2002. • Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiología. 20ª ed. BsAs. Panamericana; 1994. 58 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 59 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Página 59 4 Genética bacteriana L. Betancor, M. Gadea, K. Flores Introducción Las bacterias son microorganismos con una capacidad extraordinaria de adaptación a diferentes condiciones ambientales. Para comprender la esencia de esta capacidad es importante conocer sus bases genéticas, es decir como está organizada la información genética, como realizan y regulan su expresión y que mecanismos de variación génica poseen. La capacidad infecciosa de las bacterias patógenas radica en que poseen la información génica necesaria para colonizar los tejidos del huésped, invadirlos y/o producir sustancias tóxicas que causarán la enfermedad. Por otro lado, el conocimiento del funcionamiento genético de las bacterias, sumado al hecho de que son de fácil manejo en el laboratorio y que tienen crecimiento rápido, ha permitido usarlas para sintetizar productos útiles a la medicina, tanto para el diagnóstico como para la prevención y tratamiento de algunas enfermedades. Estas posibilidades se han visto incrementadas con el desarrollo de la ingeniería genética y la disponibilidad de técnicas de biología molecular. Estructura del genoma bacteriano Toda la información genética esencial para la vida de la bacteria está contenida en una única molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular, cerrado por enlace covalente. Dicha molécula se denomina cromosoma bacteriano. Muchas bacterias poseen además ADN extracromosómico, también circular y cerrado, denominado ADN plasmídico por estar contenido en los plásmidos. Éstos, portan información génica para muchas funciones que no son esenciales para la célula en condiciones normales de crecimiento. En términos bioquímicos la composición y estructura de los ácidos nucleicos bacterianos, es la misma que para cualquier célula. Conviene recordar brevemente, que los ácidos nucleicos son macromoléculas compuestas de nucleótidos unidos en forma covalente por medio de enlaces fosfodiester entre los carbonos de las posiciones 3´ y 5´ de dos residuos de azúcares adyacentes. Esta estructura forma un esqueleto de azúcares y fosfatos constante en toda la macromolécula. La variación entre los nucleótidos que constituyen la cadena de ácido nucleico, esta dada por sus bases nitrogenadas; para el ADN son: adenina (A), timina (T), citocina (C) y guanina (G) y para el ácido ribonucleico (ARN) son en lugar de timina, el uracilo (U). La A y G se denominan bases púricas o purinas, mientras que T, U, y C se 60 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA denominan bases pirimidínicas o pirimidinas. Así, una cadena o hebra de ácido nucleico, tendrá una estructura primaria determinada por la secuencia de las bases que la componen. El ADN como macromolécula, esta compuesto por dos cadenas nucleotídicas o hebras antiparalelas que se enlazan entre sí formando una doble hélice. Los enlaces entre ambas hebras de ADN están determinados por puentes de hidrógeno entre las purinas de una cadena, con las pirimidinas de la otra. Entonces, la A forma dos puentes de hidrógeno con la T, mientras que la C forma tres puentes de hidrógeno con la G. Dicho fenómeno se conoce como complementariedad de bases, es decir que la A es complementaria a la T y la C lo es para la G (ver figura 1). Estos enlaces mantienen estable la estructura de doble hélice de ADN, en la cual se pueden distinguir pares de nucleótidos o pares de bases (pb). Estos pb pueden usarse como unidad de tamaño o longitud para las moléculas de ADN, de esta manera podemos decir por ejemplo que el ADN cromosómico de Escherichia coli tiene un tamaño de 4,2 millones de pb o lo que es lo mismo de 4.200 kilobases (Kb). Todas las células deben enfrentarse al problema de como lograr contener en su estructura moléculas tan grandes como el ADN. Volviendo al ejemplo de E. coli, los 4.200 Kb de su genoma implican una longitud de 1,3 mm es decir unas mil veces la longitud de la célula. Las bacterias no poseen histonas asociadas a su genoma y en consecuencia no tienen la posibilidad de compactar su ADN en estructuras tipo nucleosomas como las células eucariotas. Por lo tanto, deben compactar su ADN de otra manera. Esto se logra porque el ADN circular cerrado es capaz de adoptar una estructura terciaria denominada superenrollamiento, que implica el enrollamiento del eje de la doble hélice sobre si mismo (ver figura 2). Este superenrollamiento se dice que tiene sentido negativo porque tiene el sentido contrario al enrollamiento de una hebra de ADN sobre la otra. Esto supone para la bacteria una fuente de almacenamiento de energía para ser usada en muchos procesos fisiológicos que la requieren, por ejemplo la separación de las dos hebras de ADN necesaria para la replicación y la transcripción. El cromosoma bacteriano es suficientemente largo como para formar muchos lazos circulares, que como tales pueden superenrollarse formando una serie de dominios topológicos independientes. Esta organización en dominios colabora a la compactación general del genoma bacteriano e impide que, con la ruptura de una hebra (en cualquier sitio del cromosoma) se pierda el superenrollamiento total, manteniendo la energía almacenada. Las bacterias poseen enzimas (topoisomerasas) capaces de alterar la estructura del ADN, modificando su superenrrollamiento. Estas topoisomerasas actúan agregando o eliminando vueltas superhelicoidales y cumplen un rol importante en los procesos de replicación y transcripción del ADN. Además, es interesante mencionar que algunas de las topoisomerasas como la ADNgirasa, son blanco de acción de los antibióticos del grupo de las quinolonas, como el ácido nalidíxico. Los plásmidos son ADN extracromosómico Como ya dijimos, muchas bacterias poseen información génica contenida en moléculas de ADN distintas a las del cromosoma bacteriano, denominadas plásmidos. Estos, son moléculas circulares de ADN de doble cadena que constituyen una unidad de replicación independiente del cromosoma. Por esto puede encontrarse más de una copia del mismo plásmido dentro de la célula bacteriana. En general los plásmidos de mayor tamaño se encuentran en una o unas pocas copias, mientras que los más pequeños pueden estar en hasta cien copias por célula (plásmidos multicopia). Aunque el ADN plasmídico no porta información genética esencial para la vida de la TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA !CIDODEOXIRIBONUCLEICO!$. CADENADEAZÞCARFOSFATO ! 0 3 4 PUENTESDEHIDRØGENO 0 ' 0 # 3 3 ! 3 3 0 ! 0 4 3 3 0 # 0 3 3 ' 3 PARDEBASES 0 ' 0 Figura 1. Estructura del ADN. Apareamiento de dos hebras de ADN basado en la complementariedad de bases. A (adenina) se aparea con T (timina) por medio de 2 puentes de hidrógeno, mientras que C (citocina) se aparea con G (guanina) por medio de 3 puentes de hidrógeno, formando los llamados “pares de bases”. 0 4 0 3 61 NUCLEØTIDO # 3 0 bacteria, sí porta genes que le confieren nuevas propiedades fenotípicas y que en algunos casos le son útiles para su adaptación al crecimiento en determinados ambientes. Muchas bacterias potencialmente patógenas para el hombre, solo son capaces de comportarse como tales cuando portan un plásmido que contiene genes que le permiten expresar moléculas de adhesión a los tejidos del huésped o sintetizar sustancias tóxicas para éste. Como ejemplo la toxina tetánica producida por Clostridium tetani, está codificada plasmídicamente. En otros casos, los plásmidos contienen genes que codifican enzimas capaces de degradar algunos antibióticos, permitiendo que la bacteria sobreviva a la acción de los mismos. Por ejemplo la producción de β-lactamasas por cepas Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus y Haemophylus influenzae está codificada plasmídicamente. Los plásmidos pueden clasificarse según distintos criterios, por ejemplo por su tamaño, su número de copia o el tipo de genes que contiene (plásmidos de virulencia, plásmidos de resistencia a antibióticos, etc.). También pueden clasificarse en grupos de incompatibilidad; 62 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA DISOCIACIØNLOCAL Figura 2. Superenrollamiento del ADN. Una molécula de ADN circular relajado puede ser “retorcida” para formar una molécula superenrrollada negativamente. Esta reacción es catalizada por una enzima “girasa”, mientras que la reacción inversa lo es por una “topoisomerasa”. !$.SUPERENROLLADO CÓRCULORELAJADO se dice que dos plásmidos pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad si son incapaces de coexistir en la misma bacteria. Muchos plásmidos, en general los de mayor tamaño (que pueden portar hasta 50 o 100 genes), suelen ser capaces de transferirse de una bacteria a otra mediante un proceso llamado conjugación (véase mas adelante). Estos plásmidos de conjugación codifican todos los factores necesarios para su transferencia. Algunos plásmidos mas pequeños, no conjugativos, pueden ser movilizados, es decir que poseen la secuencia necesaria para permitir su transferencia, pero ellos mismos no codifican las proteínas necesarias para ser transferidos. Por último, otros plásmidos no se transfieren en absoluto. La adquisición de ADN plasmídico por una cepa bacteriana, puede realizarse por medios distintos a la conjugación como transformación, la transducción mediada por fagos o la incorporación en el cromosoma, como veremos mas adelante. Genes "saltarines" de las bacterias Los elementos transponibles son segmentos de ADN capaces de moverse desde una posición a otra en el genoma. Es decir que pueden transponerse o “saltar” desde un sitio determinado del genoma, separándose del resto del ADN, hasta otro sitio distinto al cual se integran. También pueden transponerse desde el cromosoma a un plásmido o viceversa o a distintos TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 63 sitios dentro de la misma molécula de ADN. Los elementos transponibles están ampliamente distribuidos en la naturaleza, tanto en virus, como en células procariotas y eucariotas. Existen dos tipos de elementos transponibles: las secuencias de inserción (elementos IS) y los transposones (Tn). Los elementos IS son segmentos pequeños de ADN, de aproximadamente 1 a 2 Kb que contienen la información genética mínimamente necesaria para la transposición. Poseen secuencias específicas en ambos extremos del fragmento que consisten en repeticiones invertidas una respecto de la otra. Estas secuencias, son reconocidas específicamente por enzimas codificadas en el mismo elemento IS, denominadas transposasas, responsables de la integración del elemento al sitio blanco del genoma. Los Tn son segmentos de ADN que además de portar la información necesaria para la transposición, contienen genes que pueden codificar diferentes propiedades fenotípicas. Dentro de éstas se destaca la resistencia a ciertos antibióticos, como es el caso de la resistencia de alto nivel a la gentamicina que tienen algunas cepas de Enterococcus sp. Algunos plásmidos poseen uno o mas Tn que portan determinantes de resistencia a antibióticos; la capacidad de estos elementos para transponerse de un plásmido a otro, proporciona a la bacteria gran flexibilidad para desarrollar resistencia, dado que dichos plásmidos son generalmente conjugativos, por lo que pueden transferirse entre distintas bacterias. La inserción de un elemento transponible puede producir diferentes efectos sobre la expresión de la información génica como impedir la funcionalidad de un gen o activar la expresión de otro. Replicación del ADN bacteriano El genoma completo de una célula, sea procariota o eucariota, debe replicarse con exactitud una vez por cada división celular. Por lo tanto, la iniciación de la replicación compromete a la célula a una división posterior. Si se inicia la replicación, la división consiguiente no debe ocurrir hasta que se haya completado la replicación y, de hecho el final de la replicación puede disparar la división celular. Las bacterias, a diferencia de las células eucariotas, son capaces de replicar su ADN a lo largo de todo su ciclo celular. Se denomina replicón a cada unidad de replicación del ADN que contiene todos los elementos requeridos para regular este proceso. El cromosoma bacteriano se replica a partir de un único origen que se mueve linealmente hasta completar la duplicación total de la molécula, por lo que constituye un replicón. Esto facilita la regulación que está centrada en la etapa de iniciación; una vez que la replicación del cromosoma se inicia en su origen, todo el cromosoma será duplicado. Los plásmidos, constituyen replicones independientes del cromosoma, generando una replicación por ciclo celular que se coordina con la replicación genómica (plásmidos unicopia) o permitir varias replicaciones por ciclo (plásmidos multicopia). El sitio de ADN que se está duplicando, se llama horquilla de replicación. La replicación puede ser unidireccional o bidireccional, según se formen una o dos horquillas en el origen. Generalmente, los cromosomas bacterianos tienen replicación bidireccional, mientras que algunos plásmidos pueden replicarse unidireccionalmente. En la replicación unidireccional, una horquilla sale del origen y progresa a lo largo del ADN. En la bidireccional, se forman dos horquillas que se alejan del origen en direcciones opuestas hasta que se encuentran completando la duplicación. Esto permite a la bacteria duplicar su ADN mas rápido que si 64 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 3. Replicación del ADN. El proceso de replicación del ADN es semiconservativo, ya que cada nueva molécula posee una hebra sintetizada “de novo” apareada a su complementaria proveniente de la molécula que le dio origen. El poroceso genera dos moleculas de ADN idénticas. .EWSTRAND el proceso fuera unidireccional, pudiendo replicar mas de mil pb por segundo. Es importante destacar que, aunque la velocidad de replicación es muy elevada, la fidelidad de la misma también es grande, siendo la frecuencia de mutaciones espontáneas del orden de una cada 107 a 1011 pb replicados. La replicación es semiconservativa porque cada molécula de ADN posee una cadena del ADN original y una nueva. Esto resalta la importancia de la complementariedad de bases en la estructura del ADN (ver figura 3). Las enzimas encargadas de catalizar el proceso de replicación, se denominan ADN polimerasas. Si bien en E. coli se conocen tres tipos distintos, la responsable de la mayoría de los procesos de replicación es la polimerasa III, mientras que las polimerasas I y II cumplen principalmente funciones de reparación de rupturas o de errores en las moléculas de ADN. También participan otras enzimas, como las helicasas responsables de “desenrollar” el ADN en el origen o cerca de él, paso indispensable para iniciar la replicación. 65 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 4. Colaboración de proteínas en la horquilla de replicación. La ADN polimerasa III necesita para iniciar la síntesis un cebador o primer que es sintetizado por una ARN polimerasa especial. Algunas proteínas desenrrollan la hélice de ADN y otras se unen a los fragmentos de ADN unicatenario para estabilizarlo. Como la polimerasa solo sintetiza ADN en dirección 5’ a 3’, una de las cadenas se sintetiza en forma discontinua, dejando una serie de fragmentos de ADN y de huecos sin replicar. La ADN polimerasa I rellena los huecos y una enzima ligasa sella los fragmentos entre si. CADENANUEVA !$.POLIMERASA @ #ADENAMOLDE PROTEÓNASDEUNIØN AL!$. @ HELICASA PRIMER @ !$.POLIMERASA @ MOLÏCULAORIGINAL @ !$.PRIMASA FRAGMENTODE /KASAKI Esquemáticamente, podemos decir que la replicación consta de tres fases: iniciación, elongación y terminación. La primera se produce desde el origen del replicón donde se forma la o las horquillas de replicación, gracias a la acción de las helicasas que “desenrollan” el ADN. De esta forma se constituye una porción monocatenaria de ADN que estará en condiciones de formar un complejo con proteínas de unión al ADN, encargadas de estabilizar la cadena sencilla, evitando la formación de puentes de hidrógeno. Se sintetiza un corto oligonucleótido de ARN con un grupo 3´ oxidrilo libre, que actuará como cebador o primer, en el cual la ADN polimerasa agrega los nucleótidos. La elongación consiste en el avance de la horquilla de replicación, conforme se van agregando nucleótidos a la nueva cadena, siguiendo un orden establecido por las reglas de complementariedad de bases (A con T y C con G), entre la cadena “molde” y la nueva. En esta etapa participa fundamentalmente la ADN polimerasa III. Todas las polimerasas conocidas agregan nucleótidos en dirección 5´- 3´ para el crecimiento de la cadena y requieren una cadena de ADN molde, un cebador y los nucleótidos. (Ver figura 4). La terminación se produce después de que ambas horquillas de replicación han atravesado la mitad del cromosoma en direcciones opuestas y se encuentran en la región terminal del genoma. En esta región, existen secuencias de ADN que actúan como bloqueadores para el avance del las horquillas, por lo tanto se asegura que la replicación termine en esa pequeña porción del genoma. Expresión de los genes procariotas TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN La expresión genética de todas las células depende de los procesos secuenciales de transcripción y traducción que, en conjunto transfieren la información contenida en una secuencia de nucleótidos de un gen, a una secuencia de aminoácidos de una proteína. Esto implica que a partir de la dotación génica portada por la célula (genotipo), se expresarán un conjunto de características evidenciables y que constituirán el fenotipo celular. Durante la transcripción, las reglas del apareamiento de bases son aplicadas por la ARN 66 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 5. Comparación entre la expresión de los genes eucariotas y procariotas. Los ARNm procariotas son a menudo poligénicos, es decir que contienen información para mas de una proteína. El extremo 5’ se traduce cuando todavía se está transcribiendo el extremo 3’. Los ARNm eucariotas son monogénicos y requieren de modificaciones postranscripcionales antes de atravezar la membrana nuclear y llegar al citoplasma donde son traducidos. ! %5#!2)/4!3 02/#!2)/4!3 " $.! #)4/0,!3-! 42!.3#2)0#). .·#,%/ INTRONS M2.! EXONS 42!$5##). $.! PROTEÓNA GEN TRANSCRIPTOPRIMARIO 42!.3#2)0#). 2.! CAP !!!! M 2.! M 2.! !!!! !!!! 42!$5##). PROTEÓNA polimerasa para sintetizar un producto complementario a una cadena del ADN usada como molde, que es el ARN. Una de las clases mas importantes de ARN es el llamado mensajero (ARNm), que porta la información para la síntesis de proteínas. La ARN polimerasa bacteriana, es distinta de la que tienen las células eucariotas; de hecho, algunos antibióticos que tienen como sitio blanco de acción la ARN polimerasa (por ejemplo la rifampicina) son efectivos exclusivamente ante células procariotas. La ARN polimerasa reconoce un sitio específico en el ADN, llamado promotor, al cual se une iniciando la transcripción. Un mismo transcripto, ARNm, puede contener la información correspondiente a más de un gen, por lo tanto se traducirá luego en más de un polipéptido. El conjunto de genes que son transcriptos en un único ARNm y que por tanto se expresan en conjunto se denomina operón. (Ver más adelante). Los genes procariotas no poseen intrones como los eucariotas, es decir que una vez transcripto el ARNm, éste será traducido directamente en una secuencia polipeptídica, sin necesidad de realizar ningún procesamiento después de la transcripción. Otra diferencia importante con la expresión de los genes eucariotas, es que como las bacterias no tienen un compartimento nuclear definido, los procesos de transcripción y traducción están acoplados. Es decir que mientras se está sintetizando una molécula de ARNm, el ARN naciente puede tomar contacto con los ribosomas e iniciar la síntesis proteica (ver figura 5). Ésto es una ventaja para la bacteria y constituye una importante causa de su elevada capacidad para adaptarse a diferentes ambientes, porque le permite responder rápidamente a los estímulos sintetizando las proteínas necesarias, en el momento adecuado. La traducción es un proceso por el cual el ARN ribosómico, el ARN de transferencia (ARNt) y muchas proteínas ribosomales, realizan la “lectura” del código genético. Dicho código está “escrito” en tripletes de nucleótidos o codones portados por el ARNm; de la TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 67 “escritura” de la secuencia correspondiente de aminoácidos, surge el producto polipeptídico. El ribosoma desempeña un rol fundamental, reuniendo al ARNm y a los ARNt cargados de aminoácidos. La estructura y composición de los ribosomas procariotas (ARN y proteínas), difiere en cierta medida de los ribosomas eucariotas. Tienen menor masa y por lo tanto, menor coeficiente de sedimentación (la subunidad mayor 50 S y la menor 30 S, ambas suman 70 S). Estas diferencias entre los ribosomas procariotas y eucariotas, igual que otras diferencias en la expresión génica (polimerasas, topoisomerasas, proteínas, mecanismos regulatorios y factores de elongación), tienen una serie de implicancias. Una de éstas es la sensibilidad diferencial de procariotas y eucariotas a toxinas y antibióticos. Por ejemplo los macrólidos, los aminoglucósidos, el cloramfenicol y otros son antibióticos que actúan en el ribosoma bacteriano o en el proceso de síntesis proteica; en cambio, algunas toxinas bacterianas como la diftérica, actúan selectivamente en la síntesis proteica eucariota. Existen dos sitios en el ribosoma: el aceptor (sitio A), donde los ARNt cargados se asocian en primer lugar y el sitio peptídico (sitio P), donde se sujeta la cadena polipeptídica en crecimiento. En cada adición de aminoácidos, el ARNm avanza un codón y el nuevo aminoácido se traslada del sitio A al P, incorporándose a la proteína en formación. Como el código genético es universal, el significado de los codones es similar al de los eucariotas, aunque cabe mencionar que existen algunas diferencias en los codones que determinan la iniciación y la terminación de la traducción, así como en la preferencia de uso de ciertos codones. Como en los procesos de replicación y transcripción, el paso inicial de la traducción es un importante punto de regulación. Regulación de la expresión génica de las bacterias Las bacterias tienen muchos mecanismos para controlar la expresión de sus miles de genes, con cual logran que el producto de un gen determinado, solo se sintetice cuando es necesario y, en lo posible en la cantidad óptima. Esto les confiere una importante capacidad de adaptación a cualquier cambio de concentración de nutrientes del medio en que habitan, activándose determinadas vías metabólicas solo cuando son necesario. Así, las bacterias evitan sintetizar enzimas cuando falta el sustrato correspondiente, pero siempre están preparadas para fabricarlas cuando aparece dicho sustrato en el entorno. Un importante mecanismo de regulación desarrollado por las bacterias, se basa en la activación o desactivación de la transcripción de un grupo de genes cuyos productos tienen funciones relacionadas y que están organizados en una región del genoma que permite regular su expresión. Esta forma de organización genética se denomina operón y le permite a la célula administrar en forma óptima sus reservas energéticas. Un operón consiste en: un promotor, sitio blanco de la regulación; genes adyacentes que codifican cada una de las enzimas de una vía metabólica y una secuencia de terminación de la transcripción. Así, todos los genes constituyentes de un operón son transcriptos de forma coordinada como ARNm policistrónico, es decir multigénico. Dicho ARNm es traducido secuencialmente en proteínas por los ribosomas. La iniciación de la transcripción puede regularse positiva o negativamente. Los genes bajo control negativo se expresan constantemente, excepto que sean inhibidos por una proteína represora que evitará la expresión del gen por su unión a una secuencia específica del ADN, 68 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA denominada operador. Este operador impide que la ARN polimerasa inicie la transcripción en el promotor. Aquellos genes cuya expresión se encuentra bajo control positivo, no serán transcriptos excepto que esté presente una proteína activadora que se une a una secuencia específica del ADN y ayuda a la ARN polimerasa en los pasos iniciales de la transcripción. Los operones pueden ser inducibles o reprimibles. Se considera inducible, cuando la introducción de un sustrato en el medio aumenta la expresión de las enzimas necesarias para su metabolismo. Éstos solo funcionan en presencia de una pequeña molécula, el inductor. Por otro lado, en el mecanismo de regulación por represión, disminuye la síntesis de algunas enzimas cuando existen cantidades suficientes de los productos terminales de la vía metabólica correspondiente. Esto se denomina represión por producto final; los metabolitos terminales son moléculas llamadas correpresores (ver figura 6). Un ejemplo clásico es el operón lactosa (lac), descrito en E. coli. Contiene un conjunto de genes cuyos productos son las enzimas responsables de la degradación de la lactosa. En ausencia de lactosa en el medio, el operón es reprimido por la unión de una proteína represora a la secuencia del operador, esto impide la acción de la ARN polimerasa. La adición de lactosa al medio anula dicha represión, dado que el propio azúcar actúa como inductor uniéndose a ! ).$5##).'¡.)#! '%.%342!.3#2)04/3 2EG0/'ENES M2.! 2EPRESOR ACTIVO )NDUCTOR 2EPRESOR INACTIVO '%.%3./42!.3#2)04/3 2EG0/'ENES " 2%02%3).'¡.)#! '%.%3./42!.3#2)04/3 2EG0/'ENES 2EPRESOR ACTIVO 2EPRESOR INACTIVO #ORREPRESOR '%.%342!.3#2)04/3 2EG0/'ENES M2.! Figura 6. Mecanismos de regulación de la expresión génica. a) Inducción: Un gen regulador (reg) codifica para una proteína represora en su estado activo que se une al operador (O) bloqueando la unión de la ARN polimerasa al promotor (P). En presencia del inductor, la proteína represora es inactivada y el operador se encuentra disponible para el inicio de la transcripción. b) Represión: El gen regulador codifica para una proteína represora en su estado inactivo. En ausencia de la molécula correpresora, ocurre la transcipción. En presencia del correpresor, la proteína represora es activada para su unión al operador, bloqueando de este modo la transcripción. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 69 la proteína represora e impidiendo que ésta continúe asociada al operador. Este mecanismo de control negativo, asegura que el operón lac se transcriba solo cuando hay lactosa en el medio. Sin embargo, existe un mecanismo para aumentar al máximo la expresión del operón lac, basada en un mecanismo de control positivo mediado por proteínas activadoras. En E. coli existe una proteína llamada proteína activadora del gen por el catabolito (PAC), que forma un complejo con el monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) y adquiere la capacidad de unirse a una secuencia específica del ADN presente en el promotor. La unión del complejo PAC-AMPc al ADN, potencia la unión de la ARN polimerasa al promotor y permite aumentar la frecuencia de iniciación de la transcripción. Así, no solo se regula la síntesis, sino también la cantidad que se sintetiza, según los requerimientos de las enzimas responsables de la degradación de la lactosa. Este tipo de mecanismo regulador de la transcripción, se encuentra en muchas bacterias para diferentes vías metabólicas. También existen operones que son regulados en la terminación de la transcripción por un mecanismo especial llamado atenuación qu es característico de las vías biosintéticas de aminoácidos y se basa en el acoplamiento entre transcripción y traducción. Este es el caso del operón triptófano (Trp), en el cual el promotor codifica un pequeño péptido que contiene do Trp en posición crítica. Cuando hay suficiente cantidad de este aminoácido en el medio, el péptido se sintetiza rápidamente a partir del promotor que es transcripto y luego traducido. Esto provoca un cambio en la conformación del ADN correspondiente al operón, que permite reconocer una señal de terminación de la transcripción entre el promotor y los genes estructurales; sitio donde la ARN polimerasa se separa del ADN y termina la transcripción. Por el contrario, cuando no hay suficiente Trp, el péptido no podrá sintetizarse y la ARN polimerasa continuará transcribiendo los genes del operón. Así, la célula solo sintetizará el aminoácido, cuando no haya suficiente cantidad de éste en el medio para ser usado en las vías biosintéticas. No solo en la transcripción existe regulación, también existen en la traducción y luego de ella. La velocidad de la traducción de las diferentes secuencias de ARN transcriptos, puede variar más de mil veces según el sitio de unión del ribosoma con el mensajero. Generalmente, el control de la traducción se basa en la obstrucción del sitio de unión del ribosoma, ya sea por la unión de una proteína al ARN ribosómico en ese sitio o por el apareamiento de bases de éste con otro fragmento de ARN. Este es el mecanismo usado para la regulación de la síntesis de las proteínas ribosomales, cuyos genes también se encuentran organizados en operones. Por último, existe también la regulación postraduccional que la bacteria usa para inactivar enzimas innecesarias. Si bien existen mecanismos para suprimir la producción de enzimas cuando no son necesarias, hay que considerar que estas enzimas tienen una vida media relativamente larga y que en algunas ocasiones es más redituable energéticamente inactivar las enzimas de una vía biosintética, que asumir el gasto de ATP correspondiente al funcionamiento de dicha vía cuando el producto está disponible en el medio. Mecanismos de variación genotípica Como vimos, las bacterias tienen mecanismos que les permiten cambiar su expresión génica favoreciendo la síntesis de los productos de ciertos genes y reprimiendo la de otros. Estos mecanismos pueden llamarse de variación fenotípica, ya que implican una serie de cambios en el fenotipo celular o de la población bacteriana. También existen mecanismos de variación genotípica, que serán igualmente traducidos en cambios fenotípicos, pero que se basarán en una modificación de la información genética contenida en la célula. 70 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Básicamente, existen dos formas de variación genotípica en las bacterias. Por un lado, en el genoma se producen cambios debidos a mutaciones y por otro, las bacterias pueden intercambiar material genético y sufrir recombinación. MUTACIONES Una mutación es un cambio heredable en la secuencia de bases de los ácidos nucleicos que constituyen el genoma de un organismo; ésta se produce en condiciones naturales con baja frecuencia y se deben fundamentalmente a errores en los procesos de replicación del ADN. Además de las mutaciones espontáneas, pueden ocurrir mutaciones inducidas, provocadas por agentes mutagénicos (químicos, físicos o biológicos) que proporcionan una herramienta para introducir cambios en el genoma bacteriano en el laboratorio. La mayoría de estos errores o alteraciones introducidos en el genoma, son corregidos por los mecanismos de reparación del ADN, pero algunos escapan a la corrección y pueden originar cambios heredables que proporcionan una diversidad genética. Dada la baja frecuencia de mutaciones, solo los microorganismos con alta tasa de crecimiento, pueden alcanzar cifras suficientemente altas como para que sean detectables. Las mutaciones en las bacterias, frecuentemente afectan propiedades fácilmente reconocibles como requerimientos nutricionales, morfología o resistencia antibiótica. Algunas mutaciones pueden conferir al mutante una ventaja frente a la cepa que le dio origen, bajo ciertas condiciones ambientales, de manera que la progenie de dicha célula mutante es capaz de superar el crecimiento de la cepa original y sustituirla. Este es el caso de las mutaciones que confieren resistencia a los antibióticos, en las que el mutante resistente se seleccionará en un ambiente en el que las bacterias estén expuestas al antibiótico en cuestión. Este tipo de mutaciones se denominan selectivas. En cambio, frente a una mutación no selectiva la bacteria no adquiere beneficios en relación a su progenitor, por ejemplo la pérdida de pigmento de las colonias de Serratia marcescens que se observa cuando se cultivan en agar. Las mutaciones puntuales, son aquellas que implican un cambio en una única base; pueden provocar que se cambie un aminoácido por otro en el producto proteico (mutación por cambio de sentido). Otras veces no se traducen en ningún cambio (mutación silenciosa), dado que como sabemos existe más de un codón para cada aminoácido. También puede suceder que el codón se convierta en una señal de terminación (mutación sin sentido) y en ese caso se traducirá una proteína incompleta no funcional. Las deleciones y las inserciones producen cambios más notorios en el ADN, provocando la pérdida o la incorporación de cualquier número de pares de bases. Por lo tanto, siempre que éste no sea múltiplo de tres se producirán mutaciones por desplazamiento del marco de lectura, que suele provocar la pérdida total del fenotipo. Muchas mutaciones que originan un producto proteico defectuoso, pueden ser suprimidas por un segundo evento de mutación en otro sitio del genoma (mutaciones supresoras), restaurándose el fenotipo original. TRANSFERENCIA DE GENES ENTRE BACTERIAS La recombinación genética es el proceso mediante el cual los elementos genéticos contenidos en el genoma de diferentes individuos se combina. Esto permite que el individuo origine alguna nueva función que pueda dar como resultado una adaptación a los cambios en el medio ambiente. Este es un evento evolutivo importante y las células tienen mecanismos específicos que aseguran que dicha recombinación se efectúe. A diferencia de los eucariotas donde la recombinación genética ocurre en asociación a la reproducción sexual, en los procariotas TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 71 comprende una serie de mecanismos independientes del evento de reproducción celular. Estos mecanismos son llamados transformación, transducción y conjugación. La transformación es el proceso por el cual ciertas bacterias (llamadas competentes), son capaces de incorporar ADN exógeno proveniente de otras bacterias, que está libre en el medio. La virulencia del Streptococcus pneumoniae está relacionada con la presencia de una cápsula polisacarídica a su alrededor. Las bacterias con cápsula tienen un aspecto liso (S) cuando se cultivan en placas de agar y son capaces de matar a los ratones que son inyectados experimentalmente con una suspensión bacteriana. Las colonias con bordes rugosos (R) de S. pneumoniae, carecen de cápsula y no son letales al infectar ratones. Frederick Griffith en 1928 observó por primera vez la transformación cuando mezcló bacterias S muertas con bacterias R vivas y encontró que al inyectar la mezcla en ratones, también resultaba letal. De esto concluyó que las cepas R habían sido transformadas en bacterias S, ahora capaces de fabricar el polisacárido capsular virulento. La capacidad de captar el ADN exógeno, conservarlo en forma estable e interaccionar con él, se denomina competencia. Este fenómeno depende de la presencia de un sistema de captación de ADN específico asociado a la membrana. (Ver figura 7). Ejemplos de bacterias con competencia natural son Haemophilus influenzae, Neisseria sp., Streptococcus pneumoniae y ciertas especies de Bacillus. Aunque la mayoría de las bacterias no presentan capacidad natural para captar ADN, es posible inducir en el laboratorio la competencia, generando por distintos medios distorsiones en la membrana celular; por ejemplo con pulsos eléctricos (electroporación) o con cambios osmóticos y térmicos. Estos procedimientos son muy usados para introducir experimentalmente ADN extraño, por ejemplo un plásmido, en una bacteria y así transformarla para que adquiera un fenotipo de interés. Las bacterias también pueden ser transformadas con ADN viral, en cuyo caso el proceso se llama transfección. La transducción es la transferencia de ADN de una bacteria a otra por intermedio de un bacteriófago. Existen dos formas de transducción la especializada y la generalizada. La primera ocurre cuando un fago temperado porta genes bacterianos adquiridos durante un ciclo infeccioso anterior y al infectar una nueva bacteria e integrar su genoma al cromosoma bacteriano, incorporará a éste la información genética correspondiente a la bacteria infectada previamente. La transducción generalizada se produce por partículas virales defectuosas que se originan como cápsides vacías durante la replicación viral y que luego incorporan ADN de una bacteria; así, al infectar una nueva bacteria podrá introducir en ella dicho material genético. La conjugación se basa en el intercambio unidireccional de información genética desde una bacteria donante a otra receptora mediante un contacto real. (Ver figura 8). Los plásmidos son los elementos genéticos que con mayor frecuencia se transmiten de esta forma. La capacidad de conjugación depende de la presencia en la bacteria de plásmidos conjugativos que contienen los genes necesarios para tal proceso. Un ejemplo muy conocido de plásmido conjugativo es el plásmido F de E. coli que codifica las proteínas necesarias para la conjugación, incluyendo el pili sexual. Éste, es una estructura especializada esencial para el contacto entre la bacteria donadora y la receptora. Generalmente, los plásmidos conjugativos solamente causan la transferencia de su propio material genético pero en ocasiones el plásmido puede integrarse al cromosoma bacteriano y en el momento de conjugar se transferirá no solo a sí mismo, sino también a los genes cromosómicos que se encuentran tras él. Teóricamente todo el cromosoma podría ser transferido lo que requeriría más de dos horas, pero la unión entre las bacterias por medio del pili persiste menos tiempo. Las cepas bacterianas con el plásmido 72 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 7. Modelo para el proceso de transformación natural. Para la inducción del estado competente se requiere de un factor de competencia (FC). El DNA exógeno bicatenario se une a las células competentes en dos pasos diferentes, la unión laxa y la fuerte. Fragmentos de DNA monocatenarios son transportados al interior celular unidos a proteínas. Estos complejos DNA-proteínas facilitan la recombinación posterior de los fragmentos exógenos en el cromosoma huésped. #ROMOSOMA &# #ÏLULA COMPETENTE $.!EXØGENO 5NIØNLAXA 5NIØNFUERTE 4RANSPORTEDE$.! 2ECOMBINACIØN F tienen gran capacidad de recombinación por lo que se denominan cepas hfr por su sigla en inglés (high frecuency of recombination). Debemos recordar que este es un mecanismo muy efectivo para la transferencia de genes de resistencia antibiótica. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 73 Figura 8. Transferencia del plásmido F mediante conjugación. Una célula F+ es capaz de sintetizar un pili especial (factor F) que le permite iniciar el proceso de conjugación para transferir el plásmido F a una célula receptora F-. & CÏLULA& LASCÏLULASENTRANENCONTACTO YCOMIENZANLACONJUGACIØN & @ @ CÏLULA& %LPLÉSMIDO&SEREPLICA PRODUCIENDOUNFRAGMENTO UNICATENARIOAL %L!$.MONOCATENARIOESTRANSFERIDO @ @ SESINTETIZALAHEBRA COMPLEMENTARIA ,ASCÏLULASSESEPARAN LUEGODELATRANSFERENCIA & & 3EOBTIENENCÏLULAS&H Aportes de la biología molecular y la genética bacteriana a la medicina Una de las contribuciones más importantes de la ingeniería genética de bacterias, es su uso para desarrollar vectores o vehículos que permitan el clonado de cualquier secuencia de ADN. Los vectores más usados con este fin son los plásmidos bacterianos. 74 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Clonar implica introducir un fragmento de ADN en un vector. Los vectores de clonación deben permitir la inserción de un fragmento de ADN extraño y ser capaces de replicarse normalmente dentro de la bacteria. Como vimos, los plásmidos tienen la capacidad de autoreplicarse y son elementos génicos factibles de ser transferidos entre bacterias e introducidos en una cepa deseada, por lo tanto constituyen buenos vectores de clonación. Actualmente existen varios tipos de vectores, algunos plasmídicos (como el pBR322 o el pUC) y también virales (como el bacteriófago lambda) o, los más modernos llamados cósmidos que combinan algunas de las ventajas de los plámidos con las de los fagos. Para clonar un gen cualquiera en un plásmido, es necesario primero cortar el ADN plasmídico y el ADN del cual procede el gen a clonar, para luego ligarlos de la forma deseada. Para esto, se utilizan enzimas de restricción. Muchas bacterias sintetizan estas enzimas, que son capaces de cortar hebras de ADN (extraño a la propia bacteria), en secuencias nucleotídicas específicas. Por ejemplo, una cepa determinada de E. coli, produce una enzima denominada EcoRI, que reconoce la secuencia GAATTC y la corta (ver figura 9). Después que EcoRI ha cortado el ADN, quedarán bases sin aparear que estarán disponibles para aparearse con otro fragmento de ADN que tenga las bases complementarias. Si cortamos dos fragmentos de ADN con esta enzima y mezclamos los productos de esa reacción, se obtendrá un producto recombinante por combinación de los dos ADN originales. Estas enzimas que han sido purificadas hace tiempo y que hoy se producen comercialmente, son usadas para clonar genes en por ejemplo un plásmido bacteriano. De esta manera, es posible incorporar en un plásmido bacteriano un gen eucariota que codifique para una proteína determinada que nos interese producir en grandes cantidades, siempre que se conozca su secuencia nucleotídica y se disponga de enzimas de restricción que sean capaces de cortar específicamente el fragmento que contiene el gen. Una vez obtenido el fragmento de ADN de interés y cortado el plásmido que será usado como vector con las mismas enzimas %CO2) 2ESTRICCIØN ,IGACIØN !$.2ECOMBINANTE Figura 9. Mecanismo de acción de la endonucleasa EcoRI. La enzima EcoRI reconoce la secuencia GAATTC en el DNA de doble cadena. En ese sitio es capaz de cortar el DNA dejando extremos cohesivos. Esto permite restringir dos moléculas de DNA diferentes y luego ligarlas (utilizando una enzima ligasa), para producir una molécula de DNA recombinante. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 75 de restricción, estaremos en condiciones de ligar ambos fragmentos de ADN, valiéndonos de las propiedades de complementariedad de bases del ADN; así se construye el plásmido recombinante. Este plásmido podrá ser introducido por transformación en una cepa bacteriana apropiada y se podrá producir la proteína de interés en un cultivo bacteriano de E. coli, purificándola luego a partir del cultivo (ver figura 10). Usando estos procedimientos de clonado y expresión de genes, actualmente se producen muchas proteínas que son usadas en el tratamiento de algunas enfermedades humanas (por ejemplo la diabetes), al producir hormonas humanas como la insulina, la hormona de crecimiento o el interferón, en bacterias recombinantes obteniendo cantidades suficientes como para su aislamiento y uso terapéutico. Además, la disponibilidad de antibióticos naturales para el tratamiento de las infecciones bacterianas no es infinita, por lo que otra importante área de investigación se centra en la aplicación de la ingeniería genética a la creación de nuevos antibióticos. Por manipulación genética se intenta producir mutaciones específicas en los genes encargados de la codificación de proteínas con efecto antibiótico o producir moléculas de antibióticos híbridos, logrados por técnicas de ADN recombinante. Otra importante aplicación de la biología molecular a la medicina, es la producción de vacunas recombinantes. Este procedimiento se basa en la expresión en bacterias de genes propios de patógenos contra los que se desea vacunar, por ejemplo virus, parásitos u otras bacterias. El procedimiento consiste básicamente en el clonado de genes que codifican para antígenos de superficie del virus o del parásito contra el que se desea vacunar. Estos antígenos serán expresados en la cepa recombinante y purificados a partir del cultivo de la misma cepa, usándose luego como inmunógenos. Así, clonando los genes apropiados en los microorganismos adecuados, podrán producirse grandes cantidades del antígeno puro. Este método proporciona la ventaja de que evita trabajar con microorganismos patógenos. El desarrollo de la vacuna contra la hepatitis B representa el primer éxito de las vacunas recombinantes. Ésta, es producida en una levadura que ha sido transformada previamente con un vector recombinante que contiene el gen del antígeno de superficie del virus. Estos métodos pueden usarse también para la producción de vacunas vivas, es decir vacunas que son administradas con virus o bacterias vivas que han sido manipuladas genéticamente para perder su virulencia, pero que mantienen intactas sus propiedades inmunogénicas. Además, estos microorganismos denominados atenuados, pueden usarse como vectores de genes de otros gérmenes patógenos para producir vacunas que inmunicen contra más de una enfermedad infecciosa a la vez. Estos procedimientos son motivo de investigación en los laboratorios de desarrollo de vacunas en todo el mundo. Biotecnología aplicada al diagnóstico clínico Otro uso de la producción de antígenos a escala industrial en bacterias, es para realizar pruebas diagnósticas que detecten anticuerpos específicos contra antígenos microbianos en el suero de pacientes. En estos casos, interesa clonar en una bacteria de rápido crecimiento como E. coli, el gen que codifica para un antígeno determinado del microorganismo contra el cual se desea detectar la respuesta inmune desarrollada por el paciente. De esta manera, se producirá el antígeno proteico en cantidad suficiente como para “capturar” los anticuerpos en la técnica elegida para la prueba diagnóstica, ya sea por enzimoinmunoensayo (ELISA), inmunofluorescencia, aglutinación de partículas de látex u otras. Un ejemplo de esto, es el reciente desarrollo de una técnica de ELISA para la detección de anticuerpos dirigidos contra 76 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 10. Clonación de un fragmento de DNA en un plásmido. Un gen de interés puede ser clonado en un plásmido. Para eso, el DNA plasmídico y el DNA exógeno son tratados con la misma enzima de restricción y mezclados en presencia de una enzima ligasa. El producto de la ligación es introducido en una cepa bacteriana por transformación, y se seleccionan los clones recombinantes por la resistencia al antibiótico portada por el plásmido. !$.%842!/ ).3%2#). 0,£3-)$/ -%2#!$/2$% 2%3)34%.#)!! !.4)")/4)#/3 !$. 2%#/-").!.4% ).42/$5##).%. #¡,5,!(/30%$!$/2! 3%,%##).$%,!3#¡,5,!315%#/.4)%.%.!$.2%#/-").!.4% 0/2#2%#)-)%.4/%.02%3%.#)!$%!.4)")/4)#/ TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 77 el antígeno del core del virus de hepatitis B, habiéndose este antígeno clonado y expresado en E. coli. Las bacterias patógenas se comportan como tales porque poseen ciertos genes, tanto en cromosomas como en plásmidos, que le confieren la capacidad de expresar determinadas características fenotípicas denominadas factores de virulencia o determinantes de patogenicidad. El estudio detallado de la genética bacteriana, ha permitido identificar algunos de estos genes y hoy somos capaces no solo de identificar a una bacteria como patógena cuando la aislamos produciendo enfermedad, sino también cuando encontramos en ella los genes responsables de la expresión de determinantes de patogenicidad. Esto es importante cuando no alcanza con identificar a nivel de especie una cepa bacteriana aislada de una muestra biológica patológica, para afirmar que esa bacteria es el agente causal del proceso infeccioso. Este es el caso de las enfermedades diarreicas causadas por ciertas cepas de E. coli. Como sabemos, E. coli es parte de la microflora normal del aparato intestinal del hombre y por supuesto esas bacterias no actúan como patógenos en el intestino. Sin embargo, algunas cepas especiales de la misma especie, cuando colonizan el aparato gastrointestinal, a través de la ingesta de alimentos o agua contaminados, son capaces de multiplicarse y causar un proceso infeccioso que se manifiesta con diarrea. Estas cepas productoras de diarrea, difieren en su carga genética de las pertenecientes a la flora normal en que poseen genes que codifican para factores de virulencia, por ejemplo pueden ser capaces de producir toxinas cuyo blanco de acción es el enterocito o producir determinadas proteínas de membrana externa para adherirse a la mucosa intestinal. Entonces, cuando en una enfermedad diarreica hay que establecer el diagnóstico clínico microbiológico, por ejemplo en un lactante (edad en la que E. coli es el primer agente causal de diarrea), no alcanzará con identificar fenotípicamente como E. coli a una cepa aislada en el coprocultivo, sino que habrá que determinar la presencia de ciertos determinantes de patogenicidad para afirmar que se trata de una cepa patógena. Una opción para esto es identificar la presencia de los genes que codifican para estos determinantes. Para esto se han desarrollado técnicas de hibridación por sondas, que se basan en las propiedades de complementariedad de bases del ADN. Una sonda, es un fragmento de ADN complementario a una región de un gen que nos interesa identificar, la cual ha sido previamente marcada con algún indicador que pueda ser detectado luego de la hibridación. El marcado puede realizarse incorporando nucleótidos radioactivos o biotinilados o marcados con digoxigenina. Si en un cultivo bacteriano interesa saber si posee el gen X, cuya secuencia es conocida, podremos construir una sonda específica para dicho gen, extraer el ADN del cultivo y mezclarlo con nuestra sonda. Esto se realiza en condiciones que puedan desnaturalizar la estructura de doble cadena de ADN, para permitir que la sonda logre hibridar con su secuencia complementaria. Así, podremos evidenciar si nuestro cultivo posee o no el gen buscado, porque de estar presente encontraremos la marca correspondiente a la sonda incorporada en la estructura del ADN. Esta técnica puede usarse aplicando la sonda directamente sobre una muestra clínica, por ejemplo una sección tisular y en ese caso se denomina hibridación in situ. Hoy se disponen de muchas sondas específicas de ADN usadas para el diagnóstico de muchas enfermedades bacterianas. La hibridación por sondas y otros métodos para detectar un gen en particular, es útil para realizar el diagnóstico etiológico de las infecciones producidas por microorganismos cuyo cultivo es dificultoso, ya sea por crecimiento lento como en Mycobacterium sp., o por tener requerimientos especiales de cultivo y aislamiento como Chlamydias sp., Rickettsias sp. o virus. El mayor problema diagnóstico usando hibridación por sondas, es la baja sensibilidad de 78 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA la técnica, dado que es necesario que en la muestra existan suficientes copias del gen buscado como para que la marca correspondiente a la sonda sea detectada. Generalmente, las técnicas de hibridación in situ con sondas no radioactivas, son capaces de detectar más de 200 copias del gen. Por esto, muchas veces la sensibilidad de la técnica no es suficiente como para descartar aquellas muestras en las que se obtienen resultados negativos. Uno de los más interesantes avances en diagnóstico clínico, ha sido el desarrollo de un método que permite amplificar el número de copias de un determinado fragmento de ADN de interés. Esta técnica, llamada reacción en cadena de la polimerasa (PCR), permite generar millones de copias exactas de un fragmento de ADN a partir de una copia original en dos o tres horas. La PCR se basa en las propiedades de replicación del ADN la cual puede reproducirse in vitro si se coloca el ADN molde en una mezcla de ADN polimerasa, nucleótidos y cebadores específicos (primers) para las regiones del fragmento que se desea amplificar. Esta mezcla, se coloca en condiciones de pH y osmolaridad tales que permitan el funcionamiento adecuado de la polimerasa. Primero se coloca la mezcla a altas temperaturas (94 o 95ºC) para lograr que el ADN se desnaturalice, es decir que se separen ambas hebras. Luego se somete a temperaturas adecuadas para que los cebadores hibriden con el ADN molde (entre 40 y 55ºC, según la secuencia de los cebadores). En una tercera etapa, se coloca a la temperatura adecuada para que la polimerasa de ADN actúe catalizando la replicación. Las polimerasas que se usan para estos fines, deben ser capaces de tolerar las altas temperaturas de desnaturalización del ADN, por lo que la enzima utilizada proviene de una bacteria termófila. La polimerasa más usada en PCR, proviene de Thermus aquaticus (Taq polimerasa) cuya temperatura óptima es 72ºC. Hoy se usa ésta y también otras enzimas, producidas en forma recombinante en E. coli. Estos cambios de temperatura se realizan en un termociclador, que es capaz de variar entre rangos muy amplios de temperatura en tiempos muy cortos. Este ciclado de temperaturas, por ejemplo: 94ºC por un minuto, 45ºC por un minuto y 72ºC por un minuto y medio, se repite aproximadamente 30 veces. Así, se logra que en cada ciclo se duplique el número de Figura 11. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN molde se desnaturaliza (aprox. 94 °) y los primers se unen en sus secuencias complementarias en los extremos de la región a amplificar ( aprox. 55°, según la secuencia de los primers). Luego la polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN a partir de cada primer copiando la cadena molde ( a 72°). Asi se completa un ciclo, repitiendose el proceso unas 35 veces, amplificando la secuencia de interés en forma exponencial. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 79 copias de cada una de las hebras del ADN molde, con lo que se logra un crecimiento exponencial (ver figura 11). Este procedimento puede aplicarse directamente a una muestra clínica, para determinar la presencia o ausencia de un microorganismo en particular, mediante la detección de una secuencia específica en su ácido nucleico. Para revelar el resultado del ensayo, la mezcla de reacción debe ser sometida a electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida. En esta, el ADN migra desde el polo negativo al positivo en diferentes grados según el peso molecular, es decir su tamaño en pares de bases. El fragmento a amplificar es por supuesto de tamaño conocido, por lo que podrá determinarse la presencia del gen buscado en la muestra, porque se habrá amplificado en la reacción y aparecerá una Figura 12. Corrida electroforética banda del tamaño correspondiente en el gel (ver en gel de agarosa, para revelar figura 12). una reacción de PCR. En el carril de Los geles deberán ser revelados para que desala derecha se observa un marcador de rrollen una reacción de color visible que nos ayude peso molecular y en los dos carriles anteriores el producto de la amplifi- a determinar la presencia o ausencia de la banda de cación del tamaño esperado. En el interés. En los geles de agarosa, el revelado se hace primer carril la muestra no contenía la generalmente con bromuro de etidio, que es un agensecuencia de interés. te intercalante del ADN, es decir que su molécula se intercala entre las bases del ácido nucleico. Este procedimiento colorea el gel porque el bromuro de etidio fluoresce bajo luz ultravioleta; por lo tanto cuando el gel se expone a la luz ultravioleta, se evidenciará o no la banda correspondiente. En los geles de poliacrilamida, el revelado puede realizarse con nitrato de plata. El resultado de la PCR también puede evidenciarse, combinado la PCR con una técnica de hibridación por sondas. Esto se logra transfiriendo el ADN del gel a una membrana (por ejemplo de nitrocelulosa) y ponerla en contacto con una sonda específica. En este caso el revelado lo brinda la marca de la sonda. Este procedimiento de transferencia de ADN a una membrana combinado con hibridación por sondas, se denomina Southern Blott. Aunque hemos centrado el interés de estas técnicas de detección de ácidos nucleicos para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, también son usadas para diagnosticar algunas enfermedades neoplásicas y hereditarias. La aplicación de la biotecnología molecular a la medicina, representa un campo de intensa investigación y vertiginoso desarrollo. La prevención, el tratamiento y el diagnóstico de muchas enfermedades que hasta hace pocos años resultaba imposible, hoy son una realidad y cada vez la biología molecular aporta más conocimientos y tecnología aplicables a la mejora de la calidad de vida y la salud humana. Bibliografía • Schaechter M, Medoff G, Eisenstein BI, Guerra H. Microbiología. Mecanismos de las enfermedades infecciosas. Ed Panamericana. 2ª ed. Buenos Aires 1993 80 • TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiología. 20ª ed. BsAs. Panamericana; 1994. • Lewin B. Genes VII. Ed. 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La buena calidad de este trabajo lleva implícita, entre otras, actividades propias del laboratorio: criterio de selección de exámenes a solicitar por los médicos clínicos; recolección, rotulado y transporte de las muestras; evaluación de las muestras y pruebas de laboratorio; procedimientos que verifican los resultados y el uso apropiado por los médicos de los resultados para el diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Existen muchos métodos para realizar el diagnóstico de las infecciones microbianas en el laboratorio. Estas incluyen examen directo, aislamiento por cultivo, detección de antígenos y ácidos nucleicos y pruebas serológicos para detectar la respuesta de anticuerpos del individuo a la infección. No existe un único abordaje que cumpla todos los requerimientos del diagnóstico microbiológico, por lo tanto hay que implementar una combinación de métodos. La elección de los mismos dependerá de los diferentes factores que incluyen el conocimiento de las patogénesis de los agentes sospechosos, el estado de la enfermedad y la disponibilidad y utilidad de los diferentes métodos para la infección particular. Estrategia en la elección de los métodos El laboratorio de microbiología deberá tener a disposición del clínico todas las pruebas necesarios para el diagnóstico y la atención de los pacientes a servir. Pero no todas las pruebas pueden ser realizadas en el laboratorio, por lo tanto éste deberá decidir cuáles se realizarán allí, cuáles se enviarán a un laboratorio de referencia y cuál será ese laboratorio. Las necesidades de los pacientes dictarán el número y la variedad de métodos que el laboratorio ofrecerá. Basado en estudios numéricos históricos y predictivos de las pruebas solicitados, el laboratorio puede discontinuar pruebas poco usadas que resultan costosas y de baja calidad. Por otra parte, antes de decidir implementar una nueva prueba diagnóstica, ésta deberá ser seleccionada previamente. El conocimiento de la población influirá en esta 82 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA decisión, porque una prueba varía según su eficiencia para detectar un resultado positivo en relación con la prevalencia de esa enfermedad en la población. Generalmente las medidas de performance de una prueba incluyen sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivo y negativo. Inherente a la determinación de la sensibilidad y la especificidad de una prueba, el gold standard o patrón de oro, es el parámetro con el que se compara la prueba. Esto no siempre es posible de realizar. Existen, por ejemplo, nuevas pruebas de detección de antígenos como los ensayos para virus sincicial respiratorio que pueden ser más sensibles e igual de específicos que el cultivo convencional. En tales circunstancias no debe juzgarse la performance de una prueba contra métodos standard. Cuando se dan las condiciones para una comparación con un gold standard, la sensibilidad y la especificidad de un método es independiente de la población de pacientes a analizar. Así, los laboratorios no necesitan realizar grandes estudios de evaluación de nuevas pruebas y usarán evaluaciones que fueron realizadas por microbiólogos competentes y respetados que fueron publicados en la literatura científica. La elección de una prueba deberá basarse en la performance publicada y la utilidad detectada por el laboratorio, según la prevalencia percibida desde el laboratorio de la enfermedad en cuestión. Es conveniente definir en este momento los conceptos de sensibilidad y especificidad. La sensibilidad de una prueba diagnóstica puede tener diferentes definiciones. Puede explicar la habilidad de una prueba para detectar pequeñas cantidades de lo analizado (por ejemplo los anticuerpos). Otra definición de sensibilidad determina que es la habilidad de un método para detectar casos positivos (ausencia de falsos negativos). También puede ser definida como la probabilidad de que una prueba sea positiva cuando la enfermedad está presente o la proporción de personas con infección que reaccionan positivamente en la prueba diagnóstica realizada. Por ejemplo, una prueba diagnóstica será más sensible, cuando detecte mayor número de personas infectadas o enfermas. La sensibilidad de una prueba se calcula según la siguiente fórmula: Reactivos positivos x 100 Reactivos positivos + falsos negativos La especificidad de una prueba es la habilidad que tiene para identificar correctamente a todos los negativos (ausencia de falsos positivos). Otra definición es la probabilidad de que una prueba sea negativa cuando la enfermedad no está presente o la proporción de personas sin la infección o enfermedad que reaccionan como negativas. Por ejemplo, una prueba es más específica cuando tiene menos reacciones positivas entre las muestras de personas que no tienen la enfermedad. La especificidad se calcula según la siguiente fórmula: No Reactivos x 100 No Reactivos + Falsos positivos Por otro lado, la eficacia de una prueba es la habilidad general de detectar correctamente todos los positivos y los negativos. Es una combinación de sensibilidad y especificidad y brinda una idea de la eficacia total de una prueba. Hay que considerar que no es lo mismo aplicar una prueba a una población con alta prevalencia de determinada enfermedad que a otra población con una baja prevalencia de la misma. Es interesante conocer los valores predictivos de estas pruebas. El valor predictivo, es la probabilidad de tener la enfermedad determinada por el resultado de la prueba. Existen dos tipos, el positivo y el negativo. El valor predictivo positivo, es la probabilidad de tener la enfermedad si el resultado de la prueba es positivo y se calcula con la siguiente fórmula: TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 83 Reactivos positivos x 100 Reactivos positivos + falsos positivos El valor predictivo negativo, es la probabilidad de no tener la enfermedad si el resultado de la prueba es negativo y se calcula con la fórmula: No Reactivos x 100 No Reactivos + falsos negativos Los valores predictivos de las pruebas lo determinan la sensibilidad, la especificidad y la prevalencia de la enfermedad en la población en la que se aplica dicha prueba. Recolección y transporte de las muestras La utilidad de un procedimiento analítico está directamente influido por la calidad de la muestra. La primera apreciación a realizar es si la muestra es representativa de la enfermedad que se considera. Por ejemplo, si el paciente tiene una neumonía es incorrecto realizar un exudado faríngeo para aislar el germen causal, porque las muestras respiratorias altas no son representativas de infecciones del aparato respiratorio inferior; los microorganismos que causan estas infecciones son habitantes normales de la flora nasofaringea. En esta enfermedad, el microorganismo también se puede aislar en la sangre del individuo, porque son enfermedades que pueden cursar con bacteriemia; también en el líquido pleural si están presentes. Tampoco es correcto en enfermos con otitis media, buscar el microorganismo causal en el exudado nasal por las mismas razones. Pero en este caso (otitis media), el microorganismo se puede aislar en el líquido del oído medio por punción de la membrana timpánica. Los materiales provenientes de sitios normalmente estériles, siempre son muestras excelentes cuando se realizan en condiciones adecuadas. Para estudiar las bacteria anaerobias, nunca se deben recoger muestras contaminadas con flora normal, porque generalmente los anaerobios forman parte de la flora normal y su aislamiento en muestras recogidas en contacto con piel o mucosas son imposibles de interpretar. Para la recolección de las muestras, el médico debe considerar que para realizar una buena recolección es fundamental la transmisión correcta de las indicaciones, las cuales deben ser racionales. Esto es importante para que el personal que recoge la muestra (enfermeras, técnicos de laboratorio, etc.), sepan y entiendan lo que deben hacer. En la selección de la muestra hay que considerar la representatividad como ya fue mencionado. Además, siempre hay que preparar el sitio de extracción de la muestra. Si se realiza por punción, habrá que realizar la desinfección correcta de la piel; si es un examen de orina, la limpieza de la región y recolección del chorro medio, etc. Es importante destacar que es frecuente recibir en el laboratorio de microbiología muestras inadecuadas por diferentes razones. Describiremos algunas de estas solicitudes irracionales. Los hemocultivos se reciben como muestras únicas o más de tres en 24 horas. Las muestras únicas de sangre dificultan la interpretación en el laboratorio, porque se aíslan microorganismos de la flora normal de piel y no se puede evaluar si éstos son por contaminación de la muestra en el momento de la extracción o porque dicha bacteria en la causante de la enfermedad del paciente. En la mayoría de las situaciones no se necesita realizar tomas seriadas que recargan innecesariamente el trabajo del laboratorio y no aportan datos nuevos de interés. Las muestras de heridas o secreciones respiratorias para estudio bacteriológico, pueden ser inadecuadas cuando existe predominio de células epiteliales sobre la otra población celular y no son representativas del estudio que se pretende. Para el estudio de virus respiratorios, se considera 84 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA que la muestra fue incorrecta si en los aspirados nasofaríngeos no se obtuvieron células. Otras muestras inadecuados para estudio son: muestras de objetos y superficies inanimados, exudados de lesiones de boca, contenido intestinal, abscesos perirectales, colostomía, exudados de lesiones de decúbito y puntas de sondas vesicales o catéteres pleurales. A continuación se mencionan los requisitos necesarios para una correcta recolección de las muestras. En principio dicha recolección debe realizarse antes del inicio de la antibioticoterapia. Un ejemplo demostrativo es la realización de la punción lumbar en la meningitis aguda supurada. En esta situación, luego del diagnóstico clínico se realiza la punción lumbar para el diagnóstico citoquímico y bacteriológico; luego y antes de obtener los resultados, se inicia el tratamiento antibiótico. Posteriormente, cuando se tienen los resultados, en las mejores de las situaciones se podrá adecuar la terapéutica o adoptar otras conductas pertinentes. Como los antibióticos no tienen efectos sobre los virus, se puede obtener una muestra para cultivo viral aún cuando el tratamiento antibacteriano ya se hubiera iniciado. También es útil averiguar si el paciente ha recibido vacunas virales o tratamiento antiviral recientemente. La muestra se dirigirá a buscar el microorganismo en el sitio donde esté y se buscará que la muestra esté exenta de contaminación externa; para esto es necesario que el técnico brinde al paciente la instrucciones al respecto. También hay que considerar la etapa de la enfermedad, por ejemplo para aislar Salmonella typhi en la fiebre tifoidea, se podrá aislar en una muestra de sangre obtenida en los primeros días de enfermedad, con el pasar del tiempo la posibilidad de recuperación del germen disminuye y habrá que recurrir a otras muestras como materia fecal que tienen menor significación clínica. Para los virus, las mejores muestras generalmente son las que se obtienen al inicio de la enfermedad (dentro de las primeras 72 horas), cuando el virus se excreta a concentraciones relativamente elevadas y todavía no se ha unido a anticuerpos. Después de transcurridos siete días, habitualmente no vale la pena realizar cultivos virales cuando se trata de huéspedes inmunocompetentes. No obstante, en inmunocomprometidos y en infecciones virales persistentes o crónicas, el virus puede aislarse durante períodos prolongados. La muestra deberá tener un volumen suficiente para su procesamiento, además de ser recogida en recipiente rotulado y limpio por fuera. Es imperativo que la muestra se acompañe de datos clínicos. El envío debe realizarse rápidamente preservando la muestra de temperaturas extremas y de la desecación. Para ello se usan medios de transporte. Los hisopos son de diferentes materiales: algodón, alginato, etc. Existe la posibilidad de que algunos sean tóxicos para algunas especies bacterianas y se desaconseja su uso en algunas muestras. Generalmente los hisopos de algodón son de uso generalizado, considerando que pueden contener ácidos grasos no saturados inhibidores de N. gonorrhoeae, por lo que se recomiendan los de alginato de calcio o de dacron para muestras uretrales. A continuación detallaremos algunos ejemplos de recolección y transporte de muestras clínicas. • Hisopados conjuntivales: frotar la conjuntiva palpebral con un hisopo estéril humedecido con solución salina estéril. Colocar el hisopo en 3 o 4 ml de medio de transporte. • Hisopados de lesiones y vesículas cutáneas: recolectar la muestra dentro de los tres días de la erupción de la vesícula. Primero, se lava suavemente la superficie de la vesícula o la lesión con etanol al 70%, luego se aspira el fluido vesicular con una jeringa de tuberculina y se coloca el aspirado en 3 o 4 ml de medio de transporte. En las lesiones cutáneas o vesículas abiertas, frotar con un hisopo y colocarlo en 3 o 4 ml de medio de transporte. El hisopado de las vesículas puede ser colocado en el medio de transporte que ya tiene el fluido vesicular. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 85 • Aspirado nasofaríngeo: es la muestra de elección para los virus respiratorios. Se introduce una sonda nasogástrica (SNG) por las fosas nasales hasta la rinofaringe y se aspira el moco en un tubo colector especial. El contenido de la SNG se lava con medio de transporte para virus que se recoge en el tubo colector. • Hisopados nasales: introducir suavemente un hisopo de algodón seco en la nariz. Dejar el hisopo en la nariz durante algunos segundos para que las secreciones sean absorbidas. Colocar el hisopo dentro de 3 o 4 ml de medio de transporte. • Hisopados faríngeos: frotar las amígdalas y la faringe con un hisopo de algodón seco. Colocarlo en 3 o 4 ml de medio de transporte. • Hisopados rectales: introducir un hisopo de algodón humedecido, 2 o 3 cm dentro del canal anal y realizar movimientos rotatorios. Colocar el hisopo en 3 o 4 ml de medio de transporte. • Heces: recolectar 2 o 4 g de la muestra en un recipiente limpio. • Orina: recolectar 10 a 15 ml de orina recientemente emitida en un recipiente estéril y enviarla directamente al laboratorio. • Líquido cefalorraquídeo (LCR): recolectar al menos 0,1 ml de LCR (mejor 2 o 3 ml). Transportarlo al laboratorio inmediatamente. • Sangre con anticoagulante (para cultivo viral o inmunofluorescencia): recolectar sangre entera en un tubo que contenga heparina, citrato o EDTA (quelante de calcio) y enviarla directamente al laboratorio. La entrega rápida (2 a 6 horas) al laboratorio es esencial. • Suero (para pruebas serológicas): recolectar la muestra de sangre en un tubo estéril que no contenga anticoagulantes. Enviar la muestra al laboratorio (no congelar). Los medios de transporte son diferentes para estudio viral o bacteriano. Métodos El cultivo y la identificación de los patógenos específicos a partir de los materiales recogidos de los pacientes en los que se sospecha una infección es la mejor herramienta diagnóstica disponible, aunque no la más rápida. En algunas situaciones dicho estudio resulta difícil o incluso imposible, por ejemplo en rickettsiosis y en la sífilis. En algunos casos puede ser necesaria la serología u otros métodos, ya sea por que no se conocen las condiciones necesarias para su cultivo in vitro o por los riesgos que implica la manipulación de estos microorganismos. Hoy se dispone de técnicas para detectar y cuantificar muchos marcadores específicos de enfermedades infecciosas. Por un lado, se usan técnicas inmunológicas para cuantificar las inmunoglobulinas específicas o detección de antígenos en los tejidos; por otro, la introducción de la genética molecular en el laboratorio clínico, ha sido un gran avance al respecto. MÉTODOS DIRECTOS Son aquellos que detectan: al microorganismo por microscopia, al microorganismo por cultivo, a los antígenos del microbio y los ácidos nucleicos (reacción en cadena de la polimerasa). Para la detección de antígenos se usan técnicas inmunológicas como la inmunofluorescencia (IF), el enzimoinmunoanálisis (EIA) y los test de aglutinación. MÉTODOS INDIRECTOS Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) que desarrolla el huésped. Se basan en la detección de anticuerpos específicos mediante técnicas inmunológicas (EIA, IF, western blot, etc.). 86 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA DIAGNÓSTICO MICROSCÓPICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS El microscopio de luz es una de las herramientas más útiles en el diagnóstico bacteriológico. Aún hoy con el desarrollo de métodos más rápidos (muchos requieren instrumentos sofisticados o caros), la simple visualización microscópica de muestras clínicas es todavía la forma más rápida y específica de orientar el diagnóstico clínico. Basta recordar la utilidad del examen en fresco para la visualización de algunas bacterias, por ejemplo el examen en fresco con campo oscuro para Treponema y las muestras fijadas y teñidas con coloraciones simples o diferenciales, como la coloración de Gram o de Ziehl Neelsen. Existen distintos tipos de microscopios ópticos o de luz. El más usado en el laboratorio de bacteriología es el microscopio de campo claro (de luz transmitida), el resto (de campo oscuro, de contraste de fases, de luz ultravioleta) tienen uso más restringido. El microscopio de luz consta de dos sistemas de lentes convergentes: el objetivo (próximo al objeto de estudio) y el ocular (próximo al ojo del observador). Posee un objetivo de bajo aumento (10X), uno de mediano aumento (40X) y uno de alto aumento (100X o lente de inmersión). Este último es el más usado en bacteriología, porque al sumergir el lente en el aceite que recubre el preparado aumenta el poder de resolución a 0,2 micras, siendo posible observar la mayoría de los tipos bacterianos. El microscopio posee además una fuente de luz (incluida o externa al instrumento), un condensador móvil, un espejo que refleja la luz y un diafragma que permiten regular el paso de la luz concentrando los rayos luminosos sobre el objeto. Por último, tiene una platina para colocar la lámina de estudio y un mecanismo de ajuste para enfocar el sistema de lentes sobre el objeto. Dicho mecanismo consta de un macrométrico (de ajuste grosero) que coloca al objeto próximo al foco y un micrométrico (de enfoque fino) que permite el enfoque del objeto. La microscopia óptica es un método sencillo y rápido que muchas veces orienta al diagnóstico etiológico. Nos informa la cantidad y morfología bacteriana, además de la presencia de determinados tipos celulares presentes en el preparado que validan o no la muestra para el análisis microbiológico; por ejemplo: las células epiteliales en muestra de secreciones respiratorias. El examen microscópico puede realizarse en fresco u obteniendo un frotis fijado y coloreado. El examen en fresco permite apreciar la existencia de bacterias y la presencia de movilidad de las mismas y características de esta. Esto último muchas veces orienta a la identificación de una cepa bacteriana o al diagnóstico etiológico. Algunas bacterias como las espiroquetas tienen un diámetro muy pequeño como para ser observadas en un microscopio de luz transmitida, por lo cual se usa el microscopio de campo oscuro que permite distinguir sus propiedades morfológicas y de movilidad. En este microscopio, la luz pasa a través de un condensador que proyecta luz transversalmente sobre la muestra, de modo que el haz de luz incide oblicuamente sobre la superficie del microorganismo siendo reflejado. Los rayos desviados son los que penetran en el objetivo y hacen que los cuerpos bacterianos se observen rodeados de un halo brillante. La microscopia de fluorescencia tiene los mismos principios de óptica, las diferencias están relacionadas con la generación y transmisión de la luz útil para la excitación de colorantes fluorocromos o de fluorescencia natural de los microorganismos. Algunos producen luz después de absorber luz ultravioleta; otros lo hacen luego de haber tomado un fluorocromo, por ejemplo las bacterias ácido alcohol resistentes. Por último, otros producen luz luego de la unión del antígeno a un anticuerpo conjugado previamente con un colorante fluorescente, este método es muy usado en virología y será expuesto con las técnicas Inmunológicas; también es muy TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 87 usado en el diagnóstico de algunas enfermedades bacterianas, poe ejemplo Chlamydia spp. y virus sincicial respiratorio. La microscopia electrónica usa electrones en lugar de luz. Dicho método de estudio es útil por ejemplo para el diagnóstico de virus causantes de gastroenteritis. Con el microscopio electrónico se puede observar la morfología de los viriones presentes en las muestras clínicas. La limitación de este método, además del costo del microscopio, es que necesita una concentración elevada de viriones (aproximadamente 109 partículas virales por ml, dependiendo del virus) en la muestra, por lo tanto decimos que es poco sensible. Por esto es una técnica poco usada, más aún con el desarrollo de técnicas alternativas de similar utilidad. El microscopio electrónico nos permite, por ejemplo, obtener resultados positivos rápidos de muestras de materia fecal de pacientes con diarrea. Rotavirus, Adenovirus, Coronavirus y Calcivirus pueden ser visualizados e identificados como causantes de esta enfermedad. Por ejemplo, Rotavirus posee una forma característica en doble rueda y un tamaño distintivo (70 nm de diámetro) y se los encuentra en concentraciones de hasta 1011 partículas virales por gramo de heces. También en otras muestras, como líquido vesicular, biopsia de tejidos, verrugas, orina o suero es posible obtener resultados positivos mediante coloración negativa. Si la concentración de virus en la muestra clínica es baja y por tanto no son visibles directamente por el microscopio electrónico, se pueden usar técnicas que aumentan la visualización, por ejemplo la inmunoelectromicroscopia. Ésta consiste en el agregado de anticuerpos específicos antivirales y la formación de agregados de partículas que son visibles con mayor facilidad que las partículas solas (ver figura 1). AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS VIABLES El cultivo es aún el gold standard y una herramienta importante de diagnóstico. Permite además, identificar el microorganismo aislado, realizar estudios de sensibilidad a los antibióticos y antivirales y tipificar el microorganismo con fines epidemiológicos. Figura 1. Microfotografía electrónica de virus visualizados en heces de pacientes con diarrea. A- Adenovirus. B- Rotavirus. 88 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Para el microbiólogo el problema es decidir cuál o cuáles de los microorganismos aislados en una muestra clínica están involucrados en la enfermedad en cuestión. Son pocos los microorganismos a los cuales el término “patógeno” puede aplicarse invariablemente, definiendo patógeno aquel microorganismo que siempre que se encuentra estará causando una enfermedad infecciosa. La mayoría pueden integrar la flora del huésped que es dinámica en su composición. Por lo tanto, es interesante definir los sitios estériles y los que poseen flora, aunque no existen categorías claras que delimiten entre especies patógenas e inocuas. Las conclusiones se basarán en los criterios establecidos para un buen procesamiento del material. Como regla general, la elección de métodos y medios de cultivo se ajusta a la naturaleza, al origen de la muestra y a los interrogantes que se pretende responder. Por ejemplo para una muestra de pus drenada de un absceso: ¿Cuáles microorganismos están presentes como agentes causales? Se supone que cualquier microorganismo presente puede ser el causal y que el tratamiento dirigido hacia él debe resultar beneficioso. La estrategia a seguir debe ser recuperar cualquiera y todos los microorganismos presentes. El método será utilizar varios medios de cultivo y enriquecimiento. En contraste con este enfoque abierto, algunos cultivos se realizan para determinar si un patógeno particular está presente o no. Por ejemplo en un exudado faríngeo: ¿Cuáles microorganismos están presentes como agentes causales? S. pyogenes. La estrategia a aplicar debe ser investigar un único agente tratable y cultivable. Por lo tanto el me´todo será usar medios de cultivo solo para S. pyogenes. De esto se desprende que existe muchos medios de cultivo con diferentes propósitos. Por un lado, existen los medios simples que permiten el desarrollo de microorganismos con gran capacidad metabólica, que con pocos nutrientes son capaces de extraer todo lo necesario para multiplicarse. Por el contrario, existen medios complejos que agregan diferentes sustancias necesarias a algunos microorganismos. Los medios de cultivo también pueden definirse como determinados, aquellos que tienen su composición químicamente definida o aquellos no bien definidos. Para el cultivo pueden usarse medios de cultivo diferenciales que ponen en evidencia alguna característica metabólica de algún grupo de bacterias. También pueden usarse medios selectivos que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos, permitiendo el desarrollo particular de otros. Por último, los medios de enriquecimiento son medios líquidos que facilitan el desarrollo de algunos microorganismos inhibiendo la flora asociada y modificando la relación cuantitativa entre estos. El aislamiento posterior en medios sólidos permite la recuperación de estas bacterias. En el laboratorio de bacteriología clínica cuando se realizan estos cultivos, hay que considerar su sensibilidad para las diferentes muestras. No es lo mismo el diagnóstico de infección urinaria por urocultivo (técnica de sensibilidad alta), que el diagnóstico de neumonía por cultivo de esputo (técnica de sensibilidad muy baja). Otro elemento importante a considerar es la valoración de resultados positivos. ¿El microorganismo aislado de un sitio normalmente estéril, es un contaminante?; ¿forma parte de la flora normal de otros sitios en el huésped? Un ejemplo interesante es cuando se realiza una única muestra de hemocultivo y se aísla S. epidermidis, éste es un aislamiento en sangre normalmente estéril de un microorganismo que normalmente habita la piel del ser humano. Es imperativo en estas situaciones tener más de una muestra para poder interpretar estos resultados y definir si es una contaminación accidental o el microorganismo aislado es el responsable de la enfermedad. Las pruebas de identificación de las bacterias aisladas y los estudios de sensibilidad se describen en los capítulos respectivos. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 89 Cultivos celulares El aislamiento de un virus como técnica gold standard, permitía medir todas las otras pruebas de diagnóstico viral; pero hoy con el desarrollo de nuevas técnicas de biología molecular, el cultivo ya no es la técnica más sensible. Asimismo, el aislamiento de virus tiene elevada sensibilidad y especificidad; pero como solo se amplifica el virus, aumenta la sensibilidad sin disminuir la especificidad. Sin embargo, existen algunas desventajas en el aislamiento del virus. El proceso suele ser lento (días a semanas para la identificación) y en consecuencia puede no estar disponible a tiempo para influir en el tratamiento del paciente. Además, es un proceso dificultoso y caro. Por otra parte, requiere el uso de sistemas de cultivo adecuados, por ejemplo necesitan muchas líneas celulares para la detección óptima de virus. Los cultivos celulares son los biosubstratos más usados para la propagación de los virus. Un cultivo celular es obtenido de explantes de órganos o de embriones de animales. Estas células obtenidas asépticamente se disocian por acción de una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspención de células libres así obtenidas, se coloca en la superficie plana de un recipiente de vidrio o de plástico, donde se adhieren y multiplican formando una capa fina de células que se llama monocapa celular. Ésta crece en un medio de cultivo complejo que contiene albúmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer. Se previene la contaminación bacteriana agregando antibióticos adecuados al medio de cultivo. Los cultivos celulares en monocapa son los más usados, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos en microcarriers, etc.). Los cultivos celulares se dividen en primarios, diploides y líneas celulares continuas. Los primeros se obtienen a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces. Las líneas celulares diploides, crecen en pasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y conservan, por lo menos en un 75%, el cariotipo correspondiente a la especie de que provienen. Las líneas celulares continuas, permiten un número finito de subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer una línea continua, esta debe haber sido subcultivada por lo menos 70 veces. Estas líneas celulares continuas ofrecen las siguientes ventajas: disponibilidad para todos los investigadores de stocks de células idénticas, ya sea congeladas en ampollas o en monocapa en botella de cultivos, con la posibilidad de reconstituirlas cuando sea necesario. Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en todos los laboratorios. Libre de contaminación con agentes extraños. Los distintos cultivos celulares varían en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes virus, ya que existe una relación específica entre el huésped y el virus, que está en relación con los datos clínicos y el tipo de muestra para inocular. Así por ejemplo la línea celular HEp-2, son células heteroploides humanas derivadas del carcinoma laríngeo y se recomiendan para virus sincicial respiratorio y Adenovirus. La MRC5, es una línea diploide fibroblástica de pulmón embrionario humano, que se usa para el aislamiento del Citomegalovirus, el virus sincicial respiratorio, herpesvirus , Echo virus, etc. La MDCK, es una línea celular diploide de riñón canino que se recomienda para el aislamiento del virus Influenza. Luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37º C por un período de hasta 14 días en promedio, esperando la aparición del efecto citopático, la toxicidad o la degeneración celular. El cultivo se observa al microscopio a las 24, 48, 72 horas y luego 2 veces por semana. Se usan cultivos celulares no inoculados para control y comparación con cualquier cambio morfológico observado en los cultivos inoculados. El efecto citopático es la visualización de cambios morfológicos más o menos característicos en las células inoculadas producidas por 90 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA la acción del virus en el cultivo celular. Así, por ejemplo, el virus sincicial respiratorio forma sincicios o células gigantes en HEp-2. Los Adenovirus, forman células redondeadas con forma de racimo en HEp-2, dejando áreas libres de células. Cuando los virus no producen efecto citopático, se puede recurrir a técnicas que ponen en evidencia la presencia de este en el cultivo. Las más usadas son: hemadsorción, hemaglutinación y tinciones con anticuerpos monoclonales. (Ver figura 2). Hay virus que durante su multiplicación intracelular expresan en la membrana de la célula huésped elementos estructurales virales llamados hemaglutininas, glicoproteínas capaces de unirse a receptores específicos en la membrana de glóbulos rojos de diferentes especies animales. Por lo tanto, si se agregan glóbulos rojos a un cultivo inoculado, se puede evidenciar la infección de esas células a través de la unión de los glóbulos rojos a la superficie celular. Dicho fenómeno se conoce como hemadsorción. En la hemaglutinación, las hemaglutininas pueden evidenciarse en el sobrenadante de los cultivos usando el mismo fundamento que para la hemadsorción. MÉTODOS ALTERNATIVOS Otros métodos que pueden usarse en forma alternativa a los cultivos, tienen algunas ventajas y desventajas respecto a éstos. La especificidad puede ser imperfecta. Además, pueden ser incapaces de estudiar el patógeno en cuestión, como lo permite el aislamiento del microorganismo. Por otra parte, pueden ser más sensibles, permitiendo llegar a un diagnóstico con cultivos negativos. Además se realizan en menos tiempo; son más rápidos. Inmunoquímicos Estos ensayos se basan en la detección de anticuerpos (Ac) específicos que permiten señalar a determinado microorganismo presente en una infección. La otra posibilidad es la detección de antígenos (Ag) solubles en los materiales a estudiar. Son todas reacciones de tipo antígeno anticuerpo (Ag-Ac). La especificidad de los antisueros de uso corriente en el laboratorio suele ser muy variada. Generalmente, los microorganismos son un mosaico de antígenos expuestos. Según su especificidad podemos encontrar tres tipos de inmunoglobulinas: policlonales, monoespecíficas y monoclonales. Por ejemplo supongamos que dos bacterias A y B son diferentes; que la bacteria A presenta en su superficie tres Ag diferentes y que la bacteria B posee un Ag idéntico al de la bacteria A, un Ag propio y único y, un Ag que reacciona en forma cruzada con A. Un antisuero policlonal contra la bacteria A, la reconocerá en todos sus Ag, pero también reconocerá a B por el Ag idéntico al de A y por aquel que tiene reacción cruzada con A. Si pensamos en un antisuero monoespecífico contra el Ag en que B tiene reacción cruzada con A, también reconocerá las dos bacterias, tanto por reconocimiento específico, como por reacción cruzada. Por último, un Ac monoclonal solo reconocerá a la bacteria A, dado que no hay posibilidades de reacción cruzada. Es importante destacar que generalmente, todas las pruebas mejoran la especificidad y sensibilidad con los Ac monoclonales, pero su uso debe ser valorado junto a las necesidades, los costos, etc. Aunque existen técnicas diferentes para la detección de Ag o de Ac, todas se basan en diferentes formas de evidenciar una reacción Ag-Ac. La contrainmunoelectroforesis (CIE) fue una de las primeras técnicas en usarse. Ésta se basa en la carga negativa que presentan los Ag bacterianos en medio alcalino, cuando son sometidos a una corriente eléctrica; en cambio, los Ac permanecen neutros. Esta técnica es poco usada en la actualidad porque es menos sensibles que otras que se desarrollaron posteriormente y de mayor costo económico. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 91 Figura 2. Representación esquemática de un ensayo de aglutinación. Técnicas muy usadas y de fácil realización son las que se basan en aglutinación de partículas, por ejemplo la aglutinación de látex o la coaglutinación que usa S. aureus y su proteína A fijadora de inmunoglobulinas. La prueba de aglutinación es un método sencillo, de un solo paso. Además es una técnica rápida y barata. Los ensayos de aglutinación dependen de la fijación inicial de Ac o de los Ag específicos sobre eritrocitos o partículas de látex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clínica, en la que se investiga el Ag o los Ac y las partículas se aglutinan si el Ag o Ac adecuado se encuentra presente. La prueba de aglutinación ha sido usada para detectar el Ag (el más importante) de Rotavirus en heces, mostrando buena sensibilidad cuando se lo compara con el EIA para Rotavirus. También se ha usado para detectar Ag de Adenovirus. (Ver figura 2) Las técnicas de análisis inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) que usan Ac unidos a enzimas que catalizan reacciones colorimétricas, son de uso corriente. Los ELISA para la detección de Ag se basan en la “captura” del Ag por Ac específicos unidos a una fase sólida, generalmente el pocillo de una microplaca o una esfera de plástico pequeña. El Ag viral presente en la muestra clínica se combina con el Ac fijado a la fase sólida y el Ag viral se detecta mediante la adición de otro Ac específico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. En la reacción con peroxidasa el substrato es un peróxido capaz de oxidar un compuesto químico incoloro, que en su forma oxidada tiene un color característico. Si la enzima es fosfatasa, la desfosforilización es la responsable directa de la aparición del color. En los últimos años los EIA indirectos se han aplicado al diagnóstico de Ac virales. En esta técnica los Ag virales se inmovilizan en una fase sólida (esferita, policubetas para microtitulación u otros elementos de plástico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la reacción Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato apropiado para ésta. Con esta técnica se pueden procesar muchas muestras en forma rápida y automatizada, sin requerir de un observador experimentado para leer los resultados, dado que estos se leen con espectrofotómetros especialmente diseñados. Por lo tanto, dicha técnica se considera más objetiva (ver figura 3). Las técnicas inmunomicroscópicas que usan la fluorescencia (IF), también son usadas para la detección de Ag o Ac. Es una de las técnicas más antiguas y de uso más difundido en el laboratorio clínico. El principio básico de la IF directa se ilustra en la figura 4. Las muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas en un portaobjetos donde se dejan secar 92 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 3. Esquema para la detección de antígenos por enzimo inmuno ensayo directo Figura 4. Esquema de inmunofluorescencia indirecta TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 93 y se fijan. Luego se agregan Ac específicos marcados con isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los Ag virales expresados en las células. La reacción Ag-Ac se observa con el microscopio de fluorescencia por la aparición de fluorescencia de color verde manzana. Esta técnica se puede usar para identificar rápidamente el virus directamente en la muestra (por ejemplo en las células del lavado nasal o de un hisopado nasofaríngeo) o para confirmar el efecto citopático observado en cultivos celulares. Esta técnica se llama IF directa. Además con el uso de Ac monoclonales específicos para los Ag inmediatos de Citomegalovirus, es posible determinar la presencia de dicho virus en cultivos celulares algunos días antes de que se pueda reconocer el efecto citopático. Sin embargo, la eficacia de la técnica depende mucho de la calidad de los reactivos, del microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnóstico certero; además de la recolección y preparación de la muestra adecuada. Aun así, la técnica realizada en manos expertas resulta útil para identificar algunos virus como los respiratorios, dado que proporciona un diagnóstico etiológico en una jornada de trabajo. También pueden estudiarse muchas muestras simultáneamente. El advenimiento de los Ac monoclonales ha incrementado la especificidad y en algunos casos la sensibilidad de estos ensayos. Los Ac monoclonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína pueden usarse para identificar el virus sincicial respiratorio, Influenza A y B, Parainfluenza 1,2 y 3 y Adenovirus entre otros. También permite subtipificar especies virales como por ejemplo el virus herpes simple de tipo 1 y 2. Esta técnica requiere solo dos a cuatro horas y se le ha reportado una sensibilidad del 70-80 % comparada con los cultivos celulares para la identificación del virus herpes simple, 80-95% para el virus sincicial respiratorio y 71% para Influenza A. La tinción con inmunoperoxidasa es similar a la de IF y es la técnica de elección en algunos laboratorios. El procedimiento requiere algunos pasos adicionales, dado que en este caso el Ac monoclonal esta marcado con una enzima que requiere la adición de un substrato, para evidenciar la reacción por un cambio de color visible micro y macroscópicamente. La IF indirecta es un método rápido y confiable para la determinación de Ac en el suero del paciente. El principio de la técnica se ilustra en la figura 4. Se basa en la unión del Ac presente en el suero del paciente, con los Ag expresados en la superficie y el citoplasma de las células infectadas, que han sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control de especificidad se usan células no infectadas. Primero se incuba el suero del paciente con las células infectadas y no infectadas; luego se realiza un lavado con solución amortiguadora y se agregan Ac contra la inmunoglobulina G humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína. Éste último es una sustancia que se vuelve fluorescente a la exposición de la luz ultravioleta y emite una luz de color verde característica. El conjugado se unirá a los Ac del paciente si la reacción es positiva, leyéndose la prueba en un microscopio de fluorescencia. La presencia de Ac se evidencia por la aparición de fluorescencia en el citoplasma y la superficie de las células infectadas, mientras que las células control no fluorescen, generalmente se ven de color rojo. (Ver figura 4). El radioinmunoensayo (RIA) fue originalmente aplicado para identificar el Ag de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y el Ac anti-HBsAg. Estos ensayos tienen buena sensibilidad y especificidad, pero la aparición del EIA con mayor tiempo de conservación de los reactivos, costo más bajo y ausencia de residuos radioactivos, ha reemplazado las técnicas de RIA en la mayoría de las situaciones en las que se requiere la detección de Ag viral. La técnica de western blot (WB) tiene muchas aplicaciones en el diagnóstico virológico. Son particularmente útiles para el diagnóstico del virus de la inmunodeficiencia humana 94 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 5. Esquema de Western blott para la detección de anticuerpos (VIH). Dicha técnica se basa en la separación electroforética de proteínas virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa, con el objeto de determinar la presencia de Ac específicos contra cada una de esas proteínas. Se realiza esquemáticamente en tres pasos. En el primero se realizan cultivos celulares de grandes cantidades de virus que luego son tratados químicamente para su disgregación e inactivación. Los Ag resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida. A continuación se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag separados a membranas de nitrocelulosa. Por último se coloca el suero del paciente en la membrana de nitrocelulosa y se agregan Ac anti-inmunoglobulina humana unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina); finalmente se agrega el substrato enzimático para la visualización de las bandas reactivas con un producto final coloreado. Esta técnica es similar a un EIA, aunque menos sensible pero más específica. En la práctica, solamente el tercer paso se realiza en los laboratorios de diagnóstico, dado que los equipos comerciales proveen tirillas con los Ag; esto facilita la estandarización de las determinaciones. (Ver figura 5) La interpretación de las pruebas serológicas que detectan Ac tienen como concepto central, el aumento del título. El título de Ac es la recíproca de la mayor dilución del suero del paciente, en que los Ac son aún detectables. Los pacientes con muchos Ac tienen títulos altos, ya que los Ac serán detectables aún en diluciones altas del suero. Los pacientes con respuesta humoral íntegra, aumentarán el título de Ac durante la enfermedad. Por lo tanto, se deben realizar dos extracciones de suero con un intervalo de dos semanas para poder detectar las modificaciones en el título, la cual tiene que ser cuatro veces (dos diluciones) mayor para considerarse significativa. En algunas infecciones serán necesarios períodos de tiempo mayores para evidenciar dichos cambios. Una forma alternativa es la detección de inmunoglobulina M (IgM) específica. Como método directo, la detección de Ag es de uso corriente en el laboratorio para el diagnóstico de agentes de meningitis, para la detección de Ag de S. pyogenes en la faringe y para muchos virus (sicicial respiratorio, Rotavirus, virus de la hepatitis). Como método indirecto para la detección de Ac contra el microorganismo se usa en: brucelosis, fiebre tifoidea, infecciones por Chlamydia o Mycoplasma, infecciones virales como hepatitis, VIH, virus herpes y enfermedades eruptivas como sarampión, rubéola, paperas y dengue. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 95 Basados en los ácidos nucleicos En los últimos años, ha ganado aceptación en el laboratorio clínico el uso de técnicas basadas en la detección de ácidos nucleicos. La combinación del reconocimiento de fragmentos de ácidos nucleicos por medio de sondas y la amplificación previa continúan en desarrollo. Actualmente es posible extraer secuencias específicas de un fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) por medio de endonucleasas de restricción. Luego estas secuencias extraídas se pueden desnaturalizar y marcar con una enzima o con un isótopo radioactivo. A estas cadenas marcadas, que tienen una secuencia de ADN conocida se llaman sondas de ácidos nucleicos. Hoy se están produciendo sondas de ácidos nucleicos sintéticas, y así se obtienen sondas de oligonucleótidos de alta especificidad que están disponibles en el mercado y son las más usadas en los laboratorios. Hibridación molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones pueden ser: ADNADN, ARN-ARN y ADN-ARN. Primero tratan las muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los ácidos nucleicos. Luego se añade un fragmento de ADN marcado, complementario al ADN viral o bacteriano y se incuba en condiciones que posibiliten la hibridación. Finalmente la muestra se pasa por una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al ADN hibridado, de la no hibridada. Dependiendo de como este marcada la sonda, se detectará la hibridación. Si está marcada con un isótopo radiactivo se puede hacer una lectura en un contador gamma, en la cual la cantidad de radiación medida en la columna es directamente proporcional a la cantidad de ADN presente en la muestra problema. También se puede realizar la electroforesis del ADN hibridado con la sonda marcada, en gel de poliacrilamida y detectar la radioactividad emitida por la sonda mediante la aplicación de una placa de rayos X (autoradiografía). Si está marcada con una enzima se detecta por colorimetría. Citomegalovirus, Papilomavirus y virus Epstein-Barr, han sido identificados usando sondas de ácidos nucleicos (ver figura 6). La amplificación de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es otra técnica alternativa a los cultivos. Primero se realiza la amplificación de los Figura 6. Hibridación de AND con una sonda marcada 96 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA fragmentos de ADN a hibridar, con la reacción en cadena de la polimerasa que aumenta notablemente la sensibilidad de las técnicas de detección de ADN. Aunque todavía son costosos, estos métodos de microbiología molecular, ya tienen su espacio en el laboratorio clínico. Son útiles en la investigación de algunas bacterias como Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia sp., Mycoplasma. También se usan para la detección de genes que le confieren a la bacteria resistencia a algunos antibióticos, por ejemplo la meticilino resistencia de S. aureus y las betalactamasas de N. gonorrhoeae. En virología han introducido importantes cambios en el diagnóstico de enfermedades, tales como la encefalitis herpética y otras enfermedades neurológicas virales, la infección por VIH del recién nacido y la infección por Papilomavirus humano. La PCR fue desarrollada por Saiki et al., para aumentar el número de moléculas de ADN blanco en las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una única molécula de ADN y una sola copia de genes puede ser extraída de mezclas complejas de secuencias genómicas y visualizada como bandas diferentes en geles de agarosa. Esta técnica consiste, en una amplificación de secuencias específicas del ADN. Se basa en el uso de secuencias cortas de nucleótidos sintéticos llamados primers o cebadores, que se hibridan específicamente con cada una de las cadenas de ADN previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la reacción se produzca se usa una enzima llamada Taq pol (ADN polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucleótidos trifosfatos. La función natural de la ADN polimerasa consiste en reparar y replicar el ADN. Los deoxinucleótidos trifosfatos se necesitan como ladrillos para la construcción. El nucleótido al cual se una la polimerasa será complementario al de la base en la posición correspondiente de la cadena templado. Se sintetiza así una cadena simple de ADN, complementaria y alineada a cada cebador. Se realiza una serie repetida de ciclos, cada uno compuesto por tres pasos básicos: desnaturalización a altas temperaturas (95ºC) del ADN de doble cadena; acoplamiento de los cebadores, la temperatura se desciende a 55 - 72ºC y elongación del cebador, aquí se eleva la temperatura a 72ºC permitiendo la incorporación de los deoxinucleótidos. Mientras tanto se van deplecionando los cebadores y los deoxinucleótidos y se van sintetizando nuevas cadenas de ADN. Al final se consiguen miles de copias de ADN del fragmento de ADN limitado por los cebadores. Los fragmentos de ADN obtenidos se pueden identificar por varias técnicas: visualización en geles de agarosa o poliacrilamida con tinción con bromuro de etidio y examen con luz ultravioleta o hibridación con una sonda marcada. La combinación de la PCR y las sondas de ácidos nucleicos marcadas promete ser el método más sensible para la detección e identificación de los virus (ver figura 7). En conclusión decimos que para elegir un método diagnóstico, además de la sensibilidad y la especificidad, hay que considerar aspectos operativos de las técnicas a usar tales como el costo, la complejidad técnica del ensayo, el volumen necesario y preparación de la muestra, el tiempo que requiere el proceso y la disponibilidad comercial de los reactivos de calidad reconocida. Además, se debe considerar el nivel de complejidad del laboratorio y la disponibilidad tecnológica y de recursos que requiere cada técnica. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 97 Figura 7. Esquema de PCR Bibliografía • Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiología. 20ª ed. BsAs. Panamericana; 1994. • Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC (h). editores. Diagnóstico Microbiológico, Texto Atlas Color. 5ª ed. Bs As. Panamericana. 1999. 98 • TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. editors. Bailey & Scott´s. Diagnostic Microbiology. 11th. ed. St. Louis, Missouri. Mosby. 2002. • Murray PR. Baron EJ. Jorgensen JH. Pfaller MA. Yolken RH Editors. Manual of Clinical Microbiology. 8th. ed. Washington, D.C. ASM Press. 2003. • Rose NR. Hamilton RG. Detrick B. editors. Manual of Clinical Laboratory Immunology, 6th. ed. Washington, D.C. ASM Press. 2002. 99 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Página 99 6 Inmunidad contra los agentes infecciosos J. Chabalgoity, M. Pereira, A. Rial Introducción A lo largo de su vida, un individuo está expuesto a muchos agentes infecciosos; sin embargo, en la mayoría de las situaciones la enfermedad es la excepción más que la regla. La mayoría de los microorganismos infecciosos no logran ingresar al individuo, gracias a las barreras físicas y químicas que éste presenta. La barrera física más importante es la piel; la integridad de ésta, junto a la secreción de mediadores químicos, evita el ingreso de microorganismos patógenos. Asimismo, las mucosas poseen una serie de atributos (secreciones, flujo ciliar) que dificultan el ingreso de microorganismos por esa vía. Además, la existencia de poblaciones microbianas no patógenas residentes (flora normal), también impide la colonización de las mucosas por agentes infecciosos. La mayoría de los microorganismos que logran evadir estas barreras y producir infección, son destruidos en pocas horas por mecanismos no específicos de inducción rápida (inmunidad innata). Sin embargo, si un agente infeccioso es capaz de superar esas primeras líneas de defensa, se activará, en la mayoría de los casos, un tipo de respuesta de defensa (inmunidad adaptativa), altamente especializada y específica. Ésta logrará, en la mayoría de las situaciones, controlar la infección y suprimir la enfermedad. Además, de este proceso resultará la generación de memoria inmunológica, que permitirá al individuo en el próximo contacto con el mismo agente, responder más rápida y efectivamente (ver figura 1). La importancia fundamental que tiene el sistema inmune en la sobrevida de los individuos, está evidenciada por las enfermedades que padecen los individuos con alguna disfunción de este sistema. Por otro lado, la correcta regulación de la homeostasis del sistema inmune es central, porque la exacerbación de la respuesta puede provocar enfermedad en el individuo. Así, la inmunopatología es una consecuencia frecuente de la respuesta inmune contra muchos agentes infecciosos. En este capítulo describiremos, en términos generales, las características centrales de la respuesta inmune innata y adaptativa, analizando las características fundamentales de la respuesta inmune desarrollada contra distintos microorganismos. La inmunología como ciencia ha tenido gran desarrollo y existen excelentes libros de texto básicos en esta materia que deberían ser consultados para un conocimiento más detallado. 100 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 1 Inmunidad innata e inmunidad adaptativa Una respuesta inmune efectiva del huésped frente a organismos extraños requiere de la acción coordinada y conjunta del sistema inmune innato y adaptativo. Durante muchos años se estudió ambas formas de inmunidad como entidades separadas, las cuales actuaban en forma secuencial. Sin embargo, hoy se sabe que ambos mecanismos son dependientes de un único sistema integrado. La respuesta inmune innata brinda la primer línea de defensa contra los microorganismos invasores pero además provee el contexto biológico y las señales que instruirán al sistema inmune adaptativo para montar su respuesta. Así, los eventos ocurridos en el contexto de la inmunidad innata, determinan el perfil del tipo de respuesta adaptativa que se desarrollará contra el agente patógeno. Asimismo la respuesta inmune adaptativa recurre a mecanismos efectores y mediadores característicos de la inmunidad innata para eliminar los microorganismos. INMUNIDAD INNATA El objetivo de la inmunidad innata es evitar la instalación del proceso infeccioso; si éste se produce, dicho mecanismo inmunitario logra establecer un ambiente para que se desarrolle una respuesta adaptativa. Los mecanismos efectores de defensa de la inmunidad innata están compuestos por células que cumplen funciones defensivas (fagocitosis, citotoxicidad) y factores solubles (citoquinas y quemoquinas, interferones, complemento) que controlan y destruyen los microorganismos que ingresan. Estos mecanismos si bien son generales y durante mucho tiempo se los consideró inespecíficos, hoy se sabe que incluyen mecanismos de reconocimiento acoplados a sistemas de señalización intracelular, que permiten identificar el tipo de agente patógeno que está ingresando a la célula. Ello permite activar una respuesta rápida y efectiva contra el microorganismo, además de definir el perfil de respuesta inmune adaptativa que se generará contra el agente patógeno si éste logra sobrepasar la primera línea de defensa. Los fagocitos poseen receptores que reconocen componentes microbianos El reconocimiento de los microorganismos por el sistema inmune innato, está determinado por receptores conocidos como "Pattern Recognition Receptors" (PRRs) que reconocen patrones moleculares conservados: "Pathogen Associated Molecular Patterns" (PAMP), compartidos por grandes grupos de microorganismos. Como ejemplos de esos patrones aso- 101 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 2. 102 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA ciados a patogenicidad mencionamos el lipopolisacárido (LPS) en bacterias gramnegativas y los proteoglicanos de la pared de bacterias grampositivas. Existen receptores de superficie en las células del sistema inmune innato, que reconocen estos patrones y activan las vías de señalización celular que iniciarán una serie de eventos coordinados en la inmunidad innata (ver figura 2). Entre estos receptores se encuentran los llamados "Toll Like Recpetors" (TLRs); son una familia de receptores conservados en términos evolutivos, altamente especializados en transducir señales. Son esenciales para traducir el reconocimiento de componentes microbianos en activación del sistema inmune. En la actualidad hay ya descritos 10 TLRs diferentes, que inetractúan con una gran cantidad de PAMPS, como LPS (TLR-4), peptidoglicanos (TLR-2), o secuencias de ADN (TLR-9). Esta es además un área de gran acrtividad de investigación en la actualidad. Los macrófagos tisulares residentes tienen un rol crítico en el inicio de la respuesta inmune innata en el tejido. Dichos fagocitos profesionales expresan PRRs, reconocen antígenos extraños como patógenos y desencadenan la respuesta inmune innata mediante la activación de uno o más TLRs. La activación de TLRs en macrófagos tisulares residentes y células dendríticas (DCs), induce la liberación de mediadores inflamatorios (incluídas las quemoquinas) y modula la expresión de receptores de quemoquinas en las DCs. Los eventos mediados por TLRs son esenciales, tanto para el reclutamiento de DCs a los sitios de entrada de patógenos, como para su posterior migración a los nódulos linfáticos regionales para activar a los linfocitos T vírgenes específicos para el antígeno, iniciando así la respuesta inmune adaptativa. Además, las quemoquinas liberadas por las células tisulares residentes después de su activación guiarán a esas células T activadas desde el nódulo linfático al sitio de entrada o de replicación del microorganismo. Por lo tanto, las quemoquinas son un factor central que une eventos de la inmunidad innata y adaptativa. Estas sustancias pueden dividirse en inflamatorias y constitutivas. Las quemoquinas inflamatorias son inducidas o reguladas positivamente por estímulos inflamatorios (LPS, peptidoglicanos, ácidos teicoicos, motivos CpG) y son responsables del reclutamiento de células inflamatorias. Como ejemplo de éstas citamos: interleuquina 8 (IL8), MIP-1α, MIP-1β, RANTES, exotaxina, proteína quimiotáctica monocítica 1 (MCP-1) y proteína inducible por IFN-γ (IP-10). Las quemoquinas constitutivas (SLC, ELC, TARC) están presente solo en médula ósea, timo y órganos linfoides secundarios. Son las responsables del control homeostático de los leucocitos y de dirigir el encuentro de las células que necesitan interaccionar para generar una respuesta inmune: DCs y células T y B. En conclusión, la discriminación de los microorganismos a través de los TLRs y la posterior producción de un conjunto de quemoquinas determinadas, podría ser el primer punto en el cual el sistema inmune delimita su respuesta ante agentes patógenos específicos. Por otro lado, demuestra que los microorganismos determinan la naturaleza de la respuesta inmune por la activación diferencial de TLRs y los patrones de expresión de quemoquinas que determinarán los tipos celulares reclutados. Importancia de la respuesta inmune innata Durante muchos años se ha acumulado información de la importancia de la respuesta inmune adaptativa, evaluando fundamentalmente las enfermedades asociadas a las deficiencias de los componentes de la misma. Se conoce mucho menos sobre la importancia de la respuesta inmune innata, porque las deficiencias de ésta son muy raras. Sin embargo, experimentos realizados con animales transgénicos que presentan algún tipo de deficiencia en los componentes de la respuesta innata, sugieren que este tipo de respuesta no es redundante con la inmunidad adaptativa y tiene un rol esencial en la sobrevida de los individuos. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 103 Figura 3. INMUNIDAD ADAPTATIVA Cuando un microorganismo logra evadir los mecanismos de la respuesta inmune innata y en el individuo se acumula una cantidad de antígeno mayor a un umbral determinado, se activarán los mecanismos de la inmunidad adaptativa. Dicho proceso provocará la activación de las células con alta especificidad por el microorganismo en cuestión, y de mecanismos efectores específicos contra el agente patógeno. Esta respuesta demora varios días en activarse y está mediada por linfocitos T y B específicos para el microorganismo, que se activan y proliferan induciendo mecanismos efectores que eliminan el agente infeccioso y generan memoria inmunológica (ver figura 3). Como ya se mencionó, hoy se sabe que la activación de inmunidad adaptativa y el tipo de respuesta generada, depende de eventos inducidos como consecuencia del proceso de reconocimiento y señalización de la inmunidad innata. La respuesta inmune adaptativa se inicia en los nódulos linfáticos que drenan el sitio de infección, cuando las células T naive circulantes encuentran su antígeno específico. El antígeno es capturado en el tejido por DCs que se activan y se transforman en células presentadoras de antígeno (APC) profesionales y lo llevan hacia los nódulos linfáticos regionales. Cuando llegan al nódulo, las DCs activadas presentan el antígeno a células T naive que se activarán y diferenciarán a células efectoras. Estas células activadas abandonan el nódulo y migran hacia el sitio de inflamación dirigidas por citoquinas y quemoquinas; allí realizan la actividad efectora de la inmunidad celular o permanecerán en el órgano linfático para participar en la inmunidad humoral por activación de linfocitos B específicos por el antígeno. El tipo de respuesta que se genere estará determinada en gran parte por el ambiente de citoquinas generadas desde la inmunidad innata y durante la presentación antigénica, esto determinará la expansión de células T de tipo 1 o 2 (células Th1 o Th2). Dependiendo de que tipo de células T se expandan, será el tipo de inmunidad y los mecanismos efectores que se activarán. 104 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Las DCs representan el tipo de APC más importante en todo el sistema inmune. Constituyen una población de células muy heterogénea, habiéndose identificado muchas subpoblaciones tanto en humanos como en ratón. Sin embargo, todas derivan de un precursor CD34+ de médula ósea. Son células con alta capacidad migratoria, que circulan entre la sangre, los tejidos periféricos, la linfa y los órganos linfáticos. Las DCs circulan en la sangre como precursores hasta que ingresan a un tejido determinado, en el cual se transforman en DCs inmaduras (iDCs) residentes. Su rol principal en los tejidos y en las mucosas es monitorear los antígenos del microambiente, para después migrar hacia los nódulos linfáticos regionales para presentar los péptidos antigénicos procesados a las células T. Las DCs, no solo son fundamentales en la generación de una respuesta inmune, sino que también cumplen un rol fundamental en los procesos de regulación de naturaleza cualitativa de esa respuesta, así como en la inducción de tolerancia inmune ante antígenos inocuos. Por todo esto, es que actualmente se considera que la DC es una célula clave en la regulación de la homeostasis del sistema inmune. Respuesta inmune contra microorganismos Las respuestas inmunes contra los microorganismos, aunque múltiples y variadas, presentan algunas características generales. La primera es que la defensa efectiva contra los microorganismos está mediada por mecanismos efectores tanto de la inmunidad innata como de la adaptativa. Muchos microorganismos han desarrollado mecanismos que les permiten sobrevivir a la respuesta inmune innata y la protección contra ellos requiere la participación activa de la inmunidad adaptativa. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, el tipo de respuesta adaptativa está determinada en gran parte por eventos ocurridos durante la respuesta innata. Los agentes infecciosos pueden diferir mucho en sus patrones de invasión y de colonización, así como en la inmunogenicidad de sus antígenos. Por lo tanto, una respuesta inmune efectiva contra microorganismos distintos, puede requerir la activación de distintos tipos de mecanismos efectores tanto en la respuesta inmune innata como en la adaptativa. La supervivencia y la patogenicidad de los microorganismos en el huésped están críticamente influenciadas por su capacidad de evadir o resistir la inmunidad protectora, para lo cual ellos han desarrollado diferentes estrategias. Otra característica en común es que en muchas infecciones el daño tisular y la enfermedad producida puede ser causada por la propia respuesta inmune del huésped contra el patógeno, más que por el microorganismo en sí mismo. INMUNIDAD FRENTE A BACTERIAS EXTRACELULARES Las bacterias extracelulares pueden causar enfermedad por dos mecanismos distintos. El primero es la inflamación que provoca destrucción de los tejidos en el sitio de infección. Como ejemplo de esto citamos las infecciones supuradas producidas por Staphylococcus sp. y Streptococcus sp. El segundo mecanismo es la producción de toxinas con distintos efectos nocivos. La endotoxina de las bacterias gramnegativas es un potente estimulador de la producción de citoquinas y activador de los macrófagos. Muchas exotoxinas son primariamente citotóxicas, pudiendo matar por distintos mecanismos a las células a las que se fijan. Otras interfieren con las funciones celulares esenciales, por ejemplo la toxina diftérica inhibe la síntesis proteica bloqueando la función del factor de elongación 2, necesario para la síntesis de todos los polipéptidos. Otro ejemplo serían algunas toxinas clostridiales como las producidas por TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 105 Figura 4. Clostridium perfringens histotóxico, que provocan una extensa necrosis de los tejidos, desarrollando gangrena gaseosa. Inmunidad innata Los mecanismos fundamentales de la inmunidad innata operantes contra bacterias extracelulares son la fagocitosis, la respuesta inflamatoria y la activación del complemento. Los fagocitos pueden unirse a bacterias extracelulares mediante una serie de receptores; dicha interacción, junto con la señalización intracelular realizada por los TLRs, activa los fagocitos incrementando su capacidad fagocítica y microbicida. De ahí que la resistencia de las bacterias a la fagocitosis y a la digestión dentro de los macrófagos, es un determinante importante de la patogenicidad y virulencia de las mismas. La activación de los fagocitos también provoca la secreción de citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF-a) y las interleuquinas IL-1, IL-6 e IL-8, que inducen la adhesión de neutrófilos y monocitos al endotelio vascular en el sitio de la infección, seguida por la migración, acumulación local y activación de las células inflamatorias que eliminan las bacterias (ver figura 4). Sin embargo, la producción de grandes cantidades de citoquinas puede ser perjudicial y de hecho son responsables de algunas manifestaciones clínicas de las infecciones por bacterias extracelulares. El daño de tejidos normales adyacentes es un efecto colateral de estos mecanismos de defensa. La consecuencia más grave inducida por la secreción descontrolada de citoquinas, es el shock séptico que puede presentarse con coagulación intravascular diseminada, falla multiorgánica y muerte, propio de algunas infecciones por bacterias gramnegativas (desencadenado por el LPS) y grampositivas (donde el peptidoglicano y los ácidos teicoicos desencadenan efectos similares). La activación del complemento en ausencia de anticuerpos, también tiene un rol importante en la eliminación de estas bacterias. El peptidoglicano de las paredes celulares de las bacterias grampositivas y el LPS de las paredes celulares gramnegativas, activan la vía 106 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA alterna del complemento promoviendo la formación de C3 convertasa. Las bacterias que expresan manosa en su superficie, pueden unir una lectina (MBL), homóloga a C1q, que activa el sistema de complemento por la vía de las lectinas. Como resultado de la activación de este sistema, se genera C3b que opsoniza a las bacterias y mejora su fagocitosis. Además, la activación de la cascada del complemento podría terminar en la formación de un complejo de ataque a membranas que lisa a las bacterias. Figura 5. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 107 Inmunidad adaptativa La inmunidad humoral es la principal respuesta específica protectora contra estas bacterias. Los polisacáridos de las paredes celulares y de las cápsulas de estos microorganismos constituyen uno de los componentes más inmunogénicos de las mismas y son el prototipo de antígeno T independiente. Dichos antígenos estimulan a las células B que generan una respuesta de inmunoglobulina (Ig) M específica, aunque también pueden generarse otros isotipos de Ig. Probablemente sea la liberación de citoquinas la que promueva el cambio de isotipos de cadena pesada de la Ig. Los anticuerpos producidos contra los antígenos de superficie (polisacarídicos o proteicos) y las toxinas bacterianas, estimulan tres tipos de mecanismos efectores (ver figura 5): 1. Las IgG opsonizan a las bacterias favoreciendo la fagocitosis; éstas se unen a los receptores Fc γ presentes en los monocitos, los macrófagos y los neutrófilos. 2. Las IgG y las IgM neutralizan las toxinas bacterianas impidiendo que se unan a sus células blanco, promoviendo su fagocitosis. Por ejemplo, la inmunización pasiva con anticuerpos dirigidos contra la toxina tetánica, es un tratamiento que podría salvar la vida del paciente en una infección aguda por Clostridium tetani. En la mucosa respiratoria y gastrointestinal, la IgA secretoria tiene un rol importante en la neutralización de toxinas y en la prevención de la colonización de dichos tejidos. 3. Tanto la IgG como la IgM activan el sistema del complemento, que conducen a la formación, en la superficie bacteriana, de un complejo de ataque a la membrana (MAC), cuya función lítica es importante sólo para eliminar algunos microorganismos. Los individuos con deficiencia en los componentes tardíos del complemento (C5 a C9), involucrados en la formación del MAC, tienen mayor sensibilidad a la infección por determinados microorganismos como especies de Neisseria; aunque no a otras infecciones bacterianas. La principal respuesta de las células T frente a las bacterias extracelulares, está mediada por los linfocitos T CD4+ que fueron activados por los antígenos bacterianos, presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II. Estos linfocitos actuaran como células T helper secretando citoquinas que estimulan la producción de anticuerpos específicos y activando las funciones fagocíticas y microbicidas de los macrófagos. Algunas toxinas bacterianas (superantígenos) pueden estimular inespecíficamente a las células T, en consecuencia se liberan grandes cantidades de citoquinas y mediadores inflamatorios que finalizan con la producción del síndrome de shock tóxico. Como ejemplos de estos superantígenos mencionamos: la toxina del síndrome del shock tóxico de S. aureus (TSST) y la exotoxina pirógena de S. pyogenes. La inflamación aguda y el shock (tóxico o séptico) son dos consecuencias nocivas de la defensa contra las bacterias extracelulares. Una complicación tardía de las respuestas inmunes humorales frente a infecciones bacterianas, puede ser debida a la producción de anticuerpos productores de enfermedad. Son ejemplos conocidos de este fenómeno las enfermedades postestreptocóccicas, que pueden darse como secuelas de infecciones producidas por S. pyogenes (fiebre reumática y glomerulonefritis difusa aguda). Evasión de mecanismos inmunes por bacterias extracelulares La virulencia o patogenicidad de estas bacterias se relaciona con atributos que favorecen la colonización e invasión de los tejidos del huésped y que les permiten resistir a la acción del sistema inmune. Éstos incluyen: proteínas de superficie bacteriana con propiedades de adhesinas, mecanismos antifagocitarios e inhibición del complemento o inactivación de sus productos. Por ejemplo, algunos microorganismos como N. meningitidis, H. influenzae y S. 108 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA pneumoniae, secretan proteasas de IgA (anticuerpo presente en las mucosas que colonizan); S. pyogenes y S. agalactiae, presentan proteasas de C5a. Las cápsulas de muchas bacterias grampositivas y gramnegativas, confieren resistencia a la fagocitosis; además algunas tienen residuos de ácido siálico que inhiben la activación de la vía alterna del complemento. Por lo tanto, la producción de cápsula constituye un mecanismo importante de evasión inmune y las bacterias encapsuladas son más virulentas que cepas carentes de cápsula. Muchas bacterias que causan meningitis (N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae) son capsuladas. Las cápsulas constituyen un elemento común y esencial de estas bacterias, que les permite sobrevivir en la sangre. Después de una fase de bacteriemia en la cual las bacterias evaden la fagocitosis y resisten la acción bactericida del complemento, llegan al espacio subaracnoideo y se multiplican activamente en un ambiente donde los mecanismos de defensa son inefectivos. El huésped tiene algunos mecanismos para oponerse al efecto antifagocítico de las cápsulas bacterianas; pero éstos sólo son efectivos luego del desarrollo de anticuerpos anticapsulares específicos que opsonizan al microorganismo para mejorar la fagocitosis y activan al complemento. En el individuo no inmunizado, mientras se desarrolla una respuesta adecuada de anticuerpos específicos, la bacteria puede multiplicarse en la sangre e invadir las meninges causando una meningitis aguda supurada. Por lo antedicho es que las vacunas desarrolladas contra estos microorganismos tienen antígenos capsulares de la bacteria como componente principal. Otro mecanismo usado por las bacterias para evadir la respuesta inmune adaptativa, es la variación genética de antígenos de superficie. Muchas bacterias como Escherichia coli y Neisseria gonorroheae, presentan pili (estructuras implicadas en la adhesión bacteriana a las células del huésped, constituidos por la proteína pilina). En las N. gonorroheae, los genes que codifican la pilina consisten en uno o dos loci de expresión y diez a veinte loci silenciosos, cada uno conteniendo seis secuencias codificantes llamadas minicassettes. La variación antigénica de la proteína pilina resulta de una alta tasa de conversión entre loci silenciosos y de expresión. Así, es posible crear más de 106 combinaciones cuyos productos proteicos son antigénicamente distintos. Este mecanismo de variación antigénica ayuda a la bacteria a “escapar” de los anticuerpos específicos, aunque el significado principal para el microorganismo sea seleccionar el pili que mejor se adhiera a las células epiteliales del huésped. INMUNIDAD FRENTE A BACTERIAS INTRACELULARES Algunas bacterias son capaces de sobrevivir y replicarse dentro de células del huésped. Ciertas bacterias patógenas como Mycobacterium y Listeria monocytogenes, son capaces de sobrevivir y multiplicarse aún dentro de los fagocitos. Como estas bacterias están en un nicho inaccesible a los anticuerpos circulantes, su eliminación requiere mecanismos inmunes distintos a los ya vistos para las bacterias extracelulares. Inmunidad innata Los mecanismos centrales de la inmunidad innata frente a estas bacterias son la fagocitosis y la acción de células natural killer (NK). Sin embargo, las bacterias intracelulares son resistentes a la degradación dentro de los fagocitos mononucleares. Dicha resistencia contribuye en gran medida a que algunos patógenos intracelulares como M. tuberculosis sean capaces de permanecer por largos períodos en el huésped, recidivar luego de curas aparentes y establecer infecciones crónicas de difícil erradicación. Por otro lado, las bacterias intracelulares inducen la activación de células NK, ya sea TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 109 Figura 6. directamente o mediante la producción de citoquinas (específicamente interleuquina 12 o IL-12) derivadas de macrófagos. Las células NK activadas secretan interferón (IFN-γ), que es a su vez un potente activador de los macrófagos, mejorando su capacidad fagocítica y microbicida. Este proceso podrá retrasar el crecimiento de la bacteria; sin embargo, la resolución definitiva de la infección requiere de la inmunidad adaptativa. En tal sentido, se considera que las células NK son las células claves para la contención de las bacterias intracelulares mientras se desarrolla la inmunidad adaptativa. Inmunidad adaptativa La principal respuesta inmune protectora contra las bacterias intracelulares es la inmunidad mediada por células. Muchos antígenos proteicos de estas bacterias estimulan las respuestas de células T CD4+ y CD8+ y ambos tipos celulares contribuyen al desarrollo de inmunidad protectora contra las bacterias intracelulares. Una función efectora central para eliminar estos microorganismos es mediada por macrófagos activados por citoquinas (particularmente IFN-γ), derivadas de células Th1 activadas (ver figura 6). Por otro lado, las células T CD8+ activadas pueden actuar como linfocitos citotóxicos sobre células infectadas, que presentan antígenos bacterianos en el contexto de MHC clase I. Las diferencias en el tipo de respuesta mediada por células T, puede explicar las distintas manifestaciones clínicas que determina la infección por un microorganismo en individuos diferentes. En algunas situaciones, esto se ha explicado por el entorno de citoquinas secretadas en el transcurso de la respuesta, que determina la expansión de un grupo de células Th1 o Th2, que inducen mecanismos efectores distintos. Mientras una respuesta de tipo 1 favorece la inmunidad celular y determina niveles bajos de anticuerpos, una respuesta de tipo 2 determinará lo contrario (altos títulos de anticuerpos y baja inmunidad celular). Por otro lado, como ya se mencionó, estas bacterias han desarrollado mecanismos que las hacen resistentes a la fagocitosis y que persisten por largos períodos aún en individuos con inmunidad celular efectiva. Dicha persistencia genera una estimulación antigénica crónica, que puede conducir a la formación de colecciones locales de macrófagos activados (granulomas) que rodean los microorganismos impidiendo su diseminación. La inflamación granulomatosa es una característica histológica propia de muchas infecciones producidas por micobacterias y que se asocia con necrosis y fibrosis, conduciendo a lesiones funcionales severas. Así, la 110 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA respuesta inmune del huésped es la causa principal de la lesión tisular y la enfermedad en muchas infecciones por bacterias intracelulares como las micobacterias. La respuesta inmune montada frente a este tipo de infecciones puede variar entre los individuos, siendo determinante de la progresión de la enfermedad y del pronóstico clínico. Evasión de mecanismos inmunes por bacterias intracelulares La mayoría de las bacterias se inactivan cuando son fagocitadas por macrófagos y leucocitos polimorfonucleares. Sin embargo, muchos microorganismos han desarrollado estrategias para sobrevivir y replicarse en estas células. Algunos usan los mecanismos fagocíticos preexistentes para su internalización, como Mycobacterium sp. y Legionella pneumophila, que se unen a fragmentos C3b del complemento lo que favorecen su captación por las células fagocíticas. Una vez dentro de la vacuola fagocítica, algunos patógenos disuelven la membrana vacuolar y acceden al citoplasma celular rico en nutrientes, evadiendo los mecanismos bactericidas del fagocito; por ejemplo Shigella flexneri, algunas Rocketsias y L. monocytogenes; ésta última produce una hemolisina (listeriolisina O) que forma poros en la membrana del fagosoma. Otros microorganismos como Mycobacterium y Legionella, son capaces de inhibir la actividad bactericida de los fagocitos impidiendo la fusión del fagolisosoma (impiden la acidificación del fagosoma) y algunos como Coxiella burnetti, sobreviven a los agentes bactericidas liberados en el fagolisosoma (incluso requieren de factores allí presentes como señales que disparan su multiplicación intracelular). Los principales factores de virulencia bacterianos que permiten resistir la fagocitosis y facilitan la sobrevida intracelular incluyen las cápsulas y la producción de enzimas que destruyen la membrana vacuolar, que degradan proteínas lisosómicas, o que neutralizan los radicales tóxicos del oxígeno. INMUNIDAD FRENTE A LOS VIRUS Los virus son microorganismos intracelulares obligados, que generalmente ingresan a las células susceptibles usando como receptores las moléculas normales de superficie celular. Por ejemplo: el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se absorbe a la célula por medio de una glicoproteína de la envoltura viral (Gp 120) que se une al receptor CD4 de superficie, en este proceso también participan como coreceptores otras moléculas de superficie celular. Los rinovirus (virus causante del resfrío común) se unen a moléculas de adhesión intercelular (ICAM-1) expresadas en las células de muchos tejidos como las del epitelio respiratorio. Cuando el virus está dentro de la célula huésped, causa lesión celular por diferentes mecanismos. La replicación viral puede interferir con la síntesis proteica celular y provocar la muerte de la célula por lisis, liberándose muchas partículas virales nuevas (virus citolíticos). Otros virus pueden causar infecciones latentes y permanecer quiescentes por largos períodos de tiempo, sin conducir a la muerte inmediata de la célula huésped. La inmunidad contra los virus debe ser capaz de actuar en las distintas poblaciones de células infectadas (dado que distintos virus infectan distintas células). Dicho mecanismo inmunitario opera a dos niveles: previo a la invasión celular, en la etapa inicial de la infección y después de la invasión cuando los virus son inaccesibles a los anticuerpos y fagocitos. Inmunidad innata En primer lugar, la infección viral estimula la producción, por parte de las células infectadas, de IFN tipo 1 (que comprende dos grupos serológicamente distintos, el α y el β). El IFN tipo 1 tiene muchas acciones biológicas. En principio inhibe la replicación viral estimulando la TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 111 Figura 7. síntesis de enzimas celulares que interfieren con la replicación del ácido ribonucleico (ARN) o desoxirribonucleico (ADN) viral. Su acción antiviral también es ejercida sobre las células vecinas no infectadas, que quedan así protegidas de la infección. Además, el INF tipo 1 inhibe la proliferación celular por inducción de las mismas enzimas mencionadas anteriormente y de otras que actúan inhibiendo la síntesis de aminoácidos. También aumenta el potencial lítico de las células NK cuya función principal es matar las células infectadas por virus. Por último, modula la expresión de moléculas MHC, aumentando la expresión de las moléculas MHC clase I e inhibiendo las de clase II. Así mejora la eficiencia de los linfocitos T citolíticos que reconocen antígenos extraños asociados a moléculas MHC de clase I. En segundo lugar, las células NK lisan muchas células infectadas por virus, constituyendo uno de los mecanismos efectores principales en los estadíos iniciales de la infección viral. (Ver figura 7). Además del IFN tipo 1, el IFN-γ, el TNF y la IL-2, aumentan el potencial lítico de estas células. Inmunidad adaptativa La inmunidad específica contra virus está mediada tanto por mecanismos celulares como humorales. En las etapas iniciales de la infección, los anticuerpos específicos antivirales son muy importantes. Los dirigidos contra las proteínas de envoltura o de las cápsides virales que participan en la adsorción, impiden la unión con el receptor celular y por lo tanto el ingreso a la célula susceptible; éstos son llamados anticuerpos neutralizantes. Además, opsonizan a 112 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA los virus, mejorando las funciones fagocíticas, aunque también pueden facilitar la infección de aquellas células portadoras de receptores Fc. La IgA de las mucosas es importante en la neutralización de virus que ingresan al organismo por vía respiratoria o digestiva; de hecho la inducción de inmunidad secretoria es una de las bases para el desarrollo de vacunas orales o nasales. Desafortunadamente, la vacuna oral contra la poliomielitis es una de las pocas que lo ha logrado. La activación del complemento también puede participar de la inmunidad mediada por anticuerpos, principalmente lisando virus envueltos y promoviendo la fagocitosis. La inmunidad humoral es un componente importante de la respuesta inmune contra los virus, pero no es suficiente para erradicar muchas infecciones virales. Los anticuerpos tienen efecto protector, sólo en las primeras etapas de la infección viral; además, es importante destacar que su capacidad neutralizante in vitro, tiene poca correlación con la capacidad protectora in vivo y que es difícil transferir inmunidad antiviral a animales no inmunes sólo con anticuerpos purificados. Un mecanismo fundamental de la inmunidad específica contra las infecciones virales establecidas está constituido por los linfocitos T citotóxicos, fundamentalmente los linfocitos T CD8+ que reconocen antígenos virales asociados a moléculas MHC clase I, sintetizados en el interior de las células infectadas. En este momento es importante recordar que las moléculas MHC de clase I están en la superficie de cualquier tipo celular. Para su diferenciación y activación, los linfocitos T citotóxicos requieren dos tipos de señales; la primera es el reconocimiento específico del antígeno en la célula blanco en asociación al MHC clase I y la segunda son citoquinas producidas por las células T helper CD4+ que reconocen antígenos virales asociados a MHC clase II. Los linfocitos T citotóxicos diferenciados, ejercen su efecto antiviral por tres mecanismos: a) lisis de las células infectadas por liberación de gránulos que contienen, entre otras macromoléculas, una proteína formadora de poros (perforina o citolisina); b) estimulación de enzimas intracelulares que degradan los genomas virales; c) secreción de citoquinas, más específicamente IFN-γ y linfotoxina (LT), en menor grado IL-2. Aunque estas células producen citoquinas, no lo hacen en cantidades suficientes o en los tipos necesarios para generar la diferenciación completa de sus precursores en linfocitos T citolíticos activos y diferenciados; de ahí la necesidad de las citoquinas producidas por las células T helper CD 4+ mencionadas anteriormente. En algunas infecciones virales esta respuesta inmune es la causante de la lesión tisular. Por ejemplo, en la infección producida por el virus de la hepatitis B, la lesión hepática está mediada principalmente por la respuesta inmune celular generada. De hecho, los individuos con deficiencias en las células T, padecen una enfermedad con menor daño hepático, pero con mayor tendencia a la cronicidad y los inmunocompetentes padecen una enfermedad con lesiones hepáticas más severas, pero raramente se produce la enfermedad crónica. Evasión de los mecanismos inmunes por los virus Variación antigénica En muchos virus se ha identificado un gran número de tipos serológicamente diferentes. La capacidad viral de variar antigénicamente es uno de los mecanismos de evasión más difundido e ilustrado por muchos virus. En el VIH, por ejemplo, se observa una importante variabilidad genética, fundamentalmente en los genes env, debida a los errores cometidos por la enzima transcriptasa reversa viral que pueden conducir a cambios de hasta un 30% TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 113 en regiones hipervariables de la Gp 120. Otro ejemplo conocido es el virus Influenza, en el cual la variación antigénica puede ser de dos tipos: menor o deriva antigénica, resultado de mutaciones puntuales en genes que codifican para HA y NA; y mayor o cambio antigénico, que obedecen a sustituciones o reordenamientos de segmentos enteros de ARN viral que producen un nuevo virus para el que la población general no tiene inmunidad, ocasionando pandemias de gripe. Supresión de respuesta inmune Este mecanismo queda ejemplificado por aquellos virus capaces de infectar células del sistema inmune, linfocitos o macrófagos, alterando su función e inhibiendo la inmunidad adaptativa. Este fenómeno de supresión inmune es visto en infecciones causadas por VIH, virus Epstein Barr, citomegalovirus y virus del sarampión, entre otros. Otros mecanismos de evasión inmune viral incluyen: la expresión limitada de antígenos en las membranas celulares (arenavirus, rabdovirus); la persistencia viral en sitios poco accesibles a la respuesta inmune (papilomavirus, citomegalovirus); la inhibición de expresión de moléculas MHC clase I (adenovirus); etc. Conclusiones El sistema inmune permite que los individuos sobrevivan al contacto con diferentes tipos de patógenos. Los mecanismos iniciales de defensa provistos por la inmunidad innata permiten eliminar muchos de los agentes infecciosos y sientan las bases para el desarrollo de una respuesta inmune adaptativa con alto grado de especificidad por el patógeno que logra quebrar esa primer línea de defensa. Los mecanismos efectores relevantes para eliminar distintos tipos de microorganismos, varían según las características de virulencia y patogenicidad de éste. La resolución de una infección se acompaña de la muerte de la mayoría de las células efectoras y de la generación de células de memoria. Muchos microorganismos han desarrollado sistemas que le permiten evadir la respuesta inmune. El conocimiento detallado del sistema inmune y de la patogenesis de los agentes infecciosos, nos permite diseñar alternativas para estimular artificialmente el sistema inmune y así poder responder efectivamente frente a ellos. Las vacunas son el ejemplo más importante de ello. Los avances en el conocimiento de la inmunobiología y la patogénesis microbiana, permiten un diseño más racional de estas aproximaciones y puede resultar en el desarrollo de nuevas vacunas contra agentes patógenos que hasta ahora han resultado elusivos. Bibliografía 1. Abbas, Litchman. Cellular and Molecular Immunology. 5th ed. --: Elsevier Science; 2003. 2. Campbell J, Butcher E. Chemokines in tissue-specific and microenvironment-specific lymphocyte homing. Curr. Op. Immunology 2000; (12): 336-41. 3. Galucci S, Matzinger P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr. Op. Immunology 2001; (13): 114-9. 4. Janeway C, et al. Immunobiology. The immune system in health and disease. 5th ed. --: Garland Publishing; 2001. 5. Lipscomb M, Masten B. Dendritic cells: Immune regulators in healt and disease. Phsyiol Rev 2002; (82): 97-130. 114 6. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Luster A. The role of chemokines in linking innate and adaptive immunity. Curr. Op. Immunology 2002; (14):129-36. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 115 Página 115 7 Interacciones huésped-parásito. Flora normal M. Torres Introducción y definiciones El cuerpo humano presenta una gran superficie cutánea y mucosa por la que están en contacto con el medio ambiente. En esta superficie existen diversos sectores con diferentes características de humedad, temperatura, pH y disponibilidad de nutrientes, en los cuales residen microorganismos La flora humana normal es el conjunto de microorganismos que conviven con el huésped en estado normal, sin causarle enfermedad. Su composición es característica para la especie humana, tanto en el tipo de microorganismos que la componen como en su número y distribución en el organismo. La flora normal coloniza las superficies cutáneas y mucosas. Sin embargo, hay que mencionar que en el organismo en condiciones normales existen sitios estériles, como la pleura, las meninges, la cavidad peritoneal, el pericardio, etc. Esto debe ser tenido en consideración al realizar un estudio microbiológico. Las técnicas usadas para obtener una muestra biológica de un sitio con flora normal, son diferentes a las usadas para sitios estériles. También son diferentes los medios de cultivo que se usarán para sembrar dichas muestras (generalmente requerirán medios que inhiban el crecimiento de la flora normal) y la interpretación de los cultivos. Por ejemplo, si se aisla un microorganismo del líquido cefalorraquídeo, siempre es anormal si se tomaron las precauciones necesarias para no contaminar la muestra; en cambio, en un exudado faríngeo se aislarán diferentes microorganismos, los cuales deberán ser valorados cuidadosamente para destacar los que son habitantes normales de ese sitio y los que no. La flora basal es la característica de cada sector del organismo y está constituida por bacterias que siempre están presentes en dicho sitio. Por ejemplo Staphylococcus epidermidis en la piel y E. coli en el intestino. En cambio, la flora transitoria es variable de un ser humano a otro y está compuesta por bacterias que colonizan en forma intermitente un determinado sector. Esta flora transitoria puede incluir bacterias potencialmente patógenas para el individuo u otras personas que entran en contacto con él. Hay que destacar que la flora transitoria de la piel puede ser eliminada con el lavado de manos. Importancia de la flora normal La flora humana normal representa un importante mecanismo de defensa del huésped. (Ver cuadro 1). Contribuye al desarrollo de la respuesta inmunológica, como ha sido demostrado en 116 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA modelos animales que nacen y son criados en condiciones estériles (individuos axénicos). Estos animales presentan un pobre desarrollo de los componentes de su sistema inmunitario. La flora normal, además, ayuda a evitar la colonización de la piel o las mucosas por bacterias que pueden ser patógenas. Generalmente los microorganismos para iniciar la infección deben primero colonizar los epitelios. Allí, seguramente compiten con los integrantes de la flora normal por factores tales como receptores celulares y nutrientes. Cuadro 1. Importancia de la flora normal Efectos directos Producción de bacteriocinas Producción de metabolitos tóxicos Reducción del potencial de óxido reducción Consumo de nutrientes esenciales Competencia por receptores Efectos indirectos Aumento de la producción de anticuerpos Estímulo de la fagocitosis Aumento de la producción de interferón Deconjugación de ácidos biliares FLORA NORMAL DE LA CAVIDAD ORAL Existen diversos nichos dentro de la cavidad oral y pueden reconocerse diferencias en la composición si se estudia la flora de los dientes, la lengua, la mucosa yugal o el surco periodontal. La flora oral es de tipo mixto, con asociación de bacterias aerobias y anaerobias. Las bacterias que se adhieren a la superficie dental en forma permanente, lo hacen por diferentes polímeros de origen bacteriano como dextranos y levanos, sintetizados a partir de hidratos de carbono de la dieta. La cantidad de bacterias anaerobias es máxima en el surco gingival. Los dientes presentan superficies de adherencia que tienen la particularidad de no renovarse periódicamente, como lo hacen los epitelios. Formando parte de esta flora predominan diferentes especies de Streptococcus α-hemolíticos. A nivel de la placa dentaria se hallan el Streptococcus mutans y el Streptococcus sanguis. El Streptococcus mitis se adhiere tanto a los dientes como a las mucosas y el S. salivarius predomina en la mucosa lingual. El frotis realizado de saliva o hispoados de mucosa oral muestran células epiteliales y cocos grampositivos en cadenas. Esto suele verse en muestras de expectoración mal recogidas e indican contaminación por flora oral. Entre las bacterias anaerobias grampositivas pueden hallarse Actinomyces sp. en la placa dentaria y algunas especies de Lactobacillus en menor cantidad. La mayoría de las gramnegativas son anaerobias como, Bacteroides del grupo melaninogenicus y especies del género Fusobacterium. También pueden encontrarse espiroquetas del género Treponema distintas de T. pallidum. Los cocos grampositivos anaerobios pertenecen a los géneros Peptococcus, Peptostreptococcu y Ruminococcus entre otros. Además pueden aislarse especies de Mycoplasmas y levaduras del género Cándida. Como es un complejo ecosistema, existen muchas interrelaciones complejas también entre los distintos integrantes. En la placa dentaria, las bacterias se hallan en altas concentraciones, formando colonias microscópicas y ubicándose en estratos. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 117 La flora de la cavidad oral está involucrada en la patogenia de enfermedades como las caries y la periodontitis. En el desarrollo de la caries dental intervienen no solo las bacterias, sino también factores como el pH ácido resultante de la descomposición de hidratos de carbono de la dieta, etc. La periodontitis resulta de la agresión de la flora normal a los tejidos de sostén del diente. Los microorganismos de la boca también causan procesos como los abscesos periodontales y de cuello. Los pacientes con válvulas cardíacas enfermas, pueden desarrollar endocarditis bacteriana, en la que están implicados los Streptococcus α-hemolíticos. Esta enfermedad generalmente es una infección endógena, causada por bacterias de la cavidad oral que pasan al torrente sanguíneo por manipulaciones odontológicas y colonizan las válvulas cardíacas alteradas. La actinomicosis cérvico facial es una enfermedad que tiene como agente etiológico algunas especies de Actinomyces provenientes de la cavidad oral. FLORA NORMAL DEL APARATO DIGESTIVO El tubo digestivo alberga un gran número de bacterias. También en este nivel se pueden reconocer distintos nichos ecológicos. La flora normal intestinal contribuye a la síntesis de vitaminas K y de vitaminas del complejo B, además de ayudar en los procesos digestivos. También compiten con los microorganismos patógenos por los nutrientes y los receptores; y elaboran bacteriocinas. Estómago En condiciones fisiológicas y sin alimentos, el pH gástrico es extremadamente ácido, aproximadamente 2. Con los alimentos éste aumenta aproximándose al pH neutro. La densidad de bacterias en el estómago es relativamente baja y se compone de microorganismos de la flora orofaríngea que han sido deglutidos, como los Streptococcus α-hemolíticos, los Lactobacillus sp., los cocos anaerobios, la Cándida sp. y otros capaces de resistir el medio ácido. Intestino delgado En el duodeno se mantiene el pH que limita el crecimiento de microorganismos. El peristaltismo representa un mecanismo importante que mantiene un número bajo de bacterias. La bilis tiene propiedades antimicrobianas que inhibe a muchos microorganismos. Otras sustancias, como la lisozima y la inmunoglobulina A (IgA) secretoria, también contribuyen a mantener un número reducido de bacterias. La cantidad de bacterias aumenta gradualmente hacia el íleon. En los sectores distales del intestino delgado, la flora normal se asemeja a la colónica. En el íleon terminal se alcanzan concentraciones de 106 a 108 bacterias por ml de contenido intestinal, con predominio de anaerobios. Intestino grueso Las bacterias representan aproximadamente el 40% del peso seco de la materia fecal. El aumento del contenido bacteriano probablemente se explica por: disminución del peristaltismo, aumento del pH cercano al fisiológico y disminución del contenido de agua. Pasando la válvula ileocecal los microorganismos de la flora normal alcanzan concentraciones de 107 a 109 bacterias por ml, llegando al máximo en el recto con 1011 bacterias por ml. Sin duda, es el mayor y más complejo ecosistema microbiano del organismo y se estima que en él conviven más de 500 especies diferentes de bacterias, con predominio de las bacterias 118 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA anaerobias. Estos corresponden en su mayoría a los géneros Bacteroides y Fusobacterium entre los bacilos gramnegativos y especies de Peptostreptococcus, Sarcina y Veillonella entre los cocos. Los bacilos grampositivos están representados por especies de Bifidobacterium, Actinomyces, Bacillus, Lactobacillus y Clostridium. Entre los anaerobios facultativos predominan las enterobacterias, siendo E. coli la que predomina, seguida de especies de Klebsiella, Proteus, Enterobacter y Citrobacter. Entre los cocos grampositivos pueden hallarse especies de Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus. La adquisición de la flora normal se inicia en el momento del nacimiento; en el recién nacido los microorganismos que inicialmente colonizan el aparato digestivo provienen del periné y de la vagina de la madre. Generalmente se trata de E. coli, Klebsiella sp. y especies de Enterococcus; más raramente especies de Clostridium. En lactantes alimentados a pecho se aíslan Bifidobacterium sp. Con la introducción de la alimentación artificial aumenta el número y la diversidad de los microorganismos normales del intestino. Al año de vida la flora digestiva normal es idéntica a la del adulto. A continuación se menciona la importancia que tiene la flora normal del intestino. En primer lugar, es de destacar que determina el desarrollo correcto de la mucosa intestinal; además interviene en el metabolismo de sustancias como el ácido fólico, la biotina y las vitaminas B12, K y E. También favorece la producción de IgA y contribuye a la inmunotolerancia, dado que constituye un importante estímulo antigénico. Las bacterias que forman la flora normal del intestino cumplen un rol importante en la constitución del ciclo enterohepático de algunos fármacos. También tiene efecto de barrera, porque al ocupar nichos ecológicos impide el establecimiento de otras bacterias potencialmente patógenas. Este fenómeno se conoce como interferencia bacteriana. Las bacteriocinas son sustancias segregadas por las bacterias normales del intestino; dichos productos son tóxicos para bacterias de otros géneros distintos a los normales. Por último cabe mencionar que la flora normal del aparato digestivo interviene en infecciones oportunistas o endógenas en circunstancias como: obstrucciones mecánicas y perforación del aparato digestivo. En este caso, los microorganismos pasan al peritoneo causando una enfermedad grave. La gran diversidad de la flora fecal puede ser fácilmente objetivada realizando un frotis de materia fecal normal, tiñéndolo con coloración de Gram y observándolo al microscopio. Se observarán muchas bacterias grampositivas y gramnegativas, tanto bacilos como cocos. FLORA NORMAL DE LA VAGINA Fue una de las primeras en ser reconocida en 1892 por Döderlein quien describió el patrón biológico normal que se observa en la mujer en edad genital activa. La composición de la flora normal depende del contenido estrogénico. El estímulo hormonal determina la proliferación de las células epiteliales que aumentan su contenido de glucógeno. Este es utilizado por Lactobacillus spp., siendo el ácido láctico el producto final del metabolismo, el cual provoca un descenso importante del pH. La acidez resultante inhibe el crecimiento de muchas bacterias. En la mujer en edad genital activa predominan distintas especies de Lactobacillus, otros bacilos grampositivos y en menor cantidad cocos grampositivos (Streptococcus spp., Enterococcus spp., etc.). También pueden encontrarse algunos Actinomyces, bacilos gramnegativos anaerobios como Bacteroides y distintas especies de enterobacterias. El Streptococcus agalactiae (grupo B) se aísla en un porcentaje variable a esta edad, que aunque no suele producir enfermedad en la mujer, su presencia implica riesgo para el recién nacido en el que puede causar una enfermedad severa. Durante la gestación, a medida que progresa el embarazo, aumenta la densidad de Lacto- TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 119 bacillus y disminuye la de bacilos gramnegativos anaerobios y facultativos; el resultado es un mecanismo que reduce el riesgo de bacteriemia grave durante el parto y el puerperio. Algunas levaduras, como Candida albicans y otras, pueden formar parte de la flora vaginal normal. Estos hongos eventualmente, por alteraciones del ecosistema pueden causar síntomas. En la etapa prepuberal predominan los microorganismos de origen cutáneo y perineal: S. epidermidis, Propionibacterium spp. y pueden aislarse levaduras en escaso número, al igual que enterobacterias y bacilos gramnegativos anaerobios. En la mujer postmenopáusica, gracias al cesar del estímulo hormonal, la flora de la vagina retorna al patrón que tenía en la infancia. La flora vaginal protege frente a la infección vaginal, especialmente durante el embarazo y suministra la flora normal al recién nacido. El exudado vaginal es el estudio bacteriológico indicado para el diagnóstico de la infección genital y comprende el estudio directo y el cultivos de los fluidos vaginales. En la mujer sana en edad genital activa, el examen directo mostrará células epiteliales planas acompañadas de Lactobacillus: bacilos grampositivos grandes. En condiciones patológicas esta imagen se pierde y es reemplazada por la presencia de polimorfonucleares, levaduras con pseudofilamentos, G. Vaginalis, flora de tipo anaerobia, etc. FLORA NORMAL DEL APARATO RESPIRATORIO El aparato respiratorio se divide en dos sectores anatómicos: alto y bajo. En el individuo normal únicamente las vías respiratorias altas (fosas nasales y faringe) están colonizados por flora normal. Los senos paranasales, el oído medio, la tráquea, los bronquios pulmonares y la pleura son estériles. En las fosas nasales la estructura anatómica tortuosa generan una corriente de aire turbulenta. Cuando el aire choca contra las mucosas, se calienta y las partículas grandes que éste contiene son retenidas por el mucus y los pelos de las narinas. En sectores más bajos los microorganismos que ingresan por esta vía llegan al tejido linfoide del anillo de Waldeyer. El sistema mucociliar, la capa de moco y los reflejos como la tos, el estornudo y la broncoconstricción son otros mecanismos de defensa importantes. La mucosa respiratoria también es rica en IgA. En el tejido pulmonar existen macrófagos alveolares que contribuyen a la defensa del huésped, fagocitando las bacterias y otras partículas. En la faringe la flora normal está compuesta principalmente por Streptococcus α-hemolíticos. El estudio bacteriológico de un hisopado faringoamigdalino es habitualmente indicado para diagnosticar faringitis bacteriana. Una vez realizado el cultivo en placas de agar sangre ovina, el bacteriólogo debe ser capaz de diferenciar la flora normal, compuesta principalmente por Streptococcus con hemólisis viridans, de potenciales patógenos como Streptococcus β-hemolíticos. En las fosas nasales se encuentran microorganismos característicos de la piel: Staphylococcus epidermidis y especies de Corynebacterium. Alrededor de 20 a 30% de los individuos son portadores nasales sanos de S. aureus, porcentaje aumenta en personas diabéticas sometidas a hemodiálisis y en el personal de salud. En preescolares es habitual la colonización nasal por Streptococcus pneumoniae y especies de Haemophilus. En la faringe se encuentran además diferentes especies de Lactobacillus, Propionibacterium, Corynebacterium, Moraxella, etc. Los anaerobios superan en diez veces a los aerobios y se aíslan 120 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Peptoestreptococcus spp., Bifidobacterium spp. y Actinomyces spp. Los bacilos gramnegativos que se encuentran, generalmente son Fusobacterium spp. y Bacteroides spp. En las criptas amigdalinas se produce acumulación de materia orgánica que disminuye el potencial de óxido reducción, por lo tanto el número de anaerobios puede ser muy elevado. Algunos individuos albergan S. pneumoniae y Haemophillus influenzae, sin que ello signifique enfermedad. También pueden encontrarse especies no patógenas de Neisseria y Streptococcus β-hemolíticos no pertenecientes al grupo A. En condiciones normales no existen bacterias más allá de la glotis. La flora orofaríngea está implicada en infecciones pulmonares, causadas por la aspiración de estos microorganismos. Generalmente esto ocurre en pacientes que tienen alterados los reflejos de defensa debido a alteraciones de la conciencia, etc. En las infecciones bronquiales o pulmonares, el estudio de la expectoración puede resultar útil si el paciente logra obtener una buena muestra mediante el esfuerzo de tos. Hay que ser cauteloso en la lectura de esta muestra, porque la misma se contaminará en diferentes grados por la flora oral. Como ya se dijo, si se observa al microscopio, se podrá diferenciar una muestra inapropiada formada principalmente por saliva, de una muestra adecuada, compuesta principalmente por leucocitos polimorfonucleares y escasas o ninguna célula epitelial FLORA NORMAL DE LA PIEL La piel del ser humano es un extenso y heterogéneo territorio con diferencias en su estructura y condiciones ambientales, lo que determina diferencias en la densidad y composición de su flora normal, según el área considerada. La mayoría de los microorganismos colonizan el estrato córneo, que es relativamente impermeable. Los mecanismos de defensa que presenta la piel están representados por: el recambio celular continuo de las capas superficiales del epitelio, el pH bajo debido a metabolitos de las glándulas sebáceas y los macrófagos de la piel. Como se mencionó, en el personal hospitalario la flora transitoria puede estar integrada por bacterias que potencialmente pueden causar enfermedad a los pacientes. El lavado de manos es la medida profiláctica más importante para evitar la transmisión de infecciones. La composición de la flora normal, tanto en sus aspectos cualitativos como cuantitativos, puede estar influida por factores climáticos, condiciones de higiene, etc. Dentro los microorganismos que constituyen la flora normal de la piel, predominan los grampositivos. La flora basal se compone de Staphylococcus spp. (generalmente S. epidermidis), Micrococcus spp. y Corynebacterium spp. El Propionibacterium acnes es un bacilo grampositivo anaerobio que coloniza las glándulas sebáceas. Esta bacteria posee lipasas que degradan los lípidos secretados por esas bacterias. Los metabolitos resultantes son principalmente ácidos grasos insaturados con actividad antimicrobiana. La flora transitoria está integrada por S. aureus y en menor cantidad, por bacilos gramnegativos (Enterobacterias, Acinetobacter) en regiones como axilas, ingle y periné. Esta flora cutánea participa en el desarrollo de infecciones cuando se producen soluciones de continuidad en la piel. Muchas infecciones como foliculitis o forunculosis tienen origen en los folículos pilosos o glándulas. Otras infecciones ocasionadas por bacterias de la flora normal, se producen cuando se colocan catéteres percutáneos u otros dispositivos que implican la ruptura de la barrera cutánea. La flora del conducto auditivo externo es similar a la de la piel. Hay que destacar que a diferencia del anterior, el oído medio es estéril. La flora normal de la piel puede objetivase mediante cultivos en medios apropiados. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 121 FLORA NORMAL DE LA CONJUNTIVA La conjuntiva ocular carece de flora basal, porque no se producen interacciones estables entre esta mucosa y los microorganismos. El saco conjuntival puede contener algunos microorganismos que proceden de la piel circundante o del contacto mano ojo. La secreción lacrimal efectúa un continuo barrido de las partículas que se depositan en la conjuntiva. Esta secreción es rica en lizosima, enzima que destruye las bacterias, especialmente las grampositivas. El parpadeo, las pestañas y las cejas contribuyen a evitar el ingreso de partículas al saco conjuntival. Las bacterias que pueden encontrarse son Staphylococcus spp. , Corynebacterium spp., Streptococcus α-hemolíticos y Bacillus spp. El uso de lentes de contacto se asocia a la colonización por bacterias de los géneros Serratia y Pseudomonas. Las bacterias de la conjuntiva pueden causar infecciones graves como úlceras de córnea y endoftalmitis. Éstas, generalmente, están precedidas por traumatismos de córnea o perforaciones del globo ocular. FLORA NORMAL DEL APARATO URINARIO Excepto la uretra anterior, el aparato urinario es estéril. La orina contribuye a mantener la vía urinaria libre de microorganismos, gracias al arrastre de la orina durante la micción, al pH ácido de la orina y a la alta osmolaridad que presenta. La uretra anterior está colonizada por bacterias provenientes del periné. Dichas bacterias son eliminadas al inicio de la micción, propiedad que se usa para obtener la muestra por chorro medio para el urocultivo, evitando así la contaminación. En la mujer, la menor longitud de la uretra y la proximidad de ésta con el ano explican, al menos en parte, la mayor incidencia de infección urinaria. 122 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA SECCIÓN 123 II Principales procesos infecciosos 8. Infecciones de piel y partes blandas 9. Infecciones respiratorias 10. Gastroenteritis 11. Infección urinaria 12. Bacteriemias y sepsis 13. Infecciones del sistema nervioso central 14. Infecciones de transmisión sexual 15. Infecciones hospitalarias >> 124 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 125 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Página 125 8 Infecciones de piel y tejidos blandos G. Varela Generalidades Comprenden un conjunto heterogéneo de procesos infecciosos, con o sin respuesta inflamatoria local o sistémica evidente. Está formado por una gran variedad de cuadros clínicos con compromiso, gravedad y evolución diferentes. El número de agentes asociados a estos procesos es importante e incluye fundamentalmente bacterias, tanto de origen endógeno como exógeno, y en menor proporción virus. Las vías de ingreso de estos agentes a los sectores afectados son: la inoculación directa (más frecuente), la vía hemática o linfática, o por contigüidad. No resulta fácil hacer una clasificación de estos procesos basada exclusivamente en su topografía, ya que se trata de situaciones dinámicas y con frecuencia los planos comprometidos son varios, como veremos más adelante. En este capítulo no trataremos infecciones que presentan manifestaciones cutáneas como por ejemplo: sífilis, chancro blando, herpes genital, condilomas acuminados (ver capítulo 14), lepra. Tampoco veremos las infecciones que cursan con bacteriemia (como endocarditis, meningitis) que pueden presentar lesiones a nivel cutáneo. No haremos mención a enfermedades virales como sarampión, rubéola, varicela zóster, si bien debemos destacar que las lesiones a nivel cutáneo presentes en estas enfermedades pueden servir como puerta de entrada para diferentes agentes bacterianos asociados a infecciones de piel o tejidos blandos propiamente dichas. (Ver capítulos 6 y 7) Aproximación a la definición de tejidos blandos: son los tejidos, órganos y espacios ubicados entre la piel y los huesos. Incluyen de afuera hacia adentro: piel (epidermis y dermis), tejido celular subcutáneo con el panículo adiposo, fascias y aponeurosis, y el tejido muscular (con logias inextensibles en algunos casos). Esta distribución por sectores tiene variaciones cualitativas y cuantitativas, de acuerdo a la región anatómica estudiada (pared abdominal, escroto, manos, etc.). La piel constituye casi el 20% del peso corporal de un sujeto adulto. Está compuesta de dos capas: epidermis la más externa, y la interna denominada dermis. La epidermis está dividida en varios estratos: germinal, espinoso, granuloso y por último el estrato córneo (el más externo, en contacto directo con el medio ambiente). Por debajo de la epidermis se encuentra la dermis, constituida entre otros, por proteínas fibrosas tipo colágeno, fibras elásticas y mucopolisacáridos. Es rica en vasos sanguíneos y linfáticos, glándulas sudoríparas y sebáceas, fibroblastos, macrófagos y células cebadas. Las glándulas anexas (sudoríparas y sebáceas) y los folículos pilosos se encuentran en esta capa, a pesar de que su origen es ectodérmico. 126 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA La piel está en contacto con el medio ambiente y expuesta a una gran variedad de microorganismos, incluidas las bacterias que integran la flora normal (basal y transitoria). Ofrece innumerables nichos ecológicos para el desarrollo de distintos microorganismos, debido a la variedad de microambientes con características fisicoquímicas diferentes que posee (axilas, pliegues inguinales, cuero cabelludo, etc.). También está sometida a cambios estructurales y funcionales relacionados con la edad del sujeto, el estado hormonal, la higiene personal, y a factores exógenos como por ejemplo el clima (temperatura, humedad, etc.). Impétigo Se trata de una infección superficial de la piel, sobre todo de la epidermis, aunque raramente puede comprometer la dermis y tejidos subcutáneos. Se manifiesta inicialmente por la aparición de vesículas rodeadas por un halo de tipo inflamatorio, que pasan luego a pústulas, y por último a costras. Las lesiones son sumamente pruriginosas, el rascado facilita la diseminación a otras zonas del cuerpo y a otros individuos susceptibles. La mayoría de los casos ocurren en niños de dos a cinco años, afectando principalmente la cara, con distribución periorificial (boca, nariz) y también las extremidades, sobre todo inferiores, más expuestas a pequeños traumatismos. Es una enfermedad altamente contagiosa, frecuente en zonas con clima tropical y en niños con higiene personal deficiente. Traumas menores, picaduras de insectos y otras lesiones cutáneas actúan como factores predisponentes alterando la integridad de la barrera cutánea. Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes (de distintos serotipos M) son los agentes más frecuentemente asociados a impétigo. En el caso de Streptococcus pyogenes, la colonización faríngea precede al desarrollo de la enfermedad en dos a tres semanas y es más frecuente en los meses fríos; en cambio en los casos asociados a Staphylococcus aureus la colonización previa es sobre todo en el ámbito nasal. Son frecuentes los casos debidos a infecciones mixtas Impétigo por Streptococcus pyogenes TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 127 por S. aureus y S. pyogenes. Streptococcus del grupo C y G se asocian raramente a impétigo y Streptococcus agalactiae (grupo B) se ha recuperado de casos que ocurren en recién nacidos. Algunos casos de impétigo estreptocócico pueden dar como complicación no supurada una glomerulonefritis difusa aguda. (Ver capítulo 17) DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO El frotis del contenido de las vesículas o pústulas teñido por la técnica de Gram muestra la mayoría de las veces cocos grampositivos agrupados en cadenas o racimos. El cultivo en placas de agar sangre ovina al 5% del contenido de las vesículas o pústulas, puede mostrar colonias sospechosas de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes o ambas. Para una descripción detallada de los procedimientos de laboratorio utilizados en el diagnóstico etiológico, ver capítulos 16 y 17. TRATAMIENTO Es tópico, aplicando directamente sobre las lesiones antisépticos (iodóforos u otros), o antibióticos (mupirocina, bacitracina, etc.). En casos de impétigo generalizado o extenso deben administrarse antibióticos por vía general, que actúen sobre los diferentes agentes etiológicos potenciales (por ejemplo: cefalosporinas de primera generación). Debe prestarse especial atención a las cepas de S. aureus resistentes a meticilina. (Ver capítulo 16) El tratamiento con antibióticos por vía general no disminuye la incidencia de glomerulonefritis. IMPÉTIGO BULLOSO Es una forma de impétigo producida por cepas de S. aureus pertenecientes habitualmente al fagotipo 71, ocurre sobre todo en recién nacidos y niños pequeños. Es debido a la acción a nivel de la piel de dos exotoxinas exfoliativas (toxina exfoliativa A y B, ver más adelante síndrome de piel escaldada) producidas por la cepa infectante. Raramente ocurre sobreinfección de las lesiones con cepas de Streptococcus. La curación sin cicatrices es la regla. Ectima Es una afección cutánea similar al impétigo, aunque el compromiso es más profundo y la evolución es más lenta. Se observa sobre todo en las extremidades inferiores, es frecuente en niños y ancianos. Las lesiones se ulceran y luego se recubren de una costra amarilloverdosa. Generalmente están rodeadas de una sobreelevación violácea. Los agentes responsables más comunes son Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus. El tratamiento es el mismo que para el impétigo. En algunos casos de bacteriemia por Pseudomonas aeruginosa u otros bacilos gramnegativos, pueden aparecer lesiones cutáneas denominadas ectima gangrenoso. Son ulceraciones circulares, induradas, indoloras, con una éscara central de color negro grisáceo característico, rodeadas de un halo eritematoso; son producidas por la necrosis hemorrágica y la reacción inflamatoria que ocurre en la zona afectada. Eritrasma Es una infección superficial de la piel, producida por cepas de Corynebacterium minutissimum (bacilos grampositivos, aerobios-anaerobios facultativos, no esporulados, inmóviles, catalasa positivos y ampliamente distribuidos en la naturaleza). Se manifiesta por manchas de color pardo rojizo, similares a las producidas por los dermatofitos; son más frecuentes en hombres 128 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA y personas obesas con diabetes mellitus. Son muy pruriginosas, con escasa descamación y lenta evolución. Puede haber períodos asintomáticos y épocas de exacerbación. Las lesiones predominan en la región gentiocrural. Los macrólidos por vía oral son el tratamiento de elección. Foliculitis Es la inflamación aguda de causa infecciosa del sector distal (más superficial) del folículo piloso y de las glándulas apócrinas asociadas. Generalmente existe compromiso de varios folículos al mismo tiempo. Las lesiones son de tipo papular con un punto central sobreelevado y purulento. Tiene distribución variable, con predominio en la cara y axilas. Puede haber compromiso de los folículos pilosos del conducto auditivo externo. La foliculitis de las pestañas se conoce con el nombre de “orzuelo”. Una forma particular, denominada “sicosis de la barba”, se caracteriza por la afectación crónica de los pelos de la barba. Staphylococcus aureus es el agente etiológico más frecuente, aunque se han descrito casos adquiridos en piletas de natación causados por cepas de Pseudomonas aeruginosa. En pacientes inmunocomprometidos los casos de foliculitis por Pseudomonas aeruginosa pueden evolucionar a cuadros más graves como el ectima gangrenoso. Otros bacilos gramnegativos pueden asociarse a foliculitis en personas con acné, sobre todo luego del tratamiento con antimicrobianos. Forúnculo En este caso el proceso inflamatorio es más profundo que en la foliculítis, puede haber compromiso de la grasa subcutánea y de la glándula sebácea asociada. Habitualmente ocurre en un solo folículo, aunque pueden estar comprometidos varios a la vez, como veremos más adelante a propósito de carbunco por Staphylococcus. Se manifiesta como un nódulo rojo y doloroso, que luego se hace fluctuante y purulento. Eventualmente, puede abrirse al exterior a través del folículo afectado. Son más frecuentes en zonas húmedas, calientes y expuestas a roce frecuente, como por ejemplo cuello, cara, axilas, pliegues inguinales y nalgas. Entre los factores predisponentes para el desarrollo de forúnculos se destacan: estado de portador nasal de cepas de S. aureus, obesidad, tratamiento prolongado con corticoides, defectos en la serie blanca (neutrófilos), estrés y probablemente diabetes mellitus. Como consecuencia de la manipulación incorrecta de la lesión puede haber diseminación hematógena (bacteriemia) con aparición de focos metastáticos (osteomielitis, endocarditis, etc.). Especial cuidado debe tenerse con los forúnculos próximos a la nariz y labio superior, por la eventual diseminación hemática al seno cavernoso a través de las venas emisarias facial y angular. Ántrax estafilocócico Es un proceso más extenso y grave que compromete simultáneamente varios folículos pilosos. Habitualmente ocurre en la región de la nuca, espalda o muslos, donde la piel es más gruesa y menos extensible. Aparecen múltiples abscesos separados por tejido conectivo que luego drenan a la superficie a través de los propios folículos. En ocasiones puede haber bacteriemia con focos metastáticos secundarios (endocarditis, osteomielitis, etc.). El agente etiológico más frecuente en ambos casos (forúnculos y carbunco) es Staphylococcus aureus. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 129 Carbunco cutáneo (pústula maligna). Causado por Bacillus anthracis TRATAMIENTO La mayoría de los forúnculos se curan con medidas locales como aplicación de calor húmedo para provocar el drenaje espontáneo. Puede ser necesario el drenaje quirúrgico. En casos con compromiso de capas más profundas (celulitis) debe agregarse tratamiento con antibióticos adecuados. (Ver capítulo 16) Carbunco cutáneo (pústula maligna) Es causado por cepas de Bacillus anthracis (bacilo grampositivo, esporulado, aerobio) que puede causar infecciones en animales herbívoros y seres humanos. Es una enfermedad profesional, se observa fundamentalmente en personas que tienen contacto estrecho con animales contaminados (veterinarios por ejemplo), o sus productos (clasificadores de lana, esquiladores, etc). Los esporos ingresan por heridas en la piel, luego germinan y las formas vegetativas se multiplican activamente a nivel local. En el sitio de inoculación aparece una pápula indolora que progresa rápidamente a una úlcera rodeada de vesículas y por último a una lesión necrótica de color negro. El carbunco cutáneo es la forma más frecuente de ántrax, y sin tratamiento adecuado tiene una mortalidad cercana al 20%. El diagnóstico etiológico se realiza por el aislamiento e identificación de Bacillus anthracis a partir de la lesión. Penicilina, doxiciclina o ciprofloxacina se utilizan para el tratamiento de este proceso. Erisipela (Fuego de San Antonio) Es un tipo característico de celulitis superficial y recidivante; con participación de la epidermis, la dermis, el tejido celular subcutáneo y compromiso importante de los vasos linfáticos. Es común en niños pequeños y ancianos. Las lesiones son más frecuentes en los miembros inferiores, aunque se observan algunos casos de erisipela facial, con afectación del dorso nasal y mejillas. Las probables puertas de entrada a nivel de los miembros inferiores son: heridas 130 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA quirúrgicas, úlceras, abrasiones, psoriasis, dermatitis o infecciones fúngicas. Como factores predisponentes locales se destacan entre otros: alteraciones en el retorno venoso y linfático; a nivel general el alcoholismo, el síndrome nefrótico, la diabetes mellitus y alteraciones de la sensibilidad táctil protopática. La infección puede extenderse en profundidad y comprometer fascias musculares (fascitis necrotizante). El agente etiológico más frecuente es Streptococcus pyogenes, raramente se asocia a infección por Streptococcus del grupo C o G. Streptococcus agalactiae (grupo B) se ha recuperado en casos de erisipela en recién nacidos. El estudio bacteriológico (directo y cultivo) tiene poca aplicación en esta enfermedad, ya que la tasa de recuperación, aún estudiando los bordes de la lesión con o sin instilación previa de suero fisiológico estéril, es baja. La bacteriemia ocurre en menos del 10% de los casos y a partir de la faringe solo se recuperan cepas de Streptococcus en aproximadamente el 20% de los casos. TRATAMIENTO Se realiza con penicilina G o macrólidos en pacientes alérgicos. Procesos por acción de exotoxinas a nivel cutáneo (producidas localmente o en un foco alejado) SÍNDROME DE PIEL ESCALDADA (SPE) Se debe a la infección por cepas de S. pyogenes productoras de exotoxinas exfoliativas A y B, termoestable y termolábil respectivamente, con actividad serinproteasa, que digieren las uniones estrechas intercelulares (desmosomas) del estrato granuloso. No se produce citólisis y no hay respuesta inflamatoria. Ocurre en niños pequeños, y es raro en adultos. La riqueza relativa de GM4, receptor conocido para las toxinas exofilativas, en los niños pequeños explicaría en parte este hecho. La infección o colonización por la cepa toxigénica ocurre sobre todo a nivel del cordón umbilical. Tratamiento Consiste en medidas generales de sostén (recordar algunas de las funciones conocidas de la piel: termorregulación, balance hidroelectrolítico, barrera defensiva, etc.). Existen formas incompletas de SPE, causadas también por cepas de S. aureus productoras de toxinas exfoliativas. El compromiso cutáneo es menor con una erupción eritematosa generalizada (escarlatina estafilocócica). ESCARLATINA Es un exantema eritematoso difuso que comienza en el tronco y luego se extiende a los miembros. Respeta la zona perioral, plantas y palmas. Es causada por cepas lisogénicas de S. pyogenes (también, aunque más raramente, por cepas del grupo C o G) productoras de exotoxinas pirógenas estreptocócicas, también conocidas como toxinas eritrogénicas (Spe). La infección ocurre frecuentemente a nivel faríngeo y puede ser asintomática. Hasta el momento se han descrito siete toxinas inmunológicamente diferentes (A-J menos D, E, I). Pertenecen al grupo 1 de toxinas bacterianas y pueden actuar como “superantígenos”. (Ver más adelante síndrome de shock tóxico). Las cepas de Streptococcus pyogenes asociadas a cuadros invasivos graves y rápidamente letales, con manifestaciones de síndrome de shock tóxico producen freceuntemente SpeA. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 131 SÍNDROME DE SHOCK TÓXICO (SST) Es una enfermedad sistémica, con compromiso cutáneo, causada por la infección con cepas de Staphylococcus aureus productoras de TSST-1 (toxina del síndrome de shock tóxico-1). Se trata de una exotoxina proteica, termoestable e integra junto a otras toxinas bacterianas (toxinas estreptocócicas pirogénicas, enterotoxinas estafilocócicas) el grupo I, conocidas también como “superantígenos”. Estas moléculas tienen la capacidad de estimular en forma inespecífica a los macrófagos (células presentadoras de antígenos, con el receptor CMH II) y linfocitos T, con liberación excesiva de citoquinas (IL-2, FNT, etc.) responsables en parte de las manifestaciones sistémicas observadas en este síndrome. La colonización o infección con estas cepas toxigénicas puede ocurrir a nivel de la vagina (uso de tampones hiperabsorbentes) o de heridas (accidentales o quirúrgicas). Las manifestaciones cutáneas (aparte de las de la herida y el conjunto de manifestaciones sistémicas) son: exantema generalizado de tipo escarlatiniforme, y en los casos de SST causados por cepas de Streptococcus pyogenes puede observarse descamación severa de la piel de palmas y plantas. VERRUGAS COMUNES Plantares, planas, son causadas por la infección localizada de la epidermis con ciertos tipos de Papillomavirus (4, 63, 26, 27, 29, 41, 57, 65, entre otros). Los virus se replican en las células del estrato escamoso, estimulando la proliferación celular con engrosamiento de la capa basal, espinosa y granulosa. La curación es espontánea, aunque puede haber recidivas. La trasmisión es por contacto directo. MOLUSCO CONTAGIOSO Son lesiones bien delimitadas, blanquecinas, a veces agrupadas y con umbilicación central causadas por Poxvirus (Molluscum contagiosum); trasmitido por contacto directo o a través de fomites. Es frecuente en niños y en adultos sexualmente activos (promiscuos). En pacientes con SIDA se observa una forma generalizada con compromiso de zonas extensas de piel. CELULITIS Es un proceso inflamatorio agudo y difuso que compromete tejidos más profundos (celular subcutáneo) con manifestaciones clínicas locales (dolor, rubor, calor, edema) y sistémicas (decaimiento general, fiebre, etc.). Puede afectar distintos sectores del cuerpo (cabeza, tronco, miembros) dando diferentes cuadros clínicos. Es una enfermedad grave, con tendencia a la diseminación local o general por vía linfática o hemática. En algunos casos, la valoración quirúrgica es fundamental para establecer el grado de compromiso y la vitalidad de los tejidos afectados. Los agentes responsables pueden alcanzar el sitio de infección por diferentes vías: directamente a través de soluciones de continuidad en la barrera cutánea (cirugía, picaduras, heridas, etc.); por contigüidad (a partir de un foco infeccioso contiguo o próximo); y menos frecuentemente por vía hematógena (a partir de un foco infeccioso distante). Agentes etiológicos Bacterias aerobias o aerobias-anaerobias facultativas (Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes) son las especies bacterianas más frecuentemente asociadas a casos de celulitis. Streptococcus del grupo C y G también producen estos cuadros. Streptococcus grupo B se ha recuperado de casos de celulitis en recién nacidos. Haemophilus influenzae (bacilo gramnegativo pleomórfico, exigente desde el punto de vista nutricional, no esporulado, encapsulado), es responsable de algunos casos de celulitis facial en niños pequeños (menores de cinco años) 132 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA no vacunados. La evolución es rápida, la bacteriemia es frecuente y muchos de estos niños presentan manifestaciones clínicas de otros focos infecciosos (meningitis). Streptococcus pneumoniae (coco grampositivo, lanceolado, encapsulado, catalasa negativo, no esporulado) y bacterias anaerobias que integran la flora oral, también se asocian con casos de celulitis facial en niños pequeños. En algunos casos la etiología es mixta o polimicrobiana. Varias de las enzimas, toxinas y otras estructuras bacterianas, se vinculan con la patogenia de estos procesos. Proteinasas, hialuronidasa, estafiloquinasa, toxinas citolíticas (alfa, beta, gama, delta, etc), cápsula y estreptolisinas entre otras, se relacionan con el daño celular, tisular y la diseminación de la población bacteriana. En los capítulos correspondientes a los agentes, estos y otros atributos de virulencia conocidos se tratan en detalle, así como sus mecanismos de resistencia a los antimicrobianos. Otros agentes menos frecuentes Erysipelothrix rhusiopathiae, bacilo grampositivo, anaerobio facultativo, ampliamente distribuido en la naturaleza, es responsable de casos de celulitis de manos en personas que manipulan peces de agua salada, carne de aves, carne vacuna y cueros. Puede haber bacteriemia y endocarditis. Aeromonas hidrophyla, bacilo gramnegativo, ubicuo, con metabolismo de tipo fermentativo, vinculado a casos de celulitis en personas con abrasiones cutáneas mínimas y contacto prolongado con agua dulce. Serratia, Proteus, y otras bacterias de la familia Enterobacteriaceae, pueden producir celulitis en sujetos inmunocomprometidos. Diagnóstico etiológico Se puede intentar recuperar el o los agentes involucrados por cultivo de diferentes muestras representativas del proceso (aspirado de borde de la lesión, biopsia, etc.) o a partir de hemocultivos. Sin embargo, el rendimiento microbiológico es bajo, aproximadamente se obtienen resultados positivos en el 20% a 30% de los casos estudiados. CELULITIS CON NECROSIS TISULAR Lo característico en estos casos es la gran destrucción de tejidos, la rápida evolución y el pronóstico más grave; sumado a la necesidad urgente de realizar distintos tratamientos quirúrgicos. Se conocen también con el nombre de gangrenas infecciosas (para diferenciarlas de las de origen vascular), afectan tejido subcutáneo, piel suprayacente y en ocasiones hay compromiso de fascias (fascitis necrotizante) y tejido muscular (miositis). Según el sector comprometido de forma predominante y los agentes bacterianos participantes, definiremos algunos procesos: celulitis anaerobia por bacterias del género Clostridium, celulitis por otras bacterias anaerobias, fascitis estreptocócica necrotizante, celulitis necrotizante sinérgica progresiva. CELULITIS ANAEROBIA POR CLOSTRIDIUM Generalmente no hay compromiso de la fascia ni del músculo. Comienza de forma insidiosa y luego evoluciona rápidamente. Está causada habitualmente por cepas de Clostridium perfringens (bacilo grampositivo, esporulado, anaerobio aerotolerante, ubicuo e integrante de la flora intestinal de los seres humanos). El agente ingresa a través de heridas (accidentales, quirúrgicas, etc.) contaminadas con esporos bacterianos. La presencia de cuerpos extraños y tejidos desvitalizados en la profundidad de la herida crea un ambiente adecuado para la germinación y posterior multiplicación de las formas vegetativas. (Ver capítulos 3 y 21) Las manifestaciones locales incluyen: edema, rubor y dolor moderados. No hay un cuadro tóxico importante. Debido a la producción de gas puede haber crepitación en la región afectada. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 133 Celulitis por Clostridium perfringens luego de una fractura expuesta de miembro superior. La tinción con la coloración de Gram del pus que drena por la herida puede mostrar la presencia de bacilos grampositivos característicos (relativamente cortos y de bordes rectos). La exploración quirúrgica es fundamental para descartar el compromiso muscular y de las fascias subyacentes. Tratamiento Limpieza quirúrgica con debridamiento y drenaje, y administración de antimicrobianos adecuados. CELULITIS POR OTRAS BACTERIAS ANAEROBIAS Clínicamente es similar a la anterior, sin embargo las cepas responsables son bacterias anaerobias no esporuladas (cocos grampositivos, bacilos gramnegativos) pertenecientes a diferentes géneros. En muchos casos la infección es polimicrobiana y con participación de bacterias aerobias y anaerobias facultativas (Staphylococcus, Streptococcus, Enterobacteriaceae). El pronóstico es bueno si el diagnóstico y el tratamiento adecuado son precoces. FASCITIS ESTREPTOCÓCICA NECROTIZANTE Incluye dos entidades según los agentes infecciosos responsables: a) Tipo I: se trata de una infección mixta, en la que participan por lo menos una especie anaerobia (bacilos gramnegativo o cocos grampositivos) y una o más cepas aerobias (Streptococcus, bacilos gramnegativos: Pseudomonas y otros); b) Tipo II: es el cuadro conocido como gangrena estreptocócica y el agente etiológico más frecuente es Streptococcus pyogenes, solo o en combinación con S. aureus. Se trata de procesos agudos que aparecen luego de intervenciones quirúrgicas, sobre todo a nivel abdominal o cercanas al recto (perirrectales). Las producidas por Streptococcus pyogenes también pueden ocurrir luego de traumatismos banales. El sector afectado está rojo, caliente 134 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Celulitis de brazo causada por Streptococcus agalactiae y doloroso; la piel suprayacente adquiere un color gris azulado y luego aparecen vesículas de contenido serosanguinolento. Con el tiempo se transforma en una éscara negra y como consecuencia de la destrucción de los nervios periféricos, la zona puede perder sensibilidad. En las formas mixtas puede haber crepitación y un olor fétido característico. Los síntomas y signos generales incluyen: fiebre, malestar general, decaimiento, acompañados habitualmente de leucocitosis. El diagnóstico se realiza por exploración quirúrgica con valoración del estado de la fascia que se presenta necrótica, con resistencia disminuida y se diseca fácilmente. La tinción del exudado puede revelar la presencia de cocos, bacilos grampositivos y negativos. El tratamiento es quirúrgico. Tratamiento médico: antimicrobianos adecuados por vía intravenosa (teniendo en cuenta para la elección, entre otros factores: agentes participantes, sus posibles mecanismos de resistencia, producción de exotoxinas con acción local o a distancia). Existe una forma especial de fascitis necrotizante que afecta los genitales masculinos, denominada gangrena de Fournier. El proceso puede comprometer: escroto, periné, pene y pared abdominal. Algunos casos de fascitis necrotizante causados por Streptococcus pyogenes pueden asociarse con un cuadro sistémico sumamente grave, denominado síndrome de shock tóxico estreptocócico, con manifestaciones similares al producido por cepas de S. aureus productoras de TSST-1. Las cepas de Streptococcus pyogenes aisladas con mayor frecuencia en estos casos pertenecen a los serotipos M1 y M3, y son productoras de exotoxinas pirógenas de tipo A o B. CELULITIS NECROTIZANTE SINÉRGICA PROGRESIVA En este caso no hay compromiso de la fascia, y suele aparecer luego de intervenciones quirúrgicas, abdominales o torácicas. Se conoce también como gangrena de Meleney. Se trata de un proceso infeccioso polimicrobiano, que aparece en la proximidad de la sutura y luego de varios días. Hay dolor intenso, con rubor y edema. Más tarde en la lesión se pueden reconocer tres sectores más o menos definidos: uno central, gangrenoso de color verdoso con aspecto TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 135 de cuero seco, un sector intermedio de color violeta y muy doloroso, y otro externo de color rojo intenso. La evolución es más lenta que en los casos anteriores. MIOSITIS INFECCIOSA Se trata de procesos inflamatorios agudos, fundamentalmente de etiología bacteriana (aunque hay casos asociados a virus) y poco frecuentes. Los agentes infecciosos pueden alcanzar el músculo a través de diferentes vías: por inoculación directa (heridas penetrantes); por contigüidad a partir de procesos cercanos; por vía sanguínea desde focos infecciosos alejados. Las entidades más importantes son: piomiositis, mionecrosis por clostridios y mionecrosis no producida por clostridios. PIOMIOSITIS Infección aguda del músculo esquelético (sin compromiso inicial de la piel y de otras partes blandas o hueso adyacente), causada generalmente por cepas de S. aureus. Clínicamente se manifiesta por dolor localizado, tumefacción y a veces se asocia impotencia funcional, con o sin fiebre. MIONECROSIS POR CLOSTRIDIOS Se trata de un proceso agudo que compromete músculos esqueléticos, sumamente tóxico, de progresión rápida y potencialmente fatal. Es causado principalmente por cepas de Clostridium perfringens. La mionecrosis por clostridios se observa en situaciones que tienen en común la presencia de lesiones musculares extensas (con gran destrucción tisular y compromiso del aporte sanguíneo) y contaminación con esporos de C. perfringens o de otros clostridios histotóxicos; como sucede luego de fracturas expuestas, heridas de cirugía abdominal, inyecciones intramusculares con suspensiones que contienen sustancias vasoconstrictoras, heridas de guerra, etc. También se describen casos en los cuales la herida no es evidente, denominados mionecrosis espontánea no traumática, en los cuales los agentes responsables (Clostridium septicum u otros) llegan por vía hemática a partir del intestino. En este caso existen factores predisponentes a nivel intestinal (cáncer de colon, infarto intestinomesentérico, etc.). El síntoma inicial es el dolor, aparece dos a tres días luego del traumatismo y es sumamente intenso. En la zona afectada puede haber crepitación debido a la acumulación de gas (en logias inextensibles esta acumulación compromete aún más el aporte sanguíneo), sin embargo puede estar enmascarada por el edema importante. Se acompaña de manifestaciones generales de toxemia (taquicardia, sudoración profusa, hipotensión, etc.). Por la herida drena un líquido serosanguinolento de olor fétido. En la exploración quirúrgica (obligatoria) se comprueba que los músculos afectados no se contraen, están pálidos y friables, no sangran al corte, y han perdido su elasticidad. El estudio microscópico de frotis hechos a partir del líquido o de muestras de tejido pueden mostrar bacilos grampositivos caraterísticos y pocos polimorfonucleares. Varias enzimas y toxinas bacterianas (alfatoxina o lecitinasa, beta, epsilon y tita entre otras), serían responsables de la gran destrucción tisular y disminución de la respuesta celular inflamatoria a nivel de la zona afectada; también de algunas manifestaciones generales tardías como ictericia y hemoglobinuria por lisis tóxica de los glóbulos rojos. (Ver capítulo 21) El diagnóstico rápido es muy importante y se basa en los elementos clínicos y los resultados de la exploración quirúrgica, complementados por el estudio microscópico directo (frotis teñidos por la técnica de Gram) de muestras de líquido o partes de tejido. 136 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Tratamiento Es fundamental el debridamiento quirúrgico completo, extirpando todos los músculos afectados, llegando incluso a la amputación cuando el proceso compromete miembros; y la administración de antimicrobianos adecuados para disminuir la carga bacteriana y la producción de toxinas. Se puede utilizar la cámara hiperbárica como terapia coadyuvante. Una forma particular de mionecrosis por clostridios es la que ocurre en el músculo uterino. Es una infección grave, que se produce generalmente por maniobras abortivas realizadas en condiciones precarias, también puede presentarse tras un aborto o parto espontáneo. Se produce por la irrupción brusca en el torrente circulatorio de la alfatoxina (hidrolisa la lecitina de las membranas celulares) de C. perfringens desde la cavidad uterina, este pasaje está favorecido por el aumento de la irrigación del útero grávido. La toxina causa la hemólisis que lleva a la tríada sintomática de Mondor: hemoglobinemia, ictericia y hemoglobinuria, con estado general grave e insuficiencia renal aguda. MIONECROSIS NO PRODUCIDA POR CLOSTRIDIOS En estos procesos los agentes etiológicos son los siguientes: cocos grampositivos anaerobios, bacilos gramnegativos anaerobios, muchas veces asociados a S. aureus o S. pyogenes. Glosario • Exantema: erupciones de la piel. Pueden ser de dos tipos, a) escarlatiniforme con micromaculopápulas, ásperas, sin espacios de piel sana; b) morbiliforme, micromaculopápulas más suaves, separadas por sectores de piel sana. • Eritema: enrojecimiento de la piel, limitado o difuso que desaparece con la aplicación de presión. • Máculas: modificaciones del color normal de la piel, no se palpan. • Pápulas: Elevaciones pequeñas, hemisféricas, menores de un centímetro, sólidas y circunscriptas. • Vesículas: elevaciones localizadas, de entre uno y cinco milímetros, con contenido líquido. • Ampollas: elevaciones localizadas, de mayor tamaño que las vesículas, con contenido seroso o seropurulento. Pueden estar tensas o flácidas. • Pústulas: pequeñas elevaciones de contenido purulento. • Costras: masas secas de suero, pus o sangre mezcladas con restos celulares y bacterias. Aparecen luego de pústulas, vesículas o ampollas. • Éscaras: formadas por tejido necrosado. Bibliografía • AC Goméz , C Pérez, FL Blanco. Infecciones de piel y tejidos blandos. En: JA. García-Rodríguez y JJ Picazo. Microbiología Medica. Mosby/Doyma Libros S.A. editores. Madrid-España. 1999. Pp 213-225 • MN Swartz. Infecciones de piel y partes blandas. En : G. Mandell, JE Bennett, R Dolin. Enfermedades Infecciosas. Principios y Práctica. Editorial Médica Panamericana, BA. 5ta. Edición. 2002. Pp 1258-1304. • M. Ruvertoni. Exploración de la piel y sus anexos. En: I. Gentile. Semiología Pediátrica. Tomo 2. Oficina del Libro. AEM. 1era. edición. Montevideo-Uruguay. 1995. Pp 41-60. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 137 Página 137 9 Infecciones respiratorias M. Macedo, S. Mateos Las infecciones respiratorias (IR) son afecciones muy frecuentes. Constituyen una importante causa de morbilidad y mortalidad en todas las edades. Clasificación Según la localización encontramos las IR altas, que son las que afectan al tracto respiratorio superior, y las IR bajas, es decir las que afectan al tracto respiratorio inferior. De acuerdo a la etiología podemos hacer dos tipos de clasificaciones: a) por un lado se distinguen las infecciones bacterianas, virales, parasitarias y fúngicas; b) por otro lado es clásico diferenciarlas en específicas, es decir aquellas infecciones que son causadas por un agente en particular, como la tos convulsa o tos ferina o coqueluche (causada por Bordetella pertussis), la tuberculosis (causada por Mycobacterium tuberculosis), la difteria (Corynebacterium diphteriae), e inespecíficas que son ampliamente las más frecuentes. a) Según la etiología – Bacterianas, virales, parasitarias. – Específicas, inespecíficas. b) Según la localización: – Altas. – Bajas. Nos referiremos, en este capítulo, exclusivamente a las infecciones bacterianas y virales clásicamente denominadas inespecíficas. Infecciones respiratorias altas Son las infecciones que afectan la nasofaringe, orofaringe, laringe, tráquea, oído y senos paranasales. Debe recordarse que la mucosa del tracto respiratorio superior es continua por lo que una infección en cualquiera de sus sectores puede propagarse hacia sus sectores inferiores. RESFRÍO COMÚN (RINITIS) Es la inflamación de la mucosa nasal. Es una infección sumamente frecuente, y es la manifestación más frecuente de infección del tracto respiratorio superior causada por muchos virus 138 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA diferentes. A pesar de su elevada frecuencia, no existe terapéutica ni medidas preventivas específicas para la mayoría de sus agentes etiológicos. Etiología Salvo raras excepciones, los agentes etiológicos son virus. Los virus más frecuentemente involucrados son Rinovirus, Coronavirus, Parainfluenza y Adenovirus; menos frecuentemente Virus Respiratorio Sincicial (VRS) y Enterovirus. Dependiendo de las series estudiadas, las proporciones de cada virus varían, pero en general Rinovirus son los agentes más frecuentes. Debido a dificultades diagnósticas, probablemente la frecuencia de Coronavirus está subestimada pero se sabe que tiene un rol importante en la etiología del resfrío común. En cuanto a Adenovirus, algunos tipos (1, 2, 5, 6) se asocian a cuadros inespecíficos como el resfrío común, mientras que otros tienen tendencia a causar cuadros más específicos (ej.: 3 y 7- fiebre faringoconjuntival; 8 - queratoconjuntivitis). Influenza virus afecta la mucosa nasal en el curso de infecciones que afectan simultáneamente otros sectores del tracto respiratorio, incluso el tracto inferior. Sin embargo, las reinfecciones con un mismo tipo de virus Influenza pueden manifestarse como resfrío común sin fiebre y permiten al virus diseminarse rápidamente entre personas susceptibles. Epidemiología La vía de ingreso es respiratoria. Los virus se diseminan por contacto directo con secreciones infectadas, mano a mano o a través de fomites, y posteriormente son inoculados en la mucosa nasal o conjuntival; la inoculación en la mucosa oral es una ruta menos efectiva. Esta vía de diseminación es la más frecuente para la mayoría de los virus respiratorios, y explica la alta tasa de ataque en contactos familiares. Por aerosoles: ha sido documentada esta forma de transmisión para Influenza virus, pero se presume que puede ocurrir también con Rinovirus y Enterovirus. El resfrío común suele ocurrir con mayor frecuencia en los meses fríos del año, pero cada virus tiene su propia incidencia estacional (figura 1). Rinovirus predomina en otoño y primavera; VRS aumenta a mitad del invierno; Coronavirus aumenta al final del invierno y primavera. Esto sugiere un fenómeno de interferencia entre los distintos virus que aún no es claro. En cuanto al rol del clima y la temperatura, se cree que por un lado las bajas temperaturas aumentan el hacinamiento de personas en espacios cerrados favoreciendo la diseminación; por otro lado, los cambios en la humedad ambiental relativa alteran la viabilidad viral, por ejemplo Rinovirus tiene mayor viabilidad cuando la humedad es de 40% a 50%, mientras que Influenza y Parainfluenza virus persisten viables en aerosoles habiendo baja humedad ambiental relativa. Figura 1. Distribución estacional de los virus respiratorios TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 139 Patogenia El período de incubación es de uno a cuatro días. La replicación viral se produce en las células ciliadas del epitelio nasal y la nasofaringe. La viremia no es frecuente, salvo para Enterovirus. La eliminación del virus aumenta al tercer o cuarto día de infección y suele desaparecer al quinto; en niños el período de eliminación puede ser más prolongado. La infección es limitada por los mecanismos locales de inmunidad. Los síntomas, que suelen hacerse más prominentes luego del quinto día de enfermedad y desaparecer hacia el décimo día, se deben a edema e hiperemia de la mucosa y destrucción de células epiteliales. Manifestaciones clínicas Dependiendo del agente etiológico, el contacto previo con el mismo agente o agentes antigénicamente relacionados y el estado inmunológico del huésped, la presentación clínica es variable. El espectro de signos y síntomas comprende aumento de las secreciones mucosas con corrimiento nasal u obstrucción nasal, edema inflamatorio de la mucosa, estornudos, odinofagia, congestión conjuntival. Puede haber síntomas sistémicos: fiebre (siempre de bajo grado), mialgias, cefaleas, tos seca, afonía, etc. Diagnóstico etiológico Debido a la diversidad de agentes que pueden causar rinitis (recordar que estos agentes poseen más de un tipo antigénico, algunos incluso, como Rinovirus, poseen cientos) y a la levedad del proceso, el diagnóstico etiológico es engorroso y costoso. Si se desea realizarlo con fines epidemiológicos, la muestra que se prefiere es el aspirado nasofaríngeo (ANF) fundamentalmente en niños pequeños, pero el hisopado nasofaríngeo es una alternativa aceptable, y es la muestra más utilizada en adultos. El cultivo es el método directo de elección para todos los virus respiratorios. Los métodos directos rápidos (inmunofluorescencia) son en general menos sensibles que el cultivo; muestran mayor utilidad para VRS que para otros virus. La serología solo sirve con fines epidemiológicos, ya que el diagnóstico es retrospectivo y se requieren sueros pareados para su correcta interpretación. Tratamiento Es una infección leve y autolimitada que no requiere tratamiento específico, además de que no se dispone de fármacos antivirales para la mayoría de estos virus. Los antivirales antivirus Influenza se reservan para personas de riesgo de enfermedad grave durante los períodos de epidemias. El tratamiento es, por lo tanto, sintomático. Es importante recordar que en el curso de la infección, y muy frecuentemente en etapa de resolución, las características del corrimiento nasal van cambiando debido a la acumulación de células muertas y otros detritus. Esto no debe hacer pensar en una infección bacteriana sobreagregada o en la agravación del cuadro, por lo que no tendrá efecto ningún otro tipo de tratamiento, especialmente el uso de antibióticos. Prevención La principal medida es limitar el contacto con personas infectadas. Se dispone de vacunas para algunos de estos virus, ej.: Influenza y Adenovirus, por lo tanto previenen una mínima cantidad de casos. La posibilidad de obtener una vacuna que proteja contra Rinovirus es muy remota debido a la gran cantidad de serotipos de este virus y a que no se ha demostrado inmunidad cruzada entre ellos. 140 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA FARINGITIS Y AMIGDALITIS Es una infección frecuente, tanto en niños como en adultos. Etiología La mayoría de las faringoamigdalitis son virales, pero, a diferencia de lo que ocurre con la rinitis, también puede ser de etiología bacteriana y es especialmente importante diferenciar unas de las otras. Faringitis viral Los agentes virales más frecuentes así como los síndromes clínicos a los que se asocian, se muestran en el siguiente cuadro. La afección faríngea puede ser primaria o presentarse en el curso de otra infección respiratoria o sistémica. Causas virales de faringitis Virus Síndrome/Enfermedad Estimated Importance* Rinovirus Resfrío común 20 Coronavirus Resfrío común 5 Adenovirus Fiebre faringoconjuntival 5 Herpes simplex virus (types 1 y 2) Gingivitis, estomatitis, faringitis 4 Parainfluenza virus (types 1–4) Resfrío común, laringitis 2 Influenza virus (types A and B) Influenza 2 Coxsackievirus A (types 2, 4–6, 8, 10) Herpangina <1 Epstein-Barr virus Mononucleosis infecciosa <1 Cytomegalovirus Mononucleosis infecciosa <1 VIH-1 Primoinfección VIH <1 Copyright © 2000, 1995, 1990, 1985, 1979 by Churchill Livingstone La epidemiología, profilaxis y tratamiento de las faringitis virales merecen las mismas consideraciones realizadas para el resfrío común. Fiebre faringoconjuntival: la presentación clínica de la faringitis producida por Adenovirus generalmente es más severa que la asociada al resfrío común. Se acompaña de malestar general, mialgias, cefaleas, chuchos de frío, mareos, fiebre alta, odinofagia y exudado faríngeo purulento indistinguible del observado en las faringitis bacterianas. Una característica distintiva, si está presente, es la conjuntivitis que afecta a un tercio de los casos. Es de tipo folicular y bilateral. Faringitis herpética: la infección primaria por Herpes simplex puede presentarse como una faringitis aguda. Los casos leves son indiferenciables de las otras etiologías. En los casos severos la presencia de inflamación y exudado purulento puede hacer pensar en una faringitis bacteriana. Las vesículas y las úlceras planas de paladar son hallazgos característicos. Herpangina: es un tipo infrecuente de faringitis causada por el virus Coxsackie y se diferencia por la presencia de pequeñas vesículas en paladar blando, la úvula y pilares anteriores de faringe. Las lesiones se abren para convertirse en pequeñas úlceras blancas. Se observa principalmente en niños, en quienes puede manifestarse como una enfermedad febril severa. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 141 Mononucleosis infecciosa: se asocia a infección por Citomegalovirus y en un 50% de los casos se presenta con odinofagia, fiebre alta, adenopatías periféricas en todos los territorios, fatiga, esplenomegalia. Faringitis bacteriana Streptococcus pyogenes (Streptococcus betahemolítico del grupo A) es el principal agente bacteriano de faringitis. Otros estreptococos beta-hemolíticos agentes de faringitis son los de los grupos C, G y F de Lancefield. La faringitis estreptocóccicas debe ser diferenciada de las de otra causa ya que puede tener complicaciones supurativas y no supurativas. Otras bacterias que causan faringitis con menor frecuencia: Arcanobacterium hemolyticus, Neisseria gonorrhoeae, Corynebacterium ulcerans, Micoplasma pneumoniae. Epidemiología Estas infecciones ocurren durante todo el año pero tienen su pico de incidencia en otoño y primavera. El grupo etario más afectado y el de mayor riesgo de complicaciones es el de 5 a 15 años. La trasmisión se produce por vía respiratoria por contacto estrecho persona a persona. Manifestaciones clínicas El período de incubación es de dos a cuatro días. El cuadro más característico está dado por la instalación abrupta de odinofagia acompañada de fiebre, cefalea y malestar general. En niños son frecuentes las náuseas, vómitos y dolor abdominal. Los signos más destacados son edema, enrojecimiento e hiperplasia linfoide a nivel de la faringe posterior, hiperplasia amigdalina, exudado amigdalino blanco grisáceo, adenomegalias cervicales dolorosas. Si bien esta signosintomatología es sugestiva de faringitis bacteriana, también puede deberse a causas virales, y por este motivo nunca puede realizarse el diagnóstico etiológico únicamente sobre la base del cuadro clínico. Por otra parte, un cuadro respiratorio alto que carezca de estas manifestaciones raramente corresponderá a una faringitis bacteriana. La infección faríngea aguda es de resolución espontánea; la fiebre desaparece en tres a cinco días y el resto de los síntomas y signos suele resolverse en el plazo de una semana. Como veremos entonces, el único motivo por el cual se justifica el tratamiento antibiótico es la prevención de las complicaciones. En los casos en que la cepa de S. pyogenes que causa una faringitis u otra infección produce toxinas eritrogénicas, puede producirse escarlatina. Se trata de un eritema difuso y puntiforme que se acompaña de enantema característico que afecta el paladar y la lengua. Complicaciones Hoy en día son poco frecuentes debido al advenimiento de la antibioticoterapia. a) Complicaciones supuradas. A nivel local, pueden producirse abscesos o flemones periamigdalinos, abscesos retrofaríngeos. Por extensión directa del germen: otitis media, sinusitis, mastoiditis, linfadenitis cervical supurada. Otras complicaciones supuradas, como infecciones del sistema nervioso central, son extremadamente raras. b) Complicaciones no supuradas (secuelas postestreptocócicas): fiebre reumática y glomerulonefritis. 142 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA FIEBRE REUMÁTICA (FR) Es una enfermedad que se caracteriza por lesiones inflamatorias no supurativas que afectan fundamentalmente al corazón, las articulaciones, el tejido subcutáneo y el sistema nervioso central. Su presentación clínica es muy variable dependiendo del grado de afección de cada órgano. El espectro de manifestaciones incluye: carditis, poliartritis, corea, nódulos subcutáneos y eritema marginal (signos mayores). Otras manifestaciones menores y menos específicas incluyen fiebre, artralgias, etc. Puede ser autolimitada, pero también es posible que ocurra daño cardíaco severo con insuficiencia cardíaca y lesiones articulares que causen incapacidad. Las personas que han sufrido un episodio de FR son especialmente susceptibles tras nuevas infecciones por S. pyogenes. Este germen ha sido claramente establecido como el agente de esta afección, aunque el mecanismo por el cual la bacteria induce la enfermedad no se conoce con exactitud. Más recientemente, se ha descubierto que algunos estreptococos betahemolíticos del grupo Cy G tienen potencial para desencadenar una respuesta autoinmune que puede originar FR. Así mismo, se han descrito aislamientos de S. dysgalactiae subespecie equisimilis (que habitualmente son de grupo C o G) portadores del antígeno A de Lancefield. De modo que esta complicación que tradicionalmente se consideraba causada exclusivamente por S. Pyogenes, es posiblemente causada también por otros estreptococos agentes de faringitis. Las teorías más aceptadas son: 1) injuria tisular debida a los efectos tóxicos de productos estreptocócicos, en particular de las estreptolisinas S y O; 2) depósito de complejos antígenoanticuerpo a nivel de los tejidos dañados; 3) procesos autoinmunes inducidos por la similaridad entre antígenos estreptocócicos y antígenos de tejidos humanos (mímica molecular); esta última es sobre la que se ha hecho mayor énfasis. No todas las cepas de S. pyogenes tienen igual capacidad “reumatogénica”. Algunos tipos M se asocian fuertemente con el posterior desarrollo de FR. Por otra parte, las infecciones cutáneas por este germen no causan FR. Esto podría explicarse por la falta de reumatogenicidad de las cepas que causan piodermia, o podría indicar que es necesario el sitio faríngeo, abundante en tejido linfoide, para generar los trastornos inmunes probablemente responsables de la enfermedad. GLOMERULONEFRITIS (GN) Es una enfermedad inflamatoria del glomérulo renal que sigue a las infecciones faríngeas o cutáneas causadas por cepas pertenecientes a un limitado número de serotipos de S. pyogenes, llamadas cepas nefritogénicas. Se manifiesta por edema, hipertensión arterial, hematuria y proteinuria. A diferencia de la FR, S. pyogenes no es el único agente capaz de causar GN, sino que otras infecciones también pueden originarla. La causa de la lesión renal no es clara, pero también en este caso se aboga por la hipótesis del daño autoinmune. Se han descrito similaridades antigénicas entre constituyentes bacterianos y el tejido renal humano, y se han encontrado inmunocomplejos depositados en nódulos subepiteliales. Diagnóstico etiológico El principal objetivo, como hemos dicho, es diferenciar las infecciones causados por virus de aquellas causadas por S. pyogenes; eventualmente, frente a fuertes sospechas clinicoepidemiológicas, puede ser necesario identificar causas bacterianas específicas (ej.: difteria, gonococcia) para las cuales existe tratamiento. El “gold standard” para el diagnóstico de faringitis bacteriana es el exudado faríngeo. Nos enfocaremos en la investigación de S. pyogenes. De todos modos, el diseño del estudio tal como lo describiremos permite la detección de otros Streptococcus y Aracanobacterium. La toma de muestra se realiza mediante hisopado de las amígdalas; no es necesario utilizar medios de transporte, ya que S. pyogenes es altamente resistente a la deseca- 143 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA ción y puede permanecer viable hasta por 72 horas en hisopo seco. La muestra se siembra en un medio rico, habitualmente agar sangre. Es útil puncionar el agar con el asa ya que la acción de la estreptolisina O se detecta mejor en condiciones de baja concentración de oxígeno y se visualiza como un aumento de la zona de hemólisis en el sitio de punción. Tras 24 a 48 horas de incubación a 37ºC, se busca macroscópicamente la presencia de colonias betahemolíticas sugestivas de S. pyogenes. Para proseguir el estudio correctamente se debe realizar un aislamiento de la o las colonia/s sospechosa/s, ya que evidentemente no se encontrarán en cultivo puro sino en un cultivo polimicrobiano en el que habitualmente predominarán bacterias de la flora oral, especialmente colonias alfahemolíticas propias de Streptococcus spp. del grupo viridans. Una vez obtenido el germen de interés en cultivo puro, se realizará tinción de Gram para verificar que se trata de un coco grampositivo. Luego se procederá a su caracterización bioquímica. En primer lugar corresponde realizar una prueba de catalasa que deberá ser negativa, ya que se trata de una bacteria de la familia Streptococcaceae. Para orientarnos a la especie, la tabla 1 muestra las pruebas más útiles y el resultado esperado. Tabla 1. 1. Susceptibilidad a la bacitracina* 2. Prueba de PYR S + 3. Susceptibilidad a Trimetoprim-sulfametoxazol** R 4. Prueba de CAMP + * Prueba de baja sensibilidad si se utiliza aisladamente. ** Streptococcus del grupo A y del grupo B son intrínsecamente resistentes a este antibiótico, a diferencia de otros Streptococcus. PYR: Pyrrolidonyl arylamidasa. Finalmente se puede realizar determinación de los antígenos carbohidratos de la pared celular, que en general se realiza mediante aglutinación con látex o pruebas de coaglutinación. Tiene la ventaja de ser una prueba rápida que se puede realizar con un escaso número de colonias, pero su desventaja es el costo. Una alternativa al exudado faríngeo son las pruebas rápidas de detección de antígeno de Streptococcus del grupo A. Se realizan directamente a partir de la muestra de hisopado faríngeo. Estos métodos no dependen del cultivo del microorganismo y por lo tanto permiten obtener un resultado en pocos minutos. Debido a esta notable ventaja su uso se encuentra ampliamente difundido a pesar de que su costo es más elevado que el cultivo. Aunque existen variaciones de procedimiento de acuerdo a cada producto comercial, el método consiste en: 1) extracción del carbohidrato grupo A específico mediante la incubación del hisopo en ácido o por tratamiento enzimático; 2) detección del antígeno extraído, para lo cual la mayoría de los sistemas comerciales utilizan aglutinación con látex o enzimoinmunoensayo; también se ha utilizado la tecnología de ADN. Entre sus desventajas, si bien su especificidad es muy buena, en general superior al 95%, su sensibilidad es un poco menor (entre 68% y 95%). Por este motivo, la Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosas (IDSA) recomienda utilizarlo como método de screening e interpretarlo de la siguiente manera: 144 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Test rápido Considerar al paciente portador de S. pyogenes y no realizar pruebas adicionales. positivo negativo Grupo de riesgo (grupo de alto VPP) Realizar exudado faríngeo. Grupo de bajo riesgo (grupo de alto VPN) No realizar estudios adicionales VPP: valor predictivo positivo; VPN: valor predictivo negativo Serodiagnóstico Los individuos que cursan infecciones por S. pyogenes desarrollan anticuerpos contra diferentes antígenos de la bacteria. Los más comunes son: antiestreptolisina O (AELO), anti DNAsa B, antiestreptoquinasa y antihialuronidasa. Los anticuerpos AELO pueden utilizarse para realizar el diagnóstico restrospectivo de una infección por S. pyogenes. Estos anticuerpos no son útiles en el diagnóstico de la faringitis aguda, ya que su elevación comienza a observarse luego de la resolución, incluso espontánea, de esta infección. En cambio, la seroconversión en el título de AELO contribuye a aclarar el diagnóstico en pacientes con cuadros sugestivos de secuelas postestreptocócicas, en los cuales el antecedente de faringitis no es evidente. Estudio de susceptibilidad antibiótica Hasta la fecha, S. pyogenes se mantiene uniformemente sensible a la penicilina. Por este motivo, no es necesario realizar sistemáticamente estudios de susceptibilidad en los aislamientos clínicos a menos que se decida realizar tratamiento con macrólidos, en cuyo caso debe testearse la susceptibilidad in vitro ya que el germen muestra un comportamiento variable frente a estos antibióticos. Tratamiento Debido a que el objetivo principal es prevenir las complicaciones supuradas y las secuelas no supuradas, el grupo antibiótico de primera elección es el de las penicilinas (penicilina G sódica, penicilina benzatínica, ampicilina, amoxicilina), ya que ha demostrado prevenir efectivamente la FR. En los pacientes alérgicos a penicilina, se opta por eritromicina u otros macrólidos. El tratamiento con estos antibióticos (salvo con azitromicina) debe tener una duración de 10 días, aún cuando el paciente ya no presente síntomas, como es habitual. Otras alternativas eficaces incluyen cafalosporinas de primera y segunda generación. Sin embargo, no son convenientes debido a su costo y a que, al ser de mayor espectro antimicrobiano, afectan la flora normal y favorecen la selección de resistencia. LARINGOTRAQUEOBRONQUITIS AGUDA (CRUP) Es una infección viral alta y baja vinculada con la edad, que produce una inflamación en el área subglótica que conduce a un cuadro clínico caracterizado por disnea y estridor inspiratorio característico. Crup deriva del vocablo escocés ruop, que significa “gritar con voz chillona”. Incidencia Enfermedad frecuente de la primera infancia, representa el 15% de todas las IRA en los niños. La incidencia máxima se observa durante el segundo año de vida y la mayor parte de los casos se produce entre los tres meses y los tres años de edad. Predomina en el sexo masculino. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 145 Etiología El virus Parainfluenza 1 es la causa más frecuente, el tipo 3 suele ser el segundo en frecuencia. Los brotes epidémicos causados por virus Influenza A y B pueden determinar un porcentaje significativo. Solo en un 5% de los casos puede ser causado por VRS. Las infecciones por Adenovirus pocas veces se asocian con crup, aunque la laringitis suele ser una manifestación habitual en las infecciones producidas por estos virus. Las manifestaciones más caracteristicas de la enfermedad fueron asociadas al virus Parainfluenza 2, sin embargo el porcentaje total de casos de crup provocado por éste es menor que el asociado a los tipos 1 y 3. Este fenómeno se debe a que los virus tipo 2 son menos frecuentes en la comunidad y los brotes epidémicos provocados por este virus son poco frecuentes. De todos los agentes mencionados, solo Parainfleunza tipo1 y el virus Influenza A se asocian con epidemias. En la era prevacunal el sarampión se asociaba con un crup severo y complicado. Epidemiología Los patrones epidemiológicos reflejan principalmente los patrones estacionales. El virus Parainfluenza 1 tiene su máxima incidencia durante el otoño y parecería provocar brotes epidémicos año por medio. Lo brotes en invierno o principios de la primavera se asocian más frecuentemente a Influenza A o B. Manifestaciones clínicas Inicialmente la infección viral compromete el tracto respiratorio superior, conductos nasales, nasofaringe, posteriormente se propaga por la vía canalicular descendente para afectar todos los niveles del aparato respiratorio. Los signos clásicos de estridor, disfonía y tos perruna resultan principalmente de la inflamación de laringe y tráquea, sin embargo en la mayoría de los pacientes se objetiva un compromiso pulmonar. La obstrucción y por ende la inflamación son máximas a nivel subglótico, este área representa la porción menos distensible de la vía aérea, dado que está rodeado por cartílago cricoides con un estrecho anillo anterior y lámina cuadrangular posterior más ancha, ”anillo de sello”. Estos hechos se agravan en los niños pequeños dado que en ellos las paredes de la vía aérea son relativamente distensibles, es probable que los factores anatómicos contribuyan a la mayor gravedad de este cuadro en niños preescolares. El diámetro de la laringe y la glotis es relativamente pequeño y la inflamación de las mucosas determina mayor grado de obstrucción. La resistencia de la vía aérea es un parámetro sumamente sensible, incluso a cambios poco marcados del diámetro de la vía. La resistencia al flujo aéreo está inversamente relacionada con la cuarta potencia del radio del la vía. La membrana mucosa también se encuentra relativamente más laxa, así como más vascularizada, y el anillo cartilaginoso es menos rígido, la obstrucción nasal y el llanto pueden agravar el estrechamiento dinámico de la vía aérea del niño. La enfermedad se manifiesta durante el anochecer generalmente luego de una tos leve de varios días de duración, acompañada o no de odinofagia y rinorrea serosa. Los niños infectados por Influenza y Parainfluenza suelen tener fiebre de entre 38º y 40º; en la infección por VRS la fiebre suele ser más baja. La instalación del crup puede estar anunciada por la presencia de disfonía y una profundización de la tos, habitualmente seca con un tono metálico (perruno). Aparecen polipnea, tirajes altos, estridor laríngeo inspiratorio, roncus y sibilancias. Una característica distintiva es su curso fluctuante. El cuadro puede mejorar o agravarse clínicamente en el curso de una hora. La mayoría de las veces dura entre tres y cuatro días, aunque la tos puede persistir. El diagnóstico es clínico, el asilamiento viral se discutirá más adelante, si bién no es recomendable realizar procedimientos invasivos para no alterar al niño y agravar el cuadro. 146 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Tratamiento Es sintomático. Siendo una enfermedad de etiología viral, los antibióticos no tienen efecto alguno. EPIGLOTITIS Es una infección grave de la laringe supraglótica que resulta en edema epiglótico con la consiguiente obstrucción laríngea. A diferencia de la laringitis, suele ocurrir en niños mayores de dos años; también puede ocurrir en adultos. Su etiología es bacteriana. Etiología Su principal causal es Haemophilus influenzae tipo b. Desde que se utiliza la vacuna contra este germen, han disminuido dramáticamente las infecciones invasivas que produce, dentro de las cuales se encuentra la epiglotitis. Son causas menos frecuentes: Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus, S. aureus, H. influenzae no encapsulado, H. parainfluenzae. Manifestaciones clínicas La sintomatología es de instalación brusca. Se presenta con odinofagia, fiebre elevada, disfagia y dificultad respiratoria por obstrucción de la vía aérea que domina el cuadro y causa estridor. El niño se presenta con aspecto tóxico. Cuando se asocia bacteriemia el cuadro es de muy mal pronóstico. En el adulto la presentación es menos brusca pero igualmente severa. Diagnóstico etiológico El germen puede aislarse de muestras de secreciones respiratorias del sector supraglótico y de hemocultivos en caso de bacteriemia. Tratamiento Es una emergencia pediátrica. Además del tratamiento de soporte para eliminar la obstrucción, se requiere tratamiento antibiótico. Profilaxis La principal medida profiláctica es la vacunación anti-Haemophilus influenzae tipo b. Frente a los casos de enfermedad confirmada, se adiministra rifampicina durante cuatro días a: 1) todos los contactos familiares cuando hay niños menores de cuatro años en el hogar; 2) compañeros de escuela y maestros del caso índice; 3) el paciente antes de otorgar el alta hospitalaria para prevenir la reintroducción del germen en el hogar. OTITIS MEDIA AGUDA (OMA) Es la inflamación aguda del oído medio. Es una de las enfermedades más prevalentes en la infancia. Es uno de los principales motivos de prescripción de antibióticos en atención primaria. Epidemiología La OMA es una enfermedad de lactantes y niños pequeños, la máxima incidencia se produce entre los 6 y los 18 meses de edad. A los tres años la mayoría de los niños han sufrido al menos un episodio, y hasta la mitad han sufrido una OMA recidivante (tres o más episodios). Entre los factores que influyen en la frecuencia de OMA se incluyen la alergia a antígenos y TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 147 polulantes, exposición a humo de cigarrillo, lactancia natural, estación del año, concurrencia a guarderías, pobreza, hacinamiento, mala higiene. Etiología La microbiología de la OMA se ha documentado por cultivo del líquido del oído medio obtenido mediante aspiración con aguja. Streptococcus pneumoniae (aislado con mayor frecuencia en todos los grupos etarios) seguido por Haemophilus influenzae no tipo b, son responsables de por lo menos el 90% de las OMA. Moraxella catarrhalis es el tercer agente en frecuencia, dando cuenta del 3% al 20% de las infecciones. Otros agentes menos frecuentes: H. influenzae tipo b, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Chlamydia pneumoniae, bacilos gramnegativos. Rol de los virus respiratorios (VRS, Rinovirus, Adenovirus, Enterovirus, Influenza virus, Parainfluenza virus): pueden inducir o prolongar la infección por alterar los mecanismos celulares de defensa. Patogenia Para comprender la patogenia de la OMA hay que tener en cuenta que la enfermedad afecta a un sistema constituido por partes contiguas: orificios nasales, nasofaringe, trompa de Eustaquio, oído medio, antro y celdas aéreas de la mastoides. El oído medio recuerda a una caja aplanada, la pared lateral comprende la membrana timpánica y la pared interna incluye las ventanas oval y redonda. Las celdas aéreas mastoides están detrás y el orificio de la trompa de Eustaquio se encuentra en la porción superior de la pared frontal. La trompa de Eustaquio conecta el oído medio con la nasofaringe posterior y su tercio lateral está situado en el hueso y es abierto. En el lactante, la trompa es más corta y proporcionalmente más ancha que en el niño mayor; las porciones óseas y cartilaginosas forman una línea relativamente recta, mientras que en el niño mayor forman un ángulo más agudo. Estas diferencias pueden predisponer a la enfermedad precoz y repetida en algunos lactantes. La trompa de Eustaquio desempeña al menos tres funciones importantes respecto al oído medio: protección del oído frente a las secreciones nasofaríngeas, drenaje hacia la nasofaringe de las secreciones producidas por el oído medio y ventilación para igualar las presiones del aire dentro del oído medio. La disfunción de la trompa debido a factores anatómicos o fisiológicos parece ser el factor más importante en la patogenia de esta infección. La secuencia más probable de eventos en la mayoría de los episodios comprende una anomalía previa (debido por lo general a una IRA alta viral) que da lugar a la congestión de la mucosa respiratoria y la consecuente obstrucción de la mucosa tubárica que ocasiona la obstrucción de la porción más estrecha de la trompa o istmo; la obstrucción provoca una presión negativa en el interior del oído medio, con formación de derrame. Las secreciones del oído medio se acumulan en consecuencia, si después de producirse la obstrucción tubárica existen bacterias patógenas en el oído medio que colonizan la nasofaringe, los microorganismos se multiplican y producen una infección supurada aguda. Manifestaciones clínicas La enfermedad se presenta con otalgia, hipoacusia, fiebre, anorexia, vómitos, diarrea. Cuando ocurre perforación de la membrana timpánica se observa otorrea. Posibles complicaciones de esta infección Otorrea purulenta crónica, mastoiditis aguda, bacteriemia, pérdida de audición. 148 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Diagnótico etiológico El diagnóstico etiológico de la OMA plantea un problema, ya que el único procedimiento adecuado es la timpanocentesis (la obtención de fluido del oído medio mediante la punción de la membrana timpánica). Debido a que es un procedimiento agresivo, no se justifica realizarlo en todos los casos. Por este motivo, la mayoría de las veces el tratamiento antimicrobiano es empírico. Para conocer la epidemiología local en cuanto a la etiología y la susceptibilidad antibiótica de los agentes etiológicos, es necesario realizar estudios periódicamente y en base a ellos ir adecuando la terapéutica adecuada. Tratamiento La implementación de tratamiento antibiótico en la OMA es motivo de discrepancias. Por un lado puede ser una enfermedad benigna de resolución espontánea sin tratamiento. Por otro lado puede evolucionar a complicaciones severas. Con el fin de disminuir la prescripción antibiótica en aquellos casos en que no sea necesario, en algunos países como Holanda se ha adoptado el criterio de observar a los niños con OMA, siempre que sean mayores de dos años y muestren un buen estado general. En caso de que la sintomatología persista o se agrave en el curso de las siguientes 24 hs a 48 hs, entonces se comienza el tratamiento. Sin embargo, en muchos otros países se mantiene la práctica de administrar siempre antibióticos, como es el caso de nuestro país. Como ya hemos dicho, la elección de los antibióticos apropiados se realiza en cada medio teniendo en cuenta la susceptibilidad local de los gérmenes. Mientras que S. pneumoniae presenta en el mundo un creciente grado de resistencia a penicilina, un estudio realizado en nuestro país en los años 1999 y 2000, mostró que la mayoría de las cepas de este germen son susceptibles a ese antibiótico, y las que no lo son suelen presentar resistencia intermedia y raramente absoluta. Igualmente la incidencia de resistencia a eritromicina es muy escasa. Por el contrario, se observa casi un 20% de resistencia a trimetoprim/sulfametoxazol. Algo similar ocurre con H. influenzae; la producción de betalactamasas por cepas locales es reducida, al igual que en el resto de América Latina, mientras que tiende a aumentar en el resto del mundo. En este mismo estudio, la susceptibilidad a azitromicina fue de 100%, y algunas cepas mostraron resistencia a Trimetoprim, pero en escasa proporción. De acuerdo a estas consideraciones, las recomendaciones para el tratamiento antibiótico de la OMA son las siguientes: • El tratamiento de elección es amoxicilina a altas dosis (90 mg/kg/día) por la posibilidad de cepas de S. pneumoniae de sensibilidad intermedia. En ese caso, esta dosis es suficiente para alcanzar concentraciones del antibiótico en oído medio superiores a la CIM del microorganismo. • Como tratamientos alternativos, frente a no respuesta al tratamiento, puede plantearse amoxicilina-clavulánico o cefalosporinas de segunda o tercera generación, por la posibilidad de H. influenzae productor de betalactamasas. Los macrólidos también constituyen una alternativa en pacientes alérgicos a penicilina. De optarse por macrólidos es de preferencia la claritromicina, ya que alcanza mejores concentraciones en el fluido del oído medio que azitromicina, que se concentra preferentemente en el espacio intracelular. Trimetoprim: como hemos visto, en nuestro país así como en otras partes del mundo, la resistencia aumenta gradualmente por lo que no debe utilizarse de primera elección. Finalmente, se encuentra en estudio un nuevo antibiótico, la telitromicina perteneciente a la familia de los macrólidos, que parece tener buena actividad frente a bacterias grampositivas multirresistentes. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 149 Inmunoprofilaxis Se han desarrollado diversas vacunas contra S. pneumoniae. En el mercado mundial existen dos vacunas: una conjugada heptavalente, que es efectiva en niños menores de dos años, comprende serogrupos de la mayoría de las cepas productoras de OMA y disminuye la portación nasofaríngea, pero no está disponible en Uruguay; otra 23-valente polisacarídica, que por no ser conjugada no es efectiva en niños menores de dos años y no disminuye la portación nasofaríngea del germen, por lo que mantiene la posibilidad de infección del oído medio. Se está estudiando en la región la posibilidad de elaborar una vacuna conjugada que contenga los serotipos más prevalentes. Por otro lado, debido a que las infecciones virales pueden contribuir al desarrollo y mantenimiento de la OMA, la vacunación contra el virus Influenza puede disminuir la posibilidad de OMA. OTITIS MEDIA CON DERRAME (OMD) Es la presencia de derrame en el oído medio sin signos y síntomas agudos de infección. Anteriormente se creía que no se trataba de una patología infecciosa. No obstante, en los últimos 20 años varios estudios han identificado la presencia de bacterias en el fluido de oído medio de niños con OMD. Los agentes más frecuentemente encontrados son los mismos que en OMA. En el manejo de esta patología, que todavía plantea problemas y discrepancias, se incluye el tratamiento antibiótico para los mismos agentes que en OMA. OTITIS EXTERNA Es la infección del conducto auditivo externo. Debido a la anatomía de este sector del oído, se trata de una infección localizada de piel que presenta como factores de riesgo la humedad, el calor y la maceración. Sus principales agentes son Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. El diagnóstico etiológico puede realizarse con mayor facilidad que en la OMA, ya que consiste en el cultivo del exudado del conducto auditivo externo, pero debe tenerse en cuenta que este es un sitio normalmente contaminado con flora de la piel, por lo que su interpretación debe realizarse con precaución. El tratamiento consiste en la aplicación tópica local de antibióticos durante una semana. Entre los agentes farmacológicos disponibles para uso local y de acuerdo a la etiología, puede optarse por: macrólidos, fluorquinolonas, aminoglucósidos, ácido fusídico, bacitracina, cloranfenicol, etc. SINUSITIS AGUDA Es la inflamación de la mucosa de los senos paranasales de menos de cuatro semanas de evolución. Es una afección frecuente en niños y adultos. Etiología Más del 70% de los casos de sinusitis aguda adquirida en la comunidad se deben a los mismos agentes que causan OMA: S. pneumoniae, H. influenzae no encapsulado y M. catarrhalis. Otros agentes bacterianos que pueden causarla son S. pyogenes y otros Streptococcus, S. aureus y con mucho menor frecuencia anaerobios. Chlamydia pneumoniae y Mycoplasma pneumoniae parecen contribuir escasamente. Los virus están involucrados en una minoría de los casos. En sinusitis nosocomial secundaria a trauma craneal o intubación nasotraqueal participan otros agentes y muy frecuentemente es polimicrobiana. Participan bacilos gramnegativos (P. aerugionosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Enterobacter spp, otros), S. aureus y anaerobios. 150 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Manifestaciones clínicas Son variables según la edad. Los síntomas más comúnmente observados son tos y corrimiento nasal, pero puede acompañarse de fiebre, cefaleas frontales que aumentan con la posición declive, dolor a nivel de los senos, odinofagia, halitosis. Diagnóstico etiológico Al igual que para la otitis media, la obtención de una muestra adecuada para estudio bacteriológico requiere de procedimientos invasivos, la aspiración sinusal, que por lo tanto se realiza únicamente en casos seleccionados. La práctica de realizar cultivos de nasofaringe en pacientes con sinusitis, presumiendo que las secreciones obtenidas representan a las sinusales, no es recomendada. Numerosos estudios han demostrado que los gérmenes recuperados a partir de estas muestras no corresponden a los presentes en los aspirados sinusales. Tratamiento Los antibióticos son el pilar fundamental del tratamiento de la sinusitis aguda. Debe tenerse en cuenta que el diagnóstico clínico de sinusitis aguda es en ocasiones difícil de realizar, y como hemos visto, el diagnóstico microbiológico se realiza en una minoría de casos. Para evitar el uso innecesario y excesivo de antibióticos, el médico debe tener en cuenta la probabilidad de que el paciente padezca una sinusitis aguda para decidir cuáles pacientes serán tratados. El siguiente esquema ilustra una guía útil. Por lo general, salvo en los casos en que se realizó aspiración sinusal, se realiza en forma empírica. El tratamiento inicial recomendado es amoxicilina durante 10 días, y frente a respuesta parcial continuar 10 días adicionales. Frente a no respuesta al tratamiento, los antibióticos de segunda línea son amoxicilina-clavulánico, cefalosporinas de segunda generación, macrólidos. En adultos, las fluorquinolonas también son una opción. SINUSITIS SUBAGUDA Y CRÓNICA La sinusitis subaguda es aquella en la que la sintomatología persiste por más de un mes pero menos de tres, y la crónica es la que persiste por más de tres meses. En estos tipos evolutivos de infección cumple un rol muy importante el origen odontogénico, por lo que se comprende que los gérmenes anaerobios cobran relevancia: Bacteroides, Peptostreptococcus, Fusobacterium, Veillonella. Es frecuente que sean polimicrobianas. Los gérmenes aerobios más frecuentemente TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 151 encontrados son: Streptococcus del grupo viridans y H. influenzae no encapsulado. La presentación clínica se diferencia de la sinusitis aguda en que los síntomas son menos intensos. Pueden predominar síntomas más generales e infespecíficos como fatiga, irritabilidad y malestar general sobre los síntomas locales. Puede requerir drenaje quirúrgico pero el tratamiento antibiótico es igualmente importante. Los mismos fármacos que en la sinusitis aguda, suelen ser efectivos en la sinusitis subaguda y crónica. Infecciones respiratorias agudas bajas (IRAB) BRONQUITIS AGUDA (BA) Es un trastorno inflamatorio traqueobronquial que suele asociarse con una infección respiratoria generalizada. Se presenta sobre todo durante los meses invernales. Este cuadro es de etiología viral en la gran mayoría de los casos siendo los agentes implicados con mayor frecuencia Rinovirus, Coronavirus, Influenza, Adenovirus. Otras causas menos frecuentes no virales son Mycoplasma pneumoniae y C. pneumoniae. Patogenia No se ha investigado la patogenia de la BA para todos los agentes causales. Durante la infección, la mucosa traqueobronquial se encuentra hiperémica y edematosa, las secreciones bronquiales son importantes. La destrucción del epitelio respiratorio puede ser extensa en algunas infecciones como por Influenza y ser mínima en otras, como los resfríos por Rinovirus. Es probable que la gravedad de la enfermedad aumente por exposición al humo del cigarrillo y contaminantes ambientales. Algunos estudios epidemiológicos apoyan la idea de que las infecciones bronquiales agudas recidivantes desempeñarían un papel en el desarrollo de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), al provocar junto con el cigarillo daño permanente. Manifestaciones clínicas Se presenta con tos inicialmente seca, luego productiva, con expectoración inicialmente mucosa que con los días se hace mucopurulenta. Puede haber roncus. A la auscultación pleuropulmonar puede haber estertores secos (roncus, gemidos o sibilancias), estertores subcrepitantes. No hay signos de consolidación pleuropulmonar. Los adultos pueden presentar fiebre en la BA causada por Influenza, Adenovirus y M. pneumoniae, no es frecuente cuando se asocia a Coronavirus y Rinovirus. Tratamiento No existe tratamiento específico, la mayoría de los pacientes se recuperan sin incidentes. El tratamiento es sintomático con antitermoanalgésicos, ambiente húmedo (si bien no existen pruebas de que esto abrevie el curso de la enfermedad, mejora los síntomas). La tos irritativa y paroxística puede causar molestias considerables y dificultar el sueño. Aunque la supresión de la tos puede aumentar el período de estado y favorecer la sobreinfección bacteriana secundaria, el empleo prudente y supervisado de antitusígenos (como la codeína) puede aliviar los síntomas. No deben utilizarse anihistamínicos porque desecan las secreciones y los expectorantes son ineficaces. Los antibióticos no abrevian la duración de la enfermedad ni disminuyen la incidencia de las complicaciones bacterianas, por lo cual no deben usarse en el tratamiento inicial de la BA. El hecho de que a veces los pacientes con episodios reci- 152 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA divantes mejoren con este tratamiento, sugiere que existe algo de participación bacteriana secundaria en estos pacientes. BRONQUIOLITIS Es una enfermedad viral del tracto respiratorio inferior que aparece en los dos primeros años de vida. Epidemiología y etiología La bronquiolitis muestra un patrón estacional definido con un aumento anual de casos en invierno hasta comienzos de la primavera, este patrón refleja la actividad de su agente principal, el VRS. Es una enfermedad frecuente durante el primer año de vida con una tasa de ataque entre los 2 y 10 meses de vida. Es más frecuente en varones con una relación 1.5 a 1. Son factores de riesgo para esta enfermedad la edad, especialmente en los primeros meses de vida, madre adolecente, hacinamiento, el número de hermanos. Según datos del Centro Hospitalario Pereira Rossell los ingresos hospitalarios por bronquiolitis representan el 34% en los meses de invierno, del 41% que representan en conjunto todas las IRAB. En 1999, con la finalidad de mejorar la calidad de la atención hospitalaria de los niños con IRAB y la eficiencia del uso de los recursos asistenciales, se implementó una estrategia que se denominó “Plan de invierno”. La misma se basó en la utilización de pautas de atención, diagnóstico y tratamiento. En esa oportunidad se estudiaron 226 niños con bronquiolitis obteniéndose diagnóstico etiológico en el 71.6% de ellos, siendo el VRS el agente aislado con mayor frecuencia (81%) coincidiendo con los datos internacionales. El segundo agente identificado fue Influenza (6%). Fisiopatología La patología de la bronquiolitis se concentra en el epitelio respiratorio. El virus se replica inicialmente en el epitelio de tracto respiratorio superior, pero en el lactante pequeño suele extenderse con rapidez hasta la vía aérea inferior. La inflamación temprana progresa rápidamente a la necrosis y luego se desprende. Como la resistencia al flujo aéreo se relaciona inversamente con el cubo del radio, esta inflamación y el edema hacen que las luces pequeñas de los lactantes sean particularmente vulnerables a la obstrucción. Los tapones de material necrótico pueden obstruir total o parcialmente las pequeñas vías aéreas. La constricción del músculo liso no parece ser importante en la obstrucción, razón por la cual no parecen mejorar con beta2 agonistas. En zonas periféricas a los sitios de obstrucción parcial el aire queda atrapado por un mecanismo valvular. Este hecho determina hiperinsuflación. En zonas con obstrucción total se producen zonas de atelectasias. Una respuesta inmune anormal puede contribuir en la patogenia de la bronquiolitis y a la hiperreactividad posterior de las vías aéreas como se observa en algunos niños, fundamentalmente en aquellos que requirieron internación. Algunos autores sugirieron que la IgE, la histamina y una respuesta celular anormal, desempeñan ciertos papeles en el desarrollo de la enfermedad. Los lactantes con IRAB por VRS presentaban IgE contra VRS e histamina en las secreciones nasofaríngeas con mayor frecuencia y en títulos más elevados que lactantes que tenían sibilancias por otras causas. La cantidad de IgE e histamina se correlacionó con la severidad del cuadro clínico. Otros mediadores se encontraron vinculados en la patogenia como el leucotrieno C4. Estos estudios sugieren que las sibilancias en un lactante con una IRAB en especial por VRS, pueden ser el resultado de una supresión alterada de la respuesta inmune celular o pueden ser aumentadas por ella. Entonces puede seguir una producción exagerada de IgE y otras respuestas celulares que evocan los mediadores de la inflamación de la vía aérea y el broncoespasmo. Estos hallazgos TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 153 también ayudan a explicar la tasa elevada de hiperreactividad persistente de la vía aérea y los episodios recidivantes de broncoespasmo en los niños que han tenido bronquiolitis. Manifestaciones clínicas Al inicio tos, rinitis serosa. Prodromo de uno a siete días, es común la fiebre, habitualmente leve, el compromiso del tracto respiratorio inferior aparece en dos a tres días con polipnea, irritabilidad, somnolencia, tos sibilante, emetizante, cianosante, aleteo nasal, quejido inspiratorio (obstrucción). A la auscultación, sibilancias y se observan tirajes. Algunas de las complicaciones pueden ser agudas, como apnea, sobretodo en recién nacidos, hipoxemia grave, paro hipóxico. Dentro de las crónicas, un 75% de los pacientes que han requerido internación presentarán episodios recidivantes de broncoespasmo. NEUMONIA AGUDA La neumonia es una enfermedad inflamatoria del parénquima pulmonar de etiología infecciosa, puede ser causada por bacterias, virus, hongos o parásitos. Es una enfermedad frecuente. La frecuencia relativa de cada agente etiológico varía de acuerdo a muchos factores, tales como la edad del paciente, la existencia de enfermedades asociadas y el contexto en que se adquiere la infección (comunidad, hospital, residencia de ancianos), entre otros. Así mismo estos factores influyen en la clínica, la radiografía, la selección del tratamiento, la evolución, las complicaciones y el pronóstico de la enfermedad. Se caracteriza por fiebre, sintomatología respiratoria variable y la aparición de infiltrados en la radiología. Por lo tanto esta entidad es de diagnóstico clínico, radiológico y evolutivo. En las edades extremas de la vida su incidencia es mayor que en el resto de la población y es en estos pacientes en quienes tiene consecuencias más graves. Representa un problema relevante en salud pública, tanto en sus aspectos sociales como económicos: elevada morbimortalidad, altas tasas de hospitalización, estadía hospitalaria prolongada, costos elevados. Ante la dificultad diagnóstica para establecer una etiología en la mayoría de los casos, en las últimas décadas se han utilizado clasificaciones en base a las características clínicas y al tipo de población afectada. Según las pautas propuestas por la Asociación Americana de Tórax (ATS - 2000) se distinguen tres grupos. 1. Neumonia aguda comunitaria (NAC): en este grupo deben diferenciarse las poblaciones según edad (niños y mayores de 65 años), comorbilidad como insuficiencia cardíaca congestiva (ICC), EPOC; y factores modificadores de la enfermedad, entendiendo por tales aquellas condiciones que incrementan el riesgo de infecciones por patógenos específicos (S. pneumoniae resistente a penicilina, bacilos gramnegativos, Pseudomonas). 2. Neumonia aguda intrahospitalaria: se considera aquella producida en pacientes ingresados luego de 72 hs o en pacientes que luego del egreso nosocomial inician los síntomas hasta el séptimo día del alta. 3. Neumonia en inmunodeprimidos: un subgrupo especial comprende los pacientes con SIDA, en tratamiento quimioterápico u otra inmunodepresión, en donde los agentes responsables del proceso son diferentes. Etiología Nos centraremos brevemente en los microorganimos responsables de la NAC. La distribución y frecuencia de los agentes son muy diversas, según el lugar donde se realiza el estudio y la metodología diagnóstica empleada; pese a ello en la mayoría de las series se mantiene a S. pneumoniae como la primera causa, seguido en frecuencia por H. influenzae, Mycoplasma 154 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 2. Se observan las partículas aerolizadas en el estornudo pneumoniae, Legionella pneumophila, Chlamydia pneumoniae, Moraxella catarrhalis y virus Influenza A. Más del 90% de las NAC son producidas por estos agentes. Legionella no se había encontrado en nuestro país como agente de neumonía hasta el año 2002 en que se confirmó el primer caso. Desde entonces se han diagnosticado casos con muy escasa frecuencia. Los virus respiratorios son los agentes etiológicos más importantes durante los primeros años de vida. A M. pneumoniae le corresponde el papel etiológico predominante en las neumonías de los niños en edad escolar y adolescentes. H. influenzae tipo b también ha sido responsable antiguamente de neumonías bacterianas en los niños, actualmente se identifican muy pocos casos gracias al empleo en el esquema nacional de vacunación de la vacuna antes mencionada. Staphylococcus aureus representa entre el 2% y 5% de los casos, adquiere importancia en ancianos y como complicación poco frecuente luego de una gripe. Un problema de gran actualidad es la emergencia de Staphylococcus aureus meticilino-resistente comunitario (CA-SAMR) portador de leucocidina de Panton-Valentin (PVL) que causa neumonías necrotizantes graves incluso en personas sanas sin enfermedades de base. Este problema que se observaba en otras partes del mundo desde hacía ya algunos años, se presentó de forma inesperada en nuestro país, siendo un problema sanitario muy mediático por haber causado cierto número de muertes, por neumonías y también a partir de infecciones de piel y partes blandas, en personas jóvenes previamente sanas. Los bacilos gramnegativos representan entre 5% y 10%, son agentes particularmente importantes en residentes en hogares de ancianos y alcoholistas. Patogenia En ausencia de enfermedad los mecanismos de defensa pulmonares normales mantienen estériles las vías aéreas infraglóticas. En este punto debemos recordar que los pacientes fumadores y bronquíticos crónicos suelen estar colonizados por flora orofaríngea por debajo de la glotis. El desarrollo de una neumonia implica un defecto en las defensas del huésped, la virulencia del agente patógeno o de un inóculo microbiano importante. La vía de llegada de los microorganismos al parénquima pulmonar es por vía canalicular descendente por microaspiraciones o a través de material aerozolizado, por ejemplo por un estornudo (virus respiratorios, Mycobacterium tuberculosis) (ver figura 2) Para que los microorganismos alcancen el parénquima pulmonar deben sortear una serie de barreras anatómicas y mecánicas, el sistema inmune humoral y celular y la actividad fagocítica. La mucosa nasal contiene epitelio cilíndrico ciliado y células productoras de moco TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 155 que forman una barrera de defensa. En la orofaringe, además del aparato mucociliar que arrastra en forma mecánica los microorganismos y los elimina por medio de la deglución; representan mecanismos de defensa el eflujo de saliva, el pH, la producción local de complemento y la IgA secretoria. La adherencia de los gérmenes a las superficies epiteliales de las vías aéreas superiores es un paso esencial en la colonización y posterior infección. Los microorganismos poseen mecanismos de adhesión, ya sean virus (como la hemaglutinina de influenza) o bacterias (pilis, adhesinas, exotoxinas, enzimas proteolíticas que degradan IgA, etc). La tos y el reflejo epiglótico contribuyen para que la mayor parte de las partículas grandes no alcancen las vías aéreas centrales. A nivel de tráquea y vías aéreas de conducción los microorganismos se encuentran con la segunda línea de barrera mucociliar, donde quedan atrapados. Si superan estos sectores alcanzan las vías aéreas terminales y alvéolos, donde no hay aparato mucociliar. Otros mecanismos defensivos son el líquido de revestimiento alveolar que contiene surfactante, fibronectina, IgG, complemento. También existen ácidos grasos libres, lisozima, proteínas fijadoras de hierro que pueden ser altamente microbicidas. Las células fagocíticas están constituidas por los macrófagos alveolares. Cuando los gérmenes superan estos mecanismos defensivos y la capacidad de los macrófagos para fagocitarlos, estos se convierten en mediadores de la respuesta inflamatoria y producen factores quimiotácticos (IL1, IL6, TNFα, IL8, C5, LT4) para los neutrófilos en el sitio de infección. La presencia de IgG específica estimula la activación de la vía clásica del complemento, fundamental en la respuesta antibacteriana. La inmunidad mediada por células representa un papel fundamental en las infecciones intracelulares (virus, Mycoplasmas, Chlamydias, Legionella, Mycobacterium). Algunos factores interfieren en estos mecanismos y hay que tenerlos en cuenta para entender la patogenia de esta infección. Por ejemplo: las alteraciones en el nivel de vigilia (intoxicación alcohólica, convulsiones, fármacos depresores del sistema nervioso central, stroke, etc.) pueden comprometer el cierre epiglótico y conducir a la aspiración del contenido de la orofaringe. El humo del cigarrillo altera la función mucociliar y la actividad macrofágica. Las IRA altas virales, destruyen el epitelio respiratorio y alteran la quimiotaxis de los neutrófilos. El alcoholismo, además del trastorno de vigilia, disminuye el reflejo tusígeno, predispone a la colonización por bacilos gramnegativos, disminuye la movilización de neutrófilos, disminuye la secreción de IgA. Las manipulaciones sobre la vía digestiva y respiratoria también alteran los mecanismos de defensa: intubación orotraqueal, colocación de sonda nasogástrica, fibroscopias. Otros factores que alteran los mecanismos de defensa locales son el edema alveolar en la ICC, hipoxemia, acidosis, desnutrición, uremia, la edad (por inmadurez del sistema inmune en los lactantes o por envejecimiento en los mayores de 65 años), alteraciones en la producción de inmunoglobulinas (leucemia mieloide crónica, mieloma múltiple, síndrome nefrótico, etc.), trastornos subyacentes del aparato respiratorio (EPOC, bronquiectasias, fibrosis quística), compresiones extrínsecas (adenopatías, tumores broncopulmonares). En muchos casos no se logra identificar ninguno de los factores predisponentes mencionados, pero no olvidemos el rol fundamental de los factores de virulencia de los distintos microorganismos para agredir al huésped, destacando en particular S. pneumoniae (ver capítulo 17). Manifestaciones clínicas Como hemos mencionado, desde el punto de vista clínico se ha diferenciado clásicamente entre neumonia típica o bacteriana habitual, y atípica. Pese a que en la actualidad se pone en duda la especificidad global de los signos y síntomas con respecto a la etiología determinada, se considera útil mantener los citados subgrupos con fines didácticos. La neumonia típica, causada habitualmente por S. pneumoniae, H. influenzae, bacilos gramnegativos, S. aureus, 156 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Figura 3. Figura 4. se caracteriza por su comienzo brusco, aunque puede estar precedida de un cuadro catarral. Presenta chuchos de frío, fiebre alta (ausente en ancianos) y tos seca inicial, que luego se hace productiva con expectoración mucopurulenta o herrumbrosa. Se puede acompañar de dolor tipo puntada de lado y aleteo nasal. Al examen físico se presenta con aspecto tóxico, polipneico, febril, sudoroso y con signos de condensación parenquimatosa (vibraciones disminuídas, matidez, estertores crepitantes). En la radiología de tórax se observa un opacidad inhomogénea con broncograma aéreo y afecta a uno o varios segmentos pulmonares, pudiendo ocupar todo un lóbulo (ver figura 3). El término neumonia atípica se utilizó para designar aquellos cuadros que cursaban con signos clínicos diferentes a las neumonias causadas por bacterias y que no respondían al tratamiento antibiótico. Inicialmente se pensó que únicamente obedecían a una etiología viral, pero luego se comprobó que podían ser causadas por M. pneumoniae y Chlamydia pneumoniae. Suele iniciarse de modo insidioso con cefalea, astenia, escasa afectación del estado general, tos seca persistente y muy molesta o con escasa expectoración mucosa. Fiebre sin chuchos de frío, dolor torácico retroesternal que aumenta con la tos. Son frecuentes los síntomas extrarrespiratorios TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 157 como náuseas, vómitos, exantema cutáneo, artromialgias, rinorrea, disfonía, odinofagia. La auscultación pulmonar revela la presencia de crepitantes finos, aunque puede ser normal. En la radiografía se observa un patrón intersticial, con opacidad de tipo reticulonodular. Los lóbulos inferiores son los que se afectan más frecuentemente (ver figura 4). Una mención especial merece la neumonia en ancianos, es tres a cinco veces más frecuente y de mayor mortalidad (cercana al 30%), siendo la primer causa infecciosa de mortalidad en este grupo etario. Los agentes implicados con mayor frecuencia son S. pneumoniae, H. influenzae, Klebsiella pneumoniae, S. aureus, virus Influnza A y B, y en los últimos años se ha reconocido al VRS como un agente de importancia creciente en este grupo etario. La presentación clínica es más solapada y la sintomatología menos específica. En ocasiones se presentan con una taquicardia inexplicable y trastornos en el nivel de vigilia sin fiebre. La radiología puede presentarse con una opacidad más tenue que dificulte el diagnóstico. La curación y la resolución radiológica son más lentas, el pronóstico dependerá del retardo en el inicio del tratamiento, de la etiología y la presencia de comorbilidades. Diagnóstico etiológico El laboratorio de microbiología juega un papel esencial en el diagnóstico etiológico de neumonia. La etiología polimicrobiana es frecuente cuando las neumonias son de origen aspirativo, con predominancia de anaerobios o mixtas. También es frecuente en las neumonias intrahospitalarias, especialmente en las asociadas a ventilación mecánica. La capacidad del laboratorio de obtener un diagnóstico microbiológico depende de varios factores. a) Del tipo de muestra: las obtenidas por procedimientos invasivos (lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, lavado bronquial y aspirado endotraqueal) son mejores que la expectoración, contaminada con flora bucal y no siempre representativa de la infección pulmonar. b) De la calidad de la muestra: que provenga realmente del tracto respiratorio inferior con escasa contaminación con flora bucal, lo que es especialmente importante en la expectoración. c) Del agente etiológico: las neumonias causadas por bacterias aeróbicas presentan mayor porcentaje de confirmación que aquellas producidas por bacterias fastidiosas o que no se desarrollan en medios de cultivo convencionales y que requieren métodos serológicos para el diagnóstico (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae y Legionella pneumophila). d) Del transporte rápido y oportuno al laboratorio: una muestra de expectoración debe ser sembrada en los medios de cultivos adecuados idealmente antes de dos horas de obtenida, de lo contrario deben utilizarse medios de transporte adecuados. e) De la capacidad del laboratorio para reconocer una buena muestra y de establecer criterios de rechazo cuando la calidad no es aceptable. Es importante tener presente que entre 30% y 50% de las NAC persisten sin diagnóstico etiológico incluso cuando se efectúan esfuerzos en utilizar medios de cultivo adecuados e implementación de extensos protocolos serológicos y de técnicas de biología molecular; procedimientos con los que no cuentan en general los laboratorios de diagnóstico. Esto es especialmente importante en neumonias neumocócicas, en las que algunas series informan hasta un 45% de cultivos de expectoración negativos. Muestras de origen respiratorio Son expectoración espontánea o inducida, secreción traqueal, lavado broncoalveolar (LBA), 158 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA cepillado bronquial, lavado bronquial, aspirado endotraqueal, punción transtraqueal, tejido pulmonar. La tinción de Gram continúa siendo uno de los exámenes rápidos de mayor utilidad y bajo costo, ya que permite una aproximación diagnóstica para el inicio de la terapia adecuada, considerando que Streptococcus pneumoniae es el agente etiológico más frecuente en neumonias adquiridas en la comunidad, y que este agente presenta una morfología característica en la tinción de Gram. Se debe tener siempre presente que la muestra de expectoración puede estar contaminada con flora bucal, por lo que el informe de la calidad de la muestra es esencial para una adecuada interpretación. Según los criterios de la calidad propuestos por Murray y Washington, quienes establecieron criterios de calidad según la proporción de células inflamatorias (leucocitos polimorfonuclares > 25 por campo de menor aumento) en relación a las células epiteliales (contaminación por saliva <10), el laboratorio debe rechazar las muestras de mala calidad, ya que los resultados del cultivo no aportan al diagnóstico. Estudios posteriores han demostrado que en el caso de muestras de mala calidad, muy rara vez la solicitud de un nuevo especimen consigue superar la calidad del primero, por lo que no se justifica la solicitud de una segunda muestra. Es necesario considerar también que la predominancia marcada de un tipo morfológico especial de bacterias, permite una mejor aproximación diagnóstica: abundante cantidad de diplococos grampositivos sugiere fuertemente la presencia de S. pneumoniae, la predominancia de cocobacilos gramnegativos sugiere Haemophilus influenzae, la presencia de diplococos gramnegativos sugiere Moraxella catarrhalis. El cultivo aerobio en agar sangre con atmósfera de CO2, permite la recuperación de bacterias aerobias como S. pneumoniae, H. influenzae, Moraxella catarrhalis, S. aureus, K. pneumoniae y P. aeruginosa. Si la tinción de Gram no muestra predominancia de un tipo bacteriano, pero se observa abundante cantidad de células inflamatorias, debe sospecharse la presencia de bacterias fastidiosas o de agentes virales. Algunos laboratorios de microbiología tienen diseñados protocolos de cultivo expandidos cuando esta situación ocurre, incluyendo cultivos virales. A partir de las especies bacterianas identificadas en el cultivo se realizan estudios de susceptibilidad a los antimicrobianos en uso. (Ver capítulo 35) El cultivo para Mycoplasma pneumoniae requiere la inoculación de la muestra en un agar y caldo especial (SP-4) suplementado con anfotericina y colistina y una incubación al menos de 7 a 15 días. La observación de las colonias sospechosas debe realizarse por inmunofluorescencia u otras técnicas de tinciones específicas con anticuerpos marcados. Los cultivos en líneas celulares para bacterias nutricionalmente exigentes, si bien se consideran los métodos de referencia para bacterias deficitarias tales como Chlamydia pneumoniae (bacteria gramnegativa intracelular obligada), la recuperación de esta bacteria en cultivos celulares es extremadamente baja y son altamente laboriosas, por lo que no están disponibles en los laboratorios de microbiología clínica. Las bacterias anaeróbicas pueden ser causa de hasta un 10% de las neumonias adquiridas en la comunidad, sin embargo la obtención de la muestra dificulta la confirmación etiológica. El cultivo para anaerobios se reserva para cuando la sospecha de neumonia por aspiración es alta y existen los medios para realizar una punción transtraqueal o una punción pulmonar, ya que estas son las muestras aceptables para el cultivo anaeróbico. La broncoscopia con cepillo protegido ha mostrado ser útil para el estudio de anaerobios, sin embargo requiere un transporte rápido al laboratorio. Hemocultivos Se deben solicitar cada vez que exista sospecha de neumonia adquirida en la comunidad, ya que S. pneumoniae es el principal agente etiológico y entre un 15% y 25% de las neumonias TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 159 neumocócicas cursan con bacteremia. Además tiene implicancias en el pronóstico, dado que las neumonias con bacteremia tienen mayor mortalidad, especialmente en pacientes ancianos. Los métodos de detección de anticuerpos y de antígenos, así como la amplificación genética, no se consideran métodos de referencia y, en el caso de los que emplean la biología molecular, son de alto costo. Por esta razón deben reservarse para el diagnóstico de los siguientes agentes: Legionella pneumophila, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae y virus respiratorios. Para Legionella pneumophila se realiza la detección de antígeno urinario por enzimoinmunoanálisis (EIA). Tiene una especificidad cercana al 100% y una sensibilidad del 80% cuando se obtiene precozmente (dentro de la primera semana de la enfermedad), después disminuye progresivamente. Se ha descrito también un test de látex para detección de antígeno directamente en muestras respiratorias, pero la detección de antígeno urinario por EIA es más sensible. La detección de anticuerpos en suero se utiliza para detectar IgG mediante inmunofluorescencia indirecta. Para Chlamydia pneumoniae se detectan anticuerpos en suero. Los métodos más utilizados son la microinmunofluorescencia (MIF), que se considera el método serológico de referencia y el enzimoinmunoanálisis. Sin embargo, tanto la detección de anticuerpos IgG como IgM presentan el inconveniente de que se elevan tardíamente en el curso de la enfermedad (tres semanas para IgM y seis a ocho semanas para IgG), por lo que la sensibilidad no es alta. Se debe considerar también que los títulos persisten elevados durante largo tiempo (6 a 12 meses para IgM), lo que sumado a que un 60% de la población adulta posee títulos detectables de IgG sin estar cursando una infección activa, deja a la serología como una herramienta de utilidad epidemiológica más que clínica, si bien es el método más frecuentemente implementado en los laboratorios de microbiología clínica. En general, se consideran positivos títulos de IgG > o = 1:20 y títulos de IgM > o = 1:64. Las técnicas de biología molecular actualmente son los métodos más promisorios para el diagnóstico de neumonia por C. pneumoniae. La principal dificultad para evaluar la eficacia de la amplificación genética por PCR es la ausencia de un método de referencia contra el cual validar esta técnica. Además, no existe disponibilidad de sistemas comerciales que permitan una mejor reproducibilidad. Los estudios muestran que PCR detecta entre un 10% y 20% más de casos que el cultivo y un 20% menos que la serología, sin embargo si se consideran los resultados del PCR y el cultivo en conjunto, se detectan menos casos que con serología sola. Para Mycoplasma pneumoniae se detectan las aglutininas frías. Los títulos mayores de 1: 64 han sido asociados con infección por M. pneumoniae. Sin embargo, no son específicas ni sensibles: solo un 50% de los pacientes con neumonia por esta bacteria presentan este test positivo. Se han descrito falsos positivos para enfermedades linfoproliferativas, mononucleosis infecciosa, Influenza, sífilis, infección por Adenovirus y por L. pneumophila. La detección de anticuerpos en suero se considera el principal método de diagnóstico utilizado por los laboratorios clínicos. Actualmente el enzimoinmunoanálisis es el método de elección y está disponible como test rápido (ensayos tipo tarjeta). La sensibilidad para la detección de IgM es de 80% después de la primera semana de la infección, sin embargo la IgM puede persistir elevada hasta cuatro años. Con respecto a las técnicas de biología molecular, la PCR parece ser un método promisorio para el diagnóstico de neumonia por Mycoplasma, especialmente en niños, a partir de una muestra nasofaríngea. Tendría la ventaja sobre la serología de que es más precoz, pero no ha mostrado mejor sensibilidad que la serología, si bien es un método altamente específico. Para el diagnóstico de la neumonia viral remitimos al lector al capítulo de infecciones respiratorias. 160 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Tratamiento El tratamiento de las neumonias bacterianas debe ser precoz y orientado a la etiología probable, pero dado que esto rara vez se conoce con certeza, es habitual iniciarlo en forma empírica según la frecuencia de los agentes mencionados, y en base a la epidemiología de la resistencia antibiótica local. Los antibióticos más usados son los betalactámicos, son antibióticos bactericidas. Penicilina G: es activa contra la mayor parte de cepas de S. pneumoniae de nuestro medio, por lo que exceptuando las infecciones del sistema nervioso central, la gran mayoría de las enfermedades neumocócicas pueden ser tratadas con penicilina. Cuando S. pneumoniae es de sensibilidad intermedia (CIM entre 0,1 y 2 mg/l) la dosis de penicilina debe ser mayor (150.000 a 250.000 UI/Kg/día) o administrarse cefotaxime o ceftriaxona. Como S. pneumoniae es la causa más frecuente de la NAC típica, la penicilina sigue siendo el antibiótico de elección en ellas. Los factores de riesgo que hacen sospechar sensibilidad disminuida de S. pneumoniae son: edad mayor de 65 años, inmunodepresión, haber recibido betalactámicos en los tres últimos meses, vivir en casa de salud, mal medio socioeconómico, abuso de alcohol. Aminopenicilinas (ampicilina y amoxicilina): son igualmente activas contra S. pneumoniae sensible y de sensibilidad intermedia. Para la administración oral se prefiere amoxicilina que se absorbe mejor. Muchas cepas de Staphylococcus spp., H. influenzae, K. pneumoniae, E. coli, M. catarrhalis (productoras de betalactamasa) actualmente son resistentes a aminopenicilinas, por lo que no se recomienda su uso empírico cuando se sospecha que la infección está causada por esos gérmenes. La asociación con un inhibidor de la betalactamasa (ácido clavulánico o sulbactam) recupera la actividad de las aminopenicilinas frente a la mayoría de las cepas citadas. Las cefalosporinas de tercera generación son las cefalosporinas con mayor actividad contra bacilos gramnegativos. Ceftriaxona y cefotaxime son las más activas contra cocos grampositivos, con excepción de Enterococcus spp. y Listeria monocytogenes. Ceftazidime tiene actividad antipseudomona pero es poco activa contra S. aureus y otros cocos. Los macrólidos (eritromicina, claritromicina, azitromicina), están indicados cuando hay sospecha de NAC por “gérmenes atípicos”. Por no alcanzar concentraciones séricas suficientes, los macrólidos no deben usarse si hay sospecha de bacteriemia, ni tampoco en pacientes con enfermedad moderadamente severa o grave. Bibliografía • Behrman RE, Kliegman RM, Harbin AM. Nelson Tratado de Pediatría.15ª ed. Mejico. Interamericana, 1997. • Brown PD, Lerner SA. Neumonia adquirida en la comunidad. The Lancet (Ed. Esp.) 1999; 34 (3) 174181. • Donowitz GR., Mandell GL. Neumonia aguda. En Mandell, Douglas y Bennett. Enfermedades infecciosas. 1997: 682-98. Ed.Panamericana. • Douglas Campbell G. Commentary on the 1993 American Thoracic Society. Guidelines for the treatment of communitary-acquired pneumonia. Chest.1999;115-14S-18S • Gorbach SL, Barlett JG, Blocklow NR. 2ª ed. Saunders, Phyladelfhia, 1999. Infections of the lower respiratory tract. 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En niños menores de 2 años, la OMS define la diarrea como la producción de 3 o más deposiciones líquidas o semilíquidas en 12 horas, o de al menos una con sangre, mucus o pus. Tiene habitualmente un origen infeccioso, bacteriano, viral o parasitario. Este hecho no es a menudo reconocido por la población, las madres o aun los médicos: se adjudica el origen de la diarrea al calor, a intolerancia para algún alimento, a tóxicos químicos en brotes de toxiinfección alimentaria, etc. Involucra muchas veces alteraciones funcionales o inflamatorias a nivel intestinal, con frecuente repercusión gástrica, configurando una gastroenteritis. Estas afecciones tienen habitualmente un origen exógeno, con excepción de algunas formas de diarrea postantibioticoterapia. Incluso aquellas formas de diarrea causadas por E. coli son debidas a cepas de esa especie que no forman parte de la flora normal. Los patógenos que ingresan al tracto digestivo encuentran un conjunto de obstáculos para la colonización intestinal que incluyen la acidez gástrica, la motilidad peristáltica, la flora normal y su efecto de interferencia, la integridad estructural y funcional de la mucosa, la actividad de IgA secretoria luminal, los fagocitos parietales, etc. La posibilidad de sortear estas defensas y provocar enfermedad depende de los atributos patogénicos microbianos o de condiciones orgánicas del huésped que lo colocan en situación de desventaja. La diarrea infecciosa es una enfermedad de curso agudo, o persistente si dura 14 días o más. En términos generales es una entidad frecuente y habitualmente benigna: la letalidad es baja y se presenta sobre todo en pacientes debilitados (niños, desnutridos, inmunodeprimidos), pero la mortalidad tiene significación debido a la elevada morbilidad. Epidemiológicamente, tienen especial interés la diarrea en el niño y el lactante, por su potencial gravedad, y las llamadas toxiinfecciones alimentarias, que pueden dar lugar a brotes extensos. En la actualidad, es importante prestar atención a las diarreas en los pacientes VIH +, en los tratados intensamente con antibióticos, y mantener vigilancia sobre el cólera. Los microorganismos causales en las distintas situaciones son muchas veces los mismos, por lo cual los trataremos más adelante en conjunto. Presentamos, sí, los agentes etiológicos más frecuentes en cada proceso (cuadro 1), y una mención, a propósito de cada germen, de cual es su importancia relativa en cada situación. La diarrea infantil es una enfermedad endémica, esporádica o epidémica, donde la trans- 164 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA misión de los gérmenes es fecal-oral por contacto interhumano, fomites, o a través del agua y alimentos. Las toxiinfecciones alimentarias (ej.: salmonelosis a partir de mayonesa) son brotes que ocurren cuando dos o más personas que compartieron un alimento desarrollan, en un plazo que es habitualmente menor de 72 horas, enfermedad gastrointestinal o neurológica por presencia en el alimento de microorganismos o sus toxinas. En pacientes VIH + y en los tratados con antibióticos, los gérmenes responsables pueden tener el mismo origen que en las situaciones antevistas, o pueden ser de transmisión sexual o de fuente endógena. Cuadro 1. Agentes etiológicos bacterianos y virales más frecuentes en cada proceso Enfermedad diarreica infantil Escherichia coli EPEC EIEC ETEC STEC o VTEC Rotavirus A Campylobacter C. jejuni Shigella S. flexneri S. sonnei Otras Salmonella S. typhimurium S. enteritidis Toxiinfección alimentaria Salmonella S. enteritidis Otras Staphylococcus aureus Otros E. coli C. perfringens Campylobacter Shigella Enterobacter sakazakii Diarrea en pacientes con VIH(+) 1. Agentes habituales de diarrea: en niños, igual que en HIV(-); en adultos Shigella, Salmonella Campylobacter 2. CMV y Mycobacterium avium-intracellulare 3. Patógenos de transmisión sexual Diarrea post-antibioticoterapia Clostridium difficile TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 165 Figura 1. Mortalidad infantil por diarrea Diarrea infantil. Importancia Las enfermedades diarreicas constituyen en el mundo subdesarrollado, y en concreto en la mayoría de los países de América del Sur y Central, la causa más frecuente de enfermedad infantil después de las infecciones respiratorias. Se calcula que se producen mundialmente cerca de 1000 millones de casos por año, y se estima que cerca de 5 millones de niños mueren anualmente, la mayoría antes de los 2 años de edad. En nuestro país, en el marco del Programa de Control de Enfermedades Diarreicas apoyado por OPS, los programas locales de educación, prevención y rehidratación oral contribuyeron en los años 80 a reducir la morbilidad y la mortalidad por esta causa, que era de 3,6 por 1000 nacidos vivos en 1975. Un descenso adicional se produjo tras la campaña de prevención del cólera (1991-92), si bien los efectos de la misma se han atenuado actualmente. En la figura 1 se observa la evolución descendente de la tasa nacional de mortalidad infantil por diarrea (muertes en menores de 1 año por 1000 nacidos vivos). Casi todos los decesos se producen en el período postneonatal (28 días-1 año), y la tasa es actualmente menor de 0,5 y próxima a 0,25. Las tasas globales ocultan sin embargo importantes desigualdades y problemas. La morbilidad y la mortalidad son mayores en los sectores de población más desprotegidos (bajo nivel socioeconómico y cultural, zonas urbanas marginales y algunas de frontera). La incidencia de diarrea en menores de un año es promedialmente menor que un episodio por niño por año, en el conjunto del país, pero mostró ser cercano a cinco en un estudio realizado con nuestra participación en un barrio periférico de Montevideo. El riesgo de enfermedad depende de factores ambientales (es especialmente elevado en grupos poblacionales pobres, sin provisión segura de agua potable, sin saneamiento, y con escasa información y educación para la salud referida a higiene personal y alimentaria, regulación familiar y promoción de la lactancia materna) y de factores individuales dependientes de aquellos: la inmadurez e inexperiencia inmunológica del lactante, la falla frecuente de aporte de leche materna que constituye el alimento más completo durante los seis primeros meses de vida, y la desnutrición que se acentúa con la enfermedad creando un círculo vicioso. Los factores desencadenantes están representados por los diferentes microorganismos y parásitos que describiremos. Es una afección estacional. El 63% de los casos denunciados al MSP en los últimos años corresponde al período diciembre-marzo. Las internaciones son todavía frecuentes más tarde en el año. La mortalidad se asocia actualmente a los casos que evolucionan sin cuidados de rehidratación y realimentación, a las diarreas invasivas con repercusión sistémica o localizaciones extrain- 166 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA testinales, y a los procesos persistentes que ocurren en especial en lactantes procedentes de medio socioeconómico muy carenciado, con déficit nutricional previo y severa repercusión vinculada a la enfermedad. TIPOS. ETIOLOGÍA La enfermedad diarreica aguda se considera de tipo coleriforme (parecida al cólera) cuando cursa con heces líquidas, en general abundantes, sin sangre, mucus o pus. No se acompaña en general de fiebre, y los agentes causales que se localizan en el intestino delgado no provocan acción patógena ni reacción inflamatoria morfológicamente ostensible. No se observan leucocitos en las materias fecales. Los agentes causales en el niño son habitualmente E. coli enteropatógeno o enterotoxigénico, Rotavirus, Cryptosporidium u otros microorganismos. Hablamos de diarrea de tipo invasivo o disenteriforme cuando se presenta con materias líquidas o semilíquidas acompañadas de la emisión de sangre, mucus o pus, y presencia de leucocitos en la observación microscópica, en especial cuando es causada por Shigella. Se puede asociar con fiebre, alteraciones morfológicas e inflamatorias a nivel del colon, y extensión extraentérica de entidad y frecuencia variables. Los microorganismos responsables son Shigella, Campylobacter, Salmonella, E. coli enteroinvasor, Yersinia enterocolitica o parásitos de diverso tipo. La persistencia de la diarrea no parece vincularse con grupos especiales de agentes patógenos, ni con situaciones de multiparasitismo, sino con factores defensivos, constitucionales o ambientales de otro tipo. La diarrea intrahospitalaria no está asociada en especial a patógenos invasivos o especialmente agresivos, sino a condiciones de manejo de los pacientes que favorecen la infección cruzada y la persistencia de los gérmenes en el ámbito nosocomial. Puede ser causada por bacterias de distinto tipo, virus o parásitos. Cuando son bacterias las responsables, pueden sin embargo poseer particular resistencia a los antibióticos seleccionada por su exposición reiterada a los mismos. En las diarreas infantiles agudas o persistentes, de modo similar que en países desarrollados, predomina actualmente Rotavirus. El agente patógeno bacteriano más frecuentemente identificado es E. coli patógeno entérico, en especial de los grupos enteropatógenos O111, O119 y O55, que predominaron localmente en los últimos 30 años. En diarreas con sangre, Shigella es el patógeno más frecuentemente aislado. En los países pobres, aún cercanos, los patógenos bacterianos o parasitarios son predominantes. Toxiinfección alimentaria Ya hemos definido el concepto. Se presenta habitualmente como brotes de gastroenteritis de origen común, donde el alimento y sus características operan como factor determinante sobre la relación huésped-germen. No es siempre sencillo deslindar esta forma epidemiológica de las gastroenteritis llamadas “esporádicas”, o de los brotes producidos por transmisión fecaloral, de persona a persona, en especial porque algunos de los patógenos involucrados pueden difundir de uno u otro modo. El concepto de toxiinfección alimentaria es más restringido que el de enfermedad infecciosa de origen alimentario, que puede incluir patologías tan diversas como la tuberculosis de origen bovino, la listeriosis, la brucelosis, la fiebre Q, estreptococias, encefalitis espongiforme bovina y enfermedad de Creuzfeld-Jacob humana. Otras veces el mismo germen de origen alimentario puede provocar (ej.: Enterobacter sakazakii) enfermedad digestiva o en localizaciones extraintestinales: meningitis, sepsis. Las toxiinfecciones alimentarias son así llamadas porque pueden presentarse como procesos infecciosos intestinales donde intervienen toxinas de síntesis y acción local (enterotoxinas de E. coli o de C. perfringens). TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 167 Alternativamente pueden presentarse como infecciones (virales, por ej.) sin intervención de toxinas, o como verdaderas intoxicaciones, donde las toxinas están preformadas en el alimento (S. aureus). No consideraremos expresamente en este capítulo los procesos provocados por la ingestión de toxinas de protozoarios dinoflagelados concentradas en moluscos (marea roja); tampoco nos referiremos a la enfermedad provocada por micotoxinas o por giardias u otros parásitos. El alimento que da origen a la toxiinfección puede ser simple vector que provee protección o permite la supervivencia de los patógenos que contiene (puede ser el caso de Campylobacter, Shigella, virus, Vibrio), o puede operar también como sustrato de multiplicación de los mismos, como sucede con los agentes etiológicos más frecuentes: Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Clostridium botulinum. La toxiinfección alimentaria es la causa más frecuente de enfermedad transmitida por alimentos, contra la opinión habitual, no informada, que jerarquiza la incidencia de los tóxicos químicos. Es habitualmente benigna y autolimitada. Sin embargo, su estudio es importante por varias razones: a) la alta morbilidad, desconocida con precisión en nuestro país, aunque algunos brotes recientes la han confirmado; b) la letalidad elevada del botulismo, y la gravedad de las gastroenteritis en los niños pequeños (los brotes suelen afectar a personas de diversa edad y condición previa de salud); c) la luz que arroja sobre la higiene en la producción y manejo de los alimentos, con las implicancias económicas que esto tiene en un país donde ellos representan buena parte de las exportaciones. El principal factor de riesgo de toxiinfección consiste, en nuestro medio, en el calentamiento inadecuado o insuficiente del alimento (cocción o tratamiento térmico previo tipo pasteurización, por ej.). Si este factor de riesgo se tiene en cuenta y se elimina, la mayor parte de los brotes se previenen. En nuestro país, las toxiinfecciones alimentarias más frecuentes son: a) las salmonelosis, con período de incubación habitualmente mayor de 10 horas, por consumo de mayonesa no pasterizada y no acidificada, o de derivados cárnicos mal cocidos; y b) las toxiinfecciones estafilocócicas, con vómitos y gran malestar que aparecen en menos de 6 horas, por consumo de derivados lácteos no pasterizados, en los cuales el germen ha proliferado y producido su toxina termoestable. Ambos tipos de proceso son prevenibles con temperatura adecuada de preparación de los alimentos, y lo son también la mayoría de los otros procesos posibles, incluyendo el botulismo, pues aunque C. botulinum es una bacteria esporulada y resistente, la toxina botulínica es proteica y termolábil. La actual promoción del consumo de alimentos “naturales” no tratados, no desinfectados, no cocidos, y de alimentos “precocidos” localmente o importados sin controles rigurosos, colide con la prevención planteada, inclusive en el marco de la difusión latinoamericana del cólera. Otras fuentes de riesgo importantes son la temperatura inadecuada de mantenimiento de los alimentos (la refrigeración detiene la proliferación microbiana), el origen inseguro de los mismos (animales infectados, por ej.), la falta de higiene de manipuladores y equipos, entre otros. El cuadro 2 esquematiza los tipos de toxiinfección alimentaria que es posible diferenciar en función del tiempo de incubación, presencia o no de fiebre, vómitos y cólicos, tipo de diarrea, síntomas neurológicos y otros. Diarrea en el paciente VIH + En este grupo de personas la diarrea forma parte de un conjunto de afecciones digestivas, que se presentan con frecuencia a nivel esofágico, gástrico, hepatobiliar e intestinal. Son comunes las diarreas abundantes con dolor abdominal y pérdida de peso. Se asocian en general con alteraciones observables de la mucosa intestinal, que en la mayoría de los casos están 168 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Cuadro 2. Tipos de toxiinfección alimentaria Gérmenes Tiempo de incubación Vómitos Cólicos Diarrea Fiebre Síntomas neurológicos Salmonella, Shigella, Campylobacter, EIEC, Y. enterocolitica, V. parahemolyticus 10-72 h + + Disenteriforme + (-) V. cholerae, ETEC 6-72 h (+) + Líquida - (-) V.C. ++ S. aureus, B. cereus <6h ++ + + - - C. perfringens B. cereus 6-16 h (-) + + (-) (-) VTEC o STEC 72-120 h - + c/sangre - (+ -) C. botulinum 6-36 h + - (+ -) - ++ relacionadas con patógenos reconocidos, aunque a veces se interpretan como vinculadas a la misma infección por el VIH. Los gérmenes involucrados son de tres tipos: a) agentes habituales de diarrea como Rotavirus y E. Coli enteropatógena (en niños); Salmonella, Shigella y Campylobacter entre las bacterias, o parásitos como Cryptosporidium, Giardia Lamblia y otros; b) Citomegalovirus y Mycobacterium avium-intracellulare, presentes en lesiones identificables por biopsia a nivel del delgado o del colon; c) patógenos colorrectales transferibles por vía sexual: Neisseria gonorrhoeae, Herpes Simplex, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, agentes de lesiones ulceradas en el intestino distal. En el paciente VIH + estas infecciones dan lugar a procesos severos, persistentes o recurrentes, y con frecuencia invasivos, originando bacteriemias y localizaciones secundarias de Salmonella, Campylobacter, Neisseria y otros. No contamos en el país con estudios sistemáticos, etiológicos y epidemiológicos, sobre diarrea en pacientes VIH +, como se han realizado sobre la población pediátrica. Diarrea en el paciente tratado con antibióticos El tratamiento con antibióticos no está indicado como rutina en el paciente con diarrea, donde lo fundamental es la reposición hidroelectrolítica y la realimentación. Contribuye sí a la recuperación en el enfermo de cólera, en diarreas invasivas como las producidas por Shigella y a veces por Campylobacter, y en situaciones donde la evolución clínica hace temer una infección sistémica (ej.: salmonelosis en el lactante o en el paciente VIH +). Se ha culpado incluso a la antibioticoterapia por la prolongación de la excreción fecal de Salmonella tras la infección clínica, o por la complicación con síndrome hemolítico urémico de la infección intestinal por E. coli verotóxico. En estos casos, la eliminación de la flora normal parece ser la causa del efecto indeseable de los fármacos. El tratamiento antibiótico instituido por otras causas (infección respiratoria, urogenital, postquirúrgica, etc.) puede dar lugar a alteración de la flora intestinal e instalación de una enterocolitis seudomembranosa que puede resultar una complicación fatal. Clindamicina, ampicilina, cefalosporinas y varios otros antibióticos pueden originar esta enfermedad, independientemente de la dosis, vía o duración del tratamiento. En décadas pasadas se atribuía a 169 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA S. aureus la responsabilidad por esta afección, pero estudios realizados durante la década del 70 culminaron en la demostración de que el agente causal es habitualmente Clostridium difficile, y que el tratamiento con vancomicina o metronidazol puede contribuir a controlarla. Agentes de gastroenteritis Entre los agentes que se han identificado como causa de diarrea, encontramos bacterias, virus y parásitos. Nosotros pondremos énfasis en los primeros, aunque no podemos olvidar que existe un porcentaje no despreciable de casos que son debidos a parásitos de organización más compleja. Entre los agentes bacterianos más frecuentemente aislados como causa de gastroenteritis podemos distinguir dos grandes grupos: los bacilos gramnegativos y las bacterias grampositivas, dentro de las cuales encontramos formas cocoides, como el género Staphylococcus y formas bacilares, como el género Clostridium. Dentro del primer grupo hallamos los géneros y especies que causan más frecuentemente enteritis, como E. coli enteropatógena (EPEC), Campylobacter spp., el género Shigella, Salmonella, E. coli enterotoxigénica (ETEC), etc. Otras aisladas menos frecuentemente son: E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enterohemorrágica, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Aeromonas spp., etc. En el segundo grupo destacamos a Staphylococcus aureus por un lado, y por otro a Clostridium perfringens y Clostridium botulinum, gérmenes anaerobios que en situaciones particulares ocasionan cuadros de toxiinfección alimentaria. Cuadro 3. Familia Género Enterobacteriaceae Salmonella Shigella Escherichia Yersinia Vibrionaceae Vibrio Aeromonas Plesiomonas Campylobacteriaceae Campylobacter Cuadro 4. Enterobacteriaceae Vibrio Campylobacter Bacilos Forma de coma Forma de alas de gaviota o espirilos Facultativos Facultativos Microaerófilos y capnófilos Fermentan la glucosa Fermentan la glucosa No fermentadores Oxidasa negativos Oxidasa positivos Oxidasa positivos Móviles peritricos o inmóviles Móviles por flagelo polar Móviles por flagelo polar 170 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA SHIGELLA Las características de estas bacterias y su patogenia ya han sido descritas (ver capítulo 4). Su reservorio es el ser humano. Se localizan fundamentalmente a nivel del colon, y provocan diarrea disenteriforme, con presencia característica de abundantes leucocitos en el frotis de materias fecales. Son los principales agentes de diarrea con sangre (20% a 25% de los casos en niños), y sus infecciones mejoran con el tratamiento antibiótico. La especie prevalente, S. flexneri, es actualmente resistente a ampicilina y cotrimoxazol, por lo cual el tratamiento de las shigelosis se hace con otros antimicrobianos como la ceftriaxona en niños o las quinolonas en adultos. ESCHERICHIA COLI • El término EPEC fue usado por primera vez por Neter y col. en 1955. Es la primera clase descrita de E. coli causante de diarrea, y la más frecuente en nuestro país, en especial en lactantes. Se han descrito brotes en servicios de recién nacidos. Pertenecen a 10 a 15 serogrupos característicos, de los cuales los más comunes localmente son O111, O119 y O55. Fue menospreciado como agente de diarrea cuando se descubrieron las cepas enterotoxigénicas, pero nuevos estudios confirmaron que se trata de una clase patogénica definida y diferente que interactúa con las células eucariotas del epitelio intestinal por medio de puentes proteicos con estructura similar a jeringas de inyección, que forman parte del sistema de secreción bacteriano tipo III. Se ha confirmado en varias cepas locales, de los serogrupos prevalentes, la presencia del plasmidio de virulencia EAF característico, de 60 Mda, el patrón típico de adherencia localizada sobre células Hep-2 de cultivo, y la presencia (por PCR) de los genes de virulencia bfp (pili) y eae (intimina). Cuando un lactante está cursando una diarrea asociada a esta clase de E. coli, casi todas las colonias identificables en materias fecales pertenecen a la cepa involucrada: se anula la diversidad habitual de serotipos. Algo diferente ocurre con ETEC, y sobre todo con VTEC, que son eliminados en combinación con cepas de la flora normal, en proporción variable según el momento evolutivo del proceso. Buena parte de los cultivos de EPEC aislados en el Hospital Pediátrico presentan resistencia a múltiples antimicrobianos. • ETEC. Son agentes muy comunes de diarrea en lactantes de países pobres, y de diarrea del viajero, así llamada porque afecta a habitantes de países desarrollados que se trasladan a zonas carenciadas. Tienen especial significación patogénica las cepas productoras de LT y ST, o de ST solo. Las bacterias que forman únicamente LT se recuperan con frecuencia similar en lactantes sanos y enfermos. En nuestro país, ETEC se aísla con menor frecuencia que EPEC, pero mayor que otras clases de E. coli patógeno entérico. Sus determinantes patogénicos (fimbrias y toxinas) están codificadas en plásmidos transferibles por lo que se encuentran en diversos serogrupos y serotipos de E. coli. • EIEC. En nuestro medio hemos aislado pocos cultivos de EIEC de serogrupo O29 y O124. • VTEC. Algunos serogrupos de E. coli como 026, 0111, O157, O145 y otros, tienen en común con Shigella dysenteriae tipo I la producción de sustancias proteicas de acción local y sistémica. Son llamados STEC, VTEC o EHEC. La infección por STEC puede ser asintomática, o puede traducirse en diarrea líquida, diarrea con sangre por colitis hemorrágica, síndrome hemolítico urémico (SUH) o púrpura trombótico trombopénico. Los gérmenes ingresan al organismo por vía digestiva, y colonizan el intestino grueso. La dosis infectante es pequeña (<1000) como la de Shigella, y la transmisión puede ser interhumana por vía fecal-oral, o tener como vehículo el agua o alimentos: carne bovina TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 171 mal cocida u otras, leche, jugos, etc. El período de incubación puede ser hasta de siete días. La colitis hemorrágica producida por VTEC (que precede muchas veces al SUH) se acompaña de escaso componente inflamatorio y habitualmente no presenta fiebre o emisión de leucocitos fecales como otras diarreas invasivas. No están claros los factores que facilitan su eventual progresión a SUH. Se han mencionado el genotipo microbiano, el uso de antiperistálticos y la densidad y tipo de receptores fosfolipídicos Gb3 que abundan en las células endoteliales del intestino, en el tejido renal y en el encéfalo. El tratamiento antibiótico ha sido presentado reiteradamente como causa predisponente, y es discutida su efectividad para controlar la infección, por lo cual debe evaluarse cuidadosamente su aplicación. El síndrome hemolítico urémico es una afección presente en todo el mundo que se define por la tríada: insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia. Es endémico en el Río de la Plata, en especial en Argentina, donde se producen en promedio 10 casos anuales por cada 100.000 niños menores de 5 años. En nuestro país la cifra se aproxima a 4 (10-14 casos anuales). Ocurre en especial en niños menores de cinco años, en quienes constituye la principal causa de falla renal aguda. El promedio de edad constatado en Uruguay es de 11 meses aproximadamente. Los casos se presentan en general desde la primavera hasta el otoño. La infección por VTEC es una zoonosis, aunque existe transmisión importante interhumana. En Uruguay no hemos constatado, como en otros países, epidemias de origen alimentario. El SUH se manifiesta en especial en niños del interior del país, aunque no de zona rural, y no particularmente carenciados o desnutridos. Como antecedente patológico inmediato presentan en general diarrea, habitualmente con sangre. El comienzo de la enfermedad es usualmente brusco, con instalación súbita de inquietud, palidez intensa y oliguria, en general sin fiebre. Se observan con frecuencia petequias, pero raramente sangrado franco extradigestivo. Puede haber hipertensión, alteraciones hepáticas o cardíacas, y manifestaciones neurológicas (somnolencia, irritabilidad, ataxia, convulsiones, coma), que son graves en 1/5 a 1/3 de los casos, y se interpretan como secundarias a las alteraciones hidroelectrolíticas, la hipertensión y la microangiopatía encefálica. La mitad de los pacientes necesitan diálisis. La letalidad resultante es menor de 5%, pero se pueden presentar secuelas significativas. Al menos 2 de cada 100 pacientes progresan a la insuficiencia renal extrema, que requiere diálisis crónica. SALMONELLA En el lactante Salmonella produce diarrea líquida o diarrea de tipo disenteriforme, con o sin presencia de sangre en materias fecales. La patogenia de estas infecciones ha sido discutida en el capítulo 4. Hemos contribuido a estudiar en niños hospitalizados un conjunto de casos de diarrea con sangre por coinfección con Salmonella y Campylobacter jejuni. Salmonella es localmente el agente principal de toxiinfección alimentaria. La conservación de los alimentos a temperaturas inadecuadas favorece la proliferación de los gérmenes indeseables. La dosis infectante es en general alta para el adulto (105-107), y menor en el niño, en especial el lactante. El período de incubación de la enfermedad es de 8 a 48 horas. El paciente presenta náuseas, vómitos, fiebre, diarrea y cólicos abdominales. La duración habitual de la enfermedad es de uno a cuatro días, pero se puede prolongar. El hallazgo del germen en heces y en el alimento confirma la etiología. YERSINIA ENTEROCOLITICA Es un bacilo gramnegativo de la familia Enterobacteriaceae, causante de diarrea aguda y diarrea 172 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA persistente. En nuestro país no se investiga en la rutina clínica, y son escasos los aislamientos clínicamente significativos, obtenidos en programas de investigación. La mayor parte de las cepas utilizan tardíamente la lactosa y desdoblan la urea, apareciendo en placas de aislamiento sobre agar Mac Conkey como colonias débilmente rosadas y con olor ligeramente amoniacal, visibles en 24 horas sólo por cultivo a 25-28ºC, no a 37ºC. CAMPYLOBACTER Es un género de bacilos gramnegativos exigentes, microaerófilos, de forma curva semejante a una “gaviota”, o de aspecto espirilar, muy móviles y capaces de atravesar filtros de pequeño poro. La especie C. jejuni es la responsable de más del 95% de los casos de diarrea por Campylobacter. Es agente común de diarrea aguda comunitaria (EPEC, Rotavirus, Campylobacter, etc.). En niños hospitalizados es la causa más frecuente de diarrea con sangre, después de Shigella. Las infecciones por este germen predominan en verano, pero se siguen observando en otoño y ya iniciados los fríos. C. jejuni es habitualmente sensible a macrólidos y quinolonas, y resistente a betalactámicos y otros antibióticos, propiedad que se utiliza para su cultivo selectivo. VIBRIONACEAE La familia Vibrionaceae (nombre derivado de su movilidad “como vibrando”) incluye varios géneros. El más relevante en relación con gastroenteritis es el género Vibrio. V. CHOLERAE Fue descrito por Koch en 1883 como agente del cólera. Pocos años después, en 1886, se producía en Uruguay una epidemia que tuvo origen en habitantes de Buenos Aires, infectados a su vez por viajeros procedentes de Europa. Las fuentes comunes de infección en Montevideo fueron los depósitos de agua del actual Hospital Pasteur y de un cuartel del Buceo, y los estudios microbiológicos fueron realizados en el laboratorio que luego sirvió de base al Instituto de Higiene Experimental, inaugurado en 1896. En regiones de América que han desarrollado buen acceso de los pacientes a atención primaria y rehidratación, la letalidad de la enfermedad no pasa del 1%. En Nigeria, en cambio, la letalidad ha superado el 10%. La fuente principal de los brotes sigue siendo el suministro de agua contaminada. La dosis infectante para la persona normal es habitualmente alta (104-108). Es impensable que no haya llegado en algún momento a Uruguay, en los últimos años, un viajero enfermo o portador de V. cholerae (hay 10 a 40 infectados asintomáticos por cada enfermo, y la excreción fecal puede prolongarse por tiempos variables). Lo que ha ocurrido probablemente es que las condiciones y medidas de salud pública locales han impedido su difusión a través del agua, alimentos, o de persona a persona. Cuando el germen ingresa en una región virgen de infección, todos los grupos etáreos son igualmente afectados. En zonas endémicas, la incidencia es máxima en niños mayores de dos años, sin inmunidad adquirida activa o pasivamente (transplancentaria, lactancia). De acuerdo a los bajos niveles séricos prevalentes de anticuerpos vibriocidas, y al tipo sanguíneo predominante en nuestra población (tipo “O”, 46%, el más susceptible), los uruguayos son potencialmente vulnerables a la infección con V. cholerae. Desde 1991 hemos incorporado en la rutina de estudio coprobacteriológico en el Departamento de Bacteriología y Virología la investigación de Vibrio en TCBS. Tras cientos de estudios, no hemos aislado en ningún paciente la cepa epidémica. De un lactante hospitalizado con diarrea se recuperó V. cholerae no O1, no toxigénico. Otras especies, como V. parahemolyticus o V. fluvialis, que producen gastroenteritis por ingestión de agua contaminada o productos del mar, no han sido investigadas en forma TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 173 cuidadosa en nuestro medio. Las cepas de V. cholerae prevalentes en América pertenecen al biotipo El Tor. Este difiere del clásico en algunas propiedades bioquímicas (VP), capacidad de hemaglutinación, hemólisis, sensibilidad a bacteriófagos y a Polimixina B en disco de 50 µg. Este biotipo presenta a su vez variantes. Como las cepas comunes de la séptima pandemia, V. cholerae El Tor que circula en Sudamérica es no hemolítica. El reservorio de V. cholerae es humano. La sobrevida del germen en el ambiente (agua, alimentos, suelo) es variable, pero en general corta: horas o pocos días. Hay sin embargo evidencias de que ciertas cepas de V. cholerae O1 biotipo El Tor pueden persistir en un reservorio ambiental. Desde 1973 se ha informado sobre casos esporádicos de cólera en la costa del Golfo de México, asociados con la ingestión de mariscos crudos o cocidos incompletamente. En octubre de 1992 se observaron en la India casos de cólera que no eran producidos por V. cholerae O1, sino por el serogrupo O:139. Se diseminó en forma epidémica en los alrededores de Bangladesh produciendo en pocos meses cientos de miles de casos que afectaron fundamentalmente a menores de 15 años. El agua es su vehículo principal de transmisión. La patogénesis es similar a la de la enfermedad producida por V. cholerae O1. El germen es igualmente toxigénico. Un hecho llamativo es que V. cholerae O:139 puede expresar un polisacárido capsular análogo al descripto en otros Vibrio O1. Clínicamente, se ha visto que a diferencia de V. cholerae O1, puede causar infección extraintestinal en pacientes inmunocomprometidos. La metodología para aislarlo es idéntica a la que se utiliza para V. cholerae O1. Para identificación debe tenerse en cuenta que no es sensible al compuesto vibriostático O129. La exposición a V. cholerae O1 protege contra la reinfección, pero no previene la enfermedad por V. cholerae O139, lo cual debe tenerse en cuenta para la eventual inmunización activa. El período de incubación del cólera es de 12 a 72 hs, dependiendo de la dosis infectante y de factores personales y microbianos. Tienen mayor riesgo de enfermar las personas con hipoclorhidria gástrica. El sitio primario de infección es el intestino delgado. La pérdida de fluidos es máxima a nivel del yeyuno. La infección es tópica, no invasiva y no inflamatoria. (Ver capítulo 4) Los signos prominentes de la enfermedad son la diarrea líquida abundante (agua de arroz) y la deshidratación, a veces acompañadas de dolores cólicos y vómitos. Sin tratamiento antimicrobiano, la diarrea persiste cuatro a seis días. La muerte puede sobrevenir por hipoglicemia, disbalance hidroelectrolítico extra e intracelular que afecta la función celular, hipoperfusión de órganos críticos, insuficiencia renal, arritmias y shock. AEROMONAS HYDROPHILA. A. CAVIAE Son bacterias gramnegativas, oxidasa positivas, pertenecientes a la familia Vibrionaceae, que normalmente se encuentran en el medio acuático. Han sido incriminadas como causa de diarrea principalmente en niños, pero también en adultos. La evidencia en tal sentido es todavía incompleta. Se han descrito tres formas clínicas de diarrea asociada a A. hydrophila: a) gastroenteritis leve, consistente en deposiciones líquidas, fiebre baja y vómitos ocasionales; b) diarrea disenteriforme; c) diarrea prolongada con una duración mayor de dos semanas. Se piensa que se trasmite por ingestión de agua contaminada y se ha comprobado que puede sobrevivir en agua para consumo humano con niveles standard de clorinación. PLESIOMONAS SHIGELLOIDES Es otro microorganismo acuático gramnegativo de la familia Vibrionaceae que puede causar diarrea de modo similar a Aeromonas, a través del agua o de alimentos marinos. 174 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA STAPHYLOCOCCUS AUREUS Es flora transitoria de la piel y en especial de las fosas nasales. También puede encontrarse en número reducido en el colon y la vagina. Prácticamente todas las personas son portadoras de este germen en uno u otro momento de su vida. Es causa de gran variedad de infecciones, incluyendo lesiones de piel de diverso tipo y entidad. Como causa de toxiinfección alimentaria, la fuente de contaminación por S. aureus suele ser un manipulador de alimentos que elimina gran cantidad de gérmenes enterotoxigénicos a partir de la nariz o de lesiones cutáneas activas. Raramente el germen tiene origen bovino. En el alimento contaminado, que no recibe cocción o tratamiento térmico adecuado, y que se mantiene a temperaturas intermedias, sin refrigeración, la bacteria prolifera y sintetiza proteínas tóxicas. Se necesita habitualmente más de 105 bacterias por gramo de alimento para que se forme una concentración de enterotoxina (es suficiente <1 µg/g) capaz de producir enfermedad. S. aureus tolera altas concentraciones de sal y otros solutos, y sus enterotoxinas (no el germen) pueden resistir 100ºC durante 15 a 30 minutos, por lo cual no son adecuadamente destruidas por cocción o pasteurización una vez producidas. Las cremas, quesos, o pasteles preparados con ingredientes no pasteurizados, o las carnes, jamón y pollo pueden ser vehículo de enfermedad. La toxiinfección alimentaria estafilocócica y todos sus síntomas son provocados por la enterotoxina ingerida con el alimento. Las bacterias, si están presentes, transitan el tubo digestivo y son excretadas. El período de incubación es corto (una a seis horas); la enfermedad comienza bruscamente con intensas náuseas, cólicos, vómitos y, generalmente, diarrea con postración; no se presenta habitualmente fiebre; los síntomas ceden en uno a dos días; raramente se produce la muerte en personas con otras enfermedades de base. Las toxinas de S. aureus que provocan este cuadro no parecen ajustarse al concepto común de enterotoxinas como sustancias exotóxicas bacterianas de acción local sobre la secreción y absorción de agua y electrolitos a nivel intestinal. Se interpreta que su actividad deriva de: a) el estímulo de terminaciones vagales a nivel de la mucosa gástrica, con violento efecto emético; b) su acción sistémica como “superantígenos”, proteínas que no son digeridas y procesadas por las células presentadoras, sino que forman directamente puentes entre las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad y los receptores de las células T. El resultado es el estímulo inespecífico de grandes cantidades de células T y macrófagos, con producción abundante de IL2 y otras citoquinas, cuyo efecto, al ser inoculadas por vía parenteral, es muy similar al observado en estas toxiinfecciones. Por este efecto, por su secuencia aminoacídica y por la similitud de los genes que las codifican, las enterotoxinas estafilocócicas, que son producidas habitualmente por S. aureus de tipo fágico III, se parecen a las toxinas pirogénicas de Streptococcus pyogenes y a la toxina del shock tóxico. Son un conjunto de siete proteínas muy parecidas (SEA, B, C1, C2, C3, D y E), de las cuales la más frecuente es la “enterotoxina” A. Los genes responsables de su producción son cromosómicos, plasmídicos, o incorporados por bacteriófagos. BACILLUS CEREUS Es un bacilo grampositivo, catalasa positivo, aerobio estricto, esporulado. Es móvil por flagelos peritricos. Produce lecitinasa y betahemólisis sobre agar sangre ovina. Está presente ampliamente en el ambiente, el suelo, las plantas, etc. Los esporos que contaminan los alimentos resisten la ebullición y pueden luego germinar. Origina dos tipos de enfermedad de fuente alimentaria: a) afección emética, breve, muy similar a la causada por S. aureus, compuesta por náuseas, vómitos y dolores cólicos acompañados de diarrea en algunos enfermos. El período de incubación promedio es de dos horas, y el alimento de origen es en general el arroz cocido y no bien refrigerado que ha sustentado la germinación de los esporos, la proliferación TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 175 bacteriana, y la síntesis de toxina preformada. Se trata de una toxina proteica, termoestable, de molécula pequeña (PM 5000); b) síndrome diarreico, muy parecido al producido por Clostridium perfringens. Se produce a partir de carnes, vegetales, lácteos y otros alimentos. El período de incubación es de 6 a 24 horas, y se presenta con diarrea, cólicos, a veces vómitos y raramente fiebre. Dura de uno a dos días y es causado por una enterotoxina lábil, de liberación intestinal, que activa el sistema adenil ciclasa - AMP cíclico, como las toxinas LT de E. coli y CT de V. cholerae. CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Es un bacilo grampositivo esporulado, anaerobio obligado, pero poseedor de cierto grado de aerotolerancia. El responsable de toxiinfección alimentaria es en general el tipo A. Está presente normalmente en materias fecales humanas, animales, y en el suelo, y a partir de este reservorio puede contaminar los alimentos. Para que se produzca la enfermedad, se requieren habitualmente más de 106 microorganismos por gramo. Esto ocurre cuando el alimento contaminado (carnes, pollo) recibe una cocción insuficiente, que destruye las formas vegetativas pero libera el oxígeno, reduce el potencial redox y permite la germinación de los esporos sobrevivientes. La proliferación de C. perfringens se produce durante el enfriamiento lento de volúmenes importantes del producto para consumo de muchas personas, o su mantenimiento a temperaturas intermedias. C. perfringens tipo A produce, además de la exotoxina α que permite caracterizarlo, una enterotoxina termolábil, que actúa en el epitelio ileal promoviendo la hipersecreción de agua y electrolitos e inhibiendo la absorción de glucosa. Se ha descrito también producción de enterotoxina por algunas cepas del tipo D. La enterotoxina no se forma en el alimento sino en el intestino, cuando grandes cantidades de bacterias esporulan tras sufrir el estrés ácido del estómago. No es, sin embargo, una proteína vinculada estructuralmente a los esporos, y puede ser excepcionalmente producida en situaciones en que la bacteria no esporula: en pacientes añosos o debilitados y hospitalizados, la modificación de la flora intestinal por el uso de antibióticos puede dar lugar a diarrea por proliferación bacteriana y formación de toxina en el colon. C. perfringens posee una cápsula polisacarídica que no tiene relevancia en la patogenia de la enfermedad intestinal, pero que presenta diversidad antigénica y permite clasificar las cepas con fines epidemiológicos. Ocasionalmente, en niños desnutridos, C. perfringens puede producir invasión y ulceración de la mucosa, con riesgo de vida. En su forma habitual, la toxiinfeccióm alimentaria por C. perfringens se desencadena 8 a 18 horas después de la ingestión del alimento. Cursa típicamente con diarrea líquida y cólicos severos, a veces náuseas, y raramente vómitos o fiebre. La enfermedad es habitualmente corta (24 hs) y benigna. CLOSTRIDIUM DIFFICILE Es también un bacilo esporulado que sobrevive en forma prolongada y está ampliamente distribuido en la naturaleza. Forma parte de la flora normal del 90% de los lactantes, pero de menos de 5% de los adultos sanos. En mayores de 60 años, la proporción de colonizados es alta, y también lo es en pacientes hospitalizados: el germen está presente en 10% a 30% de los mismos, y es recuperable con frecuencia del ambiente y utensilios. La enfermedad producida por C. difficile es una gastroenteritis caracterizada por proliferación microbiana intraluminal, producción de toxinas y daño mucoso significativo sin invasión. Ocurre casi exclusivamente tras antibioticoterapia y alteración de la flora normal. La mayoría de las cepas produce una o dos toxinas antigénicamente diferentes: toxina A y toxina B. Son 176 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA exotoxinas de alto peso molecular formadas durante la fase logarítmica de crecimiento. Los genes que codifican su producción están vinculados y próximos en el cromosoma bacteriano. Ambas tienen un efecto citotóxico que se debe a la alteración de los microfilamentos de actina del citoesqueleto celular. Las modificaciones en el intercambio de fluido y solutos derivan al parecer del daño citotóxico, por mecanismos que son todavía objeto de estudio. La toxina B es 1000 veces más potente que la A en cultivos celulares de laboratorio, pero la segunda parece ser la principal responsable de los efectos en vivo. El efecto de C. difficile puede ser mínimo, o puede implicar una diarrea severa y prolongada, con cólicos, fiebre alta y leucocitosis. Las complicaciones derivan principalmente del disbalance hidroelectrolítico y las pérdidas proteicas que generan hipoalbuminemia. Puede producirse megacolon y perforación intestinal. La lesión típica observable es la formación de seudomembranas, que pueden confluir y desprenderse. Se originan en zonas de ulceración mucosa con cambios inflamatorios de la lámina propia, y acumulación de fibrina, mucina, células inflamatorias y epiteliales descamadas, sin inclusión de bacterias ni invasión parietal. CLOSTRIDIUM BOTULINUM El botulismo es una intoxicación, más que una toxiinfección. Es un tipo diferente de enfermedad de origen alimentario, poco frecuente en el país, cuyas manifestaciones no son predominantemente digestivas, sino neurológicas. La exotoxina botulínica, responsable del proceso, es una macromolécula proteica muy activa: la dosis letal 50 LD50 para el ratón es <0.01 ng. Es producida por las bacterias en forma de complejo proteico, cuyos componentes no tóxicos contribuyen a proteger la toxina del ácido y proteasas gástricas. En su forma activa, tras clivaje proteolítico en el tubo digestivo, es una toxina de tipo A-B, compuesta por una cadena B, pesada (100 kDa), de fijación, y una unidad A, liviana (50 kDa), con actividad enzimática. Cuando es ingerida, la toxina es absorbida a nivel gástrico, ingresa a la sangre y se fija sobre receptores glicoproteicos o glicolipídicos de las terminaciones periféricas de las neuronas motoras. La cadena A es internalizada, y su región amino terminal opera como endopeptidasa zincdependiente que altera las sinaptobrevinas que integran la pared de las vesículas sinápticas, interfiriendo con la liberación de acetilcolina. Su estructura y modo de acción son similares a los de la toxina tetánica, pero su sitio de actividad es distinto, dando lugar a parálisis flácida, y no espástica como esta. C. botulinum es un bacilo grampositivo, anaerobio estricto, móvil, con flagelos peritricos, productor de esporos ovales y subterminales. Existen siete serotipos conocidos (A-E) de exotoxina botulínica. Una misma cepa puede producir más de un tipo. El tipo C no es patógeno para el ser humano. Los tipos E, F y G pueden ser producidos por otras especies de Clostridium: C. argentinense (llamado también C. botulinum G); C. baratii; C. butyricum. La exotoxina G es codificada por un plasmidio; los tipos C y D son producidos por conversión fágica. Se asume que los genes de los serotipos A, B, E y F están presentes en el cromosoma bacteriano. Algunas cepas de C. botulinum producen además toxinas C2 o C3, de significado discutible. C. botulinum es habitante normal del suelo, el polvo y los mares, pero no del tracto digestivo del hombre. Los esporos, en especial los de cultivos productores de toxinas A y B, pueden resistir temperaturas superiores a 110ºC durante varios minutos. Son precisamente los cultivos productores de toxinas tipo A y B los más frecuentes causantes de contaminación alimentaria y de enfermedad a nivel mundial. La fuente principal de enfermedad son las conservas caseras o defectuosas de carne y condimentos vegetales. Las cepas productoras de toxina tipo B se aíslan en general de carne de cerdo. Las productoras de proteína tipo E contaminan sobre todo conservas de pescado. En las conservas bien preparadas, el tratamiento térmico adecuado, TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 177 el bajo pH y el agregado de NaCl o nitritos son factores que sumados, multiplican su acción protectora. En productos mal conservados en cambio (conservas ahumadas, enlatados mal esterilizados por calor, etc.), los esporos pueden sobrevivir, para germinar y proliferar luego al amparo de condiciones de anaerobiosis, y producir toxina que es liberada con lisis bacteriana. El proceso requiere habitualmente 2 a 14 días. Los alimentos contaminados a niveles de peligro tienen muchas veces sabor o aspecto anormal: rancidez, putrefacción, gas, hinchazón de latas. Si se consumen sin cocinar, la toxina presente en ellos no es destruida (las toxinas botulínicas son termolábiles, alterables por el calor). Todas las cepas de C. botulinum son sacarolíticas y lipolíticas. Es variable en cambio su capacidad proteolítica. Se clasifican como tipo I cuando son proteolíticas y productoras de toxina A, B o F; de tipo II cuando son no proteolíticas, y productoras de toxinas B, E o F. Las cepas del grupo III son metabólicamente diferentes, y producen toxinas C o D. Los alimentos contaminados con cepas no proteolíticas pueden no mostrarse ostensiblemente alterados, como sí ocurre para los que contienen cepas de tipo I. Excepcionalmente, C. botulinum puede infectar heridas profundas, con restos necróticos y déficit de irrigación, y ser allí origen de toxina y de enfermedad. El botulismo del lactante es otra forma rara que ocurre por la ingestión de esporos con la miel u otro vehículo, proliferación y colonización intestinal, producción local de toxina y absorción lenta a nivel del colon. Los síntomas de botulismo aparecen 4 a 36 horas después de la ingesta del alimento contaminado. La rapidez de instalación y la intensidad del cuadro dependen de la cantidad de toxina ingerida. Las primeras manifestaciones son digestivas: vómitos, sed, constipación o diarrea (esta última solo en 15% de los casos). La enfermedad neuromuscular debuta con diplopía, y luego disfagia y disartria; más tarde aparece debilidad muscular periférica y parálisis flácida progresiva. La muerte puede sobrevenir por paro respiratorio, neumopatía secundaria o paro cardíaco por hipoxia. Con buen manejo y tratamiento, la letalidad se sitúa en 10% a 15%. Una vez fijada la toxina a la terminación nerviosa, la intervención externa con antitoxina no tiene efecto sobre esta interacción. Algo de regeneración nerviosa es obtenible, pero los pacientes que sobreviven a un episodio de botulismo presentan con frecuencia daño neurológico irreversible. Mecanismos patogénicos de los agentes etiológicos bacterianos de diarrea Se pueden distinguir en suma cinco tipos patogénicos de agentes bacterianos de diarrea. 1. Bacterias que poseen la capacidad de adherir a la mucosa y producir toxinas. V. cholerae y ETEC afectan al intestino delgado en su sector proximal. Las toxinas son producidas en la luz de este y alteran la capacidad funcional del enterocito. VTEC produce en el colon citotoxinas, cuyo efecto principal se expresa en los endotelios vasculares o a nivel sistémico. 2. Bacterias que causan diarrea por disolución del borde en cepillo de la mucosa intestinal, alteración del citoesqueleto celular y de los intercambios de agua y solutos. (EPEC a nivel del delgado; VTEC en el colon). 3. Bacterias que causan diarrea con invasión de la mucosa y proliferación dentro de la célula intestinal. Es característico de Shigella y EIEC. Ambas invaden el enterocito del intestino delgado distal y del colon, donde se multiplican y alteran el funcionamiento de las células causando su muerte. 4. Bacterias que modifican la superficie de los enterocitos, invaden con traslocación de la 178 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA mucosa, proliferación en la lámina propia y acumulación a veces en los ganglios linfáticos. Pertenecen a este grupo las especies de Salmonella no tifoídicas, Campylobacter y Yersinia enterocolitica. 5. Bacterias que forman toxinas durante su multiplicación libre en el exterior o en la luz intestinal. La producción de toxinas no está asociada a la adherencia de los gérmenes a la mucosa. S. aureus, C. perfringens y otros. Virus ROTAVIRUS El género está incluido en la familia Reoviridae. Causan infección intestinal en varias especies (hombre, simios, equinos, porcinos, caninos, bovinos, ovinos y aves). Su existencia e importancia se evidenció en 1973, cuando por primera vez se visualizaron por el microscopio electrónico (ME) en muestras de tejido duodenal de un niño con diarrea. Los Rotavirus son localmente, por frecuencia, los principales agentes causales de diarrea infantil, seguidos por E. coli. En muchos países desarrollados son su principal agente etiológico. Los casos predominan en las estaciones mas frías en los países industrializados, mientras que en los países subdesarrollados como el nuestro las infecciones ocurren durante todo el año. ADENOVIRUS ENTÉRICOS También llamados Adenovirus atípicos, los serotipos 4O y 41 pueden causar, con menor frecuencia, una enfermedad clínica importante parecida a la gastroenteritis provocada por Rotavirus. En contraste con los Adenovirus convencionales, se requieren técnicas muy especiales para poder cultivarlos. VIRUS PEQUEÑOS Son virus de 27 a 40 nm, relacionados entre sí, que causan gastroenteritis epidémica familiar, comunitaria, o de fuente alimentaria. Incluye los agentes Norwalk, Montgomery County, Hawai, etc. Son virus que clínicamente causan diarrea o “enfermedad de vómitos en invierno”, y que fueron identificados por ME, ya que no ha sido posible cultivarlos en histocultivos. No han sido investigados en nuestro medio. OTROS VIRUS Astrovirus, Calicivirus y Coronavirus han sido implicados como causa infrecuente de gastroenteritis. Métodos de estudio. Diagnóstico El diagnóstico y manejo de las gastroenteritis infantiles es fundamentalmente clínico. Solo en ciertas ocasiones se hace necesario saber la etiología: a) con fines de tratamiento antibiótico, como es el caso de una diarrea con sangre, o para descartar el cólera en situación de riesgo específico; b) con fines epidemiológicos, para conocer que cepas están circulando en un momento dado, la probable fuente de infección y las vías de trasmisión, permitiendo así implementar medidas de control que eviten su diseminación. El estudio etiológico requiere métodos diferentes para la identificación de agentes bacterianos, virales o parasitarios. Nos referiremos a los primeros. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 179 Recolección de la muestra: las materias fecales se recogen, en el caso de lactantes, con un pañal de nylon. Utilizando una espátula o cucharita de plástico se trasladan en cantidad suficiente (no menos de 10g) a un frasco estéril de boca ancha por un lado, y por otro, con un hisopo, se introducen en un tubo que contiene un medio de transporte de Cary-Blair para preservación de los gérmenes más lábiles (Shigella, Campylobacter). La muestra debe procesarse de inmediato, o refrigerarse por no más de 12 horas. Una vez remitida al laboratorio, lo primero a realizar es una tinción de Gram para reconocer eventualmente espirilos o “gaviotas” (Campylobacter) y para identificar y cuantificar leucocitos fecales. La tinción con azul de metileno facilita la observación de leucocitos fecales, expresión de presencia de un agente invasor. Si se desea investigar verotoxinas libres en heces, se realiza suspensión de las mismas en buffer PBS, centrifugación, filtrado estéril e inoculación sobre cultivos celulares. El paso siguiente es la realización del cultivo de las materias fecales. Para ello se usan distintos medios. a) Medios sólidos, que tienen por finalidad inhibir el desarrollo de la flora fecal normal y favorecer y distinguir el desarrollo de gérmenes patógenos. Son los llamados medios selectivos y diferenciales: Agar Mac Conkey lactosa, Mac Conkey sorbitol, SS (medio especial con lactosa para aislamiento de Salmonella y Shigella), TCBS con sacarosa para Vibrio, agar Skirrow u otros para Campylobacter. Estos medios contienen sustancias inhibitorias (cristal violeta, sales biliares, citratos, antibióticos en Skirrow, etc.), y habitualmente un indicador de pH que producirá un viraje de color si las colonias que desarrollan degradan el carbohidrato que contiene el medio. El agar Skirrow es un medio rico, con sangre. b) Medios líquidos de enriquecimiento: son caldos que actúan también estimulando el crecimiento de un germen e inhibiendo el de otros que pueden estar presentes en grandes cantidades. Los más utilizados son el caldo tetrationato (especial para Salmonella), el caldo selenito (para cultivo de Salmonella y algunas cepas de Shigella), el agua peptonada alcalina para desarrollo de V. cholerae, el PSB (peptona, sorbitol y bilis) para crecimiento en frío de Y. enterocolitica. Existen, pero no se usan comúnmente, medios de enriquecimiento para Campylobacter, para VTEC y otros. La mayoría de los bacilos gramnegativos enteropatógenos no tiene requerimientos atmosféricos especiales, salvo Campylobacter que requiere condiciones microaerófilas que deben proveérsele en jarra apropiada. En general precisan para crecer temperatura de 37ºC. Campylobacter crece bien a 42ºC, lo que facilita la selección. Yersinia debe cultivarse por debajo de 28ºC en agar Mac Conkey u otro, y a 4ºC para enriquecimiento en PSB. El tiempo de incubación de las placas es en general de 24 hs (48 para Campylobacter). Las colonias observables en ellas se subcultivan y se estudia su metabolismo para avanzar en su identificación. Las colonias lactosapositivas (rojas en agar Mac Conkey) se siembran en agar inclinado, citrato y lisina como posibles E. coli. Las colonias lactosanegativas (que pueden ser Salmonella, Shigella, Yersinia u otras bacterias no enteropatógenas) se cultivan en TSI y agar fenilalanina. Las colonias amarillas, sacarosapositivas en TCBS pueden pertenecer al género Vibrio; se subcultivan para realizar prueba de oxidasas y otros ensayos que lo confirmen. En agar de Skirrow u otros, Campylobacter jejuni o coli desarrolla como gotas de agua extendidas a lo largo de la estría; el Gram y la movilidad en fresco orientan a su caracterización. La identificación confirmatoria se realiza en todos los casos por pruebas metabólicas y bioquímicas complementarias (oxidasas, OF, utilización de azúcares y aminoácidos, investigación de productos finales diversos, etc.), y eventualmente por reacciones antígeno-anticuerpo 180 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA de aglutinación que enfrentan las suspensiones bacterianas con antisueros específicos para permitir la caracterización antigénica O, H y K. Los caldos de enriquecimiento se cultivan por tiempos variables según el germen a investigar (1 y 3 días para Salmonella; 21 días a 4ºC para Yersinia, por ej.). Se realizan reaislamientos en placas de agar selectivo y diferencial, como para la siembra primaria, y las colonias resultantes se estudian de la misma manera. Pueden ser necesarios ensayos especiales más complicados. a) Inoculación de cultivos celulares para investigar citotoxinas o enterotoxinas en caldos de cultivo (filtrado) de ciertos tipos de E. coli: ETEC, VTEC. b) Inoculación de animales: ratón lactante para investigar ST de E. coli; conjuntiva de cobayo o conejo para confirmación de EIEC. c) Pruebas de ELISA o aglutinación de látex para investigación de enterotoxinas de E. coli o de V. Cholerae. d) Técnicas de PCR o hibridación con sondas de ADN para identificación específica de ácidos nucleicos bacterianos en materias fecales tratadas o en cultivos realizados a partir de las mismas. El diagnóstico de las gastroenteritis virales se basa en la detección del virus o sus componentes (proteínas o ADN) en muestras de materias fecales. El microscopio electrónico es muy importante para el diagnóstico viral, pero requiere mucho tiempo de observación, es poco sensible, a menos que se combine con técnicas inmunológicas (inmunoelectromicroscopía), y no se encuentra disponible en todos los laboratorios por su costo. Los cultivos celulares constituyen un método laborioso, y la mayor parte de los agentes que producen gastroenteritis crecen mal en los mismos. El análisis para la detección de antígenos virales es el método diagnóstico más utilizado. Se usan técnicas de ELISA. Son métodos sencillos, rápidos y sensibles. Debido a que no cuentan con una especificidad del 100%, las muestras positivas se deben confirmar mediante otro ELISA denominado de bloqueo. La aglutinación de látex es una técnica de menor sensibilidad y especificidad que el ELISA, pero es un método rápido y práctico. La PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) estudia el ARN viral en materias fecales tratadas. Permite detectar los genes de Rotavirus y distinguir sus características y sus variantes para el estudio de la epidemiología molecular de estas infecciones. Es un método de alta sensibilidad y especificidad, pero no se practica en los laboratorios de análisis clínicos. Lo mismo debemos decir de muchas de las técnicas de estudio copromicrobiológico mencionadas más arriba. La investigación de un brote de toxiinfección alimentaria requiere la puesta en juego de un conjunto de procedimientos ordenados. 1. Obtención de datos personales, información clínica de cada uno de los afectados, alimentos involucrados, etc. (Ver cuadro 5). 2. Envío rápido al laboratorio (Bromatología, IMM) de un mínimo de 50g de los alimentos sospechosos (según tasas de ataque); refrigerados y en recipientes estériles. 3. Envío rápido a Laboratorio de Microbiología Médica (Ej.: División Laboratorios, MSP, o Instituto de Higiene) de 5g de heces o vómitos de los pacientes; refrigerados, en frasco estéril, y con medio de transporte si es posible. Para la orientación del estudio microbiológico hacia los agentes etiológicos probables y la correcta elección de las técnicas de laboratorio, se requiere contar con datos sobre la enfermedad (síntomas, período de incubación, duración, etc.), y sobre los alimentos sospechosos, causas posibles de su contaminación, proporción de personas afectadas que estuvieron expuestas, etc. El cuadro 6 presenta un esquema de la intervención del laboratorio en la investigación de un brote. Los procedimientos centrales son habitualmente los siguientes. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 181 Cuadro 5. Toxiinfección alimentaria. Estudio de un brote Información médica Datos personales Fecha, lugar, etc. Síntomas: incubación; descripción, duración Información de los alimentos Tipo Origen; preparación; conservación Tasas de ataques Manipuladores Información de laboratorio Alimento Personas afectadas; ambiente, utensilios; manipuladores Resumen Fecha, lugar, circunstancias. Personas afectadas, clínica. Comida involucrada, causas. Germen responsable Cuadro 6. Toxiinfección alimentaria. Diagnóstico de laboratorio Orientación • clínico epidemiológica • tipo y aspecto del alimento sospechoso • frotis del alimento y material clínico 1. Cultivo del microorganismo responsable • En materias fecales. • En vómitos. • En alimentos: homogenización previa; cualitativo o cuantitativo. 2. Investigación de toxinas • En alimentos • En materiales clínicos: MF, sangre Enterotoxina estafilocóccica Toxinas botulínicas α toxina de C. perfringens 3. Antígenos virales en heces: ELISA, látex 4. Investigación de gérmenes en ambiente, utensilios. Portadores 1. La realización de cultivos a partir de alimentos, heces o vómitos, utilizando medios especiales (de enriquecimiento, selectivos y diferenciales) y frecuentemente técnicas cuantitativas. 2. La búsqueda de toxinas en materiales clínicos o en alimentos. El diagnóstico clínico presuntivo de toxiinfección alimentaria por S. aureus se basa en la identificación de un grupo de casos con instalación brusca de síntomas predominantemente digestivos altos y corto período de incubación, asociados a la ingestión de un alimento sospechoso. El hallazgo de S. aureus en gran número en los alimentos, heces o vómitos sirve como indicación de enfermedad estafilocócica. Puede utilizarse medio selectivo y diferencial de Baird Parker, con yema de huevo y telurito de potasio, donde se aprecian colonias negras con borde en tapa de refresco, halo de precipitación por lecitinasa y contorno iridiscente 182 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA por producción de lipasa. S. aureus son cocos grampositivos, catalasa positivos, coagulasa positivos, y productores de termonucleasa detectable sobre agar DNA azul de toluidina. La confirmación se realiza por la detección de enterotoxina en el alimento, o de la producción de enterotoxina por el germen cultivado en abundancia. La investigación de enterotoxinas se realiza por reacción de precipitación antígeno-anticuerpo con antitoxinas en lámina, por ELISA sandwich polivalente comercial, o por RPLA (aglutinación pasiva reversa de látex). La confirmación de la enfermedad por B. cereus se realiza mediante la detección de grandes cantidades de microorganismos: >105 bacterias por gramo, en el alimento, en las heces, o en ambos. Se utiliza agar selectivo y diferencial MYP, con manitol, yema de huevo y polimixina, que inhibe bacterias gramnegativas. B. cereus es manitol negativo y gran productor de lecitinasa. La enterotoxina de la forma diarreica es detectable en alimentos o filtrados de cultivos por RPLA. Para afirmar que la causa de toxiinfeción alimentaria es C. perfringens deben cumplirse uno o más de estos criterios: a) aislamiento del mismo subtipo capsular en el alimento sospechoso y en las heces de la persona enferma, o en la mayoría de las personas enfermas; b) presencia de >106 gérmenes por gramo de alimento, o un promedio de >106 esporos por gramo de materia fecal. Los cultivos se realizan en anaerobiosis sobre agar TSC (triptona sulfito cicloserina) con posterior identificación de las colonias negras sospechosas. Es confirmatoria la detección de α toxina en el alimento, con técnica de hemólisis radial cuantitativa controlada por neutralización con antitoxina. La enterotoxina de C. perfringens es detectable en cultivos o en materias fecales por RPLA. El diagnóstico de botulismo es clínico, epidemiológico y de laboratorio. El último se hace de la siguiente forma. a) Evidenciando la toxina en el suero, heces, vómitos o extracto de tejidos si el paciente ha fallecido. Se demuestra su acción patógena por inyección intraperitoneal en el ratón, confirmando por calentamiento la termosensibilidad del producto tóxico, y su neutralización con antitoxina en la prueba del ratón protegido. Las pruebas sirven si el paciente no ha recibido ya antitoxina. b) Demostrando la presencia de toxina en el alimento sospechoso homogeneizado y tratado con tripsina, y aislando a partir de él el germen causal. Se destruyen las formas vegetativas con alcohol o calor, se realiza cultivo anaerobio en caldo de enriquecimiento, aislamiento en agar hígado yema de huevo, y selección en caldo de colonias que deben ser identificadas por su morfología, sus actividades enzimáticas y su producción de toxina. El diagnóstico de colitis pseudomembranosa por Clostridium difficile se realiza por endoscopía en pacientes con clínica compatible y antecedentes de tratamiento con antibióticos. El aislamiento del germen a partir de materias fecales se realiza en agar cicloserina cefoxitina fructosa yema de huevo, y es positivo en 95% de los enfermos. Las citotoxinas son detectables por inoculación sobre cultivos celulares, o por ELISA. En pacientes VIH + pueden ser necesarias la endoscopia e incluso la biopsia para confirmar la infección intestinal con Mycobacterias o Citomegalovirus cuando la etiología no puede ser determinada por estudios sobre materias fecales. Tratamiento Se basa fundamentalmente en medidas de sostén, tanto en lo que se refiere a los bacterias como a los virus, con el fin de evitar o corregir la deshidratación y la desnutrición, que ge- TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 183 neralmente ocurren en los más pequeños debido a la pérdida de líquidos y también a la mala alimentación a que son sometidos estos niños en el curso de una gastroenteritis. Requiere especial cuidado la realimentación de niños con diarrea persistente y alteraciones importantes en su funcionalidad digestiva. Debe quedar claro que el tratamiento con antibióticos está limitado a casos específicos de diarrea con sangre, donde se acorta el tiempo de excreción del germen y los días de enfermedad, a situaciones de invasión bacteriana sistémica, y también a aquellos casos donde se confirma cólera. Las cepas epidémicas de V. cholerae siguen siendo sensibles a la tetraciclina, que es el antimicrobiano indicado. Como alternativa puede usarse furazolidona u otros. Metronidazol o vancomicina son los antibióticos de elección para la enterocolitis por C. difficile. La terapia debe mantenerse 7 a 14 días, pero aún así las recurrencias no son raras. En el botulismo, el cuidado intenso de sostén y el apoyo respiratorio son primordiales para reducir la letalidad. El tratamiento antitóxico específico del paciente con diagnóstico primario debe ser precoz, para remover de la circulación la toxina no fijada todavía. Se usa antitoxina polivalente de comienzo, y monovalente una vez confirmado y tipificado el agente causal. Prevención Teniendo en cuenta las altas tasas de morbilidad que presenta la diarrea aguda en la población, los altos costos de atención institucional y la existencia de posibilidades reales de lograr un control efectivo, las gastroenteritis deben ser consideradas prioritarias dentro de los programas de salud. Para ello existe una gran cantidad de medidas posibles, desde facilitar el acceso a la asistencia primaria de la salud y a la terapia de rehidratación oral, promover la lactancia materna y la preparación higiénica de los alimentos infantiles, enseñar a la comunidad y al personal de salud el cumplimiento estricto de las precauciones universales para el control de la diseminación de infecciones, como el lavado de manos y los métodos de barrera (guantes y uso de túnica), y algo fundamental como es mejorar las condiciones sanitarias del medio ambiente (recolección de la basura, saneamiento, suministro de agua potable intradomiciliaria, etc.). En la toxiinfección alimentaria es limitado el conocimiento de la realidad epidemiológica nacional. El informe y estudio sistemático de los brotes es fundamental para conocer los microorganismos prevalentes y los alimentos de mayor riesgo. En tanto estos datos no se manejen, se gastarán a ciegas importantes montos en estudios de inspección y análisis de alimentos posiblemente irrelevantes. Al hablar de la importancia de esta entidad mencionamos los principales factores que contribuyen a limitar su difusión, y jerarquizamos la necesidad de adecuada cocción de los alimentos, y conservación de los mismos por refrigeración. Los cuidados de higiene en la manipulación, preparación y envasado de los alimentos, y el alejamiento temporal de manipuladores enfermos tiene más importancia que la búsqueda obsesiva de portadores asintomáticos. La preservación de intereses económicos no debe interferir con la necesidad de explorar y operar cuidadosamente sobre la realidad para contar con fuentes seguras de alimentos de origen vegetal o animal. La prevención de la diarrea infantil mediante inmunización activa es una meta difícil de lograr, por la multiplicidad de microorganismos involucrados (virales, bacterianos y parasitarios), por la inmadurez inmunológica de los lactantes que constituyen la población objetivo, y por la necesidad de presentar preparados inmunizantes utilizables por vía oral, que resistan el tránsito gástrico y que despierten una buena respuesta inmune celular y humoral (IgA) a nivel local, intestinal, en lo posible acompañada de un componente sistémico, como ocurre en la infección natural. 184 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA En desarrollo pleno, la población linfocitaria intestinal es la más numerosa del organismo. La pared entérica presenta estructuras de captación y presentación de antígenos y sistemas celulares de respuesta a los mismos que resultan en expresión a nivel local, a nivel sistémico (recordar vacunas antipolio), y en la superficie de otras mucosas por migración de células inmunocompetentes (inmunización por vía entérica contra Adenovirus respiratorios). En inmunidad antibacteriana importan no solo las respuestas antitóxicas o antiadhesinas, sino también las dirigidas contra los antígenos de pared y los flagelos, que parecen jugar un papel a tener en cuenta en la infección natural (ej. por V. cholerae), aunque en algunos casos esos componentes de los gérmenes no contribuyan en forma relevante a la patogenicidad microbiana. Las vacunas por vía oral con gérmenes inactivados han resultado en general poco inmunogénicas. Se han ensayado diversas cepas atenuadas de Shigella, de EPEC y de Salmonella. Los cultivos aroA de Salmonella (ej. S. enteritidis) pueden servir, por construcción genética de laboratorio, como transportadores y presentadores de antígenos correspondientes a otros patógenos. Se están ensayando en este momento para la prevención de la infección en aves. Para la prevención del cólera, la vacuna tradicional de gérmenes muertos no es efectiva, y no se recomienda su uso. Están en uso a nivel de prueba de campo dos tipos distintos de vacunas: a) vacuna inactivada que contiene bacterias “completas” y componente B de la toxina agregado como sustancia inmunizante y como adyuvante; es un producto seguro, pero la eficacia es limitada, parece tener cierto efecto protector contra las infecciones por ETEC; b) vacuna viva atenuada, preparada por modificación genética, que contiene la mayor parte de los antígenos bacterianos, incluyendo la porción B de su toxina CT, pero no su sector A, activo. Es crítico el cuidado de la inocuidad de estas cepas. Ambos tipos de vacuna anticolérica son inefectivos para las infecciones por V. cholerae O139. Se abre todo un nuevo período de investigación en el tema. El toxoide botulínico es medicación preventiva obligatoria para trabajadores de laboratorio que manejen este germen o sus toxinas, en estudios básicos o de toxiinfecciones alimentarias. Para Rotavirus se han hecho ensayos con vacunas atenuadas para el hombre, de origen animal: bovino y simiano. Han demostrado ser seguras e inmunogénicas, pero de eficacia limitada. Algunas atenúan los síntomas, más que disminuir las tasas de infección. Están en estudio cepas “neonatales” atenuadas, procedentes de recién nacidos infectados pero no enfermos. La protección conferida por una cepa atenuada es alta para la infección homotípica, pero la inmunidad heterotípica es menor; esto ha llevado a ensayar la construcción de vacunas polivalentes por reordenación genética de virus animales o humanos, de gérmenes atenuados transportadores de antígenos de Rotavirus, y de vacunas no vivas, preparadas con proteínas virales de distintos tipos, para uso parenteral u oral. El desarrollo futuro requiere tener en cuenta no solo el contenido antigénico viral, sino su presentación, dosis, vías y formas de modulación de los distintos tipos de respuesta inmune. En lo que respecta en general a las vacunas contra la gastroenteritis, existe controversia a nivel de salud pública en el mundo, ya que el ensayo y uso de preparados no bien eficaces puede crear un falso sentido de seguridad en la comunidad, y desviar recursos de las medidas prioritarias de mejora de las condiciones higiénicas, ambientales y sociales. Ejemplo: la provisión de agua potable abundante y de saneamiento son las medidas de salud pública más efectivas para controlar la difusión del cólera. La inversión de tiempo y dinero en la búsqueda de vacunas no debe interferir con el desarrollo prioritario de los recursos mencionados. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 185 Práctico de gastroenteritis • CASO 1. Lactante de siete meses, sexo masculino, sin antecedentes patológicos personales ni familiares a destacar. Procedente de un medio socioeconómico deficitario. Mal alimentado. Comienza hace 48 hs con deposiciones líquidas, 10 a 12 por día, agregando en la evolución deposiciones con sangre. Consulta en una policlínica periférica, donde le indican agua de arroz y té. Agrega a las 24 hs vómitos, rechazo del alimento y depresión neuropsíquica. Al ingreso en la emergencia instala movimientos tonicoclónicos de los cuatro miembros, con revulsión ocular, que dura cinco minutos. Al examen físico se comprueban signos de deshidratación por lo cual se comienza el tratamiento de reposición. PRÁCTICO. Se observarán placas de agar Mac Conkey y de SS sembradas con heces del paciente, en las cuales se observan abundantes colonias lactosanegativas. Se realizará a partir de ellas siembra con punta en medios de TSI, FA y otros. DISCUSIÓN. Se hablará de cuando está indicada o no la realización de un coprocultivo. Toma de la muestra y transporte. Métodos de estudio. Medios de cultivo utilizados. Interpretación de resultados. PREGUNTAS ¿Cuáles pueden ser los gérmenes involucrados en este caso? ¿Qué factores de virulencia están involucrados en la infección? ¿Cuál sería la mejor forma de terapia en esta situación? ¿Fue correcta la que se realizó? ¿Usaría antibióticos en este caso? ¿Cuáles son los factores que tendría en cuenta para la prevención de la diarrea infecciosa? • CASO 2. Lactante de cinco meses, sexo femenino, procedente de un medio socioeconómico deficitario, alimentado artificialmente. Cursa desde hace unos días un cuadro respiratorio caracterizado por rinitis serosa y tos seca. Comienza hace 24 hs con rechazo del alimento, fiebre y vómitos abundantes. Agrega en las últimas horas deposiciones líquidas (5 a 6 en 12hs). Debido a que las deposiciones aumentan en cantidad y frecuencia la madre consulta, constatándose en la puerta de emergencia signos de deshidratación. PRÁCTICO. En las placas de agar Mac Conkey y SS no se observa crecimiento alguno. PREGUNTAS ¿Por qué cree usted que no hubo crecimiento en las placas? ¿Estaba justificada acá la realización de un coprocultivo? ¿Cuáles pueden ser los gérmenes involucrados en este caso? Si a usted le interesara epidemiológicamente pedir un diagnóstico, ¿qué otros métodos de estudio emplearía para buscar el germen responsable? 186 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA • CASO 3. Paciente de nueve meses, sexo femenino, procedente del interior, de medio socioeconómico aceptable. Bien alimentado. Presenta desde hace 15 días fiebre, dificultad para alimentarse y rinitis serosa. Hace dos días comienza con deposiciones líquidas, cinco a seis por día, sin elementos anormales. Consulta la madre, y se le indica sales de rehidratación oral (SRO) luego de cada deposición. Continúa igual, agregando hace 24 horas deposiciones con estrías de sangre. Antes de la consulta, sufre un episodio convulsivo de tres a cuatro minutos de duración. La madre relata que desde hace varias horas no orina, y que lo nota muy pálido. Al examen físico: deprimido, febril. Palidez cutaneomucosa. Sin signos de deshidratación. Pañal sin deposiciones ni orina. Con el diagnóstico presuntivo de síndrome hemolítico urémico se interna en Cuidados Intensivos, donde se recogen materias que se envían al Departamento de Bacteriología y Virología del Instituto de Higiene. PRÁCTICO. Se observan placas sembradas de agar Mac Conkey y SS. De colonias lactosa positivas se inocularán tubos de Agar Infusión, citrato y lisina. Se mostrará verotoxicidad de las materias fecales. Fotos de PCR. DISCUSIÓN. Se hablará de las posibles etiologías del SHU, su patogenia, epidemiología, y pasos a seguir en el diagnóstico. • CASO 4. Paciente de 3O años con antecedentes patológicos de gastritis. Regresa de un viaje por Centroamérica. Comienza a las 48 hs con deposiciones líquidas abundantes, acuosas, de color amarillento parduzco. Concomitantemente, decaimiento y dolor abdominal. Todo cursa en apirexia. Agrega vómitos y continúa con deposiciones que cada vez son más frecuentes y más abundantes. Se queja de calambres. Es trasladado a la emergencia donde se constatan signos de deshidratación y acidosis metabólica. Se comienza el tratamiento en base a fluidos por vía intravenosa y vía oral con SRO, requiriéndose en primera instancia dos litros de suero y electrolitos. Se recogen materias para un coprocultivo. Se trata además con antibióticos, y evoluciona satisfactoriamente. En el cultivo crece V. cholerae. PRÁCTICO. Observación de colonias de Vibrio en agar TCBS (medio selectivo, y diferencial que contiene tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa). Prueba de la Oxidasa. Sensibilidad al compuesto O/129 en disco. Comportamiento en medio de TSI (sacarosa positivo). PREGUNTAS ¿Es importante aquí la realización de un coprocultivo?, ¿por qué? ¿Todas las cepas de V. cholerae son capaces de causar cólera? ¿Cómo se trasmite? y ¿cuáles son las medidas que usted y la comunidad deben tomar para prevenirlo? • CASO 5. A.S., 25 años, sexo femenino, residente de Montevideo, regresa de un viaje con sus compañeros de estudio a una ciudad del interior. A las 48 horas de haber ingerido milanesas con ensalada rusa en un restaurante de la zona, comienza con sensación nau- TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 187 seosa y vómitos, agregando a las pocas horas cólicos abdominales y deposiciones líquidas abundantes, al igual que la mayoría de sus compañeros. Al examen físico: paciente intensamente dolorida, con fiebre de 38º C axilar. Abdomen: dolor a la palpación en zona periumbilical y en fosa ilíaca derecha. No presenta defensa ni contractura. Se realizó tratamiento en base a fluidos por vía intravenosa y electrolitos. El coprocultivo muestra a las 24 hs el desarrollo de bacterias lactosa negativas H2S positivas, que estudiadas revelan ser Salmonella enteritidis. PRÁCTICO. Observaremos en medios de Mac Conkey y en SS las colonias sospechosas. Se realizará la siembra de esas colonias en TSI y fenilalanina, como paso inicial de identificación. PREGUNTAS ¿Cuál cree usted que fue la causa de la infección por Salmonella? ¿Cuál es el mecanismo patogénico del germen como productor de gastroenteritis? ¿Conoce otros métodos de estudio, que puedan complementar los ya vistos? ¿Qué medidas pueden tomarse para evitar este tipo de infecciones? 188 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 189 Página 189 11 Infección urinaria M. Torres, A. Mattera Generalidades Se considera infección urinaria a la presencia de bacterias en sectores normalmente estériles del aparato urinario, con la consiguiente respuesta inflamatoria. Las infecciones urinarias (IU) constituyen una patología muy frecuente, de elevada morbilidad, en muchos pacientes son recurrentes o pueden determinar complicaciones graves como sepsis o secuelas importantes, como daño renal. Desde el punto de vista anatómico, cabe recordar la división del tracto urinario en dos sectores, alto (riñones, pelvis renales y uréteres) y bajo (vejiga y uretra). Definiciones • Bacteriuria: presencia de bacterias en la orina. • Bacteriuria sintomática o asintomática: según se acompañe o no de síntomas vinculados al aparato urinario. • Bacteriuria significativa: número de bacterias por mililitro de orina que se corresponde estadísticamente con una infección urinaria. En los años 50, Kass definió el recuento de 100.000 o más colonias por ml de orina (105 ufc/ml) como criterio de bacteriuria significativa, o sea indicadora de IU verdadera. Este criterio fue establecido comparando el número de bacterias por ml de orina en muestras obtenidas por punción suprapúbica (PSP) y chorro medio en mujeres con pieloniefritis sintomática. Con el correr del tiempo, otros autores han propuesto niveles menores para el diagnóstico de bacteriuria significativa, en ciertas poblaciones de pacientes sintomáticos, por ejemplo 103 ufc/ml y 102 ufc/ml. Bajos recuentos bacterianos podrían deberse también a IU por cocos grampositivos, diuresis forzada, antimicrobianos suministrados previamente, contaminación de la muestra, o muestras tomadas muy al inicio de la enfermedad. Es importante recordar que también se observan recuentos bajos en IU adquiridas por vía hematógena. Epidemiología La prevalencia de IU varía con el sexo y la edad. En recién nacidos y lactantes son más comunes en varones y suelen asociarse a anomalías congénitas. Ya en edad escolar predominan en mujeres, lo cual se mantiene durante la edad adulta. Algunas condiciones como el embarazo 190 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA y la diabetes, se asocian a una mayor incidencia. En la vejez, las tasas de IU son mayores en mujeres pero se observa un aumento de los casos en hombres, asociado a enfermedades tales como pobre vaciamiento vesical debido a prolapso uterino o uropatía obstructiva por enfermedad prostática. Flora del tracto urinario Como se mencionó en el correspondiente capítulo, el tracto urinario es estéril, salvo el sector distal de la uretra, que se encuentra colonizado por bacterias procedentes de piel y perineo adyacentes (Corynebacterium spp, Lactobacillus spp, S. epidermidis, enterobacterias, etc.). Agentes etiológicos En la gran mayoría de los casos, se trata de infecciones monomicrobianas y predominan los bacilos gramnegativos. Los agentes pueden variar según la edad, sexo y patología subyacente. El agente más frecuente es Escherichia coli. En las infecciones de pacientes ambulatorios predomina E. coli, seguido de Klebsiella spp., Proteus spp. y otros bacilos gramnegativos y cocos grampositivos, como S. saprophyticus, Enterococcus spp. y Streptococcus agalactiae. Proteus spp. suele asociarse a anomalías de la vía urinaria, especialmente litiasis. Más raramente Haemophilus influenzae se aísla de infecciones comunitarias. En infecciones hospitalarias, pacientes con enfermedad urológica subyacente o portadores de sondas, la frecuencia relativa de E. coli disminuye y se aíslan Pseudomonas spp., otros bacilos gramnegativos no fermentadores, enterobacterias como Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia spp. y levaduras. Suele tratarse además de cepas más resistentes a los antibióticos. Infecciones por S. aureus o Salmonella spp. indican generalmente infección renal metástasica en el curso de una bacteriemia. Cabe recordar que Mycobacterium tuberculosis también puede producir infección renal por vía hematógena. Las IU polimicrobianas son excepcionales y se observan en sondados o pacientes con fístulas que comunican la vía urinaria con intestino o vagina. Adenovirus tipo 11 causa cistitis hemorrágia epidémica, especialmente en niños varones. Chlamydia trachomatis produce uretritis que será tratada en otro capítulo. El papel de otros agentes (Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum) ha sido postulado, pero no del todo aclarado. Patogenia En la gran mayoría de los casos, la IU es causada por microorganismos del tubo digestivo del propio paciente, que alcanzan el tracto urinario por la vía ascendente. Más raramente lo hacen por vía hematógena, en el curso de una bacteriemia a partir de un foco a distancia. Una vez en la vía urinaria deben ser capaces de adherirse y multiplicarse. Como en otros casos, que se desarrolle o no IU depende de los mecanismos de defensa del huésped y los atributos patogénicos del germen. Los mecanismos de defensa del tracto urinario son los que se enumeran a continuación. 1. El libre flujo de orina, el vaciamiento vesical periódico, determina un lavado por arrastre que impide que gérmenes con escasa afinidad por el urotelio lo colonicen. El flujo urinario comprometido de forma mecánica o funcional es la condición predisponente más común en pacientes con infección urinaria. Esta obstrucción puede deberse a cálculos, hipertrofia prostática, etc. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 191 2. Normalmente, la válvula vesicoureteral previene el reflujo de orina de la vejiga hacia sectores más altos. Alteraciones funcionales o anatómicas de esta determinan un mayor riesgo, que se observa especialmente en la infancia. 3. La proteína de Tamm Horsfall, presente en la orina, contiene numerosos residuos de manosa que inhiben competitivamente la adherencia mediada por los pili manosasensibles. 4. La mucosa intacta es también una efectiva barrera frente a la colonización. Algunas bacterias como S. saprophyticus requieren la presencia de fibras de colágeno que se exponen en la superficie luego de microtraumatismos (durante las relaciones sexuales), lo que explicaría la presencia de este agente en IU en mujeres en edad genital activa. 5. Ciertas características de la orina normal como la elevada osmolaridad, el contenido de urea y el pH ácido, inhiben el crecimiento bacteriano. 6. El pH ácido de la vagina, determinado por la flora normal en la mujer y la actividad antimicrobiana de las secreciones prostáticas en el hombre contribuyen también a dificultar la colonización perineal por potenciales patógenos. Además de los pacientes con obstrucción al flujo de orina, se encuentran predispuestos: a) Los diabéticos con descontrol metabólico, la glucosuria favorece el desarrollo bacteriano. b) Embarazadas, ya que durante esa etapa existe un mayor riesgo de infección urinaria debido a factores mecánicos (disminución de la capacidad vesical provocada por la expansión del útero, la presencia de hidrouréter, la disminución de la peristalsis y atonía ureteral) y también factores hormonales que determinan cambios (metaplasia de células del uroepitelio, aumento del tamaño renal y disminución de la capacidad de concentrar). Eventualmente, la presencia de glucosuria, en pacientes con diabetes gestacional contribuye también a un mayor riesgo. Además la asociación de bacteriuria (sintomática o no) con parto prematuro y bajo peso al nacer, ha sido fehacientemente demostrada, por ello se recomienda la detección sistemática de la bacteriuria, como rutina de embarazo. c) Niños portadores de reflujo vesicoureteral y otras anomalías. Se estima que hasta un 50% de los niños con IU tienen reflujo. d) Pacientes con vejiga neurógena en los que el incorrecto vaciado determina orina residual vesical que se coloniza fácilmente. Mecanismos de virulencia Las cepas de E. coli uropatógenas (UPEC) suelen diferir de otras cepas de E. coli que integran la flora fecal y no se encuentran como agentes de IU (no uropatógenas). Cepas de UPEC demuestran una mayor capacidad de adherencia a células del epitelio vaginal y urinario, resistencia al poder bactericida del suero, producción de hemolisina, y mayor producción de antígeno capsular (antígeno K). Pertenecen además a un limitado número de serogrupos (O1,O2, O4, O6, O7, O8, O9, O11, O18, O22, O25, O62 Y O75) . La adherencia es importante no solo en la infectividad, sino que ciertas cepas exhiben una mayor capacidad de producir IU altas. La adhesión está mediada por ligandos específicos que se unen a receptores del huésped. Esos ligandos son pequeñas proteínas localizadas en los pili. Pili tipo 1: presente en muchas enterobacterias, se une a residuos manósidos presentes en las células del huésped. Esa unión puede ser inhibida competitivamente por la manosa, por lo que 192 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA se denominan manosa sensibles. Se cree que no son las adhesinas más importantes. Fimbrias P: no se inhibe su unión por manosa, por lo que se denominan manosa resitentes. Son expresadas por el 90% de las cepas que causan infecciones altas. Anticuerpos anti fimbrias P impiden el desarrollo de pielonefritis en modelos animales. Otras adhesinas manosarresistentes como adhesinas X, han sido identificadas. La adhesión mediante fimbrias probablemente también esté presente en infecciones causadas por Klebsiella spp. o S. saprophyticus. Una vez que la bacteria logra adherirse intervienen otros factores. La hemolisina, presente en cepas UPEC, sería importante en el daño celular y en lograr que exista hierro disponible para la bacteria. La aerobactina es un sideróforo, proteína que proporciona hierro a la bacteria. El antígeno K, como en otros casos, su cápsula inhibe la fagocitosis. La endotoxina o LPS contribuye a la inflamación a nivel renal y a las manifestaciones sistémicas en pacientes sépticos. La ureasa, producida por Proteus spp., es una enzima que desdobla la urea presente en la orina en amonio y dióxido de carbono, determinando una elevación del pH urinario. El medio más alcalino da como resultado la precipitación de sales de calcio y magnesio y la formación de cálculos, que a su vez sirven como reservorio de bacterias. También producen ureasa aunque en menor cantidad, Klebsiella spp. y S. saprophyticus. Las cepas aisladas de pacientes con IU y patología urológica subyacente suelen exhibir menos atributos de virulencia. Manifestaciones clínicas Clásicamente la presencia de fiebre y dolor en una o ambas fosas lumbares se considera indicadora de pielonefritis, en tanto la disuria y la polaquiuria serían propias de la cisititis. Debido a diferencias terapéuticas y pronósticas de las infecciones altas y bajas, se han hecho numerosos esfuerzos en intentar localizar la altura de la infección sin que ninguna técnica fuera lo suficientemente práctica para su uso rutinario. Si bien los signos y síntomas pueden sugerir la localización de la infección (alta o baja), no son específicos. Es bueno entonces recordar que las manifestaciones clínicas no siempre permiten establecer un diagnóstico preciso de localización. En base a la presencia o ausencia de condiciones subyacentes que favorezcan la infección es clásico clasificar a las IU en complicadas y no complicadas. • Cistitis aguda: ocurre principalmente en mujeres jóvenes sin patología subyacente. Se manifiesta por ardor miccional, disuria, polaquiuria, eventualmente hematuria y dolor suprapúbico. El diagnóstico diferencial se debe establecer con otras causas de disuria (vaginitis y uretritis). Se estima que entre 10% y 35% de las pacientes con este cuadro clínico presentan además infección renal oculta. • Pielonefritis aguda no complicada: característicamente los pacientes se presentan con dolor en fosas lumbares, asociado a síntomas sistémicos como fiebre, vómitos, etc., pudiendo o no presentar síntomas concomitantes de cistitis. El cuadro clínico puede ser de gravedad variable, incluyendo sepsis y shock séptico. • IU complicadas: en este grupo se consideran todas las infecciones en pacientes de sexo masculino y las de mujeres con factores predisponentes. Suelen presentarse de manera menos típica, las complicaciones y las fallas terapéuticas son más frecuentes. • Síndrome uretral agudo: definido como el que se presenta en mujeres jóvenes que tienen disuria y piuria con urocultivos con recuentos menores a 105 ufc/ml. Este síndrome puede deberse a uretrocistitis (por E.coli, etc.) o a otras causas (vaginitis, infección por N. gonorrhoeae, C. trachomatis o herpes genital). De acuerdo a Stam y cols. en estas pacientes, recuentos tan bajos como 102 ufc/ml son significativos. • Prostatitis: la prostatitis aguda se presenta con fiebre y dolor perineal y lumbar y dolor a la TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 193 palpación prostática. Usualmente es debida a E.coli o más raramente a N. gonorrhoeae en jóvenes. La prostatitis crónica se manifiesta con síntomas menos precisos o por bacteriuria recurrente. Para el tratamiento se requieren drogas que alcancen buena concentración en el tejido prostático (trimetoprim-sulfa, quinolonas fluoradas) por períodos prolongados. • IU en el paciente sondado: luego de colocada la sonda, la probabilidad de desarrollar bacteriuria aumenta con los días de permanencia. Habitualmente el paciente está asintomático. Sin embargo, la bacteriuria asociada a sonda vesical constituye una causa muy importante de infección hospitalaria y bacteriemia por gramnegativos. Los gérmenes ingresan a la vía urinaria en el momento de la inserción de la sonda, por vía periuretral o bien contaminando el sistema de drenaje. Por ello, las medidas de prevención más importantes son extremar las medidas de antisepsia al colocar la sonda, preferiblemente por personal bien entrenado, maximizar la higiene del área perineal y del meato uretral y mantener el sistema colector cerrado. Diagnóstico de laboratorio • Pruebas de tamizaje: son pruebas rápidas, que permiten una orientación inicial; es conveniente realizarlas en orina de chorro medio. • Estearasas leucocitarias: son enzimas presentes en leucocitos, indican piuria, en general asociada a infección urinaria, pero que también pueden obedecer a otras causas. Un resultado positivo se correlaciona con la presencia de más de 10 leucocitos por campo. Pueden presentar falsos positivos debido a albuminuria, ácido ascórbico, detergentes, o bien inflamación de otra causa o contaminación con secreciones vaginales. Los falsos negativos se deben a la presencia de menos de 10 piocitos por campo y demoras en el procesamiento (luego de 3 horas 35% pasan a ser negativos) • Prueba de nitritos: presentes en la orina por la reducción de nitratos a nitritos ocasionada por bacterias nitratorreductasa positvas (Enterobacteriaceae). Falsos positivos pueden ser debidos a demoras en el transporte, sobrecrecimiento bacteriano, ciertas drogas, etc.; falsos negativos se ven en infecciones causadas por Enterococcus spp. y otros gérmenes nitratorreductasa negativos, y en pacientes con dieta con escasos nitratos. La realización simultánea de estos dos test (disponibles en tiras reactivas comerciales) tiene una sensibilidad y especificidad elevadas si se los compara con recuentos de 105 colonias por ml de orina, pero la sensibilidad es menor para recuentos más bajos. UROCULTIVO Es el cultivo de la orina, que debe ser obtenida en condiciones especiales para evitar la contaminación con flora de la uretra distal y el perineo. El método elegido para la toma de la muestra dependerá del paciente. Como en todo estudio microbiológico se deben recordar ciertas premisas básicas. • La muestra debe provenir del sitio de infección. • Se debe evitar la contaminación con flora normal adyacente. • Recoger la muestra previo a la administración de antimicrobianos. • Adjuntar boleta con datos del paciente, datos clínicos y forma de obtención. • No enviar muestras en colectores, mal tapadas, sucias o derramadas. 194 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Para urocultivo se prefiere utilizar como contenedor un frasco estéril, boca ancha, tapa de rosca, correctamente rotulado. a) Chorro medio: es un método no invasivo que consiste en recoger la porción media del chorro de orina emitida en forma espontánea, descartando la porción inicial para eliminar la flora. Es preferible la primera orina de la mañana o al menos tres horas de retención (orina preincubada). Se debe indicar al paciente lavar la zona genital con abundante agua y jabón, enjuagarse con abundante agua, comenzar a orinar descartando el primer chorro, sin detener la micción recoger únicamente la parte media del chorro de orina en el frasco sin tocar la piel, cerrar bien el frasco, rotularlo. Si el procedimiento no se realiza correctamente, la orina se contaminará y el examen deberá repetirse. Los cultivos de orina polimicrobianos suelen indicar contaminación. Significan una pérdida, ya que aumentan los costos de la atención médica y retrasan la terapéutica. La cooperación del paciente mejora los resultados, para ello se le deben brindar instrucciones por escrito, en forma clara y sencilla, especialmente para pacientes ambulatorios. Esto evita el uso de técnicas de recolección invasivas, disminuye las repeticiones y mejora el tiempo de devolución del resultado. Los servicios con porcentajes elevados de repetición de urocultivos deben revisar su técnica de recolección. En algunos pacientes se presentan dificultades. En lactantes y niños sin control de esfínteres se debe esperar a que el niño orine, (recolección “al acecho”), a veces son necesarias dos muestras. De todos modos, la muestra obtenida mediante bolsas colectoras se desaconseja debido a que se contamina con facilidad. En embarazadas: en el último trimestre por el aumento de la altura uterina y la mayor frecuencia de la micción son frecuentes estudios contaminados. En pacientes ancianos, que no colaboran o que tienen patología de cadera, etc. b) Punción suprapúbica: constituye el “patrón de oro”, ya que se obtiene la muestra directamente de la vejiga, es relativamente sencilla en lactantes menores de un año. Realizada por un médico entrenado presenta escasas complicaciones. Especialmente indicada en niños graves, urocultivos anteriores no concluyentes, diarrea, vulvitis, etc. La desventaja es que se trata de un método invasivo. Las ventajas son que permite documentar infecciones con bajo recuento bacteriano e infecciones por anaerobios (muy raras). c) Cateterización vesical: la colocación de sonda vesical con el único fin de obtener una muestra para urocultivo se desaconseja, debido al riesgo de infección ascendente iatrogénica. Debe reservarse para indicaciones puntuales y ser realizada por personal bien entrenado. d) Punción de sonda vesical: en pacientes sondados se puede obtener orina pinzando la sonda y luego puncionando con jeringa y aguja por encima, previa desinfección de la sonda. Debido a que los pacientes sondados a permanencia desarrollan invariablemente colonización de la sonda y bacteriuria, estos urocultivos son de muy escaso valor. e) Diagnóstico de tuberculosis: la tuberculosis renal es paucibacilar, por lo que se requieren cinco muestras de orina de chorro medio, recogidas en días sucesivos, con volumen no menor a 50 ml, que será concentrado mediante centrifugación. Luego se realizarán coloraciones y siembra en medios adecuados. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA Como en todos los casos, es preferible enviar la muestra al laboratorio de inmediato, dentro de las dos horas, de lo contrario mantenerla refrigerada (4ºC a 8 ºC) no más de 24 horas, para no alterar el recuento bacteriano. 195 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA PROCESAMIENTO INICIAL La interpretación del urocultivo por chorro medio implica un resultado cuantitativo, por lo que es elemental sembrar un volumen conocido de orina. Esto se logra mediante el uso de ansas bacteriológicas calibradas que cargan un volumen conocido; por ejemplo 10 o 100 microlitros. El número de colonias obtenidas (unidades formadoras de colonias) es luego multiplicado por el número de veces que el inóculo entra en 1 ml. Medios de cultivo empleados: deben permitir el desarrollo de los patógenos más frecuentes. Se usan en general agar sangre ovina (medio no selectivo, permite apreciar características coloniales, determinar la hemólisis, etc.) en combinación con agar Mac Conkey lactosa (selectivo y diferencial para bacilos gramnegativos no exigentes). También agar CLED (agar cisteína lactosa, deficiente en electrolitos) es un medio diferencial que inhibe el “hauch” de Proteus spp. Las placas son incubadas en atmósfera aerobia y examinadas a las 24 y 48 horas. INTERPRETACIÓN DEL UROCULTIVO Para el caso de pacientes con síntomas es suficiente con una muestra por chorro medio para la interpretación del estudio, y es por ello que se considera imprescindible contar con el dato clínico. Pueden requerirse muestras repetidas para el diagnóstico de pacientes asintomáticos. La especificidad aumenta al repetir la muestra. Nº de cultivos Especificidad 1 muestra 85% 2 muestras 95% 3 muestras 100% Es fundamental saber como se recolectó la muestra (chorro medio, punción suprapúbica, punción de sonda vesical, etc.), si el paciente tenía o no síntomas, el volumen sembrado y si se aisla un probable patógeno urinario o un contaminante. Recuento de bacterias por volumen de orina: se considera en la orina obtenida por chorro medio; en la orina de punción vesical todo recuento es significativo. Si se siembran 100 microlitros (ansa 0,1 ml), se multiplica por 10 (cada colonia representa 10 colonias/ml). Si se usa un ansa de 10 microlitros (0.01 ml) cada colonia representa 100 por ml de orina. Recuento Dato clínico Muestra Conducta > 10 ufc/ml, 1 o 2 probables patógenos Sintomático Chorro medio, sonda vesical Identificación Antibiograma > 103 ufc/ml 1 probable patógeno Sintomático Sexo masculino Chorro medio, sonda vesical Identificación Antibiograma Tres o más organismos Chorro medio, sonda vesical Ninguno, repetir > 102 ufc/ml probable patógeno (1 o más gérmenes) Punción suprapúbica, nefrostomía, cistoscopia Identificación Antibiograma 4 Tabla adaptada de: Clinical Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology 196 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Principios generales de terapéutica antimicrobiana El tratamiento antimicrobiano de las infecciones urinarias se basa en los siguientes principios. • Las drogas a utilizar deben alcanzar buena concentración en orina. En la infección urinaria no complicada, el éxito terapéutico se correlaciona con la concentración inhibitoria alcanzada en orina, más que en plasma. Algunas drogas son solamente bacteriostáticas o activas exclusivamente en el tracto urinario. • Las más empleadas son quinolonas, algunos betalactámicos, trimetoprim sulfa, nitrofurantoína y aminoglucósidos. • El tratamiento empírico es en general necesario, hasta obtener el resultado del urocultivo. (habitualmente 48 horas). Se deben elegir drogas cuyo espectro cubra los posibles agentes etiológicos, con menores efectos tóxicos, con menor costo y con mínimo efecto sobre la flora normal. Además se deben conocer datos epidemiológicos de sensibilidad y resistencia a nivel local. • La duración del tratamiento en la cisititis actualmente se acepta debe ser no menor a tres días. Planes terapéuticos de menor duración tienen una tasa inaceptable de recaída. • De acuerdo a la gravedad del cuadro clínico, la pielonefritis puede requerir hospitalización o ser tratada en forma ambulatoria. La duración no debe ser menor a 14 días. Es imprescindible realizar urocultivo. • Bacteriuria asintomática: existe evidencia de que el tratamiento es necesario en embarazadas, niños y pacientes con neutropenia o trasplante renal. Para adultos fuera del embarazo, especialmente los sondados, no hay evidencia de que el tratamiento de la bacteriuria asintomática sea beneficioso. Bibliografía • Kunin CM. Urinary Tract Infections: Detection, Prevention and Management. 5th. Edition. 1997. Williams & Wilkins • Isenberg H. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 1992. American Society for Microbiology Press • Koneman E. Diagnóstico Microbiológico, Atlas Color y Texto 5ta. ed. 1999 Editorial Medica Panamericana. • Weissfeld A. Cumitech 2B: Laboratory Diagnosis of Urinary Tract Infections. 1998. ASM Press. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 197 Página 197 12 Bacteriemias y sepsis. Endocarditis M. Macedo, G. Algorta, M. Vola, L. Pardo Definiciones Clásicamente se ha definido como sepsis a la respuesta inflamatoria sistémica frente a una infección. En los últimos años, a medida que se ha ido dilucidando la patogenia de esta entidad, han surgido nuevos términos para describir sus diferentes estadíos, lo que ha resultado en denominaciones confusas que es preciso aclarar para comprender cuando nos encontramos frente a un paciente con sepsis. • Bacteriemia: simplemente implica la presencia de bacterias en la sangre, independientemente de su magnitud, persistencia o respuesta que provoca en el huésped. Se encuentran tres patrones diferentes: 1) transitoria, la que ocurre luego de la manipulación de tejidos infectados (abscesos, forúnculos, celulitis), instrumentación sobre superficies mucosas infectadas (extracción dentaria, cistoscopia, cateterización ureteral, aborto aspirativo) y cirugía de sitios contaminados; 2) intermitente, debida a abscesos intraabdominales o viscerales no drenados, osteomielitis, artritis, meningitis, neumonia; 3) continua, es la característica principal de la endocarditis bacteriana y otras infecciones endovasculares. También se observa en las primeras semanas de la fiebre tifoidea y brucelosis. Otro patrón se observa en pacientes que están recibiendo antibióticos por vía sistémica, para los cuales el microorganismo infectante es sensible (“breakthough” bacteriemia): cuando ocurre en etapas tempranas de la terapéutica se debe generalmente a concentraciones inadecuadas del antibiótico, y cuando ocurre más tardíamente se debe habitualmente a inadecuado drenaje del foco infeccioso o deterioro de las defensas del huésped. • Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS): es un síndrome que se define por la presencia de por lo menos dos de las siguientes manifestaciones: 1) fiebre mayor a 38ºC o hipotermia menor a 36ºC; 2) frecuencia cardíaca mayor a 90 cpm; 3) frecuencia respiratoria mayor a 20 rpm, o pCO2 menor a 32 mm de Hg; leucocitosis mayor a 12.000 o menor a 4.000/mm3; o más de 10% de formas inmaduras. Este síndrome pude obedecer a causas infecciosas o no infecciosas (traumas, quemaduras, etc.). • Sepsis: es un SIRS que responde a una infección; por lo tanto, SIRS es una entidad amplia que incluye a la sepsis. Los pacientes con sepsis reúnen los cuatro criterios de SIRS; esta forma de identificar clínicamente a los pacientes con sepsis es bastante sensible, sin embargo es muy poco específica. La comprobación de bacteriemia en un paciente con SIRS sella el diagnóstico de sepsis. 198 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA • Shock séptico: es la situación de sepsis asociada a hipotensión, pese a una adecuada reposición de fluidos. • Septicemia: es un término que ha caído en desuso pero que algunos autores todavía utilizan, refiriéndose a un síndrome severo asociado con evidencia de infección aguda y falla orgánica relacionada con la liberación de mediadores del tipo de las citoquinas en la circulación. Estas definiciones surgidas de un consenso en el año 1991, son discutidas por varios investigadores, quienes consideraban que estos términos son demasiado amplios y poco específicos para la gran heterogeneidad de pacientes que son clasificados de acuerdo a las mismas. Dichos autores sugieren una revisión planteando que el principal defecto radica en que las definiciones describen síndromes clínicos más que procesos fisiopatológicos y que por ese motivo las estrategias terapéuticas no tienen el mismo efecto en todos los pacientes clasificados dentro de una misma definición. Importancia La sepsis es una de las principales causas de muerte en unidades de cuidado intensivo; la mortalidad varía entre 20% y 90%, dependiendo de factores como los siguientes. • Tratamiento antibiótico instituido. • Microorganismo responsable: se atribuye mayor mortalidad a la sepsis causada por Enterococcus, bacterias gramnegativas y hongos. • Edad: los pacientes mayores de 40 años son los de mayor riesgo. • Foco infeccioso primario: es mayor cuando el foco es respiratorio; le siguen en orden decreciente de mortalidad el origen cutáneo, abdominal, desconocido y urinario. • Entorno en el que se adquiere la infección: la de origen nosocomial conlleva mayor mortalidad que la comunitaria. • Magnitud de la bacteriemia. • Naturaleza de la bacteriemia: la bacteriemia polimicrobiana es muy poco frecuente pero mucho más grave que la monomicrobiana. • Presencia de enfermedades subyacentes y su severidad. • Complicaciones de la sepsis: principalmente shock y su severidad. Sin duda, el reconocimiento temprano y su tratamiento antes de llegar a la etapa de shock, es de fundamental importancia para reducir la mortalidad. El diagnóstico de laboratorio de sepsis plantea una serie de problemas que se discutirán posteriormente. Etiopatogenia La sepsis puede tener origen en infecciones bacterianas, virales, fúngicas y parasitarias. En la era preantibiótica, los microorgansimos gramposistivos eran los principales responsables. En el inicio de la era antibiótica comenzaron a observarse bacteriemias por gramnegativos que incluso superaron en número a las causadas por grampositivos. En los últimos tiempos asistimos a la reemergencia de gérmenes grampositivos como importantes agentes de sepsis. El cambio fundamental que se observó en la década de los 90 es el aumento dramático en la incidencia de Staphylococcus coagulasa negativos como agentes significativos de bacteriemia; esto ha generado dificultades en la interpretación de los hallazgos de laboratorio, ya que la mayoría de ellos continúa representando contaminaciones más que TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 199 bacteriemias verdaderas. Los principales agentes de bacteriemia encontrados entre los años 1992 y 1993 en Estados Unidos son: S. aureus, E. coli, Staphylococcus coagulasa negativos, K. pneumoniae, Enterococcus spp., P. aeruginosa, S. pneumoniae, Streptococcus del grupo viridans y E. cloacae. En términos generales, las condiciones que predisponen a bacteriemia y fungemia incluyen: • Edad extrema: los recién nacidos prematuros presentan especial riesgo. • Enfermedades subyacentes, principalmente neoplasias hematológicas y no hematológicas, diabetes, insuficiencia renal en etapa de diálisis, cirrosis hepática, síndromes de inmunodeficiencia y condiciones que alteran la barrera cutánea (quemaduras graves, úlceras por decúbito). • Procedimientos invasivos como la colocación de catéteres, sobre todo vasculares, cirugía de cualquier tipo, pero sobre todo del tracto digestivo y genitourinario, endoscopia gastrointestinal o genitourinaria. • Medicación: fármacos inmunosupresores (corticoides, citotóxicos); tratamiento con antibióticos excesivo o inadecuado. Aunque es imposible predecir clínicamente el tipo de germen que causa la sepsis, el conocimiento de factores favorecedores puede orientar a microorgansimos de particular importancia. Por ejemplo: en pacientes esplenectomizados son frecuentes por gérmenes encapsulados (S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis); en cirróticos son frecuentes enterobacterias, vibrios, gérmenes encapsulados; en diabéticos se ve Pseudomonas spp., S. aureus, Candida spp.; en alcohólicos predominan Klebsiella pneumoniae, S. pneumoniae; en neutropénicos son comunes enterobacterias, S. aureus, Pseudomonas spp., Candida spp.; en pacientes tratados crónicamente con esteroides se observan Mycobacterium spp., hongos, Herpesvirus. Mediadores de la respuesta inflamatoria: la respuesta sistémica del organismo a una agresión como la infección involucra una complicada cascada de eventos que culminan en compromiso hemodinámico y daño orgánico. La inflamación localizada representa un intento del organismo de contener estos mecanismos ofensivos. Cuando la respuesta inflamatoria ya no puede ser contenida y los mecanismos de regulación se ven superados pueden tener lugar complicaciones sistémicas como la sepsis. Las toxinas bacterianas tienen un rol preponderante en el desarrollo de sepsis. En las bacterias gramnegativas el lipopolisacárido (LPS), que se localiza en la membrana externa de la pared celular, tiene actividad endotoxina y es el componente vinculado a la sepsis por estas bacterias. El LPS posee tres constituyentes: antígeno O, core polisacárido y un fosfolípido en base a glucosamina llamado lípido A; este último posee la principal actividad tóxica del complejo LPS. Cuando las bacterias gramnegativas invaden el torrente sanguíneo y ocurre su destrucción, el LPS es liberado y se une a una proteína fijadora de LPS (LBP). El complejo LPS-LBP adhiere a un receptor de macrófagos unido a la membrana denominado CD14. Este mecanismo dispara la liberación de una cascada de mediadores inflamatorios farmacológicamente activos por parte de las células del huésped. Se cree que los más importantes dentro de estos mediadores son el factor de necrosis tumoral alfa (alfa-TNF) y la interleuquina-1 (IL-1), pero también están involucrados el factor de activación plaquetaria, leucotrienos, otras interleuquinas y varias moléculas de adhesión celular. Las cascadas del complemento y la coagulación son afectadas por la endotoxina a través de la activación del factor Hageman (factor XII). El resultado final de la activación de los mediadores de la sepsis es el compromiso hemodinámico y la falla orgánica. El alfa-TNF y las interleuquinas afectan el metabolismo 200 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA del ácido araquidónico resultando en la producción de leucotrienos, tromboxano A2 y prostaglandinas que aumentan la permeabilidad vascular y provocan vasodilatación. Además se cree que el TNF es un buen depresor miocárdico. El óxido nítrico es liberado por macrófagos y células endoteliales, cuya producción es inducida por la endotoxina, siendo un potente vasodilatador. Los neutrófilos estimulados liberan enzimas y radicales de oxígeno que aumentan el compromiso vascular y tisular. La agregación plaquetaria y la activación de las cascadas de la coagulación y el complemento conducen a la coagulación intravascular diseminada. Los ácidos teicoicos de la pared celular grampositiva tienen la propiedad de unirse a la LBP e inducir sepsis. Algunas exotoxinas también pueden desencadenar una respuesta inflamatoria sistémica, por ejemplo la toxina del shock tóxico por S. aureus. Diagnóstico de bacteriemia El diagnóstico de laboratorio de bacteriemia se realiza mediante hemocultivo. Se denomina hemocultivo a la cantidad de sangre que se extrae de un único sitio de venopunción; este volumen de sangre se inocula en uno o más frascos de cultivo y constituye una muestra. Existen muchos métodos de hemocultivo, desde el método manual convencional, hasta modernos métodos automatizados que son los más utilizados hoy en día. En todos ellos se deben tener en cuenta una serie de condiciones estandarizadas que permiten obtener resultados interpretables. PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIÓN Y TRANSPORTE Siempre que sea posible, la sangre para hemocultivo debe ser extraída por punción de vena periférica y no a través de catéteres vasculares. Antes de realizar la venopunción se debe realizar la correcta antisepsia de la piel y la desinfección de los tapones de los frascos de hemocultivo. La venopunción puede realizarse de varias maneras, pero se desaconseja la extracción directa en el frasco de cultivo, ya que el efecto de vacío puede provocar la aspiración de un volumen mayor del deseado, y además existe riesgo de reflujo del caldo de cultivo hacia la vena del paciente. Aunque es discutido, en general se recomienda no cambiar la aguja para inocular el frasco de hemocultivo, ya que no se ha demostrado que disminuya el porcentaje de contaminaciones y aumenta el riesgo de accidentes laborales. Las muestras deben enviarse al laboratorio lo antes posible. Pueden permanecer a temperatura ambiente por cortos períodos de tiempo; nunca se deben refrigerar. NÚMERO DE CULTIVOS Con volúmenes de sangre apropiados, dos o tres muestras de hemocultivo son suficientes para detectar la mayoría de los episodios de bacteriemia (más del 95%). En endocarditis con dos muestras se obtiene el germen en un 98% de las situaciones, si el paciente no ha recibido antibióticos. Este número de hemocultivos es adecuado para distinguir entre contaminantes y bacteriemias verdaderas, y se ha demostrado que un número mayor no tiene mejor rendimiento en este sentido, ya que habitualmente el 3% al 5% de los hemocultivos se contaminan. La obtención rutinaria de más de tres hemocultivos es costosa, aumenta innecesariamente el trabajo y contribuye a la anemia en los pacientes hospitalizados. TIEMPO E INTERVALO DE LA TOMA DE MUESTRAS Cuando la bacteriemia es intermitente, el episodio bacteriémico precede en 30 a 90 minutos TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 201 al pico febril. Por este motivo, idealmente la sangre debería recolectarse durante la hora previa al ascenso de temperatura esperado. En la práctica esto es muy difícil de prever y en general no se considera el ascenso de la temperatura. En cuanto al intervalo, no se han demostrado diferencias de rendimiento entre la toma de muestras separadas por períodos arbitrarios de tiempo y las realizadas simultáneamente. Debido a que los hemocultivos deben realizarse siempre que sea posible antes de iniciar la terapéutica antibiótica, ya que en muchos casos los sistemas automatizados más nuevos pueden detectar desarrollo bacteriano en pocas horas, parece más conveniente realizar dos a tres tomas en la primer hora, para evitar el retraso diagnóstico y terapéutico y adecuarlo a las condiciones clínicas y logísticas. Existen recomendaciones específicas para algunas situaciones particulares: frente a la sospecha de endocarditis infecciosa se deben obtener 3 hemocultivos en las primeras 24 hs de evaluación; si a las 24 hs estos son negativos se obtendrán 2 más. Si el paciente ha recibido antibióticos las dos semanas previas, se recomienda realizar dos muestras de hemocultivo por día durante tres días. Ante un cuadro de fiebre de origen desconocido se obtendrán 2 hemocultivos inicialmente; a las 24 a 36 hs se realizarán 2 o más inmediatamente antes del ascenso térmico esperado, realizando 4 muestras en 48 horas. VOLUMEN DE SANGRE POR FRASCO Es una variable crítica en relación al rendimiento de la recuperación microbiana, especialmente en pacientes adultos en quienes la bacteriemia es generalmente de escasa magnitud (típicamente <10 ufc/ml y frecuentemente <1 ufc/ml), aunque también en niños, los que habitualmente presentan bacteriemias >5 ufc/ml y muchas veces >100 ufc/ml. En adultos, cada mililitro de sangre adicional aumenta la recuperación microbiana en un 3% a 5%. Los volúmenes de sangre recomendados para cada muestra de hemocultivos son 20 a 30 ml en adultos, siendo 10 ml el límite inferior aceptado; en niños 1 a 5 ml son suficientes, y volúmenes mayores no son recomendados debido a la menor volemia que poseen. RELACIÓN SANGRE-CALDO DE CULTIVO Respetando los volúmenes de sangre recomendados, se considera apropiado una relación sangre/caldo entre 1:5 y 1:10. Diluciones mayores o menores disminuyen la posibilidad de recuperación de bacterias, las primeras por excesiva dilución de los microorganismos y las segundas por insuficiente dilución de factores inhibidores naturales y agentes antibacterianos presentes en la sangre. MEDIOS DE CULTIVO Y ANTICOAGULANTE El medio de cultivo utilizado deberá soportar el desarrollo de la mayoría de los microorganismos potencialmente involucrados en cuadros clínicos bacteriémicos. En general la mayoría de los medios disponibles comercialmente tienen esta propiedad. Se usa frecuentemente polyanethol sulfonato de sodio (PSP) a una concentración de 0.023% al 0.03%, como anticoagulante que posee además actividad anticomplementaria, antifagocítica e interfiere con la acción de algunos antimicrobianos. Su acción antibacteriana sobre algunos microorganismos es inhibida por el agregado en el medio de gelatina al 1.2%. DURACIÓN DE LA INCUBACIÓN Cuando se utilizan métodos manuales se recomienda incubar por siete días. Con los métodos automatizados, la mayoría de los microorganismos clínicamente importantes se recuperan en las primeras 48 a 72 hs y generalmente no existen diferencias de rendimiento entre 5 y 7 días 202 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA de incubación. Situaciones especiales requerirán tiempos mayores de incubación. Además, en general los gérmenes cuyo desarrollo se detecta después del 5º día son finalmente considerados contaminantes, y aunque no lo fueran, un hallazgo tan tardío no afectará en gran medida la evolución del paciente. Sistemas de hemocultivo Método Indicador de desarrollo Mecanismo de detección Manuales Convencional Turbidez Hemólisis Presencia de colonias en el caldo (sedimento o superficie) Producción de gas Observación macroscópica Subcultivos ciegos Bifásico Turbidez Hemólisis Presencia de colonias en el caldo o medio sólido Producción de gas Observación macroscópica Lisis-centrifugación Isolator. Wampole Desarrollo en medio sólido Observación macroscópica Manométrico Producción de gas Observación macroscópica (desplazamiento de líquido en el reservorio) Subcultivos ciegos BACTEC radiométrico Producción de CO2+ Radiométrico BACTEC colorimétrico Producción de CO2 Colorimétrico BacT/Alert Producción de CO2 Colorimétrico BACTEC 9000 Producción de CO2 Fluorométrico DIFCO ESP Producción o consumo de gas Transductor de presión BioMerieux vital Producción de CO2 Fluorométrico Automatizados Automatizados Monitorización continua Procesamiento: existen diferentes métodos. a) Métodos manuales: los frascos deben ser examinados con una frecuencia diaria o mayor en busca de evidencia macroscópica de desarrollo. La realización de tinción de Gram o subcultivos a las 6 a 18 hs de incubación es útil para la detección temprana de microorganismos. Los hemocultivos que no muestren evidencias de desarrollo en 48 a 72 hs deben ser subcultivados por lo menos en aerobiosis. Los subcultivos a ciegas o terminales son de limitado valor, particularmente cuando la tinción de Gram no revela la presencia de microorganismos. b) Métodos automatizados: no requieren la realización de subcultivos hasta que el sistema no indica desarrollo. Para cualquier sistema, la selección de medios para subcultivo debe basarse en la morfología encontrada por tinción de Gram. El valor de incubar un set de TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 203 placas en anaerobiosis cuando el Gram revela un morfotipo único en ambas botellas una aerobia y otra anaerobia de la misma muestra es discutido. No existen procedimientos estandarizados para la identificación de microorganismos directamente del caldo de hemocultivo. Sin embargo, algunos de ellos se han realizado exitosamente, por ejemplo: solubilidad en bilis, hidrólisis de PYR, DNAsa y pruebas de tipificación por aglutinación con partículas de látex. Así mismo, el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) no tiene estipulado pruebas directas de sensibilidad antibiótica del caldo, pero algunos investigadores han establecido pautas con resultados variables dependiendo del agente microbiano, el antibiótico testado y el método utilizado. La identificación y determinación de sensibilidad antibiótica por técnicas de hibridación o amplificación de ADN a partir de hemocultivos es posible pero poco práctica y costosa. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Los microorganismos aislados de hemocultivos se pueden clasificar en tres categorías: los que casi siempre (>90%) representan una verdadera bacteriemia, como es el caso de S. aureus, S. pyogenes, E. coli, otras enterobacterias, P. aeruginosa, S. pneumoniae, C. albicans; los que raramente representan verdadera bacteriemia (<5%), por ejemplo Corynebacterium spp., Bacillus spp., Propionibacterium acnes; los de difícil interpretación, como Streptococcus viridans, Enterococcus y Staphylococcus coagulasa negativo. Para estos casos se han desarrollado diversas estrategias que ayudan a su interpretación, de las cuales la única de valor es el hallazgo de un mismo germen en más de una muestra de hemocultivo; esto implica, como mínimo, la identificación de hasta el nivel de especie y la determinación del patrón de susceptibilidad antibiótica del germen encontrado en cada frasco de hemocultivo. En cambio, no se debe atribuir significado al aislamiento de un germen en más de un frasco en una misma muestra de hemocultivo; en este caso la positividad corresponde a un único hemocultivo, lo que para el caso de este grupo de gérmenes, sugiere fuertemente que se trate de un contaminante. Se trata también de un contaminante cuando hay una única muestra de la serie con desarrollo polimicrobiano o cuando el microorganismo aislado del hemocultivo es diferente del aislado en el sitio primario de infección, así como cuando el diagnóstico clínico de sepsis no se ha mantenido en la evolución del paciente. CONDICIONES ESPECIALES (MICROORGANISMOS QUE REQUIEREN MEDIDAS ESPECIALES PARA SU DESARROLLO Y DETECCIÓN) En algunas ocasiones debe considerarse la posibilidad de bacterias exigentes e inusuales como causa de bacteriemia, sobre todo en casos de endocarditis con hemocultivos convencionales repetidamente negativos, en casos de fiebre de origen desconocido o en infecciones focales con sospecha de sepsis en las cuales el patógeno no se ha identificado mediante los métodos habituales. Algunas bacterias de interés dentro de este grupo son: Brucella spp., Campylobacter spp., bacterias del grupo HACEK (Haemophilus aphrophilus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens y Kingella kingae), Legionella spp., Mycoplasma spp., variantes nutricionales de Streptococcus, bacterias con pared celular deficitaria, Francisella tularensis, Leptospira spp, Bartonella spp. Para algunas de ellas existen métodos automatizados comerciales; para otras se requieren condiciones particulares de incubación o períodos de incubación más prolongados. Bacterias anaerobias El espectro de bacterias anaerobias asociado a bacteriemias es estrecho. Bacteroides cons- 204 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Germen Métodos disponibles Procedimientos recomendados Brucella spp. Método manual bifásico de castañeda: los frascos tienen atmósfera con 5% a 10% de CO2; se examinan macroscópicamente cada 48 hs; se incuban 30 días antes de considerarlos negativos. Otros métodos: BACT/ALERT, lisis-centrifugación, radiométricos, etc. Campylobacter spp. No hay método ni recomendaciones específicas para su aislamiento. Se ha aislado en algunos métodos comerciales (BACTEC, Septic-Check, lisis-centrifugación), solo en aerobiosis, pero no se ha determinado el método mas sensible. Probablemente lo mejor sea utilizar medios suplementados y realizar subcultivos. HACEK No hay método específico para su recuperación. Se requiere medios de cultivo especiales, incubación prolongada (2 a 4 semanas) y subcultivos terminales. Legionella spp. Son muy pocos los casos documentados de bacteriemia por esta bacteria. Se cree que los medios de hemocultivo convencionales permiten su desarrollo pero requiere subcultivos en medios suplementados. Mycoplasma spp. Puede desarrollar en los medios convencionales con agregado de gelatina para neutralizar el efecto inhibitorio del SPS. Variantes nutricionales de Streptococcus Desarrollan en los medios de hemocultivo convencionales pero requieren suplemento de piridoxal-HCl en los medios de subcultivo. Bacterias con pared celular deficitaria Raramente aislados de sangre. Los medios osmóticamente estabilizados mediante el agregado de sacarosa o manitol permiten su desarrollo, pero debido a que estos medios también son beneficiosos para el desarrollo de algunas bacterias con su pared celular intacta, la recuperación de un microorganismo no necesariamente significa que este se encontraba presente en la sangre como una variante de pared celular deficitaria. Francisella tularensis La sangre es una buena muestra para el diagnóstico de tularemia por que la bacteria solo está presente en la sangre durante la fase aguda. Para su recuperación puede utilizarse un medio suplementado con cisteína o el sistema radiométrico BACTEC. En cualquier caso se requiere una incubación de por lo menos 14 días y subcultivos a ciegas en medio enriquecido cada 3 a 5 días. Leptospira spp. Solo puede recuperarse de la sangre durante la primer semana de la enfermedad. Deben utilizarse medios con suero de conejo o albúmina. Se deben incubar en oscuridad, en forma aerobia y a 28ºC a 29 ºC por 4 a 6 semanas. Se debe realizar examen en microscopio de campo oscuro o de contraste de fase semanalmente. Bartonella spp. Se pueden aislar por métodos de lisis-centrifugación. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 205 tituye el género más frecuentemente encontrado (45% a 75%), siendo B. fragilis la especie predominante; le siguen en frecuencia los géneros Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas, Clostridium, Propionibacterium y Peptostreptococcus. A partir de los años 70 ha disminuido el porcentaje de aislamientos de bacterias anaerobias en hemocultivos, lo cual llevó a cuestionar la necesidad de inocular rutinariamente frascos en anaerobiosis y a proponer, en cambio, la inoculación de un segundo frasco en aerobiosis, por muestra de hemocultivo. Incluso algunos investigadores han sugerido que no es importante el reconocimiento microbiológico de estos gérmenes, puesto que es posible reconocer estas infecciones clínicamente y tratarlas adecuadamente. Sin embargo, discontinuar los hemocultivos anaerobios no se recomienda por varios motivos; en algunos lugares el porcentaje de bacteriemias por anaerobios permanece elevado, la inoculación en anaerobiosis puede mejorar la recuperación de algunos microorganismos que no son anaerobios estrictos (ej: Streptococcus spp.) y, finalmente el uso de más de un frasco por muestra de hemocultivo, asegura que se obtendrá un volumen adecuado de sangre para estudio. Mycobacterium La realización de hemocultivos para aislamiento de este género se restringe a los pacientes portadores de VIH, particularmente cuando se encuentran en etapa SIDA, pero también se han encontrado especies de Mycobacterium en pacientes con otras condiciones inmunosupresoras (neoplasias, terapia crónica con corticoides o citotóxicos, diabetes, etc.). La mayoría de las infecciones diseminadas por esta bacterias se deben al complejo Mycobacterium avium y a M. tuberculosis, aunque ocasionalmente se ha aislado M. fortuitum, M. chelonei y M. genavense. Desde el inicio de la epidemia de VIH se han ensayado una serie de sistemas de hemocultivos para el aislamiento de estas bacterias. Los métodos de lisis-centrifugación fueron de gran utilidad durante mucho tiempo y aún se continúan usando, aunque actualmente existen sistemas automatizados (BACTEC) más sencillos y de menor riesgo para el operador que tienen similar rendimiento. El tiempo de detección de desarrollo varía entre 3 y 24 días para cualquiera de estos métodos, y la variable más importante en la recuperación del germen parece ser su concentración en la sangre. Virus No se ha definido con claridad el número, volumen e intervalo de obtención de hemocultivos por virus. El agente que se busca aislar con mayor frecuencia es Citomegalovirus, debido a que la viremia se considera el parámetro de mayor correlación con infección clínicamente significativa en órganos sólidos y en receptores de trasplantes de médula ósea. Hongos Existe gran variedad de métodos para su recuperación a partir de sangre. En la práctica la mayoría de los sistemas aerobios de hemocultivos son aptos para el desarrollo de Candida spp. Para otros hongos se recomienda el método de lisis-centrifugación. Los hemocultivos para hongos deben incubarse a 22ºC a 30ºC por un período de por lo menos 4 semanas antes de considerarlos negativos. EVALUACIÓN DE LA SEPSIS A PARTIR DE CATÉTERES INTRAVASCULARES Muchos métodos han sido propuestos para determinar en qué medida un catéter intravascular puede ser el origen de un episodio de bacteriemia o fungemia. Se destacan: microscopia directa, cultivos de la piel del sitio de entrada del catéter, cultivos semicuantitativos de la 206 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA punta del catéter, caldos de cultivo cuantitativos, hemocultivos de sangre periférica y cultivos cuantitativos de sangre extraída a través del catéter. El método más utilizado es el de Maki, que consiste en cultivar la punta del catéter haciéndolo rodar sobre la superficie de una placa de agar. Aunque los criterios varían según los autores, se considera que el desarrollo de 5 ufc/ml es evidencia de contaminación a nivel del catéter. CONTROL DE CALIDAD Todos los laboratorios clínicos deben mantener medidas de control de calidad específicas en relación a los hemocultivos, así como para cualquier procedimiento. Dentro de los aspectos más importantes que se deben controlar se encuentran los siguientes. • Recolección de las muestras: en lo que se refiere a medidas de asepsia, obtención de adecuados volúmenes de sangre, obtención de adecuado número de muestras de hemocultivo por paciente. • Contaminantes: el máximo porcentaje de hemocultivos contaminados que se acepta es 3%. Si un laboratorio excede esta cifra deberá tomar medidas para detectar y corregir los procedimientos que influyen en ello. • Hemocultivos positivos: el análisis periódico del porcentaje de hemocultivos positivos en un laboratorio es un indicador del funcionamiento del sistema utilizado. También contribuye a detectar sobreutilización de este recurso paraclínico cuando el porcentaje de positividad es muy bajo. Tratamiento de la sepsis Los pilares básicos en el tratamiento del paciente séptico están dados por las medidas de soporte cardiorrespiratorio y el tratamiento antibiótico precoz. Los antibióticos deben ser elegidos en base al potencial foco infeccioso primario, los datos epidemiológicos y los factores del huésped. Se recomienda el uso de agentes antimicrobianos de amplio espectro hasta tanto se halla realizado el diagnóstico microbiológico. Bajo estas condiciones, se aboga a favor de la terapéutica combinada a fin de proveer tratamiento eficaz tanto para los gérmenes gramnegativos como para los grampositivos, prevenir la selección de cepas resistentes frente a un antibiótico y, en muchos casos, aumentar la actividad de los antibióticos mediante el mecanismo de sinergia. La combinación más utilizada en el tratamiento inicial y en ausencia de sospecha de germen es la de un aminoglucósido y cefalosporina de tercera generación. Si se cree que la causa sea Pseudomonas aeruginosa u otro bacilo gramnegativo resistente a los antibióticos anteriores, es una buena opción combinar un aminoglucósido con un carbapenem. Frente a la sospecha de grampositivos debe considerarse el uso de vancomicina. Una vez que el microorganismo ha sido identificado y estudiado, la terapéutica antibacteriana debe ajustarse y en general debe ser de espectro más reducido. ENDOCARDITIS INFECCIOSA La endocarditis infecciosa (EI) se define como la infección de la superficie endocárdica del corazón (1), como el término mismo lo sugiere; aunque en la práctica médica habitualmente pensamos en la infección de las válvulas cardíacas. Es así que además de presentarse en dichas estructuras puede presentarse en comunicaciones arteriovenosas, conducto arteriosos permeable, etc. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 207 La importancia del tema no radica en su frecuencia de presentación, ya que es de baja incidencia, sino en su alta morbimortalidad, en su heterogénea presentación clínica, en las dificultades diagnósticas y en su necesidad de aplicar un empírico y precoz tratamiento antibiótico. EPIDEMIOLOGÍA Es una infección de baja incidencia, aunque muchos autores coinciden que es difícil de determinar, al parecer no ha tenido cambios respecto al total de pacientes en los últimos 30 años. Sin embargo el espectro clínico de la enfermedad ha cambiando debido a que la población anciana, inmunodeprimida y sometida a maniobras invasivas está en aumento por el avance de nuevas tecnologías médicas. Se presenta con mayor frecuencia en pacientes adultos, mayores de 50 años, siendo rara en la infancia; ahora se ha visto un aumento en los jóvenes por asociarse al uso de drogas intravenosas. Es algo más frecuente en el hombre. La válvula mitral es la más afectada de forma aislada (sin estar afectada otra válvula), seguida por la aórtica; se pueden ver en forma combinada; la válvula tricúspide solo excepcionlmente se ve afectada como veremos más adelante. La tasa de mortalidad que se situaba cercana al 100% en la era preantibiótica, hoy es considerada menor pero difícil de determinar, variable según el tipo de paciente y el microorganismo implicado. Algunos autores hablan de una mortalidad del 40% aproximadamente. FACTORES DE RIESGO Pueden entenderse con facilidad luego de comprendida la etiopatogenia de la EI; es así que son factores de riesgo todas aquellas situaciones en que exista o generen daño endocárdico o que aumenten la probabilidad de bacteriemias. Esta afección se observa con mayor frecuencia en pacientes ancianos, inmunodeprimidos, con cateterización endovenosa, pacientes que se le realiza maniobras invasivas, adictos a drogas intravenosas, etc. A nivel cardiovascular: la alteración valvular degenerativa (como es la calcificación, la enfermedad aterosclerótica, etc.) ha sustituido la valvulopatía reumática, tan frecuente en el pasado, como uno de los principales factores de riesgo. También se ve con frecuencia en pacientes portadores de válvulas protésicas, válvula aórtica bicúspide, enfermedades congénitas cardíacas, portadores de marcapasos o desfibriladores, prolapso de la válvula mitral, etc. El haber tenido una EI es un importante factor de riesgo para la misma. CLASIFICACIÓN Clásicamente la EI se clasificó en aguda, subaguda y crónica basándose en el tiempo en que llevaba al paciente a la muerte. Afortunadamente como mencionábamos luego de la terapia antimicrobiana la mayoría de los casos no evolucionan a la muerte, por lo que esta clasificación quedo un poco en el pasado; prefiriéndose actualmente una basada en la etiopatogenia. Clasificación "vieja" • aguda: evolución fulminante, la muerte se produce en menos de 6 semanas. Se asocia fundamentalmente a gérmenes más agresivos como S. aureus. • subaguda: la muerte se produce entre las 6 semanas y 3 meses. Es la que hoy asociamos a Steptococcus del grupo viridans. 208 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA • crónica: la muerte se produce luego de los 3 meses. En general éstas dos últimas se consideran juntas. Nueva clasificación y agentes etiológicos En líneas generales son los cocos gram positivos los principales agentes responsables de la EI, siendo muy raro los anaerobios. Los estreptococos y los estafilococos representan alrededor del 80-90% de las EI. Existe un grupo de EI que en series internacionales es de alrededor del 5%, en donde no se halla el germen mediante técnicas microbiológicas convencionales, son las llamadas EI con cultivos negativos. Esto puede deberse a varios factores en los que se encuentra: el uso de antibióticos previo a la toma de la muestra, EI causada por microorganismos tales como hongos, virus, especies de crecimiento lento como el grupo HACEK, riquetsias, etc., ser de etiología no infecciosa o no se este el diagnóstico, etc. • sobre válvula nativa: se presenta en pacientes con válvulas cardíacas aparentemente sanas o no. Los gérmenes implicados con mayor frecuencia son los Steptococcus del grupo viridans (S. sanguis, S. mutans, S. mitis) y Staphylococcus aureus, éste último asociado a enfermedad de curso más agudo, de mayor mortalidad y con válvula clínicamente sana. Con menor frecuencia enterococos y otros estreptococos, bacilos gram negativos aerobios (como Salmonella), hongos, etc. Cabe destacar la EI causada por Steptococcus bovis (estreptococo del grupo D) en pacientes adultos ya que se asocia frecuentemente a patología del tracto digestivo, especialmente diverticulosis y carcinoma de colon. La misma se explicaría dichas afecciones son capaces de producir bacteriemias transitorias. Algunas series muestran un 5% del total de las EI son causadas por este germen. • sobre válvula protésica: estas se dividen en precoz y tardía, con diferencias etiopatogénicas. Al parecer no existen diferencias entre las biológicas y las mecánicas. Precoz: hasta el año de la sustitución valvular, según algunos autores podrían ser 2 meses, el agente más frecuente es Staphylococcus epidermidis y otros coagulasa negativos, mas alejadamente se encuentran los bacilos gram negativos y los hongos. S. epidermidis produce sobre el material protésico un biofilm, estructura compleja en donde las bacterias interaccionan entre ellas dificultando la llegada de antibióticos y donde mantienen una baja actividad metabólica. En general no basta con el tratamiento antibiótico para su eliminación, por lo que muchas veces requiere la exéresis del material protésico. Éstos gérmenes se plantean son adquiridos durante el acto operatorio, por lo que corresponderían a gérmenes intrahospitalarios. Tardía: luego del año los gérmenes planteados se asemejan a los encontrados en la EI sobre válvula nativa. • sobre marcapasos y desfibriladores: son en general causados por Staphylococcus epidermidis u otros estafilococos coagulasa negativos, por lo que al igual que en el caso anterior puede requerirse la exéresis del mismo. • nosocomial: es aquella que se presenta a partir de las 72 hrs de hospitalización o en un ingreso anterior a las 8 semanas donde se realizaron maniobras invasivas. Las más frecuentemente asociadas son la cateterización intravenosa y las maniobras genitourinarias. El agente con mayor frecuencia es Staphylococcus aureus, seguido por otras especies. • fúngica: su incidencia a aumentado en los últimos años debido a que es más frecuente en pacientes inmunodeprimidos, con cateterización intravenosa, alimentados de forma parenteral, con tratamientos antibióticos prolongados, válvulas protésicas, etc. Los hongos TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 209 con mayor frecuencia aislados son especies de Candida sp. y Aspergillus sp., éste último asociado a cirugía cardíaca. • en pacientes adictos a las drogas intravenosas (ADIV): se produce clásicamente sobre cavidades cardíacas derechas (válvula tricúspide 70%) y por gérmenes provenientes de la piel como Staphylococcus aureus (60-70%), seguido alejadamente por estafilococos coagulasa negativos, estreptococos del grupo viridans, Pseudomonas aeuruginosa, Candida sp. etc. Por ciertas características de la enfermedad (presentarse en cavidades derechas) y del paciente, su diagnóstico muchas veces no es sencillo, pero al parecer la evolución seria más benevolente que en pacientes no ADIV. La razón por la cual se ve mayormente afectada la válvula tricúspide se desconoce, aunque se cree que pueda deberse al “bombardeo” de impurezas contenidas en las drogas injectadas, pero existen otras hipótesis. Cabe mencionar otros agentes como Coxiella burnetti, agente de fiebre Q que causa una EI crónica. El papel de los virus como agente de EI no está aclarado aún. PATOGENIA La patogenia de la EI es compleja y multifactorial; y quizás aun, no bien aclarada. Los dos sucesos principales pueden ser resumidos en: una superficie endovascular alterada (los microorganismos son incapaces de adherirse al endotelio sano) y una bacteriemia. Al parecer todo comenzaría con ciertas alteraciones que generan turbulencias de sangre (u otro tipo de estrés local) lo que produce daño endotelial con exposición de proteínas de matriz extracelular, depósitos de plaquetas y fibrina formándose una vegetación estéril, etapa llamada ENDOCARDITIS TROMBOTICA ABACTERIANA (ETAB). Para el caso de S. aureus este proceso sería algo diferente, ya que la virulencia tal de este germen permite adherirse a un endotelio físicamente sano, pero sin dejar de estar alterado: ya que expresa moléculas de adhesión. Esto se ve en endotelios con inflamación local como en la patología arteriosclerótica. La lesión previa del endotelio valvular es un prerrequisito para la colonización bacteriana en casi todos los modelos animales y probablemente en el hombre, aunque esto no indique una lesión clínicamente evidente previa. Luego ciertas bacterias pueden alcanzar la vegetación o el endotelio dañado a través de una bacteriemia transitoria, adherirse y colonizarla. Así la capacidad de ciertos microorganismos para adherirse a la ETAB es un paso crucial en el desarrollo de EI. Dicha adherencia esta mediada por numerosas moléculas de la superficie bacteriana capaces de adherirse a las proteínas de matriz extracelular presentes tanto en estreptococos como en estafilococos, llamadas colectivamente: microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules (MSCRAMMs). Para uno de los agentes mas frecuentes de EI, como es Streptococcus mutans perteneciente al grupo viridans, se describe un polisacárido extracelular complejo, el dextrán o glucocálix, implicado a su vez en la etiopatogenia de las caries. También se describe en Streptococcus del grupo viridans, una adhesina de superficie llamada FimA; experimentalmente se comprobó que Streptococcus mutantes deficientes de la misma tenían una virulencia mucho menor en el desarrollo de EI experimental. La superficie vuelve a cubrirse con plaquetas y fibrina generando un medio propicio para la multiplicación bacteriana, “escondido” del sistema inmune. Al parecer ciertas cepas bacterianas tienen mayor capacidad de agregación plaquetaria, siendo éstas las que causan con mayor frecuencia EI, como son Streptococcus y Staphylococcus. Así la vegetación aumenta de 210 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA tamaño con mayor proliferación bacteriana y mayor depósito fibirino-plaquetario, las bacterias quedan en la profundidad de la vegetación donde la infiltración linfocitaria es mínima. Esto provoca recuentos bacterianos muy elevados, en torno a 1010 UFC/ gr de tejido. A nivel inmunológico se produce una importante estimulación del sistema inmune humoral y celular, lo que explica la esplenomegalia, la hipergamaglobulinemia, el título elevado de complejos inmunes circulantes, etc. MANIFESTACIONES CLÍNICAS Son muy variadas y creemos exceden el propósito de este texto. Pueden ser comprendidas como parte de 3 grandes procesos propios de la patogenia de la EI: • El proceso infeccioso sobre la válvula cardíaca, conlleva al deterioro del aparato valvular (perforación, ruptura de cuerdas tendinosas, absceso del anillo valvular, etc.) por lo que puede detectarse un nuevo soplo, insuficiencia cardiaca, alteraciones en la conducción eléctrica (arritmias), etc. • Fenómenos embólicos a casi cualquier órgano; con mayor frecuencia a nivel renal, esplénica, cerebral (stroke) y coronario. Las lesiones de Janewey (placas hemorrágicas, indoloras, en palmas y plantas) y los nódulos de Osler (nódulos eritematosos dolorosos, habitualmente en las yemas de los dedos), es discutido por algunos autores si corresponden a fenómenos embólicos o lesiones por inmunocomplejos, la presencia de bacterias en cultivo de dichas lesiones, nos orienta más a lo primero. • Fenómenos inmunológicos por la bacteriemia constante y el estímulo constante del sistema inmune: fiebre (hallazgo frecuente), glomerulonefritis por inmunocomplejos, esplenomegalia (también por fenómenos embólicos), vasculitis (petequias, hemorragias en astilla, etc.), manchas de Roth (oculares), artralgias y mialgias, etc. ASPECTOS DIAGNÓSTICOS Por la heterogeneidad de las manifestaciones clínicas el diagnóstico de EI es complejo y requiere alto grado de sospecha clínica. Para el mismo se establecen dos tipos de criterios (criterios de Durack): • Patológicos: el cultivo y la histología de la vegetación o de embolias. • Clínicos: criterios mayores: donde se encuentran los hemocultivos positivos y la evidencia de afectación endocárdica; criterios menores: fiebre, fenómenos embólicos e inmunológicos, entre otros. La EI produce característicamente una bacteriemia continua, aunque de baja cuantía (menor a 100 UFC/mm3, las bacteriemias por estreptococos pueden ser del orden de 1-10 UFC/mm3), por lo que el hemocultivo juega un rol fundamental en el diagnóstico, sin olvidar que al recuperar el germen podemos luego realizar un tratamiento antibiótico específico. Las diferentes consideraciones a cerca del hemocultivo son iguales a las descritas para sepsis, en el inicio de este capítulo. ASPECTOS TERAPÉUTICOS La antibioticoterapia es la base del tratamiento como cabría de esperar, aunque en ciertas circunstancias se requieren tratamientos quirúrgicos. El uso de anticoagulantes, tentador por aspectos de la patogenia, resulta controvertido y asociado a complicaciones hemorrágicas graves, por lo que en general se desaconseja su uso. El uso de antibióticos en la EI tiene características particulares ya que estamos frente a una TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 211 infección en donde los microorganismos se encuentran “escondidos” bajo una red de fibrina y plaquetas, existe una alta concentración de bacterias (109 – 1010 UFC/gr) y se encuentran en un estado de actividad metabólica reducido. Recordemos para esto último que la gran mayoría de antibióticos actúan en células metabólicamente activas ya que interfieren en la síntesis de la pared, de proteínas, etc. Por estas razones frente a un germen aislado de un paciente con EI, se realiza estudio de la sensibilidad antibiótica de tipo cuantitativo, donde se establece la CIM (concentración inhibitoria mínima). Es así que se utilizan antibióticos bactericidas, por vía intravenosa, a dosis altas, de forma prolongada (alrededor de 4 semanas) y la mayoría de planes terapéuticos incluyen dos antibióticos con actividad sinérgica. Los antibióticos más usados son los betalactámicos asociados a un aminoglucósido, pero en definitiva deben ajustarse empíricamente al tipo de EI y a la epidemiología local. Bibliografía • Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC (h). editores. Diagnóstico Microbiológico, Texto Atlas Color. 5ª ed. Bs As. Panamericana. 1999. • Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. editors. Bailey & Scott´s. Diagnostic Microbiology. 11th. ed. St. Louis, Missouri. Mosby. 2002. • Mandell GL, Douglas, Bennett JD. editors. Enfermedades infecciosas, Principios y Práctica. 5ª ed. Bs.As. Panamericana. 2002. • Moellering RC. Consulting editor. Durack DT. Guest editor. Infective Endocarditis. Cavis C. Ed. Infect Dis Clin North Am. Philadelphia. W.B.Saunders Co. 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La etiología de la MEAS es bacteriana, los microorganismos involucrados varían según la franja etárea que se examine. (Cuadro 1) Los gérmenes más frecuentes son Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae tipo b y Steptococcus pneumoniae. Quedan excluídas bacterias como Mycobacterium tuberculosis que determina una meningoencefalitis subaguda a líquido cefaloraquídeo claro. Hemos hecho mención a una de las formas clásicas de comenzar a ordenar las meningoencefalitis según el aspecto del LCR. Si es turbio orienta a las meningoencefalitis agudas supuradas bacterianas. El LCR claro orienta a meningoencefalitis bacteriana tuberculosa o meningitis virales. Importancia del tema La MEAS es una enfermedad que importa mucho a la salud pública, no por su frecuencia, ya que se puede considerar como una enfermedad poco común, sino por su gravedad y porque es una verdadera emergencia médica; una persona que padece esta enfermedad puede fallecer en horas. En nuestro país según datos del MSP, desde los años 1979 a 2002 las tasas por 100.000 habitantes oscilan desde 3.27 a 5 en todo el país. Las personas que sobreviven a esta enfermedad frecuentemente quedan con secuelas neurológicas a largo plazo, que se manifiestan como crisis convulsivas, alteraciones motoras, retraso mental, deterioro de la visión o ceguera, trastornos del lenguaje o, lo más frecuente, una pérdida de audición que puede ser de moderada a profunda. Si tenemos en cuenta que los más frecuentemente afectados son los niños menores de dos años, la gravedad del daño neurológico es aun mayor, ya que afecta a un cerebro en desarrollo. Se comprende el interés que mueve a muchos investigadores por mejorar todos los aspectos que tiendan a disminuir la morbimortalidad por esta enfermedad. Sin duda un gran avance ha sido el tratamiento antibiótico que descendió la mortalidad de un 97% de la era preantibiótica a cifras de un 10% a 30% para el caso de nuestro país actualmente, variando según el agente bacteriano involucrado y la edad. Pero sin duda son también grandes los esfuerzos en los últimos años por mejorar los aspectos del diagnóstico 214 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA clínico y paraclínico, sobre todo en el diagnóstico microbiológico. Por supuesto se ha puesto especial énfasis en lograr mejores terapéuticas antimicrobianas y otras que coadyuven a disminuir la frecuencia de las secuelas. Pero tampoco ha sido menor el interés en lo que tiene que ver con la prevención, en especial el desarrollo de vacunas. Al desarrollar el tema veremos como todos los avances que se han logrado en el diagnóstico, tratamiento y prevención de esta enfermedad han sido fruto de la interrelación de la microbiología clínica y básica. Es por esto que hemos seleccionado el tema MEAS como un modelo de enfermedad causada por un grupo de bacterias que tienen en común su gran poder invasor y es un excelente ejemplo para mostrar como todos los aspectos de la investigación clínica y microbilógica se pueden interrelacionar con un fin común. En términos generales podemos decir que las bacterias que causan MEAS se adquieren por vía respiratoria a través de las gotitas de Pflugge y las secreciones respiratorias, colonizan la orofaringe, atraviesan luego la barrera mucosa y pasan a la sangre, donde se multiplican rápidamente para franquear finalmente la barrera hematoencefálica, llegando así al LCR en el espacio subaracnoideo. En este momento desencadenan un proceso inflamatorio a nivel de las meninges y el encéfalo, responsable de la enfermedad y sus complicaciones. Estas bacterias las podemos clasificar claramente dentro del grupo de bacterias que tienen como uno de los principales atributos de virulencia para causar enfermedad, la invasividad. Como ya dijimos, son muchas las bacterias que pueden determinar esta enfermedad, (cuadro 1), aunque las que con mayor frecuencia la determinan son Neisseria meningitidis, un diplococo gramnegativo, Haemophilus influenzae, un bacilo gramnegativo pleomórfico y Streptococcus pneumoniae, un diploococo grampositivo. La interrogante que se ha planteado a muchos investigadores es, que atributos de virulencia tienen en común estas bacterias, tan diferentes entre sí, que les permite causar una enfermedad casi idéntica, salvo alguna diferencia que puede haber en la presentación clínica, como es el caso de la meningitis meningocócica. Para poder comprender la fisiopatología de esta enfermedad es necesario hacer una revisión de las principales características de las bacterias que la causan y de la ultraestructura de las bacterias grampositivas y negativas. En el cuadro 1 se han resumido las características principales de los micoorganismos. Otros detalles se podrán consultar en los capítulos correspondientes. El cuadro 2 y la figura 6 del capítulo 2 resumen las principales características de la pared de las bacterias grampositivas y negativas. Se señala la ubicación de los lipopolisacáridos y proteínas de membrana externa de las gramnegativas y la pared de las grampositivas con la disposición de los ácidos teicoicos. Las bacterias que causan MEAS poseen cápsula. Todas estas estructuras juegan un papel importante en la patogenia de esa enfermedad. 215 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Cuadro 1. Neonatos 0 a 2 meses Microorganismos más frecuentes Streptococcus agalactiae Enterobacterias: Escherichia coli k1 Enterobacter spp. Citrobacter spp. Klebsiella spp. Salmonella spp. Leisteria monocitogenes coco grampositivo catalasanegativo ß-hemolítico CAMP positivo bacilos gramnegativos no exigentes oxidasanegativos Bacilo grampositivo exigente ß-hemolítico Test CAMP positivo Menos frecuentes a esta Haemphilus influenzae tipo b edad Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae 2 meses a 5 años Niños mayores de 5 años y adultos Neisseria meningitidis Género Neisseria Diplococo gramnegativo (granos de café) Encapsulados Aerobios estrictos Exigentes Oxidasa positivos Oxidan maltosa y glucosa 10 serogrupos capsulares B, C y A los más frecuentes Haemphilus influenzae Género Haemophilus Bacilo gramnegativo pleomórfico Encapsulado Exigentes Anaerobio facultativo Requiere factores de crecimiento V y X 6 serotipos capsulares: tipo b responsable de la mayoría de las enfermedades severas Streptococcus pneumoniae Género Streptococcus diplococos grampositivos (lanceolados) Encapsulados Exigente Anaerobio facultativo Alfahemolítico Optoquina sensible 83 serotipos capsulares Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae 216 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA La vía más común de llegada de las bacterias a las meninges se inicia con la colonización respiratoria alta, seguida de bacteriemia, para finalmente atravesar la barrera hematoencefáica. La llegada de las bacterias por vecindad a través de un foco infeccioso cercano a las meninges, como puede ser una otitis media, es menos frecuente. Para el caso de los recién nacidos (neonatos de 0 a 30 días de vida) las bacterias se adquieren en el canal de parto. El feto, hasta tanto no se rompa la integridad de las membranas que lo protegen en la cavidad uterina, está en un ambiente estéril. Una vez rotas las membranas, el recién nacido se coloniza por diferentes bacterias, las cuales se pueden comportar como patógenas por las propias condiciones inmunitarias del recién nacido que tiene un sistema inmunológico inmaduro. Si bien es una situación poco frecuente, las bacterias luego de colonizar las mucosas las pueden atravesar y por una bacteriemia llegar a las meninges y al encéfalo. En el recién nacido esta bacteriemia motiva casi siempre además de la enfermedad neurológica, una sepsis con afectación de otros parénquimas. Haemophilus influenzae tipo b, Streptococcus pneunomiae y Neisseria meningitidis grupo B y C, son los que en nuestro país más frecuentemente causan enfermedad en forma endémica. La mayoría de los casos se presentan en invierno y primavera y parecen vincularse con el descenso de la humedad relativa y el aire frío que facilitan la erosión de la mucosa rinofaríngea, disminuyendo las defensas locales a este nivel. El ambiente familiar es el de mayor riesgo de adquirir la enfermedad, muy especialmente si median condiciones de mala ventilación y hacinamiento. Según los datos del MSP en el período 1999-2002 el orden de frecuencia de las bacterias más comunes en menores de 5 años fue: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae. Haemophilus influenza, etc. En el cuadro 2 se describen los gérmenes aislados en el periodo 1999–2002 y el porcentaje de meningitis denunciadas como supuradas sin germen identificado. Cuadro 2. N. meningitidis serogrupo C N. meningitidis serogrupo B 1999 24 29 2000 15 38 2001 6 - 2002 0 - 44 36 N. meningitidis serogrupo W 135 N. meningitidis sin seroagrupar N. meningitidis otros Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae tipo b Otros gérmenes identificados Casos Sin germen / Con germen y % 3 2 59 2 7 80/206 (31 %) 3 3 35 2 5 54/155 (35%) Fuente: MSP División Epidemiologia - Uruguay * Fallecieron 24 pacientes; 17 eran mayores de 40 años. 63* 2 7 65/178 (37%) 29 1 10 62/138 (45%) TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 217 Uruguay fue el primer país de Latinoamérica que incorporó la vacuna anti Haemophilus influenzae tipo b en forma universal. A partir de setiembre de 1994, se comenzó a vacunar a toda la población infantil del país menor de 4 años, con la vacuna anti-Haemophilus influenzae tipo b conjugada. Según datos aportados por la División Epidemiológica del MSP, desde setiembre 1994 a la semana 30 del año 1995 (última de julio) se registraron 3 casos de MEAS a Haemophilus influenzae tipo B, en niños no vacunados o incompletamente vacunados. El número de casos en años anteriores en períodos similares fue de hasta 10 o más veces mas alto. A pocos meses de iniciada la vacunación se pudo observan un rápido impacto en la reducción de casos en meningitis. Si comparamos con los casos ocurridos en el período 1999-2002, vemos que la reducción dramática de casos se mantiene aunque se presentan casos en niños, lamentablemente no inmunizados. Estos resultados se han visto en muchos países del mundo al incorporar esta vacuna. Casos de MEAS por Haemophilus influenzae: Casos la semana epidemiológica 30 1992 31 Casos todo el año 1999 2 1993 28 2000 2 1994 37 2001 2 1995 3 2002 1 1996 0 Fuente: MSP División Epidemiología - Uruguay Clásicamente se dice que Neisseria meningitidis A Y C son capaces de causar epidemias. Con los estudios epidemiológicos de los últimos años se ha podido determinar que también existieron verdaderas epidemias por el grupo B en Cuba y en San Pablo (Brasil). En nuestro país en la década del 90 se registró un aumento del número de casos de MEAS por Neisseria meningitidis grupo C, que pasó a predominar sobre el grupo B. En el año 1996 esa situación de hiperendemia, junto a un aumento de la mortalidad por esta enfermedad (tasa de meningitis supurada 11.9/100.000, tasa de MEAS por Neisseria meningitidis grupo C de 3,1/ 100.000) determinó que el MSP impulsara una campaña de vacunación gratuita no obligatoria con vacuna polisacarídica A-C a la población entre 2 y 19 años. Se vacunó alrededor del 90% de esa franja etárea. En 1999 se decidió aplicar nuevamente la misma vacuna. En los últimos 4 anos se observó una disminución muy marcada de casos de EIM por N. meningitidis grupo C que se puede atribuir en parte a la vacunación iniciada en 1996.1 En julio 2001 se detectaron algunos eventos que alertaron sobre la posibilidad de un cambio en la evolución de la EIM por N. meningitidis grupo B: aumento del número de casos, desplazamiento de las edades de los pacientes afectados hacia la franja de mayores de 5 años, brote epidémico en una pequeña ciudad (Santa Lucía, Canelones) con una tasa de 30/100.000 habitantes y fallecimiento de pacientes predominantemente mayores de 5 años. Estos cambios epidemiológicos señalaban la posibilidad de pasaje de la forma endémica a la forma epidémica de la enfermedad. A esto se agregó el predominio de una determinada cepa (B: 4,7: P1.15,19) sobre una mezcla de cepas de N. meningitidis grupo B. Estos datos epidemiológicos y microbiológicos determinaron la decisión de inmunizar con la vacuna antimeningocóccica B-C preparada con la cepa B: 4,7: P1.15,19 en el Instituto Finlay. La campaña gratuita no obligatoria se dirigió a la población de 4 a 19 1 Fuente: MSP Vigilancia Epidemiológica CL 2000. Informe “Situación de las meningitis supuradas en el Uruguay” 13 enero 2002 218 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA años de todo el país, comenzando por el departamento de Canelones, luego Montevideo y el resto del país.2 Fisiopatología Han sido empleados por muchos autores, modelos experimentales con animales para intentar aclarar como es que los microorganismos llegan al huésped y lo colonizan; como es que pueden sobrevivir a los mecanismos de defensa del huésped, invaden el SNC e inducen una respuesta inflamatoria en el espacio subaracnoideo que contribuye a explicar la mayoría de los eventos fisiopatológicos que ocurren como consecuencia de la infección. Podemos resumir así, los pasos que siguen los microorganismos hasta determinar la enfermedad. 1. Fijación a las células epiteliales de la mucosa nasofaríngea y orofaríngea. 2. Transgresión de la barrera mucosa. 3. Sobrevida en el torrente sanguíneo (evitando las células fagocíticas y la actividad bacteriolítica). 4. Ingreso en el LCR. 5. Producción de patología en las meninges y encéfalo. Analizaremos los puntos que se conocen de estos sucesivos pasos. El primer paso crítico en la iniciación de MEAS es la colonización nasofaríngea por un nuevo microorganismo. La cápsula que estos poseen parece jugar un rol fundamental en la colonización nasofaríngea para el caso de H. influenzae y S. pneumoniae, ya que la adquisición de anticuerpos contra el antígeno capsular, ya sea por sucesivas exposiciones o por reacción cruzada con integrantes de la flora normal, como ocurre en los primeros años de la vida, ejerce una acción protectora. A esto se atribuye lo excepcional de la enfermedad por H. influenzae después de los cuatro años. Además hay trabajos que sugieren que estos anticuerpos podrían interferir con la colonización. Para el caso de S. pneumoniae, si bien no está aclarado el problema, parece ser que la situación es similar. La cápsula está también involucrada en la colonización, ya que la ausencia de anticuerpos específicos contra los serotipos que causan la enfermedad invasiva, como neumonias y MEAS, es decisiva en la determinación de la colonización. Se ha demostrado en modelos animales y en cultivos celulares que H. influenzae puede expresar fenotípicamente la presencia de fimbrias, según las condiciones de desarrollo. Estas fimbrias están relacionadas con la adhesión al epitelio nasofaríngeo. N. meningitidis coloniza la nasofaringe utilizando pilis, que encuentran a ese nivel receptores específicos en la superficie de las células de la mucosa. También se ha demostrado que una vez fijados allí, atraviesan la barrera mucosa porque son transportados a través del epitelio por vacuolas fagocíticas. Un mecanismo de defensa local de que dispone el organismo para defenderse de la colonización es la producción de anticuerpos IgA a nivel de las secreciones mucosas. Estos pueden inhibir la adhesión de los microorganismos, pero por otra parte también es conocido que muchas de estas bacterias patógenas producen IgA proteasas que inactivan a los anticuerpos IgA. Una vez que la bacteria llegó a la sangre debe sobrevivir a las defensas del huésped, esto es posible también por poseer cápsula. La cápsula les permite resistir la actividad bactericida del complemento, ya que impide que se active su vía clásica; además la cápsula inhibe la fagocitosis por los neutrófilos. Estos hechos permiten que se desarrolle una bacteriemia importante, y esto es imprescindible para que posteriormente ocurra la invasión de las meninges y el encéfalo. 2 Rev. Med. Uruguay 2002;18:83-88. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 219 El huésped tiene mecanismos para oponerse a este efecto antifagocítico de la cápsula. El antígeno capsular de S. pneumoniae y los LPS de las bacterias gramnegativas activan la vía alternativa del complemento, activando a C3 que determina la fijación de C3b a la superficie celular bacteriana, activando finalmente la vía final común del complemento (C5, C6, C7, C8 y C9), complejo de ataque de la membrana que determina la lisis celular. Pero además estos eventos facilitan la opsonización, la fagocitosis y ayudan a eliminar las bacterias del torrente sanguíneo. Se ha demostrado que pacientes con déficit de la vía alternativa del complemento y del complejo de ataque de la membrana, están más predispuestos a infecciones graves por S. pneumoniae y N. meningitidis. El mecanismo más efectivo para eliminar las bacterias de la sangre y así evitar la enfermedad es la presencia de anticuerpos específicos anticapsulares, esto explicaría por que esta enfermedad es más rara en los adultos y niños mayores de cinco años, en quienes se detectan anticuerpos (en especial es muy claro para H. influenzae). Esto explicaría también por que, en épocas de epidemias por N. meningitidis, en que un 80% de la población expuesta está colonizada en su nasofaringe, son muy pocos de estos los que enferman. Los anticuerpos anticapsulares opsonizan la bacteria y permiten que esta sea ingerida por los fagocitos polimorfonucleares y macrófagos. Parecería que el factor determinante para que ocurra invasión de las meninges está ligado al grado de bacteiremia, si esta es importante ocurre invasión meníngea. Aún no se sabe exactamente el sitio anatómico por donde hacen su ingreso las bacterias desde la sangre al espacio subaracnoideo (espacio que queda entre la aracnoides y la piamadre). Estas hojas meníngeas cubren el encéfalo y entre ellas circula el LCR. Hay estudios que avalan que lo hacen a través de los plexos coroideos, en donde se produce un proceso inflamatorio y donde el flujo sanguíneo es mayor. Por otra parte también se ha demostrado la presencia de receptores específicos para los patógenos meníngeos a nivel de los capilares de plexos coroideos y ventrículos cerebrales. Si las bacterias han sorteado los mecanismos de defensa del organismo y llegan al espacio subaracnoideo, comienza allí una activa multiplicación. Esto ocurre ya que estas bacterias capsuladas se encuentran con un ambiente en donde nuevamente los mecanismos defensivos son inefectivos. En primer lugar la concentración de proteínas del complemento es muy baja, aunque exista un intenso proceso inflamatorio. Incluso se ha demostrado que los propios leucocitos producen proteasas que inactivan el complemento. En segundo lugar esto motiva que la opsonización y la fagocitosis sean inefectivas. En los pacientes con MEAS se produce un aumento de las inmunoglobulinas en el LCR, pero este es menor comparado con el que ocurre simultáneamente en el suero, y no se establece una concentración adecuada hasta etapas avanzadas de la enfermedad. También ocurre un aumento de los leucocitos neutrófilos en el espacio subaracnoideo (ESA), al parecer favorecido por la presencia de sustancias quimiotácticas, como C5a. Para llegar los leucocitos circulantes en sangre periférica al ESA deben atravesar la barrera hematoencefálica (BHE). La BHE está constituida por endotelio capilar, las células de la astroglía y las células ependimales. La BHE separa el SNC del compartimento intravascular, y es fundamental para mantener su homeostasis. Se ha demostrado que existen receptores que intervienen en la adhesión de los polimorfonucleares (selectinas e integrinas), tanto en el endotelio capilar como en la astroglía y células ependimales. Estos receptores son activados por los productos bacterianos (LPS, ácidos teicoicos y peptidoglicán). Los leucocitos atraviesan las uniones intercelulares endoteliales evadiendo así los límites de los capilares, liberando simultáneamente productos proteolíticos, lisozimas y radicales tóxicos de O2. De la activa multiplicación bacteriana en el ESA resultan dos fenómenos muy impor- 220 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA tantes en la fisiopatología de la MEAS. Por un lado la lisis de las bacterias libera a nivel local estructuras bacterianas como LPS en el caso de las bacterias gramnegativas y fragmentos de peptidoglicán y ácidos teicoicos para el caso de cocos grampositivos. Estos productos bacterianos desencadenan una intensa respuesta inflamatoria local y a su vez también atraen al ESA fagocitos (neutrófilos y macrófagos) que infructuosamente tratan de fagocitar las bacterias. Por otro lado, las bacterias en activa multiplicación pueden pasar desde el SNC a la sangre, así como también pasar los productos bacterianos que resultan de la lisis bacteriana. Podemos imaginar a los patógenos meníngeos y sus productos entrando y saliendo del LCR permanentemente. Los fragmentos de péptidoglican y ácidos teiciocos (los denominados actualmente superantígenos) de las bacterias grampositivas, y los LPS de las bacterias gramnegativas, inducen una vigorosa respuesta inflamatoria que a su vez está producida por los denominados mediadores de la inflamación. Estos mediadores son liberados ante la llegada de las bacterias y sus productos por los neutrófilos, los macrófagos locales, células del SNC como astrocitos, célula de la microglía, células ependimales y células endoteliales. Los mediadores involucrados son IL1 α y ß, IL6, IL8, el factor de necrosis tumoral (FNT), factor activador de plaquetas, prostaglandinas, metabolitos del ácido araquidónico. Estos mediadores o citoquinas liberadas promueven la activación de receptores de adhesión de las células de los endotelios vasculares del SNC que atraen leucocitos a esas zonas, que como ya se dijo liberan productos proteolíticos. También aumenta la formación de vesículas de pinocitosis en las células endoteliales. Todo esto determina una injuria del endotelio vascular, instalándose así un aumento de la permeabilidad de la BHE. Todos estos cambios se han podido comprobar en modelos animales y se han podido investigar en lactantes y niños con MEAS. La inoculación de cualquiera de los productos bacterianos mencionados directamente al LCR de animales produce una inflamación meníngea y un aumento de la permeabilidad de la BHE. La BHE normalmente protege al SNC, impidiendo la entrada de grandes moléculas y material particulado. Estos cambios morfológicos del endotelio vascular se correlacionan funcionalmente con el pasaje de albúmina y otras proteínas de bajo y alto peso molecular a través de la BHE hacia el espacio subaracnoideo. El papel exacto que juegan los leucocitos en el aumento de la permeabilidad de la BHE, no está aún aclarado, pero se sabe que el LPS y la pared bacteriana de las bacterias grampositivas, son importantes en su determinación. También la IL1 aumenta la permeabilidad de la BHE y potencia su acción en presencia del FNT. Todos estos eventos fisiopatológicos culminan en la determinación de edema cerebral con el consiguiente aumento de la presión intracraneana; este tiene básicamente tres componentes: edema vasogénico, edema citotóxico y edema intersticial, elementos que analizaremos inmediatamente. El edema vasogénico se debe al aumento de la permeabilidad de la BHE. El edema citotóxico es producto de la alteración que sufren las células del SNC por factores tóxicos liberados por los neutrófilos, los mediadores de la inflamación (FNT) y los productos bacterianos. El edema intersticial se produce porque la circulación del LCR se ve dificultada por el aumento de la viscosidad del mismo, por el exudado de leucocitos polimorfonucleares y el aumento de proteínas, esto sumado al proceso inflamatorio de las meninges y los ventrículos, determina una dificultad no solo en la circulación del LCR sino en su reabsorción en los plexos coroideos. Se ha demostrado en modelos animales que la infección meníngea, ya sea por S. pneumoniae o por H. inflluenzae tipo b, aumenta el contenido de agua cerebral, la presión del LCR, y la concentración de lactato. También en la MEAS se altera el flujo sanguíneo cerebral, pudiéndose demostrar que en etapas tempranas hay zonas hipoperfundidas como la corteza cerebral y el hipotálamo. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 221 En suma, la respuesta inflamatoria que pone en marcha el organismo con el intento de defenderse de la multiplicación bacteriana determina una serie de alteraciones fisiológicas que son agresivas para el propio SNC, y son las que en definitiva motivan las alteraciones agudas y eventualmente la muerte; son las responsables de las secuelas neurológicas en los pacientes que sobreviven. Podemos resumir los eventos que ocurren en la MEAS de la siguiente manera: el aumento de la permeabilidad de la BHE que determina edema vasogénico con mayor volumen de sangre intracraneano, el edema celular citotóxico que implica aumento del volumen celular y el edema intersticial, son todos factores que aumentan el contenido del SNC que está alojado en una cavidad inextensible como es el el cráneo, derivando todo esto en un aumento de la presión intracraneana (PIC). Este aumento de la PIC es una de las causas de la disminución de la perfusión cerebral e hipoxemia, con un cambio al metabolismo anaeróbico marcado por las concentraciones crecientes de lactato y decrecientes de glucosa en el LCR. La intensa inflamación y la hipertensión intracraneana pueden anular la autorregulación vascular a nivel del SNC, dejando el flujo sanguíneo cerebral dependiendo únicamente de la presión arterial sistémica. Además la vasculitis y los fenómenos trombóticos que ocurren por la alteración del endotelio vascular, la activación del factor activador de plaquetas y la activación de la cascada de la coagulación, por liberación por parte de las células endoteliales de un factor con actividad procoagulante, pueden producir arteritis que determinan infartos isquémicos locales. La interacción de estos procesos puede culminar con una lesión neuronal y cerebral irreversible, focal o difusa. Es indudable que la respuesta inflamatoria contribuye en gran medida en la determinación de las complicaciones y las secuelas de esta enfermedad. Diversos grupos de investigadores intentan identificar moduladores de esta respuesta inflamatoria para mejorar el pronóstico de los pacientes. Se han evaluado diversos antiinflamatorios no esteroideos en modelos animales experimentales, tales como la indometacina. Otros fármacos como la pentoxifilina que interfiere con la Il l y el FNT también se han ensayado. La investigación en este sentido continúa, y es amplia la lista de fármacos, como los antioxidantes, que se están estudiando. Dentro de los antiinflamatorios esteroideos el más extensamente estudiado y aplicado en el tratamiento de MEAS en niños es la dexametasona, que ha demostrado disminuir el flujo de proteínas como albúmina hacia el LCR y favorece su circulación. En modelos animales se evidenció que disminuye el edema cerebral, la PIC, la concentración de prostaglandina E2, la concentración de lactato en LCR y la actividad del FNT. La administración de dexametasona parece ser más útil si se administra en las primeras horas de la enfermedad, cuando el número de bacterias es mayor, y antes de administrar el antibiótico que determinará bacteriolisis (30 minutos antes de la primera dosis de antibióticos). Se ha aplicado dexametasona en ensayos clínicos tratando a lactantes y niños con MEAS. El tratamiento con este fármaco resultó beneficioso, comprobándose que disminuye los mediadores de la inflamación y modula la inflamación meníngea. Los pacientes tratados con dexametasona y antibióticos presentaron en esos ensayos mejor pronóstico inmediato y a largo plazo. El tratamiento con dexametasona no demostró modificar la tasa de mortalidad por MEAS. Todos estos hallazgos fueron significativos cuando se evaluaron las MEAS por H. influenzae tipo b en niños. No hay opinión unánime en cuanto a su utilidad en MEAS por otros gérmenes y en pacientes adultos. Se está investigando la aplicación de anticuerpos monoclonales contra FNT, Il-1 o factor agregante plaquetario. 222 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Diagnóstico CLÍNICO La tríada típica la constituyen: síndrome febril, síndrome de hipertensión endocraneana y síndrome de irritación meníngea. Pueden presentar síndrome purpúrico (petequias en la piel por vasculitis sistémica) progresiva o no, que puede culminar en el shock endotóxico, el denominado púrpura fulminante. A todo paciente en que se sospeche una MEAS se le realizará una punción lumbar para extraer LCR controlando rigurosamente las medidas de asepsia. PARACLÍNICO Estudio citoquímico del LCR: hay elementos del examen citoquímico que nos orientan a que estamos frente a una MEAS. Primero el aspecto del líquido, si es turbio o purulento; luego si la citología muestra aumento del número de polimorfonucleares, si la glucosa está disminuida y las proteínas aumentadas. Estudio microbiológico del LCR: para que se pueda obtener un buen resultado del estudio microbiológico es imprescindible que se recuerde que todas las bacterias involucradas en la MEAS son exigentes. La muestra debe ser transportada rápidamente al laboratorio para que se la siembre en medios de cultivo que le proporcionen los nutrientes necesarios, a una temperatura adecuada de 37ºC y en una atmósfera enriquecida con CO2, que favorece el desarrollo de cualquiera de los microorganismos involucrados. Habitualmente se siembran medios como agar sangre o agar chocolate con factores de crecimiento. Lo primero que el laboratorio puede informar es el examen directo con coloración de Gram. Es de gran valor por ser un examen rápido, específico y sensible, si es realizado por una persona con experiencia. Su información se obtiene rápidamente. Si se observan diplococos grampositivos nos orienta a que el germen pueda ser S. pneumoniae; si se observan bacilos gramnegativos pleomórficos puede tratarse de H. influenzae; si se observan diplococos gramnegativos en granos de café intra y extra leucocitarios, puede tratarse de N. meningitidis. De gran utilidad también es la detección de antígenos capsulares en el LCR. La primer técnica usada para la detección de antígenos bacterianos fue la contrainmunoelectroforesis, actualmente ha sido reemplazada por técnicas más sensibles y simples de realizar, como las de aglutinación de látex y coaglutinación. El principio de estas técnicas es la adhesión de anticuerpos específicos para antígenos bacterianos (a partículas de látex o a células bacterianas de Staphylococcus aureus, respectivamente). Al enfrentarse al antígeno, si está soluble en el LCR aparece una aglutinación visible al ojo humano. La utilización de estos sistemas de detección de antígenos es útil para confirmar e identificar rápidamente en menos de dos horas lo que se ha observado al Gram, así como también es útil el diagnóstico presuntivo del agente etiológico en aquellos pacientes que han sido tratados previamente con antibióticos, en los que el examen directo es negativo. La detección de antígenos no sustituye el examen directo y el cultivo, ya que estas técnicas no son 100% sensibles y específicas. Tienen la ventaja de su rapidez, que es útil al clínico para una orientación rápida del agente etiológico involucrado. Solo el cultivo permite estudiar la sensibilidad antibiótica, si es necesario, en la bacteria aislada y permite su tipificación en base a sus diferentes antígenos capsulares o de proteínas de membrana externa, como en el caso de N. meningitidis. La tipificación exacta de las bacterias aisladas en cada año en un país es fundamental para los estudios epidemiológicos que permitirán entre otras cosas, planificar eventualmente planes de vacunación. A las bacterias que desarrollan en los medios de cultivo se las estudia con los métodos habituales de identificación: Gram, detección de enzimas, pruebas bioquímicas, requerimien- TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 223 tos nutricionales e identificación serológica de los antígenos que permiten clasificarlas en diferentes serogrupos o serotipos. Para el caso de N. meningitidis, no se realizan pruebas para estudiar su sensibilidad a los antibióticos porque aún en nuestra región se mantiene sensible a la penicilina y sus derivados. Haemophilus influenzae tipo b ha desarrollado resistencia a ampicilina, que en nuestro medio (datos aportados por el Laboratorio de Bacteriología del Centro Hospitalario Pereira Rossell) se ubica en un 6%, y al cloranfenicol en un 5% de las cepas aisladas. Por eso es que se debe realizar ante toda cepa que se aísle de LCR un antibiograma por el método de difusión en agar en medios especiales para esta bacteria, además de la detección de ß lactamasas que es uno de los mecanismos más importantes por los que esta bacteria es resistente a los antibióticos ß lactámicos, como la ampicilina. Se han detectado en los últimos años cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilina, que es el antibiótico de elección para tratar la mayoría de las infecciones neumocócicas. Se han identificado cepas resistentes a penicilina en prácticamente todo el mundo. Esta resistencia se puede clasificar de acuerdo a la concentración inhibitoria mínima en: resistencia intermedia (entre 0,1 y 1 µg/ml) y resistencia elevada > 2 µg/ml. La mayoría de las cepas con susceptibilidad disminuida a penicilina en nuestro medio tienen resistencia intermedia a la penicilna: Hortal y col3, en 2002, publicaron la susceptibilidad de 105 cepas aisladas de MEAS en niños entre los años 1994-2002, 94 fueron susceptibles (CIM < 0,1 µg/ml), 9 tenían susceptibilidad intermedia (CIM 0,1-1 µg/ml)y 2 eran resistentes (CIM > 2 µg/ml). Pero también se debe realizar la concentración inhibitoria mínima (CIM) a todas las cepas aisladas de procesos invasivos graves (a aquellas que se han demostrado resistentes al testarlo con el disco de oxacilina), para poder determinar el grado de resistencia. Se debe realizar además la determinación de la CIM para cefotaxime o ceftriaxona. Las cepas que muestran una alta resistencia a la penicilina (mayor de 2 µg/ml) son frecuentemente resistentes a otros antibióticos como cefriaxona, pero son sensibles a vancomicina. Tratamiento Este se adecúa según la edad del paciente y los agentes involucrados; a modo de ejemplo podemos ver las recomendaciones de autores internacionales que hemos resumido en el cuadro 3. En los neonatos y hasta los tres meses se puede utilizar una cefalosporina de tercera generación que es útil para tratar los tres gérmenes más frecuentes e inclusive las enterobacterias, con el agregado de ampicilina, a la que son sensibles S. agalactiae y L. monocytogenes. Algo similar ocurre en los pacientes mayores de 50 años según este protocolo. Entre los 18 y 50 años se utiliza penicilina, que sigue siendo el antibiótico de elección, pudiéndose utilizar alternativamente una cefaslosporina de tercera generación. Prevención Sin duda el avance más importante en la prevención de la MEAS ha sido el desarrollo de vacunas contra algunos de los agentes que más frecuentemente la causan. En el cuadro 4 se detallan las vacunas existentes que ya han sido utilizadas en niños y adultos. La estructura bacteriana utilizada para preparar las vacunas es el polisacárido capsular. 224 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Cuadro 3. Tratamiento empírico de la MEAS Grupo etario Tratamiento empírico Microorganismos probables Tratamiento a elección Neonatos (< 1 mes) Ampicilina y aminoglucósido S. agalactiae L. monocytogenes Enterobacterias, E. coli Ampicilina + AG Ampicilina + AG Cefotaxime + AG 1 mes a 3 meses Ampicilina y cefotaxime o ceftriaxona Los mismos del grupo 1 y 3 Lactantes y niños menores 5 años Cefotaxime o ceftriaxona Haemophilus influenzae tipo b N. meningitidis S. pneumoniae Mayores 5 años a 50 años Cefotaxime o ceftriaxona penicilina o ampicilina >50 años Ampicilina y ceftriaxona Cefotaxime o ceftriaxona o ampicilina si es sensible N. meningitidis S. pneumoniae L. monocytogenes Enterobacterias Cuadro 4 Vacuna Composición Aplicación Anti-Haemophilus tipo b Polisacárido capsular conjugado a proteína (toxoide diftérico o tetánico) Niños menores de 4 años (desde los 2 meses) Anti Neisseria meningitidis Grupo A Polisacárido capsular purificado A cualquier edad a partir de los 2 años Grupo C Polisacárido capsular purificado A cualquier edad a partir de los 2 años Bivalente. Grupos: A-C Polisacárido capsular purificado A cualquier edad a partir de los 2 años Cuatrivalente. Grupos: A, C, Y, W135 Polisacárido capsular purificado de los grupos enumerados A cualquier edad a partir de los 2 años Grupo B Proteínas mayores de membrana externa Grupos: B-C Proteínas mayores de membrana externa de grupo B y polisacárido capsular C Anti neumocócicas. Vacuna 23 valente Polisacárido capsular de 23 cepas que causan más frecuentemente enfermedad invasiva A cualquier edad a partir de los 2 años En el caso de Haemophilus influenzae tipo b se ha logrado conjugar con proteínas logrando así una vacuna inmunogénica en niños menores de dos años, los más afectados por esta enfermedad. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 225 Para el caso de Streptococcus pneumoniae existen en uso vacunas capsulares. Desde el año 2001 en Estados Unidos se está utilizando extensamente una vacuna conjugada polisacáridos-proteínas a partir de los dos meses de vida. Los estudios de efectividad previos a su utilización rutinaria y los posteriores muestran un impacto muy importante en la enfermedad invasiva por neumococo. Esta vacuna (Prevnar Wyeth/Lederle) contiene los 7 serotipos que con mayor frecuencia causan enfermedad neumocóccica invasiva en Estados Unidos. En nuestro país los serotipos que con mayor frecuencia causan este tipo de enfermedad son: 14, 5, 1, 7F, 3, 6B, 19 A, 23F, 19 F, 6 A, 18 C y 9 V. Los 14, 5 y 1 son responsables de alrededor del 70 % de los casos en nuestro país. Esta vacuna heptavalente actualmente disponible carece de los serotipos 5 y 1, por lo que su cobertura para las cepas de en nuestro país alcanza solo el 53 %. Se espera que otras vacunas 9 u 11 valentes o vacunas preparadas con proteínas neumocóccicas tal vez permitan sortear este problema. Las vacunas antimeningocóccicas preparadas con polisacáridos capsulares bivalentes o tetravalentes son utilizadas desde hace años fundamentalmente para el control de epidemias. Hoy está disponible una vacuna de polisacárido C conjugada que ya está siendo aplicada en Inglaterra en niños a partir de los dos meses, se espera que el impacto en la EIM por N. meningitidis serogrupo C será tan importante como el de las vacunas conjugadas de Haemophilus influenzae tipo b y la heptavalente neemocóoccica . Las vacunas anti-meningocócicas son preparadas con polisacárido capsular excepto para el caso del Grupo B, ya que el polisacárido capsular de ese grupo es escasamente inmunogénico. Se han desarrollado vacunas con proteínas de membrana externa purificadas, o junto a polisacárido capsular de otro grupo como el C. Estas vacunas están siendo ya utilizadas en niños y adultos jóvenes; existen publicaciones que evalúan su eficacia e inmunogenicidad en distintas franjas etáreas. Bibliografía • Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiología. 20ª ed. BsAs. 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Mattera Concepto y generalidades El término infecciones de transmisión sexual (ITS) incluye aquel conjunto de infecciones que se pueden expresar clínicamente con distinta sintomatología, que tienen diferentes agentes etiológicos y que las reúne el hecho epidemiológico de adquirirse por vía sexual, sin ser esta la única vía de transmisión. Las ITS involucran principalmente la esfera genital, existiendo la posibilidad para algunos de los agentes participantes, de generar infecciones diseminadas lesionando numerosos órganos. Dentro de estos agentes podríamos realizar una diferenciación de aquellos que no utilizan la vía sexual como principal vía de transmisión, generando síndromes infecciosos en la esfera extragenital como es el caso de la hepatitis B, A, C, y bacterias como Shigella spp., Salmonella spp., etc., denominándolas infecciones sexualmente transmisibles, un término más amplio. Las primeras ITS que se descubrieron fueron la sífilis y la gonorrea, en principio sin ser reconocidas como tales. Existe evidencia histórica no concluyente acerca del origen de la sífilis, por lo cual se duda si se introdujo en el viejo mundo por la tripulación de Cristóbal Colón, o si la misma era una una enfermedad antigua que se extendió por Europa debido a la urbanización. No se puede afirmar que Treponema pallidum fuese el agente de la pandemia conocida como Gran Pox, que asoló Asia y Europa luego del regreso de Colón de América; no obstante ello las primeras descripciones de la enfermedad datan de esa época, reconociéndose su forma de transmisión poco después. La gonorrea ya es referida en el antiguo testamento, siendo Galeno quien le diera el nombre. En 1879 Neisser descubre el agente etiológico. Ambas datan entonces, de la era preantibiótica. La evolución del tiempo ha llevado a que se sumaran a estas dos clásicas infecciones, una larga lista con variados agentes involucrados, encontrándose actualmente más de 25 agentes con 50 síndromes a los que se les reconoce un carácter de transmisión sexual. Una clasificación en base a su aparición define como de primera generación a la sífilis, gonorrea y chancro blando; de segunda generación (1970) a las producidas por C. trachomatis, Mycoplasma spp. y Herpesvirus genital; de tercera generación a las producidas por Papilomavirus humano, virus de la hepatitis y virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Las ITS constituyen un grupo de enfermedades infecciosas muy frecuentes, siendo su distribución no uniforme en el mundo, variando la incidencia de los diferentes patógenos dependiendo del área geográfica, del nivel socioeconómico, hábitos sexuales, etc. La importancia de dichas infecciones no radica solamente en sí mismas, sino también en los efectos 228 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA deletéreos que pueden ocasionar, como la infertilidad femenina secundaria y las infecciones neonatales graves. Desde el momento en que se reconocen los virus como agentes de algunas de dichas infecciones, poniéndose de manifiesto el potencial oncogénico de algunos de ellos, como ser Papilomavirus humano, y la evolutividad inexorable hacia la muerte de los pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirido por VIH, se reconoce una revaloración del impacto que las mismas tienen en la población mundial y la importancia de su prevención, diagnóstico y tratamiento. Para una correcta prevención debemos realizar una tarea informativa y educativa. Existen factores que dificultan el diagnóstico y tratamiento así como también su control, entre ellos se destacan: la clínica, en ocasiones inespecífica y poco demostrativa; la variedad de síndromes que puede determinar un solo agente etiológico; la no despreciable frecuencia de infecciones mixtas; las infecciones asintomáticas (más frecuentes en la mujer). El creciente índice de cepas resistentes a los antimicrobianos junto con la necesidad de tratamiento de la pareja y el frecuente abandono del tratamiento, completan un panorama difícil para su control. Estas infecciones pueden ser clasificadas para su estudio de diversas maneras: por los agentes involucrados (bacterias, virus, parásitos y hongos) o en base a los síndromes que estos provocan. Debemos obtener una correcta historia y examen clínico jerarquizando el interrogatorio epidemiológico del paciente, y de esta forma lograr un correcto diagnóstico clínico y orientar adecuadamente los pasos a seguir para obtener el diagnóstico microbiológico y tratar en forma adecuada al paciente y sus contactos. Epidemiología y control Dentro de los parámetros que afectan la transmisión de las ITS se encuentran los factores de riesgo, entendiendo por tales aquellos que poseen influencia causal en la adquisición de las mismas. Dentro de estos se encuentran: a) el comportamiento sexual - número de parejas sexuales, cambio de parejas, prostitución, hábitos sexuales (el sexo anal facilita la difusión, el sexo oral y la homosexualidad femenina resultan menos eficaces); b) contracepción - los métodos de barrera dificultan el contagio, el DIU (dispositivo intrauterino) facilita la infección genital ascendente, los anticonceptivos orales (ACO) facilitan el cambio en el comportamiento sexual y el riesgo de exposición; c) otras ITS con lesiones ulceradas contribuyen a la transmisión. Entre los principales marcadores de riesgo se consideran: a) la edad, siendo la adolescencia y la ectopía cervical de las mujeres jóvenes factores favorecedores; b) el sexo: son más frecuentes en el hombre; c) drogadicción; d) niveles socioeconómico y cultural bajos. Transmisión Dado que la eficacia de la transmisión de ITS no es de un 100%, es necesario un nivel mínimo de actividad sexual y cambios de parejas sexuales, que propague la infección. Sin estas condiciones la tasa de curación superaría al índice de aparición de nuevas infecciones y la prevalencia llegaría a cero. Se plantea la existencia de un núcleo central de población con elevada incidencia de ITS y factores de riesgo, que actuaría como reservorio. La población restante se infectaría al entrar en contacto en forma transitoria en este núcleo. Las infecciones persistentes como el VIH, herpes genital, etc., no siguen ese esquema de propagación, TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 229 existiendo un incremento paulatino de la población infectada. Los portadores asintomáticos cumplen un rol fundamental en la difusión de muchas ITS, por lo cual su detección es muy importante para cortar la transmisión. Para comprender un poco más la transmisión de la ITS se ha propuesto una fórmula que representa todos los parámetros involucrados en ella. Ro = Beta.c.D Ro: tasa de reproductividad de la infección-diseminación Beta: tasa de infectividad c: número de parejas sexuales D: duración de la infectividad Para que una epidemia ocurra Ro tendrá que ser mayor que 1. Algunos parámetros varían en los distintos agentes. Control Se basa en la educación y prevención de salud, la educación médica, los programas de detección, el diagnóstico y el tratamiento precoz, la notificación de las parejas sexuales, entre otras. Los principales fines del control de las ITS son: evitar la infección y sus consecuencias, interrumpir la propagación y disminuir la epidemia por VIH basado en la relación de colaboración de diferentes agentes con este virus. Esto se logra con educación y promoción de salud, acompañadas de técnicas de sexo más seguro, una correcta vigilancia epidemiológica con programas de detección precoz, la notificación obligatoria, el diagnóstico y tratamiento precoces, al igual que el tratamiento de los contactos sexuales. Además de lo antes mencionado se deben incluir las 4 C: • Consentimiento informado del paciente. • Consejería: técnicas de prácticas sexuales seguras con menor riesgo (sexo sin penetración, uso de preservativos), información sobre ITS y sugerencia de realización de la prueba serológica anti VIH. • Contactos: a través de entrevistas se conocen las conductas sexuales del paciente y sus contactos sexuales • Condones: correcto uso y evaluación de sus características (validez, envase en buen estado, cámara de aire, utilización de lubricantes acuosos, su uso durante toda la relación). Principales síndromes y sus agentes causales URETRITIS Se define como el síndrome caracterizado por aparición de corrimiento uretral, en general mucopurulento, con disuria o prurito en el meato urinario, como respuesta de la uretra a una inflamación de cualquier etiología. Las causas de este síndrome en general son infecciosas y de transmisión sexual, existiendo, sin embargo, también otras: químicas, microtraumatismos, hipersecreción glandular que puede dar lugar a dificultades diagnósticas. En base a su evolución se pueden clasificar en aguda, persistente o recurrente. En base a su etiología en gonocócica, postgonocócica, no gonocócica (C. trachomatis, U. urealyticum, Trichomonas vaginalis, Herpes, etc.) y de etiología desconocida. La incidencia de las diferentes etiologías variará en nuestro medio de acuerdo al nivel 230 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA sociocultural, existiendo predominio en población de bajos recursos de uretritis gonocócica. Es importante resaltar la frecuente asociación de N. gonorrhoeae y C. trachomatis (20%). URETRITIS GONOCÓCICA Es causada por Neisseria gonorrhoeae. Destacamos que es una bacteria extremadamente exigente, tanto desde el punto de vista nutricional como atmosférico, y en su labilidad frente al ambiente, características fundamentales a tener en cuenta para su diagnóstico. Patogenia N. gonorrhoeae posee variados mecanismos de patogenicidad que enumeramos a continuación. • Pilis (adherencia, pili 4) • Proteínas de membrana externa: Prot I - endocitosis dirigida por el parásito, resistencia al suero (Por A y Por B); Prot II - adherencia a células y entre bacterias (Opa); Prot III - resistencia al suero. • Lipooligosacárido • Receptores de hierro • IgA proteasas El primer paso en la infección es la colonización de la mucosa constituída por células epiteliales cilíndricas, dada la respuesta inflamatoria, de inmediato las bacterias toman contacto con los polimorfonucleares (PMN). Se desconoce el mecanismo por el cual una fracción de las bacterias es eliminada y otra queda viable dentro de los PMN. N. gonorrhoeae se adhiere a las células epiteliales por los pili tipo 4 e induce la fagocitosis mediante el reordenamiento de filamentos de actina. Las proteínas de membrana externa denominadas Por A y Por B tendrían el rol de disparar la fagocitosis (endocitosis mediada por el parásito mediante cambio de potencial de la membrana celular, en la que contribuiría Opa). Luego transita hasta la superficie basolateral por donde sale al espacio subepitelial, donde se genera una importante respuesta inflamatoria celular. La infección determina una respuesta no protectora, lo que podría deberse a la presencia de antígenos hipervariables (por recombinación, variación de fase o cambio de bases repetidas). El lipooligosacárido probablemente sea el responsable de la mayoría de los síntomas de la gonorrea, dado que desencadena la respuesta inflamatoria liberando localmente mediadores como FNT α, posee actividad endotóxica, contribuye a la pérdida ciliar, a la muerte de las células mucosas, así como también contribuye a la patogenia de la infección contrarrestando la actividad bactericida del suero. N. gonorrhoeae genera anticuerpos bloqueadores que no permiten el contacto de sus antígenos de superficie con los anticuerpos del huésped. Existen además proteínas de membrana externa que actuarían como receptores de los sideróforos de otras bacterias para la captación de hierro, así como también captarían hierro utilizando proteínas humanas de unión al hierro, como son la lactoferrina y la transferrina. Estos factores, junto a factores del huésped tales como presencia de IgA secretoria mucosa y complemento, determinarán que la infección pueda ser localizada (presencia de PII) o diseminada (PI, PIII, déficit de complemento, etc.); siendo esta última forma de rara aparición (3%). Clínica Luego de un período de incubación de dos a siete días aparece secreción mucopurulenta con disuria, que evoluciona a la resolución en seis meses, pero con elevada incidencia de TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 231 complicaciones y de portadores asintomáticos prolongados. La prevalencia de estos últimos es del orden del 1%, siendo fundamentales en la transmisión de la infección. Sus cepas corresponden generalmente a los auxotipos AXU. Existen localizaciones extragenitales como en oftalmia del adulto, faringitis, proctitis en homosexuales, etc., que aparecerán de acuerdo a los hábitos sexuales del paciente. Tratamiento Clásicamente se realizaba con penicilina cristalina o ampicilina asociada a probenecid. Actualmente, por la existencia en nuestro medio de 60% de cepas resistentes a penicilina por producción de ß-lactamasas (codificadas en plásmidos llamados asiático, africano y toronto, de diferente peso molecular), se prefiere antibióticos como ciprofloxacina (500 mg v.o.), cefixime (400 mg v.o.), ceftriaxona (250 mg i.m.), espectinomicina (250 mg i.m.), como tratamiento de dosis única, a no ser que se determine que la cepa no posee resistencia a penicilina. Epidemiología Destacamos que la transmisión de N. gonorrhoeae por único contacto es del 30% de una mujer infectada al hombre, y del 60% a la inversa. Dentro de los infectados el porcentaje de evolución hacia una uretritis típica, atípica o asintomática, es variable. URETRITIS NO GONOCÓCICA Este síndrome es producto de infecciones por diferentes patógenos como Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas vaginalis, Herpes genital, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, etc., de los cuales por frecuencia destacaremos los dos primeros. Etiología C. trachomatis Es una bacteria de pequeño tamaño con dos formas en su ciclo de multiplicación, el cuerpo elemental infectivo extracelular de 300 nm de tamaño, y el cuerpo reticular no infectivo intracelular de 1.000 nm. Posee una estructura de pared similar a las bacterias gramnegativas, que contiene antígenos útiles para su diagnóstico. Son parásitos intracelulares estrictos que necesitan células huéspedes para su multiplicación. Pertenece a la familia Chlamydiaceae, junto con C. psittaci y C. pneumoniae, dos especies causantes de otras patologías. Se clasifica en diferentes serotipos antigénicos según sus proteínas de membrana. Los que se denominan de la D a la K son los causantes de uretritis y cervicitis; los L1, L2 y L3 del linfogranuloma venéreo (otra rara patología de transmisión sexual). PATOGENIA Posee una proteína de membrana que favorece la endocitosis por la célula huésped (endocitosis dirigida por el parásito), son internalizadas en endosomas acidificados, luego de lo cual se produce la fusión de los mismos, y también se produce un reordenamiento a nivel del citoesqueleto celular que los transporta a nivel perinuclear. Se diferencian en cuerpos reticulados en el citoplasma. Se multiplican y luego nuevamente se diferencian en cuerpos elementales que se liberan al exterior por lisis celular. Otras proteínas, llamadas proteínas de shock térmico, juegan un rol en la estimulación inflamatoria, siendo las causantes de mayor lesión y secuelas en el proceso. 232 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA U. urealyticum Es una bacteria pequeña de 300 nm, sin pared celular, muy exigente nutricionalmente (esteroles, etc.), lo que dificulta su cultivo. Pertenece al género Ureaplasma integrante de la familia Mycoplasmaceae. PATOGENIA El mecanismo de patogenicidad de esta bacteria está en estudio; la presencia de una proteína de membrana, junto con la lesión por productos metabólicos, jugarían un rol en el mismo. CLÍNICA La uretritis no gonocócica se caracteriza por la presencia de una secreción mucopurulenta o serosa, clara, matinal, en general sin ardor miccional, con un período de incubación de 4 a 15 días. Pueden presentarse infecciones asintomáticas, complicaciones como prostatitis, epididimitis y localizaciones extragenitales, principalmente en el caso de C. trachomatis. TRATAMIENTO Se realiza con antibióticos que tengan buena concentración intracelular durante un período de siete días, dado el ciclo de multiplicación de los gérmenes involucrados. Los regímenes recomendados presentan más del 95% de eficacia y erradicación microbiológica, dentro de estos se encuentra el uso de macrólidos de última generación, como azitromicina (1g v.o. en única dosis), roxitromicina (150 mg c/12 hs durante 7 días), tetraciclinas como la doxiciclina (100 mg c/12 hs durante 7 días). URETRITIS POSTGONOCÓCICA Se denomina uretritis postgonocócica a aquellas que observamos luego del tratamiento con antibióticos que cubren exclusivamente a N. gonorrhoeae. Es generalmente causada por C. trachomatis y U. urealyticum, siendo producto de una infección originalmente mixta por N. gonorrhoeae y alguno de estos gérmenes. La terapéutica es similar a la mencionada anteriormente. URETRITIS RECURRENTE O PERSISTENTE Se observa postratamiento de uretritis no gonocócica, fundamentalmente cuando en un inicio no se evidenció germen causal alguno (uretritis de origen desconocido), también en casos de uretritis por Ureaplasmas resistentes a tetraciclinas (10%). Se debe plantear la posibilidad de encontrarnos frente a una prostatitis. El tratamiento se realiza repitiendo el inicial pero durante 15 a 21 días; si el cuadro persiste debe investigarse prostatitis o infección por Trichomonas. Diagnóstico de uretritis Se debe realizar un exudado uretral o, en su defecto, la recolección del chorro inicial de orina (15ml), ambos con una retención previa de orina de 4 horas. El estudio consta de un examen directo con coloración de Gram de la secreción uretral, preferentemente realizado con asa bacteriológica. Valoraremos la presencia de uretritis microscópica definida por la observación de más de 4 PMN por campo microscópico (1.000 aumentos) o 5 PMN por campo del sedimento de la orina recogida. Esta coloración también permite la observación de Neisseria gonorrhoeae (diplococos gramnegativos intrapolimorfonucleares) con una sensibilidad de 95% a 98% y una especificidad de 95%. El hisopado debe sembrarse en medio de cultivo para N. gonorrhoeae (medio de Tha- TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 233 yer-Martin) con incubación en 5% a 10% de CO2. La investigación de C. trachomatis se realizará buscando sus antígenos (proteínas de membrana o lipopolisacáridos) por técnica de inmunofluorescencia directa y ELISA, respectivamente. U. urealyticum se cultiva en medios específicos comerciales que permiten su identificación en 24 a 48 horas. La presencia de Trichomonas se determina por centrifugado del primer chorro de orina matinal, observando su movilidad en el sedimento. Esta técnica es poco sensible, con muchos falsos negativos. Tratamiento sindromático de uretritis En la actualidad, basados en directivas de la OMS, el manejo de las uretritis puede realizarse en forma global, no discriminando los diferentes agentes etiológicos. Esto se fundamenta en varios puntos: la dificultad para contar con un laboratorio bacteriológico de nivel disponible en las diferentes regiones, la asociación de gérmenes ya vista, la baja sensibilidad de muchas técnicas utilizadas (C. trachomatis 80% a 90%) y el elevado costo de las mismas. En nuestro país, de acuerdo con nuestras condiciones sanitarias, debe realizarse el diagnóstico microbiológico del agente, realizar la denuncia obligatoria en caso de así requerirse y además, en vista al diagnóstico epidemiológico de situación, poder tener datos que nos orienten sobre la prevalencia y la incidencia de cada agente. CERVICITIS Al ser el cérvix un órgano que responde a los cambios hormonales, sus características varían con la edad, embarazo, toma de ACO, etc. Estos cambios afectan su anatomía y su susceptibilidad a la infección por patógenos cervicales. La cervicitis mucopurulenta es el equivalente de la uretritis masculina, y ocupa un lugar importante en las infecciones de transmisión sexual en la mujer. Su diagnóstico y tratamiento no solo importan para el control de las ITS, sino también para prevenir complicaciones frecuentes como enfermedad inflamatoria pélvica (EIP), parto prematuro, infección puerperal y neonatal y neoplasia cervical. Etiología Los gérmenes más frecuentemente involucrados en infecciones del endocérvix son C. trachomatis, N. gonorrhoeae, planteándose también como probable patógeno Mycoplasma hominis. Dentro de las etiologías raras se encuentran el Herpes genital y Trichomonas vaginalis, afectando esta última principalmente al exocérvix. Debemos destacar que gran parte de las cervicitis son de carácter inflamatorio, no infeccioso, dado por agresión del pH vaginal, displasias, etc. Clínica El diagnóstico clínico de cervicitis mucopurulenta se establece por la presencia de un exudado mucopurulento endocervical, acompañado por edema y eritema de la mucosa, la cual sangra fácilmente al tacto. Diagnóstico Se realiza por un exudado endocervical previa limpieza del exocérvix con torunda. Este estudio comienza con un examen directo con coloración de Gram de la secreción, en el cual se visualiza la presencia de PMN, tomando como criterio de cervicitis microscópica la existencia de más de 20 PMN por campo microscópico de 1.000 aumentos. También podemos observar la presencia de N. gonorrhoeae (diplococos gramnegativos intracelulares), contando esta técnica con un 40% a 60% de sensibilidad y 95% de especificidad. Los cultivos se realizarán 234 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA en medio Thayer-Martin. C. trachomatis se detectará por inmunofluorescencia y ELISA. La presencia de Mycoplasma se detectará utilizando medios de cultivo complejos. El diagnóstico de cervicitis es de gran valor en mujeres con flujo vaginal asociado, con el fin de evitar las frecuentes complicaciones que aquella conlleva. Tratamiento El tratamiento específico etiológico se realiza igual que en las uretritis. Enfermedad inflamatoria pélvica (EIP) CONCEPTO Este término comprende las infecciones que afectan los diferentes órganos pelvianos (salpingitis, endometritis, peritonitis pélvica). ETIOLOGÍA Dentro de los agentes causantes de EIP se encuentran patógenos de transmisión sexual como C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. hominis, solos o asociados, y otros integrantes normales de la flora vaginal como E. coli, Streptococcus spp., anaerobios como Bacteroides spp. y Peptostreptococcus spp., en general asociados. La incidencia de los diferentes agentes es variable de un país a otro; en el nuestro no existen estudios que revelen la misma, por lo cual nos basaremos para su terapéutica en esquemas extrapolados de realidades internacionales. PATOGENIA Según el origen de los microorganismos involucrados se dividen en exógenos (en su mayoría de transmisión sexual) y endógenos (flora vaginal). La vía de diseminación es la ascendente desde el cérvix (complicación de cervicitis) o la vagina. Existen factores de riesgo para que este síndrome ocurra: la cervicitis por N. gonorrhoeae o C. trachomatis, múltiples parejas sexuales, uso de DIU y la edad (los jóvenes constituyen el principal grupo de riesgo). CLÍNICA El diagnóstico clínico muchas veces es dificultoso por presentar sintomatología inespecífica. Con el fin de estandarizar el diagnóstico se manejan criterios primarios (abdomen inferior doloroso, movilización dolorosa del cervix, dolor de anexos) y criterios secundarios (fiebre de 39ºC), leucocitosis mayor de 10.000, VES mayor de 15mm/hora, aislamiento de N. gonorrhoeae o C. trachomatis en el cérvix). El diagnóstico se realiza con la presencia de los tres primarios más alguno de los secundarios. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Se realiza con muestra de líquido peritoneal por laparoscopia o laparotomía; en su defecto, aunque no ideal, también por culdocentesis. Se realizan cultivos para N. gonorrhoeae, gérmenes aerobios y anaerobios; búsqueda de antígenos para C. trachomatis (ELISA, IF) y cultivo para Mycoplasma. Los cultivos de endocérvix no son representativos de infección tubárica, pero orientan en la etiología y representan una alternativa en caso de carecer de laparoscopia. La utilización de PCR en el diagnóstico de C. trachomatis ha determinado un aumento de la sensibilidad de este, pudiendo ser aplicado también en el diagnóstico de los cuadros anteriores (cervicitis, uretritis). TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 235 TRATAMIENTO El diagnóstico y tratamiento precoz es fundamental para evitar secuelas severas como la infertilidad por obstrucción tubárica, el embarazo ectópico, etc. La terapéutica está orientada a cubrir todos los agentes posiblemente involucrados, existiendo diferentes pautas para pacientes ambulatorias o internadas. Existen distintos regímenes terapéuticos que se pueden utilizar, en general combinan cefalosporinas de primera a tercera generación o ampicilina/ sulbactam, en combinación con doxiciclina o macrólidos, pudiendo en ocasiones asociarse también metronidazol. VAGINITIS Y VAGINOSIS Dentro de las infecciones vaginales destacamos que la única que constituye ITS es la vaginitis por Trichomonas vaginalis. El flujo vaginal constituye uno de los motivos de consulta mas frecuente de las mujeres en edad reproductiva. Entendemos por flujo al aumento permanente de los trasudados y exudados de causa fisiológica o patológica, que se objetivan por la paciente o por el examinador. El flujo fisiológico es producto de los cambios hormonales del ciclo, y contiene escasa cantidad de leucocitos. La leucorrea puede deberse a infección vaginal o cervical. Denominamos vaginitis a la infección vaginal con respuesta inflamatoria caracterizada por la presencia de polimorfonucleares en el extendido teñido con tinción de Gram. Dentro de los agentes más frecuentes se encuentra Candida albicans (levadura que integra la flora vaginal normal). Trichomonas vaginalis (protozoario flagelado), también es un agente causal, pero menos frecuente. El flujo causado por Candida sp. es de color blanquecino, grumoso (leche cortada), no oloroso, se manifiesta en conjunto con prurito vaginal y tiene pH ácido. Puede presentarse conjuntamente con la flora habitual (lactobacilos). El flujo por Trichomonas vaginalis es de color amarillo verdoso, puede ocasionar prurito, presenta olor a aminas volátiles, producto del metabolismo de las bacterias anaerobias asociadas; Determina pH vaginal alcalino y disminución o ausencia de la flora vaginal, con presencia de flora mixta anaerobia asociada. La vaginosis bacteriana constituye una entidad caracterizada por un cambio en la microecología de la vagina caracterizada por la disminución o ausencia de lactobacilos con presencia de Gardnerella vaginalis (cocobacilo Gram negativo) asociada a bacterias anaerobias como Mobiluncus sp., Peptococcus sp. y Bacteroides sp. Se diferencia de la vaginitis en la ausencia de respuesta inflamatoria, o sea en la ausencia de polimorfonucleares. El flujo de la vaginosis es oloroso por la liberación de aminas volátiles, no ocasiona prurito, se acompaña de pH vaginal alcalino y se caracteriza por la presencia de flora bacterina mixta dispuesta en la periferia de las células epiteliales, formando las células guía o clue cells. La características clínicas del flujo son orientadoras, pero debe saberse que en la mayoría de los casos, la clínica no condice con los hallazgos microbiológicos, por lo cual es indispensable el estudio microbiológico para confirmación del diagnóstico. Diagnóstico Se basa en la realización de un exudado vaginal. El mismo se estudia con un examen en fresco de flujo extraído del fondo de saco vaginal para observar la movilidad de Trichomonas vaginalis, un examen directo con coloración de Gram de las paredes vaginales para observación de levaduras en gemación o pseudofilamentos que orienten a Candida spp., presencia de “células 236 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA guía” que orienten a G. vaginalis o cocos grampositivos en cadenas que indiquen la existencia de Streptococcus ß-hemolítico grupo B, otro agente de vaginitis y cervicitis. Se valora también el endocérvix en busca de cervicitis asociada. Los cultivos se realizan en agar sangre humana para detección del desarrollo de G. vaginalis, Candida spp. y Streptococcus ß-hemolítico grupo B, necesitando la primera de cuatro a cinco días de incubación. Tratamiento Será específico etiológico. Para T. vaginalis se utiliza metronidazol en dosis única de 2 g v.o. o 250mg c/8 hs durante 7 días. En Candida spp. se utilizan óvulos de miconazol o nistatina, asociados a ketoconazol o fluconazol v.o. en caso de candidiasis a repetición. La vaginosis se trata con metronidazol 500 mg c/12 hs durante 7 días. Dado que tanto la vaginosis bacteriana como la vaginitis por Candida spp. no son infecciones de transmisión sexual, no se debe realizar tratamiento a la pareja. ÚLCERAS GENITALES Concepto y definición Las úlceras genitales son lesiones que se caracterizan por la pérdida de continuidad en el epitelio, en el que se observa una necrosis previa. La lesión inicial puede ser una pápula, pústula o vesícula. Constituyen un motivo de consulta frecuente, lo cual plantea la necesidad de una orientación diagnóstica etiológica adecuada. Las úlceras que aparecen en los genitales no son exclusivamente de transmisión sexual, existiendo otras etiologías como traumatismos, reacciones a medicamentos, alergia, lesiones químicas o evolución de una infección previa no ulcerativa (balanitis). Las etiologías infecciosas de transmisión sexual de estas lesiones son variadas y, dependiendo de la región considerada, su frecuencia relativa también varía. En nuestro medio el herpes genital ( Herpes simplex tipo II y en ocasiones I ) y la sífilis (Treponema pallidum) son los procesos más frecuentes. El chancroide (Haemophilus ducreii), el linfogranuloma venéreo (C. trachomatis L1, L2, L3) y el granuloma inguinal (Calymatobacterium), son muy poco frecuentes. Las manifestaciones clínicas de cada patología son orientadoras, pero por su asociación y muchas veces por la presentación poco específica, el diagnóstico microbiológico resulta fundamental. Dada la importancia de la sífilis y el herpes genital, nos referiremos exclusivamente a estas. SÍFILIS Es una infección sistémica de evolución crónica producida por Treponema pallidum. Esta bacteria forma parte del género Treponema, familia Spirochaetaceae; es una bacteria larga, de forma helicoidal, que se visualiza en microscopio con campo oscuro. Su estructura consta de un citoplasma cilíndrico rodeado de una membrana citoplasmática y una pared celular. Presenta seis filamentos axiales unidos tres a cada uno de los extremos, orientados hacia el centro y superpuestos a ese nivel sin unirse; por fuera de estos se encuentra la membrana externa. Esta bacteria se incurva formando 4 a 14 espirales, y posee un movimiento en sacacorchos. Su multiplicación se produce por división binaria con un tiempo de duplicación de 30 horas, es anaerobia estricta, y hasta ahora no ha podido ser cultivada. Se plantea la existencia de una capa de slime mucopolisacárido, sintetizada a partir del ácido hialurónico de los tejidos del huésped que le permite evadir la respuesta inmune. Patogenia. Historia natural de la infección Esta enfermedad presenta un período de incubación de 9 a 90 días con una media de 21 días, TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 237 seguido de una lesión primaria o chancro con linfadenopatía regional y un período secundario bacteriémico asociado a lesiones maculopapulares y linfadenopatías generalizadas. Posteriormente existe un período de latencia de varios años y, finalmente, un 30% a 50% de los casos no tratados presentan un período terciario caracterizado por destrucción mucocutánea, lesiones parenquimatosas, aortitis y enfermedades del sistema nervioso central. T. pallidum se une a las células en la puerta de entrada dando una lesión primaria y se disemina por la sangre. La lesión primaria se produce por la enzima mucopolisacaridasa que degrada el espacio intercelular del endotelio capilar, generando una endarteritis obliterante con necrosis y ulceración. El huésped responde con un infiltrado linfocitario y de células plasmáticas. La mayor parte del daño se debería a inmunocomplejos, que determinarían la respuesta inflamatoria lesiva. Inmunidad humoral Se estimula precozmente y se mantiene con las lesiones del secundarismo. Anticuerpos inespecíficos o reaginas Se forman frente a lípidos de los tejidos destruídos por T. pallidum que actúan como haptenos al unirse con la espiroqueta. No son específicos, pero se producen en la totalidad de los infectados. Aparecen una a tres semanas después del chancro y su título aumenta hasta un máximo en el período secundario. En el período terciario se encuentran en un 90% de los pacientes. La presencia de estos anticuerpos indica lesión activa, pudiendo existir falsos positivos que deberán confirmarse con técnicas de detección de anticuerpos específicos. Las reaginas descienden con el tratamiento, utilizándose como control del mismo. Anticuerpos específicos Aparecen inmediatamente después de las reaginas y persisten toda la vida si el paciente no es tratado o lo es tardíamente. La negativización postratamiento es muy lenta, pudiendo demorar años, por lo cual no resultan útiles como control terapéutico sino como confirmación diagnóstica en un paciente con reaginas positivas. Estos anticuerpos pueden ser del tipo IgG o IgM. Estos últimos se encuentran en la sífilis primaria o en la sífilis congénita. Inmunidad celular Se encuentra deprimida en la primoinfección y el período secundario, recuperándose postratamiento. Clínica Se puede dividir en dos etapas: la llamada sífilis precoz, hasta los dos años postinfección, y la sífilis tardía, a partir de los dos años. La primera se caracteriza por curarse fácilmente, ser contagiosa por transmisión sexual y por vía trasplacentaria. La sífilis tardía presenta lesiones crónicas, difíciles de curar y, en general, no se transmite por contagio sexual. SÍFILIS PRECOZ Presenta un primer período llamado de incubación de tres a cuatro semanas, donde existe bacteriemia treponémica. Le sigue un período primario donde aparece el chancro de inoculación. Se trata de una lesión ulcerada con base edematosa indurada, indolora, en general única, con localización genital y oral y duración entre cuatro y seis semanas. Esta lesión desaparece luego de este período, independientemente de la realización de un tratamiento. Es de gran utilidad para el diagnóstico, sin embargo, sus características no siempre son típicas 238 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA y se plantean problemas de diagnóstico diferencial. En este período también se presentan adenopatías regionales concomitantes con el chancro. Aparecen una semana después que este, son indoloras y bilaterales. Completa esta etapa la bacteriemia treponémica causante de astenia y cefaleas. Este período primario puede no existir cuando el contagio es postransfusión, cuando el chancro no es visible, o cuando es decapitado por el uso de antibióticos a dosis insuficientes. El período secundario se caracteriza por manifestaciones generales tales como hepatoesplenomegalia, cefaleas, poliadenopatías y manifestaciones cutaneomucosas como la roséola (exantema), condilomas planos (placas en mesetas de ingles y axilas), sifílides (lesiones planas en plantas y palmas). Luego del período secundario aparece el período de latencia precoz, que se caracteriza por la desaparición espontánea de las manifestaciones del período anterior. SÍFILIS TARDÍA Se caracteriza por la aparición de lesiones cutaneomucosas, llamadas gomas (nódulos de piel que se ulceran), lesiones óseas (periosteítis), lesiones cardiovasculares (aortitis) y lesiones neurológicas como tabes dorsal y meningitis meningovascular (más frecuentes en VIH +). Diagnóstico directo Trepoinvestigación: consiste en un raspado de lesiones del chancro primario o la roséola, con observación de treponemas en microscopio con campo oscuro. PCR: detección por técnicas de amplificación genética del genoma treponémico. Diagnóstico indirecto Investigación de reaginas: estas técnicas se utilizan para exámenes de screening en población y para control de tratamiento. Destacamos que las reaginas se positivizan luego de una a tres semanas del inicio del chancro, dato importante para la indicación de este examen. Las técnicas utilizadas son cualicuantitativas con reacciones de antígeno-anticuerpo evidenciadas por floculación (VDRL) o por aglutinación de partículas (carbón activado, RPR). Estos anticuerpos deben cuantificarse, ya que su título nos orientará frente a un falso positivo o a un título residual. Investigación de anticuerpos treponémicos: son técnicas confirmatorias y de diagnóstico en etapas latente o terciaria, pudiéndose utilizar también en la sífilis precoz, ya que se positivizan (principalmente el FTA absorbido) antes que las reaginas. Las más utilizadas son el FTA absorbido y el TPHA. El FTA es una técnica de inmunofluorescencia indirecta que utiliza como antígeno a Treponema pallidum liofilizado: puede detectar IgG o IgM. La presencia de anticuerpos contra antígenos comunes del T. pallidum y Treponema saprófitos determina la existencia de falsos positivos por esta técnica. La absorción previa del suero problema con treponema no patógeno (cepa Reiter), elimina este problema y la convierte en una técnica más específica. TPHA o técnica de inhibición de la hemaglutinación de T. pallidum está adaptada a microplacas, es de más fácil realización y presenta resultados comparables con la anterior. Tratamiento Sífilis menor de un año: penicilina benzatínica 2.400.000 UI i.m. Alérgicos a la penicilina: tetraciclinas 500 mg c/6 hs 15 días o eritromicina 500 mg c/6 hs 15 días. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 239 Sifilis mayor a un año: penicilina benzatínica 2.400.000 UI i.m. por semana durante tres semanas. HERPES GENITAL Es una de las ITS de etiología viral más frecuente, con aumento de su incidencia en los últimos tiempos. La imposibilidad de su erradicación por tratarse de una infección persistente con frecuentes recidivas y el riesgo de contagio fetal en el canal de parto, justifican su importancia y la preocupación por su control. El agente Herpes Virus simplex tipo II y tipo I (agente del herpes labial) pertenece a la familia Herpesviridae y a la subfamilia Alphaherpesvirinae; es un virus que contiene ADN, siendo su estructura y características generales tratadas en el capítulo correspondiente. Nosotros realizaremos un resumen de la patogenia, clínica y tratamiento de esta infección. Patogenia Presenta cinco fases: infección primaria mucocutánea, infección ganglionar aguda, latencia, reactivación e infección recurrente. La infección se inicia con la exposición al virus, la inoculación con participación de células epiteliales, la replicación viral con lisis celular, la rápida respuesta inflamatoria y la posterior diseminación del virus por nervios sensitivos o autónomos hasta los ganglios regionales (sacros). También se puede diseminar por contigüidad, extendiéndose las lesiones cutáneas. En los ganglios se produce una etapa de latencia que persiste toda la vida, con reactivaciones por estímulos de piel (sol, traumatismos, químicos) y centrales (coito, menstruación, estrés, infecciones). Clínica Se plantean dos situaciones: 1) la infección asintomática en la que no existe lesión ni antecedentes de la misma, solo están presentes los anticuerpos contra el virus; 2) la infección sintomática que se clasifica en: a) primoinfección herpética con lesiones de piel, sin antecedentes del mismo tipo y sin anticuerpos contra el virus, y b) infección inicial no primaria donde existen lesiones actuales sin antecedentes de las mismas, pero con anticuerpos positivos por primoinfección asintomática anterior. Las lesiones se caracterizan por múltiples vesículas dolorosas seguidas de ulceración y adenopatías inguinales de 10 días aproximadamente de evolución, pudiéndose acompañar de fiebre y cefaleas, principalmente en las primoinfecciones. Diagnóstico Métodos directos: estos métodos, en general, no están a disposición en los laboratorios clínicos. El clásico es el de aislamiento del virus en cultivos celulares, tomando muestras del líquido vesicular de la lesión. Otros métodos más rápidos son la inmunofluorescencia directa para antígenos virales y PCR para herpes. Métodos indirectos: los métodos indirectos de detección de anticuerpos son de poco valor para el diagnóstico de la infección recidivante. En el caso de una primoinfección se puede detectar un aumento del título de IgG. La IgM puede ser de utilidad en el diagnóstico de infección herpética neonatal. 240 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Tratamiento Se manejan una gran variedad de drogas antivirales, entre las cuales por frecuencia destacamos el aciclovir y el valaciclovir, como ya manifestamos en el capítulo de Herpesvirus. El tratamiento acorta los síntomas, principalmente en inmunodeprimidos y en primoinfecciones, pero no logra la eliminación del virus. Se administra en general localmente en la lesión y también por vía oral (200 mg c/5 hs durante 10 días), destacamos que el tratamiento de mayor eficacia es el que se realiza por vía oral. VERRUGAS GENITALES - CONDILOMAS ACUMINADOS Son formaciones verrugosas, vegetantes, de tamaño variable, que se localizan en la región genital y perianal, cuya etiología es viral: Papilomavirus humano (HPV), un subgrupo de la familia Papovaviridae. Papilomavirus humano es una de las causas más frecuentes de ITS, tanto en hombres como en mujeres en todo el mundo. Aún su prevalencia e incidencia persisten desconocidas a pesar de que en Estados Unidos se estima una incidencia anual de 1 a 5,5 millones y una prevalencia de 20 millones. Dicho virus se ha detectado en una amplia variedad de animales así como en humanos, siendo específicos para cada hospedero. Son virus de cápside icosahédrica con 72 capsómeros y un ADN circular de doble cadena. El genoma consiste en una única molécula de ADN doble circular que contiene dos proteínas de la cápside, L1 y L2 . El marco abierto de lectura que contiene las secuencias para codificar proteínas ocupa una de las cadenas. El genoma se divide funcionalmente en tres sectores: región reguladora no codificante; región temprana E1, E2, E4, E5, E6, y E7, que tienen que ver con la replicación viral y con la oncogénesis; región que codifica para las proteínas de la cápside. La infección se produce por contacto piel con piel, o piel con mucosa. En principio la forma más importante de contagio es por vía sexual, no descartándose la vía por fomites. El potencial oncogénico del virus radicaría en principio en que es un virus ADN, cuyo genoma se integra al genoma de las células eucariotas del estrato basal del epitelio, produciendo una infección productiva o de lo contrario quedando latente y produciendo una infección persistente. De ahí la importancia de las zonas tempranas E6 y E7 que codificarían para proteínas multifunción que se unirían a las proteínas celulares p53 y pRB, alterando sus funciones, alterando la regulación del ciclo celular, llevando a la célula a la transformación y malignización. La infección se expresa clínicamente en cuatro localizaciones: piel, mucosa genital, mucosa laríngea (recién nacidos) y mucosa oral. No se ha podido propagar los virus en cultivos celulares, por lo cual se conocía muy poco de los mismos. Gracias a las técnicas genéticas de hibridación se han podido detectar 60 genotipos, y luego con el advenimiento de técnicas como la reacción en cadena de la polimerasa, se han llegado a detectar alrededor de 200 tipos diferentes en base a las diferencias genómicas, habiendo más de 85 genotipos bien caracterizados. Dado que se asocian con lesiones precursoras del cáncer de cuello uterino y con cáncer de cuello uterino invasor, se han agrupado en grupos de bajo y alto riesgo (de acuerdo al potencial oncogénico). Los tipos de bajo riesgo serían 6, 11, 42, 43 y 44; los tipos de alto riesgo serían 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 y 70. Dentro de los de alto riesgo existen algunos tipos que se asocian más frecuentemente con lesiones precursoras (lesiones intraepiteliales escamosas) que con cáncer, algunos autores se refieren a ellos como de riesgo intermedio. Se asocia a una variedad de condiciones clínicas, que van desde lesiones inocuas cutáneas TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 241 como pueden ser las verrugas, hasta el cáncer. La relación entre HPV y cáncer de cuello uterino fue puesta de manifiesto a principio de los años 80 por Harold zur Hausen, sabiendo desde entonces que su asociación era más fuerte aún que la del tabaco con el cáncer de pulmón. Actualmente se sabe que 99% de los cánceres escamosos de cuello uterino vienen determinados por HPV, está presente en un 89% de las pacientes menores de 40 años con adenocarcima de cuello uterino y en un 43% de las mujers mayores de 60 años con igual diagnóstico. Clínica Infección asintomática: piel y mucosas sanas, diagnóstico por hiludación del ADN viral o PCR. Lesión: aparecen masas carnosas y vegetantes en forma de crestas localizadas en zonas húmedas genitales, pudiendo aparecer como papilas sésiles. Aumenta su tamaño con el embarazo y la disminución de la inmunidad celular (VIH +). Infección subclínica: no existe lesión macroscópica, el diagnóstico se plantea por colposcopia con ácido acético al 3% y penescopia con el mismo método y posterior biopsia de los sectores afectados. Diagnóstico Es clínico en las formas lesionales. Las formas subclínicas presentan dificultades. La citología, la biopsia y la colposcopia ayudan, pero muchas veces son poco específicas. El diagnóstico específico se realiza por métodos de hibridación del ADN viral o PCR, diferenciando luego mediante sondas marcadas o con enzimas de restricción los distintos genotipos virales. Por no realizarse de rutina, dado su costo elevado, los métodos histológicos son los más utilizados, llevando a un sobrediagnóstico de esta infección. Tratamiento Según pautas recientes (CDC) esta infección no debe tratarse por ser una infección viral persistente. Los tratamientos se realizarán en aquellos pacientes con lesión evidente, siempre que generen problemas estéticos o funcionales. Los pacientes subclínicos y asintomáticos deberán ser controlados (con colpocitologías en el caso de mujeres) con el fin de detectar precozmente posibles displasias. Las lesiones verrugosas se tratan con métodos citotóxicos como resina de podofilina en solución alcohólica (10% a 40%) con aplicaciones de 2 a 4 horas 1 o 2 veces por semana (98% con alta recidiva), estando contraindicada en embarazadas o para condilomas cervicales o intrauretrales. Otros métodos son los quirúrgicos, como el curetaje, la electrocoagulación en lesiones de gran tamaño y crioterapia de elección en cualquier localización. Infecciones generalizadas: SIDA El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es el último estadio de la infección por el VIH, un retrovirus ARN que posee característicamente, una enzima transcriptasa reversa (ADN polimerasa, ARN dependiente). Las alteraciones progresivas que resultan de esta infección son producto de la destrucción de la población de linfocitos CD4 cooperadores, que altera la respuesta inmune celular y humoral del organismo. Tal alteración inmunitaria conlleva a la muerte por infecciones oportunistas (Cytomegalovirus, P. carini, etc.) o por neoplasias como el sarcoma de Kaposi, que por otra parte son poco frecuentes en la población en general. La evolución natural de la infección consta de varios estadios: uno inicial de infección asintomática con respuesta inmune normal; un estadio de linfadenopatías generalizadas 242 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA con ligera deplección inmunitaria; un tercer estadio que presenta el denominado complejo relacionado con el SIDA (ARC), con déficit en la hipersensibilidad retardada, linfadenopatías generalizadas durante más de tres meses, fatiga y sudores nocturnos persistentes, y una deplección significativa de la inmunidad (<400 CD4/mm3); y la etapa final o SIDA que presenta una deplección severa de la inmunidad, infecciones oportunistas, neoplasias y posible encefalitis. Este período está definido por la aparición de determinadas infecciones y neoplasias y un valor reducido de CD4 (<200 CD4/mm3), junto con la documentación del virus o sus anticuerpos. Patogenia El inicio de la infección se produce una vez que el virus ingresa al organismo y se une por medio de una glupoproteína, GP120, al receptor CD4 que se encuentra entre otras células en los linfocitos T4 cooperadores. La glucoproteína GP41 actúa como anclaje, facilitando la aproximación y unión a la célula huésped. El virus ingresa a la célula, libera su ARN más la enzima transcriptasa reversa. Se produce la transcripción del ARN en ADN que se integra al ADN de la célula, iniciándose una fase de latencia aparente, ya que existe duplicación del genoma viral. Esta fase, junto con la de reactivación, es regulada por genes víricos utilizando mecanismos de retroalimentación positiva y negativa en conjunto con estímulos externos como sobreinfecciones, etc. Diagnóstico Para comprender la metodología diagnóstica se deben conocer las estructuras antigénicas del virus que determinan respuestas de anticuerpos (ver Capítulo 26). Los anticuerpos anti glucoproteínas de envoltura GP120 y GP41, y proteínas de cápside P24, son los más relevantes para la confirmación diagnóstica. En el transcurso de la infección se observa una evolución y cambio de la presencia en sangre de los antígenos virales y los anticuerpos IgG e IgM específicos. La secuencia de técnicas aplicadas para el diagnóstico consiste en técnicas de screening como ELISA, hemaglutinación y aglutinación de partículas de látex, muy sensibles pero no tan específicas, y técnicas de confirmación como inmunofluorescencia indirecta y Western-Blot, con mayor especificidad. Estas técnicas han evolucionado a lo largo de los años mejorando la sensibilidad, especificidad y acortando el período ventana a tan sólo 15 o 20 días. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica directa alterna- TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 243 tiva al cultivo, con buena sensibilidad y especificidad. Es de gran utilidad en el diagnóstico de infección neonatal. La búsqueda de antígeno P24 en sangre es una técnica directa más precoz que la búsqueda de anticuerpos, pero presenta una sensibilidad de 50%. Epidemiología Las vías de transmisión de este virus, además de la sexual, son la vía parenteral, que es la más efectiva, y la vía vertical (madre/hijo). No se transmite por fomites o insectos vectores. La infección vertical del recién nacido se produce en un 10% a 35% a partir de las madres infectadas, antes del inicio del uso de las medidas preventivas correpondientes. La leche materna también es un vehículo de transmisión por lo que no está indicado el amamantamiento. Existe una interacción entre la infección por VIH y otras ITS. Las úlceras genitales favorecen la infección por VIH; la infección por VIH a su vez afecta a la sífilis generando una progresión hacia la neurosífilis. El herpes genital se presenta con mayor severidad y con elevada recurrencia, al igual que la infección por Papilomavirus. La prevención de esta infección se basa, al igual que la de otras ITS, en el desarrollo de programas de educación de la población, consejería de hábitos sexuales, utilización de preservativos, control de sangre transfundida y disminución de los índices de drogadicción en la comunidad, entre otras. Dentro de este grupo de infecciones generalizadas se encuentran las producidas por virus de hepatitis B y C, Citomegalovirus, etc., que no serán tratados en este capítulo. Bibliografía • Mandell G, Douglas, Bennett J. editors. Enfermedades infecciosas, Principios y Práctica. 5ª ed. Bs.As. Panamericana. 2002. • Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. Bailey&Scott’s , Diagnostic Microbiology. Tenth Edition. Saint Louis, Missouri. Mosby, Inc. 1998 • Salyers A, Whitt D., editors. Bacterial Pathogenesis, a molecular approach.2nd. ed. Washington, D.C. ASM Press. 2001. • Burd E. Human Papillomavirus and Cervical Cancer. Clín. Microbiol. Rev. 2003 Jan; 16 (1 ): 1-17. • Galloway D. Papillomavirus in clinical trials. Lancet Infect.Dis. 2003 Aug; 3: 469-75. 244 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 245 Página 245 15 Infecciones hospitalarias M. Macedo, J. Blanco La infección hospitalaria (IH) o nosocomial es la que se adquiere en el hospital u otro servicio de salud, es decir que no estaba presente ni en período de incubación cuando el paciente ingresó a dicho centro. Como regla general se establece un plazo de 48-72 horas luego del ingreso hospitalario para establecer que la infección ha sido adquirida en ese centro de salud; este plazo considera el período de incubación de las IH más frecuentes, pero existen infecciones, como por ejemplo las transmisibles por sangre (hepatitis B, VIH, etc.) que pueden haberse adquirido en el hospital y aparecer luego del alta hospitalaria, y que deben ser consideradas sin embargo como IH. Por ello, es importante conocer el período de incubación del agente en causa para reconocer si la infección fue adquirida en el hospital o en la comunidad. En 1847 K.Ignaz Semmelwieis, médico húngaro radicado en Viena, advirtió por primera vez la transmisión intrahospitalaria de infecciones puerperales. Observó que estas infecciones se desarrollaban preferentemente en puérperas que habían sido examinadas por estudiantes de medicina que habían realizado necropsias y cuyas manos estaban, por lo tanto, impregnadas de “restos cadavéricos”, qué luego supo eran agentes infecciosos. Instituyendo el lavado de manos con una solución de hipoclorito de calcio logró disminuir notablemente el número de infecciones y su consecuente mortalidad. Semmelwieis realizó así, en esta oportunidad, dos importantes aportes al conocimiento de la patología infecciosa: la transmisión intrahospitalaria exógena de infecciones (infecciones cruzadas) y la importancia del lavado de manos. Si bien existen y se reconocen desde hace casi 2 siglos, la tendencia temporal es el aumento de casos de IH, y esto se debe en gran medida a los avances tecnológicos: grandes nosocomios donde se practican procedimientos invasivos como cirugía, transfusiones, asistencia respiratoria mecánica, terapéutica intravenosa, cateterización urinaria. También es un factor contribuyente el aumento de la sobrevida en los hospitales de individuos particularmente susceptibles: recién nacidos prematuros, inmunodeprimidos, quemados. Muchas son los factores que contribuyen a la patología infecciosa hospitalaria: • Los que dependen del microorganismo: patogenicidad de las especies, virulencia de las cepas, resistencia antimicrobiana. • Los que dependen de la susceptibilidad del paciente: edad, sexo, enfermedades subyacentes, estado inmunológico. • El medio ambiente: planta física, personal hospitalario, régimen de visitas. • Tratamientos instituidos: inmunodepresores, antimicrobianos, técnicas invasivas. 246 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Es oportuno aclarar que no todas las IH son prevenibles; se estima que por lo menos la mitad se produciría a pesar de la aplicación de estrictas medidas de prevención. Epidemiología La mayoría de las IH son de carácter endémico, es decir que se presentan de forma esperada tanto en sus características como en frecuencia. Ocasionalmente aparecen brotes o epidemias que se localizan en áreas específicas del hospital y están causadas por microorganismos particulares o con resistencia antimicrobiana inusual. La incidencia es difícil de establecer porque estará en gran parte determinada por las características del nosocomio (estructura edilicia, tamaño, número de camas y servicios, tipos de servicios) y las medidas de control aplicadas. En general varían entre 2 y 25% de los pacientes admitidos, correspondiendo las tasas más altas en servicios como los de oncología, transplantes, CTI, cirugía, y las más bajas a los servicios médicos, obstetricia y pediatría. Los agentes etiológicos de las IH incluyen bacterias, virus, hongos y parásitos, en ese orden de frecuencia. Entre la larga lista de reconocidos agentes de IH se encuentran: BACTERIAS VIRUS Acinetobacter Heptitis A, B, C, TTV Burkholderia cepacia VIH Clostridium difficile/Clostridium sordellii Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus: SAMS, SAMR hospitalario, SAMR comunitario, GISA Influenza Virus respiratorio sincicial Parvovirus Streptococcus pneumoniae Mycobacterium tuberculosis Enterococcus spp., incluyendo ERV y multi-resistentes Enterobacterias multi-resistentes Legionella pneumophila Rubéola SARS Rotavirus OTROS Candida spp. Priones: Enfermedad de CreutzfeldtJakob Aspergillus spp. Varicella Fiebres hemorrágicas Norovirus SAMS: S.aureus meticilino-sensible; SAMR: S.aureus meticilino-resistente ; GISA : S.aureus con resistencia intermedia a glicopéptidos; ERV: Enterococcus vancomicino-resistente. Ecología y transmisión Las IH pueden ser exógenas, lo que se denomina infección cruzada, o endógenas, es decir las que son causadas por agentes de la propia flora del paciente. A veces es difícil determinar si la infección es exógena o endógena Para que ocurra la infección exógena debe existir: un reservorio del agente infeccioso (lugar donde se mantiene el microorganismo con capacidad de replicación), una fuente (sitio desde el cual el paciente adquiere el agente infeccioso), un mecanismo de transmisión (me- TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 247 canismo por el cual el paciente adquiere la infección) y una puerta de entrada. El reservorio y la fuente pueden coincidir o ser elementos diferentes. Las puertas de entrada al organismo del paciente pueden ser: la orofaringe y el tracto respiratorio, el ojo, la piel y las mucosas, la uretra, el tracto genital, el tracto digestivo. Es frecuente que el acceso esté dado por instrumentos invasivos que alteran las defensas del huésped y constituyen reservorios para la persistencia y multiplicación de los microorganismos. RESERVORIOS Y FUENTES Humanos • Pacientes: están colonizados o infectados por microorganismos que son diseminados principalmente por contacto a través del personal de salud (infección cruzada). La flora de estos pacientes tiende a cambiar rápidamente a favor de microorganismos inusuales en la comunidad y de mayor resistencia a los antibióticos. • Personal de salud: en general el reservorio más importante es la piel, donde portan su flora normal, y mucho menos frecuente es que porten y diseminen patógenos nosocomiales. Los microorganismos mejor reconocidos son S.aureus a partir de portación nasal y EBHA a partir de faringe, recto y vagina. Los trabajadores con infecciones respiratorias altas sintomáticas y erupciones cutáneas parecen tener riesgo aumentado de transmisión. Es de destacar que la flora hospitalaria se caracteriza por tener perfiles de multi-resistencia a los antibióticos y por estar alterada la flora basal de los pacientes por el uso de antimicrobianos. No humanos • Reservorios y fuentes ambientales: sistemas de ventilación (Aspergillus spp., Legionella), agua (P.aeruginosa, Alcalígenes, Ralstonia picketti, etc.), las paredes y pisos no son reservorios habituales a menos que acumulen suciedad suficiente como para albergar microorganismos en gran cantidad. • Dispositivos médicos: algunos se contaminan durante su uso y otros durante su manufacturización. La mayoría de las contaminaciones ocurren cuando los dispositivos permanecen húmedos, por ej. por procedimientos de desinfección que no son adecuados. Los patógenos involucrados son muchos e incluyen micobacterias atípicas que colonizan válvulas cardíacas protésicas y el agente de Creutzfeld-Jacob que coloniza electrodos implantables. • Soluciones: algunos agentes muestran considerable tropismo por ciertos fluidos. Por ej.: soluciones de dextrosa colonizadas por bacterias que pueden fijar nitrógeno atmosférico (ej.: Enterobacter); soluciones que contienen lípidos pueden ser colonizadas por muchos microorganismos pero sobre todo S.epidermidis y Malassezia; desinfectantes, como el cloruro de benzalconio y los iodóforos que se contaminan con Burkholderia cepacia. Los fluidos intravenosos en las unidades de cuidados intensivos pueden contener P.aeruginosa y S.maltophilia. MODOS DE TRANSMISIÓN Contacto Es la forma más común. Puede darse contacto a través de la piel (de aquí la importancia del lavado de manos) o a través de grandes gotas respiratorias que pueden viajar unos pocos metros. Ej.: B.pertussis, N.meningitidis, EBHA, Adenovirus y Parainfluenza. 248 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Fecal-oral En el hospital raramente se adquieren las infecciones entéricas comunes (salmonelosis, shigellosis), pero si gérmenes que colonizan el intestino: Enterobacter spp., Serratia, E.coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp., C.difficile, Rotavirus. Frecuentemente se transmiten a través de las manos de los trabajadores, y la contaminación de fomites amplia la distribución de los gérmenes. A través de vectores Principalmente actúan como vectores de la flora hospitalaria los trabajadores de la salud. Es rara la transmisión a través de vectores artrópodos. Vía aérea Se refiere a la diseminación de microorganismo por vía de pequeñas gotitas que pueden permanecer en el aire por largos períodos de tiempo. Esta forma de transmisión puede darse: de paciente a paciente, por vía respiratoria: sarampión, varicela, tuberculosis; a partir del aire ambiental: esporos fúngicos, Legionella. Vía sanguínea Este modo de transmisión afecta a los pacientes, a través de transfusiones de sangre y derivados, a pesar de que ha disminuido notablemente desde que se realiza screening de la sangre donada para los principales agentes transmitidos por esta vía. También afecta a los trabajadores de la salud, en quienes representa un riesgo por accidentes. Ej.: HIV, HBV, CMV, HCV, bacterias, parásitos. Epidemiología de infecciones nosocomiales específicas Las infecciones más frecuentes son las urinarias, seguidas de las respiratorias bajas, las de herida quirúrgica y las bacteriemias. 249 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Infección Urinaria Agentes - BGN fermentadores - Enterococcus spp. (incluyendo ERV) Factores de riesgo Instrumentación sobre el tracto urinario, sobre todo cateterización, y dentro de este factor importa: el tiempo (aumento del riesgo 1-5% por cada día), sexo - Menos frecuentes: femenino, insuficiencia renal, otros BGN fermen- diabetes, colonización de la bolsa colectora. tadores (Acinetobacter) El uso de antibióticos disminuye - P.aeruginosa Neumonia - BGN fermentadores y no fermentadores - Aspiración - S.pneumoniae - Depresión del nivel de conciencia - Virus respiratorios - Legionella - Aspergillus Heridas quirúrgicas el riesgo para cateterizaciones de corto plazo pero lo aumenta luego del 6º día. - Ventilación mecánica En cirugías limpias: - S.aureus Secuelas Aumento de la hospitalización en un promedio de 1 a 8 días. Aumento en el uso de antimicrobianos, con las consecuencias económicas y ecológicas; es de destacar que muchas veces se trata de colonizaciones y no de infecciones Alta mortalidad. Aumenta la hospitalización en un promedio de 7 días - Enfermedad pulmonar crónica - Cirugía torácica o abdominal - Fármacos que disminuyen la acidez gástrica - Mucho más frecuente en cirugías de sitios contaminados o infectados. - Staphylococcus spp. Coagulasa negativos en implantes. - Obesidad - Anaerobios - Discutido el papel de los drenajes - Infecciones de heridas quirúrgicas, neumonías e infecciones urinarias Aumento de la hospitalización de 5 a 24 días - Diabetes - Infección en otros sitios (ej.: En cirugías abdomi- tracto urinario) nales y pélvicas: - Ausencia de profilaxis antibiótica en cirugías no limpias - BGN aerobios Bacteriemias - S.aureus - Staphylococcus spp. Coagulasa negativos - E.coli y otras Enterobacterias - Catéteres endovasculares Alta mortalidad. Aumento de la hospitalización de 14 a 30 días - Inmunodepresión - P.aeruginosa - Candida albicans ETIOLOGÍA Desde la primera descripción de Semmelweis, que involucraba infecciones por Streptococcus pyogenes, hemos asistido a la circulación cíclica de diferentes patógenos en los centros de salud. A principios del siglo XX, los cocos Gram positivos continuaban siendo los principales 250 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA agentes, especialmente Streptococcus spp. y S.aureus. Controlados estos agentes con las medidas adecuadas y el uso de antibióticos contra gérmenes Gram positivos, se observó la emergencia, a partir de 1970, de los bacilos Gram negativos, cobrando importancia las Enterobacterias y P.aeruginosa. A finales de la década del ’80 y principios de la del ’90, el uso de varias clases diferentes de antimicrobianos efectivos contra Gram negativos fue una solución transitoria para combatir a estos gérmenes, y se presenció nuevamente la emergencia de los cocos Gram positivos a la cabeza de las IH, pero esta vez con el problema adicional de la resistencia antibiótica: SAMR, GISA y EVR. Hoy en día, aproximadamente un tercio de las IH es causada por S.aureus, Staphylococcus coagulasa negativos y enterococos, mientras que otro tercio aproximadamente es causado por E.coli, P.aeruginosa, Enterobacter spp. y K.pneumoniae. Como ya se ha señalado, con mucha frecuencia estos gérmenes muestran multi-resistencia. Son habituales Enterobacterias con beta-lactamasas de espectro expandido (BLEE), Pseudomonas spp. multi-resistentes, incluyendo resistencia a carbapenems, y las resistencias ya mencionadas en cocos Gram positivos. Otra particularidad de la etiología de las IH es que pueden estar causadas por gérmenes oportunistas, es decir de baja virulencia que normalmente no causan infección en individuos inmunocompetentes o en la comunidad. El caso más notorio es el de Acinetobacter spp., un bacilo Gram negativo con muy pocos atributos de virulencia conocidos pero que puede ser resistente frente a todos los antibióticos activos contra gérmenes Gram negativos. De esta manera, un agente que suele ser inofensivo fuera del hospital, puede causar la muerte en pacientes hospitalizados. La especie más frecuente es A.baumanii, y es agente de infecciones respiratorias en pacientes ventilados, infecciones urinarias en pacientes con sonda vesical, infecciones de piel y heridas. Un capítulo aparte merecen los virus, importantes agentes de IH cuya importancia se suele sub-valorar debido a las dificultades diagnósticas. Al observar la lista de agentes virales que pueden estar involucrados y sus reservorios y vías de transmisión (en general reservorios humanos y transmisión aérea), se comprende que estas infecciones son frecuentes. Frente a la dificultad terapéutica de las infecciones virales, se puede en cambio reducir estas infecciones con profilaxis adecuada; respecto a este punto, en los últimos años se insiste con la vacunación frente a Influenza virus en el personal de salud para evitar el contagio a los pacientes. CONTROL Y PREVENCIÓN DE LAS IH El control de las infecciones es una disciplina formal en EEUU desde 1950 y surgió principalmente en respuesta a epidemias graves de infección estafilocóccica nosocomial. Dio lugar a la Epidemiología Hospitalaria, como programa de monitoreo de rendimiento: originalmente se entendía esta disciplina como la aplicación de métodos epidemiológicos a las IH; actualmente se ha ampliado a otras áreas de la salud. El objetivo primario es prevenir la adquisición de IH y reducirlas. También le compete a los programas de control las infecciones transmitidas a los trabajadores de la salud. El control de las IH comienza por el buen funcionamiento de un Comité de infecciones y la aplicación de un programa adecuado a las características del centro. El control de infecciones involucra a todos los trabajadores del centro de salud. Un programa exitoso refleja un hospital bien dirigido. Específicamente debe ser capaz de iniciar cualquier acción necesaria para reducir el riesgo de IH. Estas medidas incluyen desde la decisión de realizar tomas para estudio microbiológicos o retirar de sus lugares de trabajo al personal portador de enfermedades infecto-contagiosas TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 251 hasta cerrar salas para detener una epidemia. Además debe tomar parte en decisiones tales como restricción de horarios de visitas en respuesta a brotes de enfermedades altamente contagiosas, actividades de construcción en el hospital, planificación de sistemas de información, relación con los medios de prensa, etc. JCAHO (Joint Commission on Accreditation of Health Care Organization) recomienda que las autoridades del programa de control de infecciones sean establecidas claramente por estatuto. Es preferible que el programa sea dirigido por un trabajador de la salud con entrenamiento específico en control de infecciones y epidemiología hospitalaria. La mayor eficiencia se obtiene cuando se organiza un comité representado por un amplio espectro de departamentos del hospital. • • • • • • • • • • • El Comité siempre debe contar con los siguientes integrantes: Un representante administrativo. Un representante de cada servicio principal del hospital. Laboratorio de Microbiología. Departamento de enfermería. Ingeniería. Proveeduría. Servicios ambientales. Farmacia. Servicio de salud de los empleados. Departamento de nutrición. Otros de acuerdo a la situación local. Funciones del programa de epidemiología hospitalaria 1. VIGILANCIA: Determinar tasas endémicas para detectar epidemias. Vigilancia basada en datos de laboratorio. Como ya se ha dicho, aunque la vigilancia se lleve a cabo según los estándares más estrictos, no siempre es posible traducir sus resultados en actividades efectivas de control; se mostró que las neumonías eran las IH con consecuencias más graves para los pacientes, pero estas infecciones son las menos pasibles de vigilancia intensiva y medidas de control. Así mismo, los pacientes de mayor riesgo generalmente presentan patologías de base que limitan las posibilidades de medidas agresivas de control. 2. INVESTIGACIÓN DE EPIDEMIAS: Requiere aplicar definiciones significativas de las infecciones, identificarlas y cuantificarlas, y clasificarlas en forma apropiada en base a los factores de riesgo. Requiere asimismo que los agentes etiológicos en causa sean caracterizados al nivel más específico posible (idealmente el genómico) para poder determinar si se trata de una única clona responsable o más de una. 3. EDUCACIÓN: Siendo uno de los pilares más efectivos, es uno de los aspectos en los que más se fracasa. Es importante Instruir sobre: áreas de control, lavado de manos, esterilización y desinfección, enfermedades transmisibles. 4. SALUD DE LOS EMPLEADOS: Profilaxis post-exposición. Vacunación anti-Hepatitis B e Influenza virus. 5. REVISIÓN DEL USO DE ATB: Monitorizar el uso de antibióticos y los perfiles de susceptibilidad y correlacionarlos con los agentes utilizados. 6. DESARROLLO DE DISPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS DE CONTROL 7. EVALUACIÓN DE CALIDAD DE LOS PROCEDIMIENTOS DE CONTROL 252 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 8. EVALUACIÓN DE NUEVOS PRODUCTOS A SER INTRODUCIDOS EN EL CENTRO: Se debe ser escéptico a la hora de evaluar nuevos dispositivos médicos costosos que a veces son promovidos agresivamente con el fin de controlar las infecciones. Históricamente, la mayoría de estos productos han aumentado los gastos del hospital rindiendo poco beneficio a la reducción de las IH. Las medidas preventivas consisten en actuar a nivel de la fuente, el reservorio, la transmisión y el huésped susceptible. Es sin lugar a dudas a nivel de la transmisión donde se actúa con mayor efectividad. A este respecto, volvemos a insistir sobre la importancia del lavado de manos como una medida primordial. Otra medida para prevenir la transmisión son los sistemas de aislamiento: Las antiguas recomendaciones del Centres for Diseases Control and Prevention (CDC) establecían dos estrategias generales: 1. Aislamiento por categorías: basado en los modos de transmisión: a) Estricto, para enfermedades diseminadas tanto por contacto como por pequeñas gotitas respiratorias (ej.: viruela). b) De contacto. c) Respiratorio. d) Para tuberculosis. e) Precauciones entéricas. f) De drenajes. g) Precauciones para sangre y fluidos: considerado en las precauciones universales. 2. Aislamiento específico: basado en el modo de transmisión conocido o sospechado de enfermedades específicas lo que permite tomar medidas de aislamiento concretas para cada enfermedad. Asilamiento de sustancias corporales (ASC): es un sistema alternativo que busca superar algunos inconvenientes de los sistemas previos. Se basa principalmente en el uso de guantes por parte del personal que tiene contacto con sustancias potencialmente contaminadas y con membranas mucosas o piel no intacta de los pacientes. El lavado de manos continúa recomendándose luego de quitarse los guantes. Agrega precauciones sobre el uso de batas si es probable el ensuciamiento de la ropa y de antiparras si es posible que se salpique la cara. Ventajas: • Los guantes proveen una barrera, que además brinda un margen de seguridad cuando se comete la negligencia de omitir el lavado de manos. • Sustituye la mayoría de los sistemas tradicionales que básicamente consisten en medidas de barrera (excluye los patógenos de transmisión aérea). • Es más fácil monitorizar el cumplimiento del uso de guantes que el del lavado de manos. • Si se aplica correctamente, incorpora la mayoría de las medidas previstas en las precauciones universales. Desventajas: • Los guantes pueden dar un falso sentido de seguridad y resultar en menor lavado de manos. • Omisión del cambio de guantes entre pacientes que puede resultar más grave que el no lavado de manos cuando no se usan guantes, ya que algunos patógenos sobreviven más tiempo en estos que en la piel. Precauciones universales: Son obligatorias según OSHA (Ocuppational Safety and Health Administration): Fueron originalmente diseñadas para aplicar las antiguas recomendaciones de CDC sobre precauciones para sangre y fluidos, pero estas recomendaciones se han ampliado para incluir la piel y superficies mucosas intactas así como muchos otros fluidos además de la sangre: pleural, pericárdico, LCR, y cualquier otro fluido visiblemente contaminado con sangre. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 253 Actualmente el CDC recomienda precauciones estándar y tres categorías de precauciones de transmisión para ciertos patógenos de importancia epidemiológica. 1. Precauciones estándar: se aplica a todos los pacientes y es la estrategia primaria para un control exitoso de la IH. Sintetiza las consideraciones de las precauciones universales y el ASC. Se aplican a la sangre, todos los fluidos corporales, secreciones y excreciones, piel no intacta y membranas mucosas con independencia de los resultados de pruebas de laboratorio, disminuyendo por tanto el riesgo de infecciones de fuentes tanto conocidas como no conocidas. 2. Precauciones para la transmisión por vía aérea: usado para agentes que son fácilmente dispersables y transmisibles por pequeñas gotitas respiratorias (≤5µm de diámetro). Ej.: tuberculosis, varicela, sarampión. 3. Precauciones para la transmisión por grandes partículas: estas son transportadas generalmente por cortas distancias. Ej.: H.influenzae, N.meningitidis, C.diphtheriae, B.pertussis, Y.pestis, M.pneumoniae, S.pyogenes, Adenovirus, Influenzavirus, Parvovirus B19, rubéola. 4. Precauciones de contacto: para reducir el riesgo de contacto directo o a través de fomites. Ej.: bacterias con múltiple resistencia, algunos patógenos entéricos (C.difficile, ECEH, rotavirus, HAV, Shigella), patógenos virales en niños (VRS, parainfluenza, enterovirus, etc.), agentes de conjuntivitis viral, fiebres hemorrágicas, patógenos de la piel altamente contagiosos. PAPEL DE LA MICROBIOLOGÍA EN LA VIGILANCIA Y EL CONTROL Una relación formal y fluida entre el comité de infecciones y el laboratorio de microbiología es esencial ya que los datos microbiológicos constituyen el eje central de muchas actividades de vigilancia y control. La vigilancia basada en el laboratorio permite controlar la diseminación de microorganismos nosocomiales en el momento más temprano posible, dado que permite confirmar las infecciones clínicamente sospechadas y brinda datos sobre las características del patógeno, en especial, su sensibilidad antibiótica. El laboratorio debe desarrollar políticas y procedimientos de acuerdo a necesidades específicas de este comité. Por ej.: debe realizar reportes inmediatos de aislamientos de interés para el programa de control de infecciones, como bacterias responsables de brotes epidémicos o con resistencia inusual a antibióticos; establecer métodos de screening para determinadas infecciones en caso de sospecha dentro del hospital; en caso de epidemias, realizar sistemas de tipificación que no son de uso rutinario; guardar cepas de interés epidemiológicos (SAMR, enterococos resistentes a vancomicina) en caso de que se necesite su caracterización más sofisticada más adelante. El director del laboratorio debe asegurarse de contar con suficientes recursos técnicos y humanos en caso de que un problema infeccioso no esperado supere la capacidad del laboratorio. La resistencia a los antibióticos que se usan empíricamente es uno de los problemas más graves de las IH, por eso muchos laboratorios utilizan métodos especiales en caso de emergencia de estas cepas para poder detectarlas con prontitud. Ante la eventualidad de una brote, el microbiólogo del hospital debe ser capaz de sugerir métodos para identificar cepas con patrones de resistencia o requerimientos metabólicos específicos. AVANCES EN TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS ÚTILES DESDE EL PUNTO DE VISTA EPIDEMIOLÓGICO • Introducción de técnicas rápidas y sensibles de diagnóstico viral, ya que antes esto se basaba en datos clínicos. 254 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA • Nuevas técnicas de biología molecular que sustituyen o complementan las tradicionales (antibiograma, biotipificación, fagotipificación) como por ej. PFGE, RAPD, ribotipificación. Bibliografía 1. Centres for Diseases Control. Natural nosocomial infection study report. Annual Summary 1979. Atlanta, 1982. 2. 3. Dubay E, Grubb R. Infecciones hospitalarias, prevención y control. Panamericana, Buenos Aires, 1974. Finegold SM, Ellen Y, Baron D. Hospital Epidemiology in Diagnostic Microbiology. Bailey and Scott eds. Chicago University; 1986: 41-50. 4. Malagón G, Hernández L. Infecciones hospitalarias. 1ª ed. Editorial Médica Panamericana; Bogotá, 1995. 5. Laennette BH, Ballows A, Hauler WY. Manual of Clinical Microbiology. 5º ed. American Society for Microbiology; 1991. 6. Lossa GR, Valzacchi R. Estimación del costo de las infecciones hospitalarias. Bol. OPS; 1986:(101)134139. 7. Nacional Nosocomial Infections Surveillance System (NNIS). Nosocomial Infection rates for interhospital comparison, limitation and possible solutions. Infect.Control Hosp. Epidemiol; 1991, (12):609-612. 8. Prevention and Control of Nosocomial Infections. 2º ed. Wnzel RP eds. William & Wilkins; 1993. 9. Reunión Latinoamericana sobre Programas de Control de Infecciones Hospitalarias, recomendaciones. Caracas, 1986. Actual. Infect.; 1987(3):23-31. 10. World Health Organization. Protocol for an Internacional Survey of the Prevalence of Nosocomial Infection 1981. Geneva, 1981. 11. Weinstein RA. Nosocomial Infection Update. Emerging Infectious Diseases. 1998;4(3): 416-420. 12. Infectious Diseases. 3º ed. Gorbach SL, Bartlett JG, Blacklow NR. Lippincot Williams & Wilkins, Philadelphia, 2004. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA SECCIÓN 255 III Etiopatogenia microbiológica 16. Género Staphylococcus 17. Género Streptococcus y Enterococcus 18. Principales grupos de bacilos y cocos gramnegativos exigentes 19. Principales grupos de bacilos y cocos gramnegativos no exigentes 20. Principales grupos de bacilos grampositivos aerobios 21. Bacterias anaerobias 22. Mycobacterias 23. Chlamydia, Rickettsia y Mycoplasma 24. Leptospira 25. Virus respiratorios 26. Retrovirus y VIH 27. Virus de las hepatitis 28. Enterovirus 29. Agentes virales de gastroenteritis 30. Herpesvirus 31. Agentes de infecciones emergentes. Hantavirus, dengue, BSE >> 256 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 257 Página 257 16 Género Staphylococcus V. Seija Reseña histórica Los cocos se asociaron por primera vez a enfermedades humanas cuando fueron observados en materiales purulentos provenientes de abscesos humanos. En 1880 el cirujano escocés Sir Alexander Ogston demostró que cocos agrupados en forma de racimo eran la causa de ciertos abscesos piógenos en humanos. Louis Pasteur arribó a una conclusión similar al mismo tiempo, pero en París. En el año 1882, Ogston llamo a estos cocos “Staphylococcus”, derivando el nombre de los términos griegos staphile (racimo de uvas) y kokkus (frutilla). Morfológicamente, Ogston propuso este término de manera de poder diferenciarlos de los estreptococos, formadores de cadenas. Ogston demostró que la inyección a ratones de pus conteniendo estos cocos producía los mismos síntomas observados en el humano. También observó que si calentaba el pus y lo trataba con fenol, la enfermedad se prevenía. Introducción Staphylococcus aureus se destaca como un importante patógeno humano, produce infecciones tanto en la comunidad como a nivel hospitalario. En la comunidad, las infecciones por S. aureus son a menudo agudas, piogénicas y superficiales, aunque también puede producir, con menor frecuencia, infecciones profundas como osteomielitis, neumonía y endocarditis aguda. A nivel nosocomial S. aureus es un importante agente de infecciones de herida quirúrgica, de prótesis y otras. También S. aureus es causa de una serie de infecciones producidas por toxinas como el síndrome del shock tóxico, la intoxicación alimentaria y el síndrome de piel escaldada. Staphylococcus epidermidis es integrante de la flora normal de piel pero produce infecciones crecientes de piel y anexos, colonizando cuerpos extraños y también es causa de infecciones profundas en huéspedes inmunocomprometidos. Staphylococcus saprophyticus es causa de infección urinaria baja en la mujer joven. Taxonomía Los miembros del género Staphylococcus y Micrococcus son catalasa positivos y hasta hace poco formaban parte de la familia Micrococacceae junto a los géneros Planococcus y Stomacoccus. Estudios genéticos han demostrado que Staphylococcus y Micrococcus no están relacionados. 258 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Tentativamente el género Staphylococcus se colocó dentro de la familia Bacillaceae junto a otros géneros, Bacillus, Gamella, Listeria, Planococcus, etc. Los estafilococos son cocos Gram positivos, catalasa positivos y el diamino ácido en el peptidoglicano es la L-lisina. El género Staphylococcus posee alrededor de 30 especies, de las cuales destacaremos S. aureus, S. saprophyticus y S. epidermidis. Hábitat Staphylococcus epidermidis es integrante de la flora normal de la superficie corporal donde sobrevive gracias a sus lipasas, mientras S .aureus se encuentra habitualmente a nivel de la nasofaringe y de zonas húmedas como pliegues inguinales y axilas. A nivel del vestíbulo nasal anterior la adherencia parece estar mediada por el contenido en ácidos teicoicos. Se estima que el índice de portación nasal en los adultos es de alrededor del 20-30%. Expresado longitudinalmente, cerca del 30% de la población puede ser portador permanente, el 50% portador intermitente y el 20% no es colonizado. Algunas poblaciones pueden tener una tasa de colonización mayor como el personal de salud, los pacientes en hemodiálisis, diabéticos, adictos a drogas intravenosas, etc. A pesar que S. aureus posee numerosos factores de virulencia, puede convivir con el huésped humano formando parte de su flora normal sin causar ningún daño. Existen ocasiones en que este equilibrio se puede romper. Desde las narinas, los portadores pueden transferir bacterias a diferentes sectores de la piel, aunque habitualmente existe resistencia a la colonización de la piel intacta. Sin embargo, un traumatismo (muchas veces desapercibido) puede dar una puerta de entrada al microorganismo. En caso de infección, por tanto, S. aureus puede ser muchas veces de origen endógeno. Morfología microscópica Como ya hemos dicho se trata de cocos Gram positivos que poseen tendencia a agruparse en racimos. Tienen una forma esférica y un diámetro de alrededor de una micra. Morfología macroscópica Para apreciarla debemos contar con un aislamiento de la cepa a estudiar en una placa de Petri. El aislamiento nos permitirá observar las características de las colonias. En medios no selectivos, S. aureus presenta colonias de 1 a 3 mm de diámetro, lisas, levemente elevadas, de bordes enteros, levemente convexas y generalmente pigmentadas con un color que puede ir desde el crema al amarillo. La producción de pigmento se ve favorecida si se incuban los cultivos por 24 a 48 horas adicionales a temperatura ambiente. Cuando crecen en agar sangre ovina se puede observar una zona de β-hemólisis alrededor de las colonias. S. epidermidis presenta colonias generalmente de menor tamaño y estas no presentan pigmentación. Metabolismo En cuanto a su forma de obtener energía es tanto a través de la fermentación como de la respiración. En cuanto a los requerimientos de cultivo, son no exigentes desde el punto de vista nutricional, creciendo en medios pobres y simples. En su relación con el oxigeno son aerobios-anaerobios facultativos. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 259 Resistencia a agentes físicos y químicos Es muy resistente a las condiciones ambientales normales. Es capaz de sobrevivir hasta tres meses en un cultivo a temperatura ambiente. Muere expuesto a temperaturas mayores de 60 °C por una hora. En cuanto a los agentes químicos, es sensible a la mayoría de los desinfectantes y antisépticos, que lo matan en pocos minutos. Staphylococcus aureus Ya hemos comentado las características comunes del género Staphylococcus y ahora analizaremos las que distinguen al patógeno más importante dentro de este género. Desde el punto de vista estructural S. aureus comparte las características de los gérmenes Gram positivos y agrega algunas características distintivas. La pared celular esta compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano. Se trata de un polímero polisacárido compuesto por cadenas con uniones de tipo β (1-4) no ramificadas, que contienen subunidades alternantes de ácido N-acetil murámico y N-acetil glucosamina. Las cadenas laterales de pentapéptidos se hallan conectadas al residuo de ácido murámico y tienen unión cruzada por un puente pentaglicina fijado a la L-lisina de una cadena y la Dalanina de la otra cadena. El polímero polisacárido básico se halla también en muchos otros microorganismos, mientras la cadena de unión cruzada de pentaglicina parece ser específica de S. aureus. Tiene como función mantener la rigidez de la pared bacteriana y su resistencia osmótica. En la patogenia coadyuvaría al desencadenamiento de la inflamación por activación del complemento, es capaz de atraer leucocitos polimorfonucleares (PMN), estimula la producción de anticuerpos opsonizantes y tiene actividad similar a las endotoxinas de Gram negativos. El otro componente mayor de la pared son los ácidos teicoicos, que constituyen alrededor del 40% del peso de la pared. Estos ácidos son polímeros de glicerol o ribitol fosfato, azúcares y algunas veces, D-alanina. Están unidos en forma covalente al peptidoglicano. Cuando están unidos a la membrana citoplasmática se les llama ácidos lipoteicoicos. S. aureus posee predominantemente ácidos de ribitol fosfato, mientras que en los estafilococos coagulasa negativos estos son de glicerol fosfato. La presencia de cápsula es variable pero es importante a nivel patogénico, ya que tiene propiedades antifagocíticas. Las cepas de S. aureus que poseen cápsula son más virulentas en modelos animales. No es claro que la cápsula de S. aureus juegue un papel importante en la adherencia. Lo que si se conoce es que la adherencia de este germen a la válvulas cardíacas y cuerpos extraños esta mediada, en parte, por receptores de fibronectina en su superficie. La fibronectina es una glicoproteína importante en varias funciones de adherencia. Las cepas de S. aureus, que muestran grandes cantidades de receptores para la fibronectina, parecen ser más invasivas y más hábiles para adherirse. Además S. aureus puede presentar en su superficie receptores para el colágeno. La pared celular de S. aureus posee una proteína característica llamada proteína A. Esta tiene la habilidad de unirse a la porción Fc de las moléculas de inmunoglobulina G (IgG), y por tanto funciona como factor de virulencia, ya que interfiere con la opsonización y la ingestión de los microorganismos por los PMN, activando el complemento y dando lugar a reacciones de hipersensibilidad inmediata y tardía. Esta proteína es inmunogénica y se hallan anticuerpos contra ella en sujetos con infecciones graves por S. aureus. 260 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA DETERMINANTES DE PATOGENICIDAD Cualquier enfermedad infecciosa es el resultado de la interacción entre el microorganismo causal y el huésped. Primero analizaremos los factores de patogenicidad con que cuenta S. aureus. Estos pueden ser divididos en tres grupos (tabla 1): a) Componentes de la pared celular: ya fueron discutidos en la sección anterior. b) Enzimas: – Catalasa: podría funcionar inactivando algunos sistemas de ingestión de los PMN. – Coagulasas: tanto la coagulasa libre como el llamado “clumping factor” actúan cubriendo a la célula de fibrina y por tanto haciéndola más resistente a la opsonización y fagocitosis. – Estafiloquinasas: degradan la fibrina y contribuyen a la invasión de tejidos vecinos. – Hialuronidasa: hidroliza la matriz intracelular de mucopolisacáridos de los tejidos y por tanto contribuye a la diseminación a tejidos adyacentes. – Lipasas: las cepas de S. aureus productoras de forunculosis crónica son potentes productoras de lipasas que ayudan al microorganismo a diseminarse por los tejidos cutáneo y subcutáneo. – Fosfolipasa C: esta enzima esta asociada con cepas recuperadas de pacientes con distrés respiratorio del adulto y coagulación intravascular diseminada (eventos que ocurren durante la sepsis). Aparentemente los tejidos afectados por esta enzima se vuelven más susceptibles al daño y destrucción por componentes bioactivos del complemento y sus productos durante su activación. – S. aureus produce además, toda una serie de enzimas como las DNAsas, proteasas y fosfatasas que colaboran en el proceso infeccioso y en la producción de lesiones. c) Toxinas: S. aureus puede producir toxinas de acción general como las hemolíticas (α, β, γ y δ) y la leucocidina, y también toxinas especializadas como las exfoliatinas, toxina del shock tóxico y enterotoxinas. Las hemolisinas son importantes toxinas citolíticas sobre una variedad de células. – α hemolisina o α toxina: tiene efecto letal sobre una variedad de membranas celulares eucariotas, incluyendo la de PMN humanos, así como también la de eritrocitos de diferentes especies animales. Es dermonecrótica si se inyecta en forma subcutánea y es letal para animales si se administra en forma intravenosa. Es responsable de la zona de hemólisis observada alrededor de las colonias de S. aureus. – β hemolisina: es una esfingomielinasa activa sobre diferentes células: leucocitos, eritrocitos, fibroblastos. – γ y δ hemolisinas: se encuentran en algunas cepas de S. aureus y lisan una variedad de células diferentes. – Leucocidina: es una exotoxina con efecto tóxico directo sobre las membranas de los PMN humanos, causando degranulación del citoplasma, hinchamiento celular y lisis. El modo de acción de esta toxina comprende la formación de poros que alteran la permeabilidad celular para el potasio y otros cationes. Una inyección de esta toxina en modelos animales produce una disminución severa del número de leucocitos. – Exfoliatinas o toxinas epidermolíticas: son producidas por algunas cepas de S. aureus y consisten en dos proteínas, bioquímica e inmunológicamente diferentes, pero con funciones biológicas similares. La exfoliatina A es un producto de genes cromosómicos, termoestable y es inactivada por el EDTA, mientras la exfoliatina B es de origen plasmídico, es inactivada por el calor y estable frente al EDTA. Ambas tienen actividad proteolítica, actúan como superantígenos y disuelven la matriz mucopolisacárida de TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 261 Tabla 1. Determinantes de patogenicidad de S. aureus Determinante de patogenicidad Componentes de la pared celular Propiedades Peptidoglicano Ácidos teicoicos Proteína A Cápsula mucoide Activación del complemento Antifagocítica Antifagocítica Adherencia Toxinas Coagulasa Estafiloquinasas Hialuronidasa Lipasas Formación de absceso Destrucción del coagulo Invasión hística Colonización Hemolisinas Leucocidina Toxina exfoliatina Toxina del shock tóxico Enterotoxinas Rotura de la membrana celular Alteración de la permeabilidad celular de fagocitos Epidermólisis Shock Intoxicación alimentaria Enzimas la epidermis, resultando en la separación intraepitelial de las uniones en el estrato granuloso. Las cepas productoras de una o ambas proteínas son responsables del síndrome de piel escaldada (ver más adelante). – Enterotoxinas: se trata de moléculas termoestables responsables de la intoxicación alimentaria producida por algunas cepas S. aureus. El modo de acción de estas toxinas no es aún conocido pero se sabe que aumentan el peristaltismo (ver más adelante). – Toxina del shock tóxico (TSST-1): Es también denominada como enterotoxina F. Esta implicada en la patogenia del síndrome del shock tóxico. Aunque su rol es poco claro tiene una gran cantidad de actividades biológicas. En modelos animales potencia la actividad letal de pequeñas cantidades de endotoxina. Estos tres tipos de toxinas antes mencionadas (enterotoxinas, exfoliatinas y TSST-1) actúan como superantígeno, lo que significa que pueden activar linfocitos T directamente (alta afinidad por el complejo de histocompatibilidad tipo II), sin la mediación de células presentadoras de antígeno, resultando en la liberación de citoquinas. Esto puede determinar importantes efectos sistémicos como fiebre, hipotensión, lesiones en piel, shock, fallo multiorgánico y muerte. FACTORES PREDISPONENTES DEL HUESPED Las infecciones causadas por S. aureus, no solo dependen de los factores de agresión que este microorganismo posee, sino también de alteraciones en los mecanismos de defensa del huésped. Dentro de los factores predisponentes del huésped tenemos: • Defectos de quimiotaxis leucocitaria congénitos o adquiridos (diabetes mellitus, artritis reumatoidea). • Defectos de opsonización por anticuerpos (hipogamaglobulinemia). • Defectos en la muerte intracelular luego de la fagocitosis (enfermedad granulomatosa crónica). 262 • • • • TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Heridas de piel (quemaduras, incisiones quirúrgicas, eczema). Presencia de cuerpos extraños (suturas, vías venosas, prótesis). Infecciones por otros agentes, particularmente virus (influenza). Enfermedades crónicas como alcoholismo, falla renal crónica, enfermedades malignas, etc. PATOGENIA S. aureus produce infecciones de dos maneras: 1. En forma directa, por invasión y posterior destrucción tisular local (proceso supurado), o luego de haberse diseminado por vía sanguínea. 2. A través de efectos de toxinas. La tabla 2 muestra los tipos de infección que produce S. aureus y la tabla 3 muestra la secuencia de eventos asociados a infecciones serias causadas por S. aureus. INFECCIONES POR INVASIÓN Este tipo de infecciones puede estar producido tanto por cepas de S. aureus residentes como no residentes. El primer paso de la infección es la adherencia y colonización de las células del huésped. Se describen tres tipos de adherencia. Por un lado, la adherencia a las células de la mucosa nasal mediada por los ácidos teicoicos y también es importante la adherencia a la mucina de la mucosa nasofaríngea. Por otro, la adherencia a piel traumatizada o pequeñas disrupciones de piel, así como también a objetos extraños y estructuras subendoteliales. Esta adherencia envuelve muchas proteínas de la matriz extracelular como fibronectina, fibrinógeno, elastina, colágeno y otras. Estas proteínas interaccionan con diferentes receptores de S. aureus, antes mencionados. Por último, la adherencia de S. aureus a las células endoteliales durante los eventos de sepsis es un proceso complejo donde están involucradas la fibronectina, el fibrinógeno y la laminina. Una vez los microorganismos atravesaron la barrera cutaneomucosa, llegan al tejido subcutáneo o submucoso y se diseminan rápidamente, formando abscesos. Esta es la lesión típica producida por este microorganismo. Los mecanismos de la invasión son poco conocidos pero a este nivel se desencadena la respuesta inflamatoria del huésped que contribuye a la formación de los abscesos. La respuesta defensiva más importante por parte del huésped son los PMN. Algunas veces el germen puede seguir invadiendo, buscando áreas más profundas y avasculares. Una vez se encuentran alrededor o dentro de los huesos, o protegidos dentro de coágulos, los microorganismos se hacen bastante resistentes al ataque y erradicación por los mecanismos defensivos del huésped. Sólo la mayor intensidad de los factores bacterianos junto al fracaso de los mecanismos defensivos del huésped puede llevar a que las bacterias puedan llegar a la corriente sanguínea, diseminarse y producir focos de infección a distancia llamados abscesos metastásicos. Los eventos que llevan a la sepsis y muerte aún no son del todo conocidos. Aparentemente los ácidos teicoicos y el peptidoglicano podrían actuar como la endotoxina de los bacilos Gram negativos. Además de infecciones de piel y partes blandas, S. aureus puede producir infecciones invasivas como neumonía, osteomielitis, bursitis, artritis y otras. INFECCIONES POR ACCIÓN DE TOXINAS Estas infecciones están causadas por la liberación al medio de sustancias tóxicas, que pueden ejercer su acción a cierta distancia del foco infeccioso. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 263 Tabla 2. Infecciones producidas por S. aureus. Invasión directa Superficial • Piodermas, incluyendo impétigo y paroniquia • Infecciones de piel y tejidos blandos, forúnculos, celulitis, linfangitis, linfadenitis, etc. Profunda • Artritis séptica • Osteomielitis • Piomiositis Diseminación por vía sanguínea • Bacteriemia con o sin shock o falla multiorgánica • Formación de abscesos metastásicos (cerebro, pulmón, hígado, bazo, retroperitoneo, riñón, tracto genital, etc.) Enfermedades mediadas por toxinas • Síndrome de piel escaldada • Intoxicación alimentaria • Síndrome del shock tóxico Tabla 3. Secuencia de eventos patogénicos en infecciones serias causadas por S. aureus Colonización, portador, producción de toxina Rotura de barrera cutaneomucosa Invasión • Celulitis, linfangitis • Formación de absceso • Eventual invasión de la sangre Bacteriemia Síndrome de sepsis • Componentes de la pared • Toxina del shock tóxico • Rol de los mediadores disparados Complicaciones • • Muerte Abscesos supurados metastásicos, endocarditis, etc. Shock séptico o falla multiorgánica 1. Síndrome de piel escaldada: se debe a la producción de la toxina exfoliativa en un foco, que luego pasa al torrente sanguíneo, pudiendo diseminarse hasta regiones alejadas del foco donde no es posible aislar ningún germen. Esta toxina produce la formación de ampollas y la subsiguiente descamación de láminas epidérmicas, que puede estar localizada en una región o estar diseminada por todo el cuerpo. Se presenta con mayor frecuencia en recién nacidos y niños pequeños. 2. Síndrome del shock tóxico: es un cuadro grave que en el pasado se ha observado asociado a la utilización de tampones vaginales por parte de mujeres jóvenes. El microorganismo prolifera en el tampón contaminado y produce la toxina del shock tóxico. El cuadro clínico esta caracterizado por fiebre, hipotensión, exantema cutáneo en manos y pies, 264 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA grados variables de vómitos, diarrea, falla renal, cefalea y conjuntivitis. Evoluciona al shock grave en 48 horas. También se asocia a heridas traumáticas o quirúrgicas. 3. Intoxicaciones alimentarias: se producen por la contaminación de alimentos, que suelen ser de elevado contenido en proteínas e hidratos de carbono como pasteles, helados y salsas, y con pH superior a 5, que permitirán un rápido crecimiento bacteriano. La mala refrigeración y conservación hacen que el microorganismo prolifere, y si es una cepa productora de enterotoxina termoestable, la libera en cantidad suficiente como para producir intoxicación. El tiempo de incubación es corto (1 a 6 horas) y los síntomas son vómitos y diarrea de hasta 2 días de duración, en general sin fiebre, siendo normalmente de rápida recuperación. Este proceso sólo requiere hidratación y no necesita de tratamiento antibiótico. RESPUESTA DEL HUÉSPED La integridad de la barrera cutánea y un sistema fagocítico intacto son los principales mecanismos de defensa contra las infecciones estafilocócicas. La primera línea de defensa luego de atravesar las barrera cutánea son los PMN y el sistema monocito-macrófago. La movilización de las células fagocíticas hacia el sitio de crecimiento bacteriano requiere la elaboración de señales microbianas y específicas del huésped. El reconocimiento de S. aureus por los fagocitos está mediado por sus receptores para el fragmento Fc de la IgG, por sus receptores para la subunidad C3b del complemento, y posiblemente por otros receptores del complemento. Para ser fagocitado, por tanto, S. aureus debe estar recubierto por C3b o IgG, proceso que se llama opsonización. En cepas con cápsula se necesitan anticuerpos anticápsula para la opsonización. La proteína A tiene, como ya vimos, una importante función antifagocítica. Luego de ser fagocitados, la mayoría de los estafilococos intracelulares son destruidos rápidamente y degradados dentro de la vacuola fagocítica, pero puede demostrarse la sobrevida de una minoría, lo que podría explicar el índice de recurrencia de algunas infecciones por S. aureus. Durante la infección estafilocócica se producen algunos anticuerpos contra distintos antígenos de la pared celular, así como contra varias toxinas. En la actualidad ninguno ha logrado inducir una protección completa contra la infección por S. aureus. CUADROS CLÍNICOS La lesión característica producida por S. aureus es el absceso, este se puede presentar a nivel de la piel como forúnculo. Esta lesión es blanda, eritematosa y caliente. A las 24-48 horas desarrolla una pústula central blanca. Dentro, el material purulento es cremoso, amarillento, y frecuentemente tiene un centro constituido generalmente por un folículo piloso que es el sitio donde la infección se inició. Este tipo de infección también puede aparecer alrededor de cuerpos extraños y entonces el inóculo necesario para producir infección es más bajo y la llegada de antibióticos es menor. RESISTENCIA ANTIBIÓTICA S. aureus puede poseer resistencia para diferentes antimicrobianos. En general los estafilococos aislados de infecciones comunitarias, hasta hace poco tiempo, no poseían muchos genes de resistencia salvo por la producción de penicilinasa. Sin embargo, actualmente asistimos a la emergencia de cepas comunitarias resistentes a meticilina u oxacilina (ver más adelante). En cuanto a los aislamientos de origen nosocomial, un elevado porcentaje de los mismos tienen varios determinantes de resistencia y fundamentalmente resistencia a meticilina, asociada a resistencia a aminoglucósidos, macrólidos y quinolonas. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 265 Resistencia a β-lactámicos Existen variados mecanismos que median resistencia a β-lactámicos. La producción de βlactamasa inactiva ciertos β-lactámicos por medio de la hidrólisis del anillo β-lactámico. Estas enzimas atacan a la penicilina G, ampicilinas, carboxipenicilinas y ureidopenicilinas. El producto de hidrólisis carece de actividad antibacteriana. Más del 90% de los aislamientos de S. aureus produce este tipo de enzimas, también llamadas penicilinasas. Parte de la enzima que se produce es excretada al medio externo y parte permanece adherida a la membrana celular. Se han reconocido cuatro variantes de β-lactamasa llamadas A, B, C y D. En la mayoría de los aislamientos esta enzima es codificada por plásmidos, pero también se puede encontrar a nivel cromosómico como parte de un elemento transponible. Por otro lado tenemos la resistencia a meticilina u oxacilina. Ésta consiste en la producción de una nueva proteína fijadora de penicilina (penicillin-binding protein) PBP, llamada PBP2a o PBP2’, no presente en las cepas sensibles. Esta nueva PBP tiene una afinidad disminuida por la mayoría de los β-lactámicos y cefalosporinas. Se trata de una transpeptidasa, la cual se encarga de la síntesis de la pared cuando las otras PBPs están inactivas por estar ligadas al beta lactámico. Esta nueva PBP está codificada por un gen llamado mecA que esta presente en el cromosoma de todas las cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina. Presumiblemente la región mec se origino en estafilococos coagulasa negativos y luego se transfirió a S. aureus. Cuando una cepa es resistente a meticilina significa que la cepa es resistente a todos los antibióticos β-lactámicos (penicilinas, cefalosporinas y carbapenems). Resistencia a glicopéptidos La resistencia a glicopéptidos en estafilococos se ha descrito en aislamientos clínicos de estafilococos coagulasa negativos como S. haemolyticus y en los últimos años se comenzaron a describir aislamientos de S. aureus con sensibilidad disminuida y también resistentes a los glicopéptidos. Se necesitan todavía más estudios para establecer el exacto mecanismo molecular de resistencia a glicopéptidos. No se han aislado cepas con este tipo de resistencia en nuestro país. Resistencia a macrólidos En S. aureus la resistencia a la eritromicina tiene dos fenotipos. El primero es conferido por una modificación del rRNA blanco por enzimas constitutivas o inducibles que metilan un residuo específico en el rRNA. Este evento resulta en una disminución de la unión a la eritromicina, a otros macrólidos y a las lincosaminas. Los genes que codifican esta resistencia se encuentran tanto en plásmidos como en el cromosoma. El segundo fenotipo abarca una resistencia inducible a macrólidos. Se trata de un gen localizado en un plásmido que codifica una bomba de eflujo ATP-dependiente. Resistencia a aminoglucósidos En S. aureus la resistencia a aminoglucósidos puede ser consecuencia de uno de tres posibles eventos. 1. Una mutación cromosómica que codifica una alteración del sitio de acción en el ribosoma. 2. Transporte inefectivo, lo que produce una resistencia de bajo nivel. 3. La producción de enzimas modificadoras, el cual es el mecanismo más comúnmente 266 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA encontrado. Estas se pueden codificar a nivel de transposones localizados en plásmidos o en el cromosoma. Resistencia a quinolonas La resistencia a las quinolonas es debida a una actividad disminuida de la girasa, mediada por mutaciones puntuales localizadas en el gen gyrA cromosómico, el gen estructural de la subunidad A de la DNA girasa. Una mutación puntual en otro gen, el norA lleva a la disminución de la acumulación de la droga dentro de la célula. Además las mutaciones en el gen grlA cromosómico, confieren una resistencia de bajo nivel a las fluoroquinolonas. PERFILES DE RESISTENCIA En nuestro país se pueden describir, en forma esquemática, la circulación de tres perfiles de resistencia. Uno esta constituido por cepas de S. aureus sensibles a meticilina u oxacilina, que en más del 90% de los casos son productoras de penicilinasa y, a veces, pueden tener determinantes de resistencia a macrólidos. El segundo perfil esta constituido por cepas resistentes a meticilina u oxacilina sin resistencia acompañante a otros grupo de antibióticos salvo, a veces, resistencia a macrólidos. Este perfil se le denomina S. aureus meticilino-resistente perfil comunitario (SACOMR), ya que se empezó a detectar principalmente en cepas de origen comunitario aunque actualmente ya se detecta a nivel hospitalario. El tercer perfil esta constituido por cepas multirresistentes que poseen resistencia a meticilina, asociada a resistencia a aminoglucósidos, quinolonas y macrólidos, donde prácticamente la única opción terapéutica es la vancomicina. Este tipo de cepas se aísla mayoritariamente de infecciones de origen nosocomial. Staphylococcus epidermidis El grupo de estafilococos coagulasa negativos está constituido por un gran numero de especies. En la tabla 4 se pueden ver las especies relacionadas con patología humana. S. epidermidis es una de las especies que más frecuentemente se aísla. Comparte las características del género con respecto a la morfología y fisiología. En relación a la estructura, a nivel de la pared celular, a diferencia de S. aureus, los puentes de pentaglicina del peptidoglicano no están presentes y se sustituyen algunas moléculas de glicina por L-serina. Con respecto a la patogenicidad, S. epidermidis es capaz de producir macromoléculas de superficie y extracelulares, que inician y luego aumentan la adhesión bacteriana a la superficie plástica de cuerpos extraños. La adherencia inicial de S. epidermidis parece estar mediada por una adhesina polisacárida llamada PS/A y otras proteínas de superficie. La PS/A se trata de un polímero de galactosa-arabinosa de alto peso molecular. Los anticuerpos dirigidos contra PS/A bloquean la adherencia de S. epidermidis. Luego de la adherencia inicial, hay otra fase llamada de adherencia intracelular que es mediada por un polisacárido llamado PIA y una proteína extracelular. Esto permite la formación de varias capas de células bacterianas adheridas entre si que forman el llamado slime o biofilm. Este slime sirve para proteger a los microorganismos de los agentes antimicrobianos y de las células fagocíticas. En general, es necesaria la remoción del cuerpo extraño para lograr la cura de la infección. El slime parece tener otras actividades biológicas, dentro de las cuales se cuentan la inhibición de la proliferación de linfocitos T y un efecto adverso sobre la opsonización y fagocitosis. Las infecciones causadas por S. epidermidis se relacionan con la colonización de cuerpos extraños, especialmente en el paciente hospitalizado. En el caso de la colonización de catéteres TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 267 Tabla 4. Especies de Staphylococcus coagulasa negativos relacionadas con infecciones humanas S. epidermidis* S. xylosus S. saprophyticus* S. cohnii S. capitis S. simulans S. warneri S. auricularis S. haemolyticus S. lugdunensis S. hominis S. schleiferi S. saccharolyticus S. pasteuri S. caprae *Especies que más frecuentemente se aíslan en infecciones humanas intravenosos, puede aparecer flebitis y fiebre, y eventualmente se produce una bacteriemia y sepsis. La colonización de válvulas cardíacas protésicas puede producir endocarditis precoces y tardías. Estas infecciones conducen, en casos graves, a la retirada de la válvula contaminada. La utilización de otros dispositivos como prótesis osteoarticulares, catéteres peritoneales y derivaciones de líquido cefalorraquídeo, también pueden ser susceptibles a contaminación por S. epidermidis. Ya que la mayoría de estos cuadros se producen dentro del ámbito hospitalario, las cepas de S. epidermidis aisladas frecuentemente son resistentes a meticilina. Estas cepas, además, pueden presentar los mismos genes de resistencia ya comentados para S. aureus. La mayoría de las veces que aislamos S. epidermidis de una muestra clínica en el laboratorio de microbiología, este constituye un contaminante. Esta especie, al ser flora normal de piel, muchas veces contamina las muestras en el momento de la toma, creando dificultades para interpretar los resultados de los cultivos. Es el contaminante más importante en muestras de hemocultivo, líquidos biológicos o exudados de herida, donde su aislamiento debe ser interpretado con precaución, teniendo en cuenta las condiciones de extracción de la muestra y la condición clínica del paciente. Staphylococcus saprophyticus Presenta características similares a S. epidermidis pero es resistente a la novobiocina y la composición de los ácidos teicoicos es de fosfato de ribitol. Se encuentra ampliamente distribuido siendo causante de hasta el 20% de las infecciones urinarias extrahospitalarias en mujeres jóvenes, causan afecciones del tracto urinario bajo sin alteraciones estructurales. No presenta problemas de resistencia antibiótica. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Además de los datos clínicos y epidemiológicos, fundamentales para la orientación diagnóstica, es preciso confirmarlo con el diagnóstico microbiológico. Toma de muestras Se realizará de la forma habitual, en procesos generalizados con posibilidad de bacteriemia se realizarán hemocultivos. En el caso de procesos supurados se realizará la toma de la muestra con aguja y jeringa, siempre que sea posible. Los estafilococos son bastante resistentes a las condiciones ambientales adversas pero de todas maneras es necesario tomar precauciones en el transporte y conservación de la muestra. 268 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Examen directo En el caso de procesos supurados, el examen directo de la muestra con tinción de Gram nos permitirá observar los cocos Gram positivos agrupados en racimos, junto a un gran número de leucocitos polimorfonucleares. Cultivo En cuanto a los requerimientos atmosféricos el género Staphylococcus es aerobio-anaerobio facultativo, por tanto su crecimiento en caldo tioglicolato se hará en toda la extensión del tubo. Desde el punto de vista nutricional es no exigente, por lo tanto crece tanto en medios de cultivo pobres, como el agar simple, como en medios ricos, como el agar sangre ovina. Identificación PRUEBAS BIOQUÍMICAS Las pruebas o ensayos bioquímicos son aquellas reacciones que ponen en evidencia la existencia de una enzima o pasos metabólicos determinados, y que muchas veces nos permiten llegar a la identificación a nivel de especie. Ahora enumeraremos las pruebas bioquímicas necesarias para la identificación de los estafilococos. PRUEBA DE LA CATALASA Objetivo: separar Staphylococcus y Micrococcus (catalasa positivos) de los géneros Streptococcus y Enterococcus (catalasa negativos). Fundamento: la enzima catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno bajo la fórmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un producto final del metabolismo aerobio de los azúcares. Procedimiento: se coloca una gota de H2O2 al 3% sobre un portaobjetos y luego se transfiere una porción de colonia sobre el H2O2 realizándose una emulsión. En lo posible debe tomarse la colonia a partir de un medio sin sangre, ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y pueden falsear los resultados. Esta prueba también puede realizarse a partir de un cultivo en tubo, simplemente colocando unas gotas de H2O2 dentro del mismo. Interpretación de resultados: el desprendimiento de burbujas se considera una prueba positiva. Para diferenciar Staphylococcus de Micrococcus se realizan distintas pruebas bioquímicas que se mencionan en la tabla 5. La lisostafina es una endopeptidasa que cliva los puentes de pentaglicina presentes en la pared de lo estafilococos, por eso el género Staphylococcus es sensible a su acción. Dentro del género Staphylococcus existen tres especies que se consideran de mayor imTabla 5 Caracteres G. Staphylococcus G. Micrococcus Lisostafina S R Sensibilidad a bacitracina R S (disco 0,04 U) Utilización de + glucosa anaerobia +, reacción positiva; -, reacción negativa; S, sensible; R, resistente. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 269 portancia médica: S. aureus, S. saprophyticus y S. epidermidis. Estas se diferencian según las pruebas bioquímicas que se detallan en la tabla 6. Tabla 6. Caracteres S. aureus S. saprophyticus Coagulasa + DNAsa + Nucleasa termoestable + Presencia de proteína A + Susceptibilidad a la novobiocina R R +, reacción positiva; -, reacción negativa; S, sensible; R, resistente. S. epidermidis S PRUEBA DE LA COAGULASA Objetivo: permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que genéricamente se las denomina estafilococos coagulasa negativos (ScoN). Fundamento: S. aureus posee dos tipos de coagulasa: a) Una endocoagulasa o coagulasa ligada o clumping factor, que está unida a la pared celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado (test en lámina). b) Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor sérico (CRF), formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo). Mientras el test en tubo es definitivo, el test en lámina nos sirve como una rápida y económica técnica de tamizaje (screening). Entre un 10 a 15% de las cepas de S. aureus se mostrarán negativas en el test en lámina, por lo cual en esos casos se hace necesario realizar un test en tubo. • Test en lámina Procedimiento: se emulsionan sobre un portaobjetos una o más colonias en una gota de suero fisiológico hasta formar una suspensión lechosa. Luego se agrega, al lado, una gota de plasma citratado de conejo y se mezclan. Interpretación de resultados: debe realizarse dentro de los primeros diez segundos. Un test positivo se evidencia por la formación de grumos. Los test negativos deben ser confirmados por test en tubo. • Test en tubo Procedimiento: se emulsionan varias colonias en un tubo con 0,5 ml de plasma citratado de conejo. Se incuba a 35 ºC y se chequea la formación del coágulo a las 4 horas. Si es negativo se reincuba toda la noche y se procede a su lectura a las 18 horas. La lectura a las 4 horas es fundamental porque en alguna oportunidad puede suceder que las fibrinolisinas de S. aureus lisen el coágulo luego de 18 horas de incubación y de esta manera se produzcan un test falso negativo. Interpretación de resultados: se observa la formación de un coágulo total o parcial si el test es positivo. 270 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA AGLUTINACIÓN CON PARTÍCULAS DE LÁTEX Objetivo: permite separar S. aureus de otras especies de estafilococos. Es un test alternativo para detectar la presencia de la coagulasa y la proteína A. Fundamento: se utilizan partículas de látex cubiertas con plasma. El fibrinógeno se une al látex y detecta el clumping factor. Además, las inmunoglobulinas presentes en las partículas detectan la proteína A, capaz de unirse a la porción Fc de la IgG. Procedimiento: se trata de test comerciales por lo cual cada formulación tiene su procedimiento específico. Generalmente se mezcla el reactivo del test con una porción de la colonia. Interpretación de resultados: la formación de grumos indica un test positivo. PRESENCIA DE DESOXIRRIBONUCLEASA (DNASA) Objetivo: permite diferenciar S. aureus que posee DNAsa de otras especies del género Staphylococcus. Fundamento: se basa en la presencia de la enzima DNAsa que es capaz de clivar los enlaces fosfodiester internos de la molécula de DNA. Se utiliza un medio sólido que contiene verde de metilo, el cual se combina con DNA altamente polimerizado. Cuando la combinación no ocurre, por acción de la enzima DNAsa, se produce una decoloración del medio. Existen otros tipos de medios de cultivo como el que contiene azul de toluidina metacromático en vez de verde de metilo. Procedimiento: se siembra una colonia de estafilococo en forma de moneda en una placa de medio sólido que contiene DNA y verde de metilo. Se incuba 18 horas a 35 ºC. Interpretación de resultados: la formación de un halo transparente alrededor de la siembra indica presencia de DNAsa. PRESENCIA DE NUCLEASA TERMOESTABLE Objetivo: permite diferenciar S. aureus, que posee esta enzima, de otras especies que no. Fundamento: se basa en la presencia de nucleasa termoestable, que es una enzima con propiedades endo y exonucleolíticas y capaz de clivar DNA y RNA. Existen varias formas de investigar la presencia de esta enzima. Se utilizan cualquiera de los medios sólidos mencionados en la prueba anterior pero en estos se realizan hoyos de aproximadamente 3 mm de diámetro. Procedimiento: cada hoyo se llena con un cultivo en caldo de la cepa en estudio, que ha sido previamente llevado a 100 °C por 15 minutos. Se incuba 18 horas a 35-37 ºC. Interpretación de resultados: se interpreta igual que la prueba anterior. SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA Objetivo: separar S. saprophyticus (resistente a la novobiocina) de los demás estafilococos coagulasa negativos. Fundamento: varias especies del género Staphylococcus son resistentes a la novobiocina (disco de 5 µg.) dentro de las cuales se encuentra S. saprophyticus. Procedimiento: se siembra una placa de agar sangre o agar Mueller-Hinton como si se fuera a realizar un antibiograma. Se utiliza un hisopo embebido en una suspensión, con una turbidez equivalente a un Mc Farland 0,5, de la cepa a estudiar. Luego se aplica el disco de novobiocina y se incuba a 35 ºC por 18 horas. Interpretación de resultados: un halo de inhibición de crecimiento menor o igual a 16 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 271 mm corresponde a S. saprophyticus. Un halo de inhibición mayor de 16 mm corresponde a otros estafilococos coagulasa negativos. SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN COMERCIAL Las pruebas anteriormente descritas se utilizan en forma manual pero existen sistemas de identificación comercial para identificar las especies dentro del género Staphylococcus. Los kits comerciales disponibles utilizan, para la identificación, test de fermentación de azúcares modificados, adaptación de test manuales estándar y substratos enzimáticos cromogénicos. Estos sistemas de identificación son adaptados a un formato particular utilizado por el fabricante (por ej.: tira con microcúpulas, tarjetas plásticas, pequeñas bandejas, etc.). Existen también sistemas de identificación a nivel molecular. Para S. aureus existen sondas genéticas para su detección rápida con un 100% de especificidad. 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Microbiología Médica. Garcia-Rodriguez, Picazo. Pag 179-191. 1996. Ed Doyma. 272 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 273 Página 273 17 Géneros Streptococcus y Enterococcus G. Rodríguez Los géneros Streptococcus y Enterococcus están formados por bacterias esféricas u ovoides que crecen en pares o cadenas de longitud variable. La mayoría son anaerobios facultativos, existiendo algunas especies anaerobios obligados. Son Gram positivos, no formadores de esporos, catalasa negativos e inmóviles, y tienen complejos y variables requerimientos nutricionales. La infección estreptocócica es una de las más frecuentes, siendo algunos de los cuadros más importantes relacionados con el género: amigdalitis aguda, otitis media, sinusitis, neumonía, meningitis, infección del tracto urinario, infección abdominal o cutánea, etc. Las infecciones más frecuentemente asociadas con el género Enterococcus son la endocarditis, las infecciones urinarias y la colonización o sobreinfección de enfermos que reciben tratamiento con antimicrobianos, especialmente cefalosporinas. Taxonomía No existe un sistema de clasificación sencillo para diferenciar este heterogéneo grupo de microorganismos y la misma está sometida a revisión constante. Por el contrario, la clasificación depende de una combinación de características, incluyendo: patrón de hemólisis en placas de agar sangre, composición antigénica, características de crecimiento, reacciones bioquímicas y, más recientemente, análisis genético. La tecnología de hibridación del DNA ha revolucionado la taxonomía, poniendo de manifiesto que los enterococos son tan diferentes del resto de los estreptococos, que constituyen un nuevo género, ubicado dentro de la faminilia Enterococcaceae. Cuando los estreptococos son cultivados en agar sangre se puede observar, además de la morfología macroscópica característica de cada cepa, la presencia de un halo transparente alrededor de la colonia donde los glóbulos rojos han sido completamente lisados. Este patrón es designado hemólisis de tipo beta y es de considerable importancia ya que la exhibe Streptococcus pyogenes y muchos otros Streptococcus patógenos humanos. Un segundo grupo de microorganismos, produce hemólisis parcial o hemólisis alfa, observándose como un halo verdoso alrededor de la colonia; perteneciendo a este grupo S. pneumoniae así como otros Streptococcus que habitan el tracto respiratorio superior y gastrointestinal del hombre. Finalmente, el término hemólisis gamma se utiliza para designar aquellas especies que no producen hemólisis, aunque el término estreptococo no hemolítico es preferible. Una identificación más precisa de los estreptococos betahemolíticos fue creada por Rebecca Lancefield. Esta clasificación en serogrupos esta basada en las diferencias antigénicas 274 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA de los carbohidratos de la pared celular. Los antígenos de grupo son rápidamente extraíbles de la pared celular e identificables por reacciones de precipitación usando antisueros específicos. Los estreptococos que carecen de antígeno de grupo reconocible son identificados por características fenotípicas (reacciones de fermentación, producción de enzimas) y por hibridación del DNA. En la actualidad se reconocen aproximadamente 30 especies de Streptococcus; siendo algunas de las especies de mayor importancia en patología humana: S. pyogenes (estreptococo del grupo A), S. agalactiae (estreptococo del grupo B), y S. pneumoniae (neumococo). Principales serogrupos de Streptococcus en enfermedad humana. Serogrupo A Antígeno grupo específico de la pared celular Ramnosa-N-acetil-glucosamina B Ramnosa-glucosamina C D Ramnosa-N-acetil-galactosamina Ácido glicerol teicoico G Ramnosa-galactosamina Aspectos clínicos Faringitis, amigdalitis, escarlatina, erisipela, impétigo, celulitis, secuelas no supurativas: fiebre reumática, glomerulonefritis Corioamnionitis, sepsis puerperal y neonatal, meningitis neonatal Infecciones respiratorias altas Infecciones del tracto genitourinario, heridas, endocarditis Infecciones respiratorias altas, celulitis, sepsis Streptococcus pyogenes Streptococcus pyogenes (Streptococcus del grupo A) es una de las bacterias más importantes en patología humana. Este ubicuo organismo es la causa bacteriana mas frecuente de faringitis aguda y también da lugar a una gran variedad de infecciones cutáneas y sistémicas. Ocupa un lugar especial en la microbiología médica por ocasionar dos secuelas no supurativas, fiebre reumática (FR) y glomerulonefritis difusa aguda postestreptocócica (GNDA). CARACTERES MICROBIOLÓGICOS Streptococcus del grupo A (SgA) se presenta microscópicamente como células esféricas u ovoides de 0.6-1.0 µm de diámetro y se agrupa en pares o cadenas de longitud variable en muestras clínicas, o cuando crece en medios líquidos enriquecidos con suero o sangre. Son, al igual que el resto de los estreptococos, Gram positivos, inmóviles, no formadores de esporos, catalasa negativos y, facultativamente anaerobios. SgA es exigente desde el punto de vista nutricional, requiriendo medios complejos enriquecidos con sangre para su desarrollo óptimo. Cuando crece en medios sólidos con sangre se observa alrededor de las colonias grises de 1-2 mm de diámetro un halo de hemólisis beta (pueden existir cepas que no la exhiban, pero es excepcional). Se han identificado un gran número de componentes estructurales y productos extracelulares en SgA. A continuación serán reseñados los más importantes. COMPONENTES CELULARES a) La cápsula es la capa mas superficial que envuelve al microorganismo y está compuesta por ácido hialurónico, encontrándola en los microorganismos solamente cuando están 275 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA b) c) d) e) cursando enfermedad en el huésped. Es un factor de virulencia accesorio que dificulta la fagocitosis por los leucocitos polimorfonucleares y macrófagos del huésped. El carbohidrato específico de grupo (carbohidrato C) está constituido por un dímero de ramnosa y N-acetil glucosamina. El mucopéptido (peptidoglicano) que le confiere rigidez a la pared, al cual se unen proteínas, carbohidratos y lipoproteínas. Sus componentes tienen carácter antigénico y pueden contribuir a la patogenicidad. La proteína M es uno de los principales factores de virulencia de SgA. Se localiza en estructuras fibrilares confiriéndole a las cepas ricas en ella, resistencia a la fagocitosis por leucocitos polimorfonucleares. Las cepas que no la expresan son avirulentas. SgA puede ser dividido en serotipos basándose en las diferencias antigénicas de la molécula de proteína M. Alrededor de 80 serotipos son reconocidos actualmente. La inmunidad adquirida contra la infección estreptocócica está basada en el desarrollo de anticuerpos opsonizantes dirigidos contra la porción antifagocítica de la molécula de proteína M. Tal inmunidad es tipo-específica y permanece por varios años, tal vez indefinidamente. En algunos casos se ha demostrado protección cruzada por anticuerpos de un serotipo contra organismos de un serotipo heterólogo. La proteína M es una macromolécula filamentosa que se encuentra como un dímero estable con una estructura alfa helicoidal. Se encuentra anclada a la membrana celular y atraviesa la pared celular. La porción proximal de la molécula contiene epítopes conservados en todos los SgA, mientras que la porción distal contiene epítopes tipo-específicos. Esta configuración localiza el sector tipo-específico en la punta de las fibrillas, protruyendo en la superficie celular (figura 1). En el huésped no inmune, la proteína M ejerce su efecto antifagocítico al inhibir la activación de la vía alterna del complemento en la superficie celular. Este efecto es mediado, en parte, por la habilidad de la proteína M de precipitar fibrinógeno directamente en la superficie bacteriana. El efecto antifagocítico es anulado en presencia de concentraciones adecuadas de anticuerpos tipo-específicos. El factor de opacificación del suero (FO), es otro antígeno estrechamente asociado a la molécula de proteína M. Este factor es una alfa-proteinasa que es detectada por su propiedad de opacificar el suero de caballo. No todas las cepas de SgA tipificables por la proteína M poseen este factor. El FO es antigénico y tipo-específico, es decir que su habilidad para opacificar el suero puede ser inhibida por anticuerpos homólogos y no heterólogos de proteína M. Esta sustancia es importante principalmente por dos razones: – es un marcador epidemiológico muy útil que ayuda en la clasificación de los estreptococos cuando no es detectable por el tipo de proteína M. Figura 1. 276 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA – la respuesta tipo-específica y no tipo-específica a la proteína M es generalmente más débil después de una infección faríngea con FO positivo que con serotipos FO negativos. f) Las proteínas T y R constituyen otro complejo antigénico que no intervienen en la patogenicidad del microorganismo, pero son de utilidad para completar la tipificación de Streptococcus, especialmente en las cepas no identificables por la proteína M. g) La proteína F, no fibrilar, juega un rol crítico en el primer paso de la colonización, que es la adherencia de SgA a la molécula de fibronectina, glucoproteína situada en la superficie de las células epiteliales humanas. El ácido lipoteicoico formado por unidades de poliglicerol fosfato unidas a lípidos, podría jugar también un rol en la adherencia, en asociación con proteínas de superficie. h) Recientemente se ha descrito una peptidasa unida a la célula que cliva el componente C5 del complemento e inhibe la quimiotaxis de los neutrófilos in vitro e in vivo. PRODUCTOS EXTRACELULARES Durante el desarrollo in vivo e in vitro, SgA elabora numerosos productos extracelulares, pero solamente un número limitado de ellos han sido bien caracterizados. Algunos poseen carácter antigénico, y la determinación de anticuerpos frente a ellos se utiliza para establecer el diagnóstico de infección estreptocócica reciente. a) Hemolisinas: existen dos tipos de hemolisinas elaboradas por SgA que se denominan O y S. La estreptolisina O deriva su nombre de su oxígeno labilidad. Es reversiblemente inhibida por el oxígeno e irreversiblemente por el colesterol. Además de su efecto lítico sobre los eritrocitos es tóxica sobre una variedad de células y fracciones celulares, incluyendo leucocitos polimorfonucleares, plaquetas y lisosomas. La estreptolisina O es producida por casi todas las cepas de SgA (así como por algunos organismos de los grupos C y G), y es antigénica. La titulación de los anticuerpos antiestreptolisina O (AELO) en suero humano ha probado ser una prueba útil como indicador de infección estreptocócica reciente. La estreptolisina S es una hemolisina producida por los estreptococos en presencia de suero (de ahí “S”) o en presencia de una variedad de otras sustancias tales como albúmina, alfa-lipoproteína, RNA. La estreptolisina S no es antigénica. Tiene la capacidad de dañar la membrana de leucocitos, plaquetas y organelos subcelulares. No es inactivada por el oxígeno pero es termolábil. Dadas las características de ambas hemolisinas se observa que la hemólisis en la superficie de las placas de agar es debida primariamente a estreptolisina S, en tanto la hemolisina O exhibe su efecto en la profundidad del agar debajo del desarrollo bacteriano. b) La exotoxina pirogénica estreptocócica (SPE), antes conocida como toxina eritrogénica, es responsable del rash de la fiebre escarlatina. Experimentalmente, esta sustancia exhibe una variedad de otras propiedades tóxicas incluyendo pirogenicidad, citotoxicidad, y aumento de la susceptibilidad a los efectos letales de la endotoxina. La producción de toxina está inducida por la presencia de un fago temperado en fase lisogénica. Se conocen 10 toxinas serológicamente diferentes (A-J), cuyos efectos pueden ser neutralizados por anticuerpos. Se trata de exotoxinas que actúan como superantígenos, es decir, productos que estimulan de modo intenso e inespecífico el sistema inmune. c) Muchos productos extracelulares, pueden teóricamente, favorecer la licuefacción del pus y la diseminación de los S. pyogenes a través de los diferentes planos tisulares. Estos incluyen: TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 277 – cuatro enzimas antigénicamente distintas que participan en la degradación de DNA (DNAsas A, B, C y D); – hialuronidasa, que degrada enzimáticamente al ácido hialurónico del tejido conectivo; – estreptoquinasa, la cual promueve la disolución de coágulos al catalizar la conversión del plasminógeno en plasmina. d) Otros productos extracelulares son: NADasas, proteinasa, amilasa y esterasa. La mayoría de las sustancias recientemente enumeradas son antigénicas y los anticuerpos para cinco de estos productos han sido usados para serodiagnóstico de infección por SgA. Ellos son: anti-DNAsa, AELO, antihialuronidasa, anti-NADasa y anti-estreptoquinasa. MANIFESTACIONES CLÍNICAS Las dos manifestaciones clínicas de las infecciones por SgA son la faringitis y la piodermitis. Faringoamigdalitis estreptocócica La infección faringoamigdalar aguda es uno de los motivos de consulta más frecuentes en la práctica clínica. La misma puede ser de etiología viral o bacteriana. Dentro de estas últimas SgA es responsable de la mayoría de estas infecciones aunque otros serogrupos pueden ocasionarla (grupos C y G). Es una enfermedad autolimitada, aunque debe siempre realizarse el tratamiento antimicrobiano para prevenir las complicaciones, y afecta con más frecuencia a niños de edades comprendidas entre 5 y 15 años, pero todas las edades son susceptibles. Se transmite de persona a persona por gotitas de secreciones aerosolizadas. El número de microorganismos y su virulencia van disminuyendo desde la fase aguda a la de convalecencia, marcando un distinto grado de infecciosidad. El cuadro clínico no es específico de la etiología estreptocócica. La fiebre escarlatina es debida a la infección estreptocócica con una cepa que elabora la exotoxina pirogénica. Esta enfermedad está generalmente asociada a faringitis, aunque puede seguir a otras infecciones estreptocócicas tales como heridas. Las complicaciones de la faringitis causada por el SgA se pueden dividir en supurativas y no supurativas. Las complicaciones supurativas se observan con poca frecuencia desde el advenimiento de antibioticoterapia efectiva. Entre ellas se citan: absceso y celulitis periamigdalinos, otitis media, sinusitis. Las complicaciones no supurativas son la fiebre reumática (FR) y la glomerulonefritis difusa aguda (GNDA), que reseñaremos más adelante. El diagnóstico etiológico se efectúa a través del cultivo del exudado faríngeo. En caso de existir simultáneamente fiebre escarlatina el diagnóstico se facilita. El tratamiento está dirigido a prevenir la FR y las complicaciones supurativas. La prevención de la fiebre reumática requiere de la erradicación de la infección por SgA de la faringe, lo cual depende de un tratamiento prolongado más que de altas dosis de antibiótico. SgA es hasta el presente homogéneamente sensible a la penicilina, antibiótico de probada eficacia en la prevención de la FR. Se utiliza penicilina G benzatina 1.2 millones de unidades y para niños que pesan menos de 30 kg, 600.000 U. En pacientes alérgicos a la penicilina se administra eritromicina. Según datos actuales pueden también ser útiles nuevos macrólidos (azitromicina, claritromicina). Los regímenes vía oral deben mantenerse por 10 días. Aproximadamente un 15% de individuos quedan como portadores luego del tratamiento. 278 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Piodermitis Con este término se designan colectivamente las infecciones estreptocócicas localizadas de la piel. Impétigo: es una infección cutánea superficial, caracterizada por la aparición de vesículas, de 1-2 mm, que rápidamente evolucionan a costras de color ambarino, pruriginosas y acompañadas de adenopatías satélites. La localización más frecuente es en las extremidades. El SgA que causa impétigo difiere de aquellos que ocasionan faringoamigdalitis, perteneciendo a diferentes serotipos M. Los aislamientos a partir de las lesiones de piel son primariamente pertenecientes al grupo A, pero ocasionalmente se encuentra otros serogrupos como responsables (C y G). La respuesta inmune AELO para las infecciones cutáneas difiere de la respuesta en casos de infección faríngea, siendo más débil. Hay evidencias experimentales que sugieren que esto podría deberse a la inactivación local de la estreptolisina O por los lípidos cutáneos. Por el contrario, la respuesta anti-DNAsa y anti-hialuronidasa están conservadas y son útiles para el diagnóstico serológico. Tratamiento y profilaxis: existen gran número de antimicrobianos orales efectivos en el tratamiento del impétigo. Entre ellos se incluyen penicilina V, cefalosporinas de primera generación, eritromicina, etc. El tratamiento tópico con mupirocina tiene altas tasas de curación, pero es caro. No menos importantes son las medidas de higiene personal, que constituyen la medida profiláctica más importante. INFECCIONES INVASIVAS DE PIEL Y PARTES BLANDAS Desde mediados de la década de 1980, se observa un cambio epidemiológico en las infecciones invasivas ocasionadas por SgA, coexistiendo con la reaparición de ciertas cepas de SgA correspondientes a determinados serotipos M, observándose un aumento en la severidad y frecuencia de las mismas. Afectan mayoritariamente a adultos, y la puerta de entrada es generalmente cutánea. En algunos casos, la infección lleva al shock y fallo multiparenquimatoso, pareciéndose en ciertos aspectos al síndrome del shock tóxico estafilocócico. Por lo que se ha designado a esta entidad como síndrome del shock tóxico estreptocócico (SST). A continuación se hará una breve reseña de las infecciones estreptocócicas severas de piel y partes blandas y del SST. Erisipela Es una inflamación aguda de la piel con marcada afectación del drenaje linfático, que es causada por SgA. Su frecuencia ha aumentado en los últimos años. Puede afectar cara, extremidades o tronco. Se acompaña de síndrome toxiinfeccioso. El tratamiento con penicilina es curativo. Celulitis estreptocócica Es una inflamación aguda y extendida de la piel y el tejido subcutáneo, que puede seguir a quemaduras, heridas o incisiones quirúrgicas. Se diferencia de la erisipela porque la lesión no esta limitada y no existe una demarcación entre la zona de piel afectada y no afectada. Otros agentes pueden ser causa de celulitis, pero la mayoría de los casos son debidos a SgA y S. aureus. Aunque la penicilina es una buena elección para la etiología estreptocócica, debido a que en las etapas iniciales es difícil la diferenciación etiológica desde un punto de vista clínico, se recomienda el uso de penicilinas semisintéticas resistentes a las penicilinasas, o vancomicina. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 279 Fascitis necrotizante (gangrena estreptocócica) Es una infección de las fascias y tejidos subcutáneos profundos, caracterizada por una necrosis rápida y extensa. En forma típica comienza por una lesión traumática, generalmente trivial, en la cual se puede presentar como un área eritematosa, que en un período de 24-72 horas tiene una rápida evolución. La inflamación se extiende y se intensifica, la piel se oscurece y se torna púrpura, y aparecen bullas de contenido hemorrágico. Se acompaña frecuentemente de bacteriemia y pueden presentarse abscesos metastásicos. El proceso tiene un curso inexorable a la agravación progresiva a menos que se tomen medidas específicas y rápidas para contenerlo. Las tasas de mortalidad son altas incluso con un tratamiento adecuado. El manejo adecuado de esta entidad depende de un correcto diagnóstico precoz. El estudio mediante tinción de Gram de exudados serosanguinolentos de las lesiones, puede ser útil si revela cocos Gram positivos en cadena. El diagnóstico diferencial entre celulitis y fascitis necrotizante es crucial, ya que, si bien en ambos casos el tratamiento requerirá de antibioticoterapia, el segundo requiere además de tratamiento quirúrgico, extensas debridaciones en algunos casos. Síndrome del shock tóxico estreptocócico En los últimos años se han descrito varios casos de SST en diferentes áreas del mundo, observándose en primera instancia en adultos y, posteriormente, en niños. Las cepas de SgA que causan SST se transmiten rápidamente de persona a persona y se observa un alto porcentaje de transmisión a contactos. Patogenia: se ha encontrado una mayor frecuencia de determinados serotipos M en SST. Aunque no están aún dilucidados los mecanismos patogénicos, los estudios se enfocan actualmente a las exotoxinas pirogénicas estreptocócicas (SPE). Además de provocar el rash en la escarlatina, las SPE tienen una variedad de efectos biológicos adversos observados en modelos animales, como alteración de diferentes órganos y shock. Se encontró una homología aminoacídica entre las SPE y las enterotoxinas B y C estafilocócicas. SPE es un superantígeno, y es un inductor muy potente del factor de necrosis tumoral (FNT). Además del serotipo M, otros factores se han encontrado asociados con las cepas de SgA responsables del SST, como calidad y cantidad de SPE y, recientemente, síntesis de una proteasa. Éstos y otros elementos son los responsables de la habilidad de estas cepas de invadir rápidamente los tejidos y el torrente circulatorio, y desencadenar la liberación de los factores mediadores de la cascada de la inflamación, responsables de la falla multiparenquimatosa. La clínica puede estar entrelazada con los aspectos de la fascitis necrotizante que a menudo se asocian. Pero lo que lo caracteriza es la rápida evolución al shock, precedida de un cuadro leve localizado en un pequeño traumatismo, caracterizado por dolor local y eritema, que evoluciona a lesiones bullosas, acompañado por un síndrome febril. El shock se ve acompañado por fallo agudo de diferentes órganos: daño cerebral severo, insuficiencia renal, distrés respiratorio, miocardiopatía tóxica y disfunción hepática. Desde el punto de vista del laboratorio, se observa la alteración multiparenquimatosa, y, a diferencia del shock de etiología estafilocócica, se encuentran los hemocultivos positivos en un 60% de los casos. Para el tratamiento del paciente se requiere una unidad de cuidados intensivos y se debe realizar el soporte de las funciones vitales. Desde el punto de vista microbiológico se debe instituir una terapéutica antimicrobiana precoz, empírica al inicio, y una vez confirmada la etiología estreptocócica la penicilina G es el antibiótico de elección, aunque la misma es relativamente inefectiva cuando la concentración de microorganismos es alta. Actualmente 280 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA se está investigando también la eficacia de tratamientos que se dirijan al componente del hospedero en la patogenia de la enfermedad, es decir, interactuando con la respuesta inflamatoria (bloqueo periférico de la acción de interleucinas y el factor de necrosis tumoral). COMPLICACIONES NO SUPURADAS Fiebre reumática La fiebre reumática (FR) es una enfermedad caracterizada por producir lesiones inflamatorias no supuradas que involucran el corazón, tejidos subcutáneos y el sistema nervioso central. En su forma clásica es una enfermedad de curso agudo, febril y autolimitada. Sin embargo, puede ocurrir lesión valvular cardíaca, y este daño ser crónico y progresivo, conduciendo a falla cardiovascular, inhabilitación y, eventualmente, la muerte. Patogenia: la FR es una secuela postestreptocócica posterior a una infección respiratoria alta debida a SgA. Esto está apoyado por varios hechos: • Hay una relación temporal entre epidemias de infecciones faríngeas por SgA y epidemias de FR. • La mayoría de pacientes con FR tienen un antecedente reciente de faringitis. • En pacientes con FR se detectan anticuerpos anti-estreptocócicos que revelan infección reciente. • El uso continuo de antimicrobianos profilácticos que disminuyen las faringitis por SgA recurrentes, se acompaña de una disminución de FR en pacientes con antecedentes de la misma. La FR se asocia con infección faríngea por SgA, no así por infecciones cutáneas, y a su vez con determinados serotipos M que se llaman comúnmente “cepas reumatógenas”. Estas cepas tienen la característica de no poseer el factor de opacificación (FO) y de poseer una gruesa cápsula. Aunque SgA sea la causa de la FR, no está totalmente aclarado el mecanismo exacto por el cual el microorganismo induce la enfermedad, existiendo varias teorías al respecto: • Efectos tóxicos de ciertos productos de SgA, particularmente las estreptolisinas S y O; • Reacción tipo enfermedad del suero mediada por complejos Ag-Ac, tal vez localizados en los sitios de daño tisular; • Fenómenos autoinmunes inducidos, tal vez, por la similitud o identidad entre ciertos Ag estreptocócicos y ciertas moléculas de los tejidos humanos. Clínicamente tiene una presentación muy variada y no existe un test diagnóstico específico. Se presenta por una variedad de síntomas y signos que pueden ocurrir solos o en combinación. De acuerdo a su importancia diagnóstica se dividen en criterios mayores y menores. Criterios mayores: carditis, poliartritis, corea, nódulos subcutáneos, y eritema marginado. Criterios menores: fiebre, artralgia, falla cardíaca, reactantes de fase aguda (proteína C reactiva, velocidad de erotrosedimentación elevada, leucocitosis). Desde el punto de vista diagnóstico, a los criterios recientemente analizados debemos sumarle la presencia de evidencia de infección estreptocócica reciente. Tal evidencia puede ser un episodio de faringitis estreptocócica documentado bacteriológicamente o la demostración de un título elevado de anticuerpos anti-estreptocócicos en suero. Este último estudio, si bien no permite hacer diagnóstico de FR, posibilita evidenciar la existencia de una infección por SgA reciente. Se realiza en suero la dosificación de AELO siendo considerado como indicador de infección reciente valores iguales o mayores a 200 unidades Todd. Se pueden dosificar también los anticuerpos anti-DNAsa y anti-hialuronidasa. Tratamiento y profilaxis: el tratamiento está destinado a disminuir la inflamación, disminuir la fiebre y control cardiovascular. En cuanto a la profilaxis es importante destacar TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 281 que los pacientes que han tenido FR tienen un riesgo elevado de repetir los episodios junto con cada infección faríngea por Sga, de modo que estos pacientes requieren una profilaxis continua para prevenir las infecciones recurrentes por estos microorganismos. Esta consiste en la administración de 1.2 millones de unidades de penicilina G benzatina administrada cada 4 semanas. En pacientes con alergia a la penicilina se administrará eritromicina estearato 250 mg dos veces al día. En cuanto a la duración de esta profilaxis continua existe gran controversia. Algunos grupos opinan que la misma no debe ser discontinuada hasta que el paciente cumpla 20 años. Otros grupos recomiendan que ésta se mantenga indefinidamente. Por otra parte, se investiga intensamente en el desarrollo de una vacuna segura y efectiva en base a la proteína M para prevenir la infección por SgA. La misma debería ser polivalente, y poseer determinantes antigénicos que otorguen inmunidad tipo-específica y no contengan antígenos cruzados con tejidos humanos. Glomerulonefritis difusa aguda (GNDA) La GNDA es una afección aguda de los glomérulos renales que está caracterizada anatomopatológicamente, por lesiones proliferativas difusas de los glomérulos; y clínicamente, por edema, hipertensión, hematuria y proteinuria. Es una secuela no supurada de infecciones faríngeas o cutáneas causadas por ciertas cepas de SgA llamadas “nefritógenas” que pertenecen a serotipos determinados, diferentes de los relacionados con FR, siendo el más frecuente el serotipo 12. Al igual que en la FR, no se conoce el mecanismo exacto por el cual se produce la afección. Dado el período existente entre la infección y el desarrollo de GNDA, la presencia de hipocomplementemia, y que inmunoglobulinas y componentes del complemento están presentes en el riñón desde el inicio de la afección, existen grandes evidencias para adjudicar a un mecanismo inmunológico la causa de la injuria renal. La hipótesis más aceptada al respecto sugiere que el daño renal sería causado por el depósito de complejos inmunes compuestos por antígenos estreptocócicos y anticuerpos del huésped, a nivel del glomérulo. El diagnóstico se hace en base a la clínica y a evidencias de infección estreptocócica reciente. Esta última en base a historia previa de escarlatina, infección faríngea por SgA o por demostración de títulos elevados de Ac antiestreptocócicos. Se debe recordar que en las GNDA asociadas a piodermitis los AELO no se elevan, por lo que se deben titular los anticuerpos anti-DNAsa o anti-hialuronidasa. Tratamiento y profilaxis: desde el punto de vista microbiológico los pacientes deben recibir penicilina G benzatina para erradicar las cepas nefritógenas, siendo este tratamiento sólo con propósitos epidemiológicos ya que no modificará el curso de la GNDA preexistente. A diferencia de la FR no se recomienda la profilaxis continua ya que son raros los episodios de GNDA recurrentes. Streptococcus agalactiae Streptococcus agalactiae o Streptococcus del grupo B (SgB), fue descrito como patógeno humano en 1935 por Fry en tres casos de fiebre puerperal. CARACTERES MICROBIOLÓGICOS SgB son cocos Gram positivos, anaerobios facultativos, exigentes, que en medios sólidos con sangre crecen formando colonias grisáceas de 3 a 4 mm de diámetro, rodeadas de un halo estrecho de beta-hemólisis. SgB poseen dos antígenos en la pared celular de naturaleza polisacárida, uno es el antígeno C específico de grupo, y otro es tipo-específico, la sustancia S 282 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA que permite la clasificación en cinco serotipos: Ia, Ib, Ic, II y III. Por fuera de la pared aparece rodeado de una cápsula de naturaleza polisacárida, que inhibe la fagocitosis. La cápsula del serotipo III en particular, inhibe la activación de la vía alterna del complemento, que participa en el proceso de opsonofagocitosis de estas bacterias. El ácido siálico constituye el residuo terminal de los serotipos la y III, y es responsable del efecto recién nombrado. MANIFESTACIONES CLÍNICAS La asociación entre colonización del tracto genital materno en el momento del parto por SgB e infección neonatal invasiva temprana está bien establecida. Se describen en el recién nacido síndrome de dificultad respiratoria, meningitis, sepsis, otitis, empiema. En adultos, puede ser agente etiológico de infecciones urinarias, vaginales, y es muy importante como agente de sepsis puerperal. El diagnóstico microbiológico se realiza mediante aislamiento de SgB a partir de hemocultivos, líquido cefalorraquídeo o focos de supuración. Existen métodos rápidos de diagnóstico que consisten en la detección de antígenos capsulares en líquido cefalorraquídeo. SgB es uniformemente sensible a las penicilinas y estas son el tratamiento de elección una vez establecido el diagnóstico etiológico. La prevención de la colonización del feto puede lograrse mediante la profilaxis con ampicilina durante el parto a las madres portadoras. No obstante la solución en un futuro próximo puede radicar en la inmunización activa con preparaciones de polisacáridos capsulares purificados. Streptococcus betahemolíticos de los grupos C y G En humanos se han aislado en infecciones faríngeas y cutáneas similares a las del grupo A. También se han descrito casos aislados de infección puerperal, sepsis, endocarditis y neumonía. Son sensibles a la penicilina, pero se han descrito cepas tolerantes. Enterococcus y Streptococcus del grupo D ENTEROCOCCUS Los enterococos son cocos Gram positivos que se agrupan en pares o cadenas cortas. Pertenecían al grupo D de la clasificación de Lancefield junto con los no enterococos, que permanecen en el género Streptococcus. Caracteres microbiológicos Son anaerobios facultativos, capaces de desarrollar en condiciones extremas tales como NaCl 6.5%, pH 9.6 y a temperaturas que oscilan entre 10-45 ºC. Pueden sobrevivir 30 min a 60 ºC y desarrollan en presencia de 40% de sales biliares. La especie más frecuentemente aislada en la clínica es E. faecalis en 80-90% de los aislamientos, seguido por E. faecium, el cual está aumentando su incidencia en hospitales, especialmente cepas multirresistentes. Se encuentran en el medio ambiente y su hábitat más importante es el tracto gastrointestinal del hombre y otros animales. Patogenia Aunque no se ha descrito un factor de virulencia clásico, la resistencia de los enterococos a múltiples agentes antimicrobianos le permite sobrevivir y proliferar en pacientes que reciben tratamiento antimicrobiano. Esto da cuenta de la habilidad de los enterococos para sobrein- TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 283 fectar pacientes que están recibiendo antimicrobianos de amplio espectro. Los enterococos pueden adherirse a las válvulas cardíacas y a las células epiteliales renales, propiedades que sin duda contribuyen a su habilidad para causar endocarditis e infecciones del tracto urinario. Por formar parte de la flora intestinal los enterococos son capaces de producir infecciones en pacientes ambulatorios u hospitalizados, y se pensaba anteriormente que la mayoría de las infecciones causadas por estos agentes eran endógenas. Sin embargo, la mayoría de las infecciones ocurren en pacientes hospitalizados, o bajo tratamiento con diálisis peritoneal o hemodiálisis, en los cuales el agente es exógeno, encontrándose las cepas en el medio ambiente y en manos de personal. En algunos países ocupa el segundo o tercer lugar en frecuencia como causa de infección hospitalaria. Los enterococos han sido aislados de infecciones del tracto urinario, bacteriemia y endocarditis, infecciones pélvicas, abdominales y de heridas. El atributo más sorprendente de los enterococos es su resistencia relativa y absoluta a los antimicrobianos de uso más común en las infecciones por Gram positivos. Los enterococos poseen una variedad de mecanismos adquiridos de resistencia, la mayoría de los cuales están mediados por genes codificados en plásmidos o transposones. Es muy importante la resistencia de alto nivel adquirida a los aminoglucósidos que da como resultado resistencia a la combinación sinérgica de aminoglucósidos con agentes betalactámicos, asociación terapéutica muy usada, y para la cual debe estudiarse la sensibilidad frente a una infección grave por enterococos. A fines de la década de 1980 fue descrita en Europa la resistencia a la vancomicina (único antimicrobiano útil frente a las cepas resistentes a los demás agentes) causando actualmente impacto en otras partes del mundo. Es también en esta década que se encuentra la primera cepa productora de betalactamasas. El tratamiento de las infecciones enterocócicas es complicado, tanto por los patrones especiales de sensibilidad o resistencia que ellos exhiben, como por la necesidad de pruebas de estudio de la sensibilidad especiales para demostrar su verdadera susceptibilidad en el laboratorio. STREPTOCOCCUS DEL GRUPO D S. bovis es la especie más frecuentemente aislada en patología humana dentro del grupo. Son clasificados dentro del grupo D en base a su antígeno de pared (Lancefield). Las manifestaciones clínicas más importantes causadas por S. bovis son bacteriemia y endocarditis. La puerta de entrada es generalmente el tracto gastrointestinal, aunque la vía biliar o el tracto urinario también han sido implicados como probables fuentes. Hay una llamativa asociación entre bacteriemia producida por S. bovis y neoplasia de colon subyacente, por lo que todo paciente con bacteriemia debida a S. bovis debe ser sometido a un estudio exhaustivo para descartar la posibilidad de esa patología subyacente. Está en discusión si S. bovis juega algún rol en dicho neoplasma o si es solamente un marcador. La bacteriemia por S. bovis se acompaña en un 25-50% de los casos de endocarditis, la cual tiene un curso subagudo y es indistinguible clínicamente de la producida por los estreptococos del grupo viridans, con raras complicaciones sépticas periféricas y excelente respuesta a los antimicrobianos. S. bovis es muy susceptible a la penicilina. Si bien la asociación penicilina-aminoglucósido se ha mostrado sinérgica contra S. bovis, el curso de tratamiento durante cuatro semanas sólo con penicilina se ha mostrado igualmente efectivo. La vancomicina es una alternativa razonable en los pacientes alérgicos a la penicilina. 284 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Streptococcus del grupo viridans o grupo alfa hemolítico Los Streptococcus del grupo viridans constituyen un grupo heterogéneo compuesto por diferentes microorganismos con diferentes nichos ecológicos y patogenicidad. Aunque son organismos que forman parte de la flora normal del tracto respiratorio y digestivo, pueden, bajo determinadas circunstancias, invadir sitios estériles pudiendo provocar enfermedades graves. Comparten las características generales del género y se caracterizan por producir un halo de alfa-hemólisis alrededor de sus colonias. Tienen requerimientos nutricionales variables y desde el punto de vista de sus requerimientos atmosféricos la mayoría son anaerobios facultativos, existiendo algunas cepas capnófilas y otras microaerófilas. Aunque algunos aislamientos pueden reaccionar con los antisueros de Lancefield, son no agrupables. Se distinguen varias especies en este grupo, requiriendo su identificación de una variedad de pruebas bioquímicas. Dentro de sus factores de virulencia se destacan: • la presencia de ácido lipoteicoico que favorece la adherencia del microorganismo (importante en la adherencia a las válvulas cardíacas cuando ocasiona endocarditis); • la producción de abundantes polisacáridos extracelulares (limo) que interviene en los mecanismos patogénicos de producción de caries y les brinda adherencia entre ellos, mecanismo importante en endocarditis. Los estreptococos de este grupo se aíslan de diferentes procesos patológicos: caries dental, infecciones quirúrgicas, bacteriemias, endocarditis (de la cual es responsable del 50-75% de los casos sobre válvulas nativas), abscesos profundos, etc. La mayoría de Streptococcus del grupo viridans son susceptibles a la penicilina G; pero se están reportando recientemente cepas moderada y altamente resistentes en algunas áreas del mundo. También se han descrito algunas cepas que presentan el fenómeno de tolerancia, en el cual los microorganismos pueden ser inhibidos por concentraciones bajas del antimicrobiano, pero se requiere un nivel 32 veces mayor para lograr la actividad bactericida. Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae es un importante patógeno humano, agente etiológico reconocido de neumonía, meningitis, sinusitis y otitis media; es menos frecuentemente el origen de endocarditis, artritis, y peritonitis. CARACTERES MICROBIOLÓGICOS Es un coco Gram positivo que se agrupa formando cadenas en medio líquido. Es catalasa negativo, exigente desde el punto de vista nutricional y requiere para su óptimo desarrollo de una atmósfera enriquecida con 5-10% de CO2. Posee una alfa-hemolisina que degrada la hemoglobina dando un color verde alrededor de la colonia cuando desarrolla en agar sangre. El peptidoglicano y los ácidos teicoicos son los constituyentes principales de la pared celular. En la figura 2 se observa una representación esquemática de la cápsula, pared celular y membrana celular. La integridad de la pared depende de la presencia de numerosas cadenas peptídicas laterales que están entrelazadas por enzimas (transpeptidasas y carboxipeptidasas), siendo el sitio activo de estas enzimas el punto de unión de los antibióticos betalactámicos. Un constituyente único de los neumococos es el polisacárido C, un ácido teicoico compuesto por fosfato de colina covalentemente unido al peptidoglicano en la capa externa de la pared celular. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 285 Figura 2. Por fuera de la pared se encuentra una cápsula de naturaleza polisacárida presente en prácticamente todos los aislamientos clínicos. Se reconocen aproximadamente 80 serotipos de S. pneumoniae en base a las diferencias antigénicas en los polisacáridos capsulares. MECANISMOS PATÓGENICOS La adherencia bacteriana es el primer paso en la producción de infección. Recientemente se ha descubierto una adhesina en el neumococo que le permite unirse a receptores específicos de las células epiteliales. La naturaleza química de estos adhesinas aún no ha sido dilucidada. Una vez que la colonización ha tenido lugar, la infección resultará si los microorganismos son llevados a sitios donde los mecanismos defensivos (específicos e inespecíficos) del huésped no los eliminen. S. pneumoniae tiene la capacidad de producir enfermedad por su habilidad para escapar a la fagocitosis y la destrucción por las células fagocíticas del huésped. A diferencia de SgA el S. pneumoniae produce pocas toxinas, de modo que produce enfermedad debido a su capacidad de replicarse en los tejidos del huésped y generar una respuesta inflamatoria intensa. a) Evasión de la fagocitosis: los neumococos son pobremente ingeridos por las células fagocíticas en ausencia de anticuerpos capsulares y complemento. Se ha observado experimentalmente, por transposición mutagénica, que la interrupción en la producción de cápsula torna una cepa virulenta en avirulenta. Los mecanismos por los cuales la cápsula inhibe la fagocitosis aún no están totalmente aclarados, existiendo varias posibilidades: – ausencia de receptores en la célula fagocítica que reconozcan los polisacáridos capsulares; – la presencia de fuerzas electroquímicas que repelen las células fagocíticas; – enmascaramiento por anticuerpos no específicos y complemento que se depositan en la superficie bacteriana y la tornan inaccesible a la fagocitosis. b) Activación del complemento: la pared celular del neumococo, parece activar la vía alterna del complemento. La inyección de peptidoglicano o ácido teicoico separadamente en el espacio subaracnoideo causa una reacción inflamatoria con características de meningitis 286 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA bacteriana. Esta activación está asociada con la liberación de C5a que atrae gran cantidad de polimorfonucleares al medio. c) Existen otros factores que contribuyen de forma secundaria en la producción de enfermedad, entre ellos se encuentran: – neumolisina, que es una toxina que se inserta en la bicapa lipídica de las membranas celulares mediante su interacción con el colesterol, y causa una gama de efectos citolíticos y citotóxicos, por ejemplo, inhibiendo la función bactericida de los leucocitos polimorfonucleares y el barrido ciliar. Quizás más importante aún es que esta sustancia produce una intensa inflamación al activar la vía clásica del complemento. – otros: proteínas de superficie, autolisina (produce la desintegración de la pared bacteriana liberando sustancias bacterianas en el foco), alfa-hemolisina y, finalmente, neuraminidasa, que podría contribuir a la adherencia bacteriana por clivado del ácido siálico en las superficies mucosas. MECANISMOS DEFENSIVOS DEL HUÉSPED Existen amplias evidencias que la respuesta de anticuerpos anticapsulares otorga una protección efectiva contra la infección neumocócica, apareciendo anticuerpos anticapsulares específicos a los 5-8 días de comenzada la infección, que es el tiempo en que la fiebre desaparece cuando no media tratamiento antimicrobiano. FACTORES QUE PREDISPONEN A INFECCIÓN NEUMOCÓCCICA S. pneumoniae es el principal ejemplo de bacteria patógena extracelular. En estos microorganismos las alteraciones en los principales elementos defensivos (factores humorales como Ac, complemento y células antifagocíticas), llevarán a una predisposición del huésped a infección repetida. PRESENTACIÓN CLÍNICA S. pneumoniae produce una gran variedad de cuadros clínicos, destacándose entre ellos por su gravedad y frecuencia, la meningitis y la neumonía. Meningitis S. pneumoniae junto con Neisseria meningitidis constituyen los agentes más frecuentes de meningitis en el adulto. Ésta se produce como resultado de una bacteriemia o por extensión de focos cercanos (senos paranasales, oído medio). La patogénesis de la meningitis se reseña en otro capítulo. Neumonía S. pneumoniae es el agente más frecuente de neumonía bacteriana de origen en la comunidad. Es una patología muy frecuente que afecta todas las edades, su incidencia está relacionada con la estación, y puede ser causa de muerte sobre todo en mayores de 65 años. El diagnóstico es clínico, radiológico y microbiológico. En cuanto al último, el diagnóstico es confirmado por la identificación de S. pneumoniae en las secreciones bronquiales o el hemocultivo. SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS La penicilina ha sido el antibiótico de elección para el tratamiento de infecciones neumocócicas hasta hace pocos años, que se ha tornado gradualmente más resistente a la misma. Esta resistencia refleja la selección de mutantes espontáneas, para las cuales se requiere una TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 287 concentración mayor para saturar las proteínas fijadoras de penicilina (PBP). Más recientemente aún, han aparecido cepas altamente resistentes a la penicilina, situación más grave todavía. La resistencia a la penicilina constituye solamente una parte del problema, ya que las cepas que la poseen tienen también un aumento en la resistencia a otros antibióticos betalactámicos. Vancomicina puede llegar a ser la última alternativa en la actualidad, pero se debe tener en cuenta la aparición de enterococos resistentes a la misma, y la posibilidad de transmisión de esta resistencia a S. pneumoniae. En la actualidad el tratamiento debe basarse en los estudios de susceptibilidad, por lo que los laboratorios clínicos deben hacer la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) para S. pneumoniae. PREVENCIÓN Se recomienda la vacunación de aquellos grupos con riesgo incrementado de infección neumocócica: enfermedad pulmonar crónica, enfermedad cardiovascular avanzada, diabetes mellitus, cirrosis, insuficiencia renal crónica, y aquellos individuos de más de 65 años de edad. Un segundo grupo de individuos estaría integrado por personas que tengan un compromiso del sistema inmune: infección por VIH, asplenia, linfoma, mieloma, enfermedad de Hodgkin, transplantados, etc. La vacuna está constituida por los polisacáridos capsulares de los 23 serotipos más frecuentemente aislados de infecciones. Un estudio reciente de efectividad de la vacuna presentó datos epidemiológicos que demostraron que el efecto protector de la misma persiste por 5 años en personas jóvenes sanas, decreciendo más rápidamente a medida que aumenta la edad. La inmunización pasiva con inmunoglobulina humana también protege contra la infección neumocócica, y se ha usado en niños portadores de infección por VIH y en adultos con linfoma, en los cuales no se espera tener una respuesta de anticuerpos frente a la vacunación. Género Streptococcus. Procedimientos de laboratorio Como ya mencionamos para el género Staphylococcus la identificación comienza con el estudio de la morfología macroscópica y microscópica a partir de un cultivo puro. Sólo haremos mención a aquellas especies más frecuentes en la práctica clínica. En cuanto a los requerimientos nutricionales el género Streptococcus es exigente y por lo tanto debe ser cultivado en medios ricos que le aporten los nutrientes necesarios, por ejemplo agar sangre ovina al 5%. Dentro de las pruebas bioquímicas para la identificación, la primera, luego de determinar que se trata de cocos Gram positivos, es la prueba de la catalasa. Ver capítulo 16, Género Staphylococcus. Luego de determinar que se trata de cocos Gram positivos, catalasa negativos, debemos observar el efecto que producen las colonias de la cepa en estudio sobre placas de agar sangre ovina al 5% (tipo de hemólisis). Así podemos clasificar este grupo de gérmenes en: • beta-hemolíticos: son aquellos que producen una hemólisis total de los glóbulos rojos, observándose como un halo transparente alrededor de las colonias. • alfa-hemolíticos: son aquellos que producen hemólisis parcial, la cual se observa como un halo con tonalidad verdosa alrededor de las colonias. • gamma-hemolíticos: son aquellos que no producen hemólisis sobre el agar sangre. 288 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA ESTREPTOCOCOS BETA HEMOLITICOS Los grupos más importantes son aquellos que se mencionan en la tabla 2, junto a las pruebas bioquímicas que se utilizan para su identificación presuntiva. Tabla 2. Streptococcus grupo A Streptococcus pyogenes Streptococcus grupo B Streptococcus agalactiae Sensibilidad a la bacitracina PYR + Prueba de CAMP - + - Bilis esculina - - + - Sensibilidad a la bacitracina Objetivo: separar el Streptococcus pyogenes de los demás estreptococos beta hemolíticos. Fundamento: el 99% de las cepas de Streptococcus pyogenes son sensible a bajas concentraciones de bacitracina (discos con 0,04 U). Un 5% de las cepas de Streptococcus agalactiae son sensibles a la bacitracina. Procedimiento: se realiza sembrando 3-4 colonias, tomadas con asa bacteriológica de un cultivo puro, que se estrían sobre una placa de agar sangre en varias direcciones intentando obtener un cultivo confluente. Luego se coloca el disco de bacitracina y se incuba 18-24 horas a 35-37ºC. Interpretación de los resultados: la aparición de cualquier halo de inhibición del crecimiento alrededor del disco se considera una prueba positiva (no importa el diámetro del halo). Hidrolisis del PYR Objetivo: separar Streptococcus pyogenes y Enterococcus de los demás estreptococos. S. pyogenes y Enterococcus poseen la capacidad de hidrolizar el substrato PYR (pirridonil ß-naftilamida) debido a que poseen la enzima l-piroglutamil aminopeptidasa. Existen varias configuraciones comerciales de este test por eso no detallaremos ninguna en particular. En general siempre se revelan por un cambio de color. Este test es más específico y menos laborioso que realizar el test de sensibilidad a la bacitracina, la bilis esculina y caldo salado (se verán más adelante). Prueba de CAMP Objetivo: separar Streptococcus agalactiae de los demás estreptococos ß-hemolíticos. Fundamento: los estreptococos del grupo B producen una proteína extracelular difusible llamada “factor CAMP” (iniciales de los autores que lo describieron) que actúa sinérgicamente con la ß-lisina de S. aureus, potenciando la lisis de los eritrocitos. Procedimiento: se realiza estriando un cultivo del estreptococo ß-hemolítico en estudio en forma perpendicular a una estría de un estafilococo productor de ß-lisina, en placas de agar sangre. Se incuban 18-24 horas a 37ºC. Interpretación de los resultados: la prueba positiva se evidencia por la presencia de una zona de potenciación de la hemólisis en forma de punta de flecha en el lugar donde se contactan las dos estrías. ESTREPTOCOCOS ALFA Y GAMMA HEMOLITICOS Dentro de este grupo se incluyen Streptococcus penumoniae, Streptococcus del grupo viridans y Enterococcus (algunas cepas pueden presentar beta-hemólisis). Describiremos los ensayos bioquímicos utilizados para su identificación. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 289 Tabla 3. Algunas características de las bacterias del género Streptococcus frecuentes en patología humana Clasificación bioquímica Clasificación serológica Tipo de hemólisis (en placa de agar sangre ovina al 5%) S. pyogenes A Beta S. anginosus A,C,F,G o no agrupables Beta, Alfa o Gamma S. agalactiae B Beta, ocasionalmente Gamma S. disgalactiae C,G Beta S. bovis D Alfa, Gamma, ocasionalmente Beta Bilis esculina Objetivo: separar los estreptococos del grupo D y Enterococcus de los demás grupos de estreptococos. Fundamento: se basa en la capacidad de los estreptococos del grupo D y Enterococcus para crecer en un medio de cultivo que contiene 40% de bilis y de hidrolizar la esculina a esculetina; ésta se combina con el citrato ferroso que posee el medio, dando un complejo de color negro. La concentración de bilis es fundamental, ya que existen estreptococos del grupo viridans que son capaces de crecer a concentraciones menores de bilis. Procedimiento: se realiza sembrando en superficie tubos de agar bilis esculina inclinado. Interpretación de resultados: una reacción positiva se evidencia como ennegrecimiento del medio. Prueba de tolerancia a la sal (caldo salado) Objetivo: separar los enterococos, capaces de crecer en caldo salado, de los demás estreptococos del grupo D. Fundamento: se basa en la capacidad de los enterococos de crecer en una concentración de 6,5% de NaCl. Se trata de un medio de cultivo líquido que contiene además de NaCl, glucosa y un indicador de pH: púrpura de bromocresol. Procedimiento: se inocula el caldo salado con la cepa a estudiar y se incuba 18-24 horas a 35ºC. Interpretación de los resultados: se considera la prueba positiva cuando aparece turbidez con o sin acidificación del medio, que se observa como un viraje de color del púrpura al amarillo. La no aparición de turbidez indica una prueba negativa. PYR La prueba de PYR se utiliza para la identificación del género Enterococcus, como ya fue mencionado. Para la identificación de especies dentro del género Enterococcus se realizan una serie de pruebas bioquímicas basadas en la utilización de distintos azúcares y aminoácidos, entre otras. Sensibilidad a la optoquina Objetivo: diferenciar S. pneumoniae de otros estreptococos β-hemolíticos. 290 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Fundamento: se basa en la sensibilidad de S. pneumoniae a una concentración menor o igual a 5 µg/ml de hidroxicuprina (optoquina). Procedimiento: estriar un cuadrante de una placa de agar sangre en varias direcciones con una suspensión Mc Farland 0,5. Colocar luego un disco de optoquina en el centro del área estriada. Incubar 18-24 horas a 37ºC en 5-10% de CO2. Interpretación de resultados: halos de inhibición iguales o mayores a 14 mm; o iguales o mayores a 16 mm con discos de optoquina de 6 y 10 mm de diámetro, respectivamente, indican sensibilidad. Identificación serológica Muchos Streptococcus aislados de infecciones humanas poseen antígenos específicos de naturaleza polisacárida (polisacárido C o ácidos teicoicos) que se encuentran en la pared celular. La extracción del polisacárido C por diferentes técnicas y su posterior enfrentamiento con antisueros específicos definen una serie de grupos que se denominan con letras mayúsculas a partir de la A. La utilidad de la extracción antigénica dependerá del tipo de hemólisis. En los estreptococos ß-hemolíticos se ha confirmado como el mejor método para su clasificación. En los no ß-hemolíticos, la extracción antigénica sólo es útil para la identificación de los grupos D y B. Existen diferentes métodos para la extracción enzimática que no detallaremos. Actualmente se utilizan métodos de extracción rápida por medio de enzimas de extracción. Luego se procede a la identificación del polisacárido por medio de técnicas de aglutinación con partículas de látex que tienen absorbido el antisuero específico. También existen en el mercado kits comerciales que utilizan técnicas de coaglutinación. Bibliografía • Manual of Clinical Microbiology. 7th edition. Edited by Murray P, Baron E.J, Pfaller M, Tenover F, Yolken R. 1999. ASM Press, Washington. • Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogens. 3rd ed. Edited by Brogden KA et al. 2000. ASM Press, Washington. • Mims, Playfair, Roitt, Wakelin and Williams, Microbiología Médica, 2ª edición. Mosby, Harcourt Brace, España, 1999. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 291 Página 291 18 Principales grupos de bacilos y cocos gramnegativos exigentes M. Torres Neisserias El género Neisseria comprende dos especies patógenas para el hombre; siendo éste el único reservorio conocido: N. meningitidis y N. gonorrhoeae. Otras especies de Neisseria no patógenas, se encuentran habitualmente formando parte de la flora normal de la orofaringe. La familia Neisseriaceae comprende varios géneros: Neisseria, Moraxella, Acinetobacter y otros. Moraxella catarrhalis (antes denominada Branhamella catarrhalis), inicialmente incluido en esta familia ha sido actualmente reclasificada como un subgénero de Moraxella. Las técnicas de identificación de este germen son similares a las de la familia Neisseriaceae. Su crecimiento en medios simples a temperatura de 22 ºC, su incapacidad de fermentar hidratos de carbono y la producción de una desoxirribonucleasa (DNAasa) permiten su identificación. Un gran porcentaje de cepas producen ß-lactamasas. Este germen ha sido implicado en los últimos años como agente de diversas enfermedades infecciosas, entre ellas otitis media en niños, exacerbación de bronquitis crónica y neumonía, sobre todo en pacientes con enfermedad respiratoria subyacente. El género Acinetobacter está compuesto por cocobacilos Gram negativos, oxidasa negativos, no exigentes. Forman colonias lisas, blancas o grisáceas, a veces hemolíticas, similares a las de las enterobacterias. Los miembros de este género habitan en el agua y el suelo, y también forman parte de la flora normal humana de la piel. Estos sitios suelen ser el reservorio de la bacteria en hospitales y causar brotes, en los que el germen se comporta como oportunista. Suelen ser resistentes a múltiples antibióticos y en general afectan a pacientes portadores de tubos endotraqueales, sondas, catéteres, etc. Morfología Las bacterias del género Neisseria son cocos Gram negativos, inmóviles, que se agrupan en pares en diplococos, cuya forma se ha comparado a granos de café. El citoplasma y la ultraestructura son muy similares en N. meningitidis y N. gonorrhoeae y comparten 80% de sus secuencias de bases del ADN. Aunque son Gram negativas, contienen endotoxinas, y ultraestructuralmente tienen una pared celular típica de las bacterias Gram negativas, se parecen a los cocos piógenos en su patogenicidad y su sensibilidad intrínseca a la penicilina. Ambas especies pueden colonizar las mucosas sin causar síntomas. La enfermedad causada por N. gonorrhoeae es, en general, localizada, en cambio N. meningitidis produce enfermedad 292 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA grave, diseminada, muchas veces fatal. Esto podría deberse a que N. meningitidis presenta una cápsula polisacárida bien definida. Ambas especies poseen fimbrias o pili, las cuales han sido relacionadas con la virulencia. Metabolismo Son aerobios, y las especies patógenas son exigentes desde el punto de vista de sus requerimientos nutricionales (agar sangre o agar chocolate), de temperatura (crecen a 37 ºC pero no a 22 ºC) y atmosféricos (atmósfera con 5 a 7 % de CO2). Son oxidasa positivos. Estos requerimientos de cultivo, así como el patrón de utilización de distintos azúcares (en especial glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y fructosa) se utilizan para diferenciar las distintas especies de Neisserias (tabla 1) Tabla 1. N. meningitidis N. gonorrhoeae N. lactamica N. sicca N. mucosa N. subflava N. flavescens M. catarrhalis glucosa + + + + + + - maltosa + + + + + - sacarosa + + V - Lactosa + - DNAasa + M. catarrhalis produce desoxirribonucleasa, lo que permite diferenciarla de Neisseria. Las especies patógenas del género Neisseria son bacterias extremadamente sensibles a las condiciones ambientales adversas, como las temperaturas extremas, cambios de pH y desecación; lo que debe ser tenido en cuenta en la recolección y el transporte de las muestras clínicas al laboratorio. Neisseria meningitidis Este germen causa principalmente meningitis, meningococemia y más raramente otros cuadros clínicos. ESTRUCTURA ANTIGÉNICA La presencia de cápsula esta asociada a la virulencia. Las cepas que colonizan las membranas mucosas sin producir enfermedad en general no son capsuladas. Sobre la base de diferencias antigénicas del polisacárido capsular se han identificado al menos trece serogrupos. Estos son: A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y, y Z. Estos antígenos capsulares pueden ser puestos en evidencia por distintas técnicas (aglutinación de partículas de látex o contrainmunoelectroforesis), ya sea en una cepa aislada, o directamente en el liquido cefalorraquídeo. La mayoría de las enfermedades invasivas son producidas por los serogrupos A, B, C, W135 e Y. Han sido descritas epidemias de meningitis causadas por el serogrupo A, mientras que los grupos B y C causan fundamentalmente enfermedad en forma esporádica o endémica. La estructura de estos polisacáridos ha sido extensamente estudiada y se conoce para la mayoría de los serogrupos. La identificación y purificación de estos antígenos ha dado como resultado la producción de vacunas efectivas para los serogrupos A, C, Y y W135. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 293 El polisacárido capsular del grupo B, por si solo no es inmunogénico. Se han encontrado similitudes antigénicas entre este polisacárido y los de otras bacterias no relacionadas como Escherichia coli K1 (que causa meningitis en el recién nacido). En base a antígenos subcapsulares (proteínas de pared celular) las cepas de N. meningitidis se clasifican a su vez en serotipos, subtipos e inmunotipos. Hay 5 clases de proteínas de membrana externa (OMP, por sus siglas en inglés) mayores, que se designan con cifras del 1 al 5 y que se diferencian por su peso molecular, mapa peptídico y patrón electroforético. El serotipo se basa en reacciones serológicas utilizando anticuerpos monoclonales antiproteína 2 o 3 (una cepa tiene proteína 2 o 3 pero no ambas a la vez). El subtipo se define en diferencias antigénicas de la OMP 1. El inmunotipo se define sobre la base de diferencias antigénicas del lipopolisacárido (LPS). Cada serogrupo contiene cepas con una variedad de tipos, subtipos e inmunotipos; no hay tipos restringidos a un determinado serogrupo. Por ejemplo, a la fecha hay aproximadamente 20 serotipos, 7 subtipos y 8 inmunotipos dentro del serogrupo B; pero hay muchas cepas no tipificables. De acuerdo a una convención, una cepa puede ser designada: B:15:P1.3:L3,8 serogrupo B – serotipo 15 – subtipo 3 – inmunotipo 3 y 8 Estos sistemas se utilizan en laboratorios de referencia con fines epidemiológicos, para caracterizar las cepas que circulan en una comunidad en un determinado momento y para desarrollar vacunas. Otros métodos para tipificar cepas se basan en la movilidad electroforética de enzimas metabólicas producidas por N. meningitidis. Este método, denominado electroforesis de enzimas multilocus, es útil para caracterizar el genoma y agrupar cepas por su relación genética. Existen al menos 78 tipos electroforéticos en esta clasificación. ATRIBUTOS DE VIRULENCIA Polisacárido capsular Parece ser el mayor factor que contribuye a la virulencia. La presencia de cápsula le confiere a la bacteria la capacidad de sobrevivir en el torrente sanguíneo ya que esta impide la fagocitosis; sólo cuando el paciente ha desarrollado anticuerpos anticapsulares específicos la bacteria puede ser opsonizada, esto es lisada con la colaboración del sistema del complemento. Endotoxina Básicamente es similar a otros LPS en su estructura. Se caracteriza por ser un LPS fuertemente inductor del fenómeno de Shwartzman-Sanarelli, con una potencia notablemente superior a la del LPS de otros Gram negativos. Durante el crecimiento de N. meningitidis se liberan al medio grandes cantidades de LPS que dañan al endotelio, causando una importante respuesta inflamatoria y necrosis vascular. Proteasa de IgA Es producida por todos los serogrupos y liberada al medio; es una endopeptidasa con una gran afinidad por la IgA humana. Sustancias quelantes del hierro El hierro es esencial para el metabolismo de la bacteria y ella compite con el huésped por él, por medio de estos factores. 294 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Pili Como es sabido son filamentos proteicos pequeños, que se extienden desde la superficie de la bacteria y cuyo papel es fundamental en la patogenia ya que median la adherencia a las superficies mucosas. Aunque han sido menos estudiados que los pili de N. gonorrhoeae, serían similares en cuanto a su estructura. Median la adherencia de N. menigitidis a la mucosa nasofaríngea y son importantes en la determinación del estado de portador. También ha sido postulado que intervendrían en traspasar la barrera hematoencefálica e interactuar con las meninges. Las bases moleculares de estas interacciones no han sido aún del todo aclaradas, pero parece tratarse de una interacción con un receptor específico tanto en lo anatómico (epitelio nasal anterior) como para la especie humana. PATOGENIA N. meningitidis ingresa a través de las vías aéreas superiores y se establece en la mucosa nasofaríngea. No ha sido aún aclarado como el germen atraviesa la mucosa e ingresa a la circulación. La enfermedad meningocócica es el resultado de la invasión del torrente sanguíneo. Los huéspedes susceptibles son aquellos que carecen de anticuerpos anticapsulares específicos, que son bactericidas. Los individuos con estos anticuerpos específicos (producidos posiblemente como respuesta a la colonización previa por N. meningitidis o bien a antígenos relacionados de otros gérmenes de la flora normal) resisten a la capacidad del germen de invadir el torrente circulatorio. Los anticuerpos son opsoninas y determinan que el germen sea destruido. Una vez en el torrente circulatorio se multiplican y con gran rapidez pueden llegar a concentraciones que están entre las más elevadas que se conocen. El ingreso de N. meningitidis al torrente circulatorio puede llevar a una entidad denominada “púrpura fulminans” con coagulación intravascular diseminada, manifestaciones cutáneas (petequias y equimosis), hipotensión, shock y muerte. La coagulación intravascular diseminada, el shock y la fiebre son respuestas a la endotoxina mediadas por el factor de necrosis tumoral y la interleuquina 1. Así, estos signos son consecuencia directa de la capacidad de N. meningitidis de sobrevivir y multiplicarse en el torrente circulatorio. Los aspectos clínicos serán desarrollados con más detalle en el capítulo de meningitis aguda supurada. DIAGNOSTICO MICROBIOLÓGICO Frente a un cuadro clínico compatible con meningitis se deberá realizar una punción lumbar para obtener datos de la composición citoquímica del liquido cefalorraquídeo (LCR) y para estudio microbiológico. Debe recordarse la labilidad de los gérmenes que causan meningitis y transportar la muestra de inmediato al laboratorio. Una vez en el laboratorio de bacteriología, el LCR será sometido a examen directo, cultivo y detección de antígenos capsulares de los distintos agentes de meningitis. El examen directo con coloración de Gram es sencillo y rápido. Permite una orientación inicial de la terapéutica siempre y cuando lo realice un técnico experimentado. El cultivo se realizara en agar sangre, agar chocolate y medios de enriquecimiento; deben recordarse los requerimientos de atmósfera del germen. A las colonias sospechosas se les realiza coloración de Gram, prueba de oxidasa y pruebas para determinar la utilización de azúcares. El laboratorio puede además realizar la determinación del serogrupo mediante antisueros específicos. SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS La penicilina continúa siendo el tratamiento de elección para la meningitis meningocócica. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 295 Esta droga es bactericida y atraviesa la barrera hematoencefálica. En el momento actual no parece ser necesario realizar estudios de susceptibilidad en forma rutinaria ya que son habitualmente sensibles. Se han descrito raros casos de cepas con alteraciones a nivel de las proteínas fijadoras de penicilina (PBP) que hacen aumentar la concentración inhibitoria mínima a la droga. PROFILAXIS La probabilidad de desarrollar meningitis meningocócica es mucho mayor en sujetos que han estado en contacto con un caso, por ello se administra quimioprofilaxis a los contactos cercanos, para evitar casos secundarios. Esta se realiza con rifampicina por períodos cortos, droga efectiva en eliminar el estado de portador. Vacunas Se dispone de vacunas para los serogrupos A y C que han sido utilizadas en caso de epidemias en diversos países, incluso el nuestro. En Estados Unidos existen vacunas tetravalentes anti A, C, Y y W135. Para esos serogrupos utilizan vacunas preparadas con polisacárido capsular. En general son poco eficaces en menores de dos años. Se estima que esto podría mejorar si se obtienen vacunas conjugadas con proteínas. La vacuna para prevenir la enfermedad por el serogrupo B continúa siendo un problema, ya que el polisacárido capsular es poco inmunógeno y este es el serogrupo que causa la mayor parte de los casos en países desarrollados. Los investigadores han orientado su atención a otros antígenos como las proteínas de membrana externa para estimular la inmunidad. La vacunación está especialmente indicada en: • Niños y adultos con defectos de sus mecanismos de defensa tales como anesplenia o déficit de los componentes terminales del complemento. • Prevención de los casos secundarios al contacto con el paciente. Estos casos secundarios pueden desarrollarse incluso semanas más tarde que el caso índice. • Viajeros a áreas endémicas (N. meningitidis serogrupo A en el África subsahariana, región conocida como “cinturón de la meningitis”). • Epidemias. Debe recordarse que es obligatorio notificar esta enfermedad a las autoridades sanitarias. Neisseria gonorrhoeae Descrito en 1879 por Neisser en pus uretral, es el agente etiológico de la gonorrea. Comparte las características del género en cuanto a la morfología celular. Para aislarlo de mucosas que presentan flora normal (por ejemplo uretra anterior o cuello uterino) se requiere de medios especiales como agar chocolate y antibióticos para inhibir otras bacterias. Existen diversos suplementos de antibióticos, el más conocido es el medio de Thayer-Martin que contiene vancomicina, colistina y nistatina. El resto de los requerimientos de temperatura, humedad y atmósfera, así como las propiedades bioquímicas utilizadas para su identificación son similares a los de N. meningitidis. CARACTERÍSTICAS COLONIALES Luego de 18 a 24 horas de incubación se producen colonias cuyo aspecto puede diferir si se trata de un aislamiento reciente o si se han efectuado sucesivos pasajes in vitro. Se distinguen cuatro formas principales; las colonias T1 y T2 se producen en cultivos primarios y son pe- 296 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA queñas y convexas. Luego de varios subcultivos se obtienen colonias más grandes y aplanadas llamadas T3 y T4. Esto se atribuye a la pérdida de la expresión de los pili. Cualquier tipo de colonia puede diferir también en su opacidad. Esto depende de la presencia en la pared celular de una molécula llamada proteína II. TIPIFICACIÓN DE CEPAS Se dispone de varios métodos para caracterizar cepas de N. gonorrhoeae con fines epidemiológicos. Los más desarrollados son los métodos serológicos y la auxotipificación que pueden usarse por separado o en combinación. También los perfiles de resistencia a antimicrobianos se utilizan con fines epidemiológicos. Los métodos serológicos se basan en diferencias en antígenos de superficie como proteína I o pili, y en general se realizan por técnicas de coaglutinación. Auxotipificación Por el crecimiento de N. gonorrhoeae en medios de cultivo químicamente definidos se han podido conocer las necesidades de ciertos factores de crecimiento, y sobre estas bases se han definido los llamados auxotipos. Estas son características estables de una determinada cepa que se utilizan como marcadores en estudios sobre virulencia, capacidad invasiva y sensibilidad a antimicrobianos. Se ha observado que algunas cepas precisan para su desarrollo la presencia de arginina, hipoxantina y uracilo, lo que se denomina auxotipo AHU o bien Arg-Hyx-Ura. En general este auxotipo se corresponde con cepas muy sensibles a la penicilina y a la vez muy resistentes a la acción bactericida del suero humano normal, dando muchas veces infecciones diseminadas (bacteriemia). Antígenos de superficie y determinantes de patogenicidad Por técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida se separan diversas proteínas de superficie de N. gonorrhoeae. • Pili: son apéndices que emergen como proyecciones desde la superficie de la bacteria. Están constituidos por subunidades proteicas o pilina. Su función es mediar la adherencia de la bacteria a las células del huésped, especialmente a las microvellosidades del epitelio columnar. También le confieren al germen una mayor resistencia a la fagocitosis. N. gonorrhoeae puede variar de fase, es decir, presentar alternativamente formas con pili o sin ellos; en un proceso estrechamente regulado desde el punto de vista genético. Además de esta variación de fases, los pili pueden presentar una importante variación antigénica, esto es, cambios antigénicos en la proteína de los pili expresada. La variación antigénica está determinada por la inserción o deleción de unos pocos residuos de aminoácidos y ocurre a nivel del extremo carboxi terminal de la pilina. Este proceso también está controlado en el cromosoma bacteriano, por diversos genes. La porción variable, terminal, de la pilina es justamente el blanco de la respuesta inmunitaria por lo que la variación antigénica a ese nivel representa un mecanismo de escape para evadir las defensas del huésped. Por su papel fundamental en la patogenia, los pili han sido objeto de múltiples investigaciones como candidatos al desarrollo de vacunas; pero su extremo grado de variabilidad antigénica ha hecho perder el entusiasmo en una vacuna de este tipo. • Proteína I: la mayor de las proteínas de membrana externa, tiene función de porina, formando un canal hidrofílico a través de ella. Es posible que también intervenga en la fagocitosis, paso importante en la patogenia de la gonorrea. A diferencia de otras proteínas de membrana externa de este germen, esta es expresada en forma constante, por lo que ha sido utilizada como sistema para tipificar cepas. Existen dos subclases de TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA • • • • • • • 297 proteína I, denominadas IA y IB. Cada una de ellas tiene decenas de variantes, lo que define serovariedades. Como respuesta a la infección se producen anticuerpos opsonizantes anti-proteína I en suero y secreciones. Estos anticuerpos pueden ser protectores si la reinfección es causada por una cepa con la misma serovariedad de proteína I. Por otra parte, se sabe que las cepas portadoras de proteína I subclase A se asocian más a menudo con enfermedad diseminada y mayor resistencia al poder bactericida del suero humano, en tanto que las cepas IB tienden a producir enfermedad localizada (uretritis, cervicitis) y a ser resistentes a los antibióticos. Proteína II: es una familia de proteínas de membrana externa, que manifiestan una extensa variación antigénica de cepa a cepa e incluso dentro de una misma cepa. Esta proteína no siempre es expresada por la bacteria, cuando está presente, le otorga la capacidad de formar colonias opacas in vitro. Desde el punto de vista funcional, su presencia aumenta la capacidad de adherencia a células epiteliales y a neutrófilos. Proteína III: a diferencia de las anteriores es estable en su composición. Existen proteínas similares en N. meningitidis y en otras bacterias. Es una proteína poco inmunogénica y tiene la capacidad de bloquear anticuerpos dirigidos contra otros antígenos de superficie. Su papel en la patogenia no se comprende aún. La proteína III tiene funciones de porina (al igual que la proteína I) que permite el ingreso a la bacteria de nutrientes de bajo peso molecular por difusión. Adhesinas: se ha postulado la presencia de otras moléculas con capacidad de adhesión, distintas de los pili, pero no han sido bien caracterizadas todavía. Proteínas reguladoras del hierro: son una familia de proteínas que le permiten a la bacteria adquirir el hierro del huésped; por lo tanto, la presencia de este tipo de proteínas representa una ventaja para su supervivencia. Proteasa de IgA: esta proteína cliva la inmunoglobulina A1 humana en la región bisagra, con lo que la inactiva. Se especula que este sería un mecanismo importante para inactivar la Ig A secretoria. Lipooligosacárido (LOS): al igual que en otros gérmenes Gram negativos actúa como endotoxina pero carece de las largas cadenas de polisacáridos que se encuentran en las enterobacterias. Median la mayoría de los efectos tóxicos observables en los modelos experimentales. Como los pili, el LOS presenta variaciones entre diversas cepas y en pasajes sucesivos de una misma cepa. Plásmidos: la mayoría de las cepas presentan un plásmido de 2,6 megadaltons de función no conocida (plásmido críptico). Se han identificado al menos cinco plásmidos diferentes que codifican ß-lactamasas y que se caracterizan por diferencias en su peso molecular. También se ha descrito un plásmido conjugativo que media la resistencia de alto nivel a la tetraciclina (tet M). PATOGENIA DE LA INFECCIÓN POR N. GONORRHOEAE El germen se disemina de persona a persona por contacto directo y estrecho con secreciones infectadas, habitualmente contacto sexual. Afecta en forma selectiva al epitelio no cornificado. La vaginitis no es una manifestación de la gonorrea en la mujer en edad genital activa, pero sí en la etapa prepuberal o posmenopáusica. No está del todo aclarado cómo el germen asciende por la vía genital, se ha postulado que esto estaría favorecido por contracciones uretrales y uterinas, o tal vez vehiculizados por el esperma. Las mucosas producen IgA secretoria que podría ser clivada por la proteasa. Una vez que entra en contacto con la mucosa se producen una serie de complejas interacciones 298 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA moleculares que finalmente determinan la invasión de esas células. Dado que se trata de un patógeno exclusivamente humano hay pocos modelos experimentales animales que permitan aclarar detalles de la patogenia de la enfermedad. Los estudios han sido realizados principalmente en cultivo de tejidos (explantes). Por ejemplo cultivos de trompas de Falopio han sido usados para estudiar la colonización. Dos tipos de células epiteliales se encuentran en este órgano: células ciliadas y no ciliadas. Cuando el germen es incubado en estos explantes, ocurren una serie de eventos: Adhesión a células no ciliadas El primer paso en la infección es la colonización del epitelio columnar. Al igual que otras bacterias, en el proceso de adherencia e invasión intervendrían fenómenos de polimerización de moléculas de actina. Algunos componentes de superficie de N. gonorrhoeae están involucrados en estas etapas iniciales. Los pilis median la adhesión inicial (no estrecha o distante) a las células epiteliales. Cepas mutantes que carecen de ellos, aún son capaces de invadir las células epiteliales, por lo que en esta etapa, seguramente intervienen además otros factores. La familia de proteínas de membrana externa P.II (o también OPA, por opacidad) parecen mediar, al menos en parte, una segunda etapa de adherencia íntima, y contribuir a la invasión. Las proteínas de membrana externa llamadas P.I parecen impedir la unión fagolisosómica en los polimorfonucleares y reducir su metabolismo oxidativo, por lo que determina la capacidad de ciertas cepas de sobrevivir (al menos un pequeño porcentaje de bacterias) dentro de los fagocitos. Endocitosis del germen, disminución progresiva del movimiento ciliar y pérdida de las cilias de las células adyacentes, causada por el lipooligosacárido Las células no ciliadas engloban a las bacterias por medio de seudópodos. Esta fagocitosis, llevada a cabo por fagocitos “no profesionales” se conoce como endocitosis dirigida por el parásito. Las células ciliadas mueren y son selectivamente eliminadas de la superficie del epitelio. Esta etapa no requiere de la presencia del germen intacto y puede ser reproducida solamente con el LOS o fragmentos de peptidoglicano. El LOS desencadena la respuesta inflamatoria, con gran liberación de factor de necrosis tumoral α (TNFα), el cual a su vez determina la escarificación del epitelio de las trompas de Falopio. Probablemente el LOS sea el responsable de la mayoría de los síntomas de la gonorrea. Esta molécula contribuye a la resistencia al suero y a una mayor capacidad de producir enfermedad sistémica (probablemente debido a una menor capacidad de activar el complemento). Transporte de la bacteria a través de la célula epitelial Las bacterias son transportadas en una vacuola de endocitosis, dentro de la cual aún pueden replicarse y se acentúan los procesos de citotoxicidad determinados por el LOS. Dentro de la vacuola el germen se halla protegido de los macrófagos, de los anticuerpos y de los antimicrobianos. Liberación del germen al espacio subepitelial Las bacterias son transportadas hacia el sector basal de la célula, las vacuolas se fusionan con la membrana basal y descargan los gérmenes en el tejido conectivo subepitelial. Allí causan inflamación local como consecuencia de lo cual, se produce un exudado, rico en polimorfonucleares y que contiene numerosas bacterias intra y extracelulares. Eventualmente ingresan a los vasos sanguíneos para dar la forma diseminada de la enfermedad. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 299 Sobrevida de N. gonorrhoeae en el torrente circulatorio El suero humano normal tiene la capacidad de destruir bacterias Gram negativas circulantes, a diferencia de las Gram positivas que son resistentes a ese poder bactericida. Este efecto depende fundamentalmente de la presencia del complemento y no se requieren anticuerpos específicos. Las cepas de N. gonorrhoeae que se asocian a la forma diseminada de la enfermedad suelen ser más resistentes al poder bactericida del suero humano normal. Esto probablemente sea debido al agregado de residuos de ácido siálico a nivel de la pared del germen. El ácido siálico es un componente de la superficie de muchas células humanas, inclusive eritrocitos, y se cree que la presencia de éste en la superficie de la bacteria enmascararía a los antígenos responsables de desencadenar la lisis bacteriana. CLÍNICA El espectro de manifestaciones clínicas comprende desde infecciones localizadas en el aparato genitourinario (uretritis, cervicitis), infecciones locorregionales (enfermedad inflamatoria pélvica, epididimitis), hasta la enfermedad diseminada, con invasión del torrente sanguíneo y eventualmente, invasión de órganos a distancia. Estos aspectos serán tratados más extensamente en el capítulo correspondiente. Uretritis y cervicitis Son las manifestaciones más comunes de la gonorrea. En el hombre se manifiesta por disuria y corrimiento uretral purulento, luego de un período de incubación de 2 a 5 días. En la mujer la sintomatología suele ser mucho menos específica y, de estar presente, se traduce en flujo cervical purulento, disuria; más raramente absceso de las glándulas de Bartholino. Orquiepididimitis En el hombre el dolor y edema a nivel de testículo y epidídimo reflejan el compromiso de éstos órganos. Enfermedad inflamatoria pélvica Es determinada por la progresión de la infección al aparato genital alto (endometrio, trompas, peritoneo). Está entidad puede responder a otras etiologías (Chlamydia trachomatis, infecciones por flora mixta proveniente de la vagina). La inflamación de la mucosa tubaria y posterior cicatrización puede determinar una obstrucción permanente de la luz, con las consiguientes secuelas: infertilidad y embarazo ectópico. Proctitis Se caracteriza por dolor, tenesmo, sangrado y exudado, a veces con producción de abscesos rectales o perianales. Faringitis Es habitualmente asintomática. Conjuntivitis Es adquirida por el recién nacido al pasar por el canal del parto (oftalmía neonatorum); aunque puede verse a otras edades. Sin tratamiento, puede conducir a la ceguera. Su incidencia se ha reducido en forma notable con la instilación profiláctica y obligatoria de gotas de nitrato 300 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA de plata (credé) en la conjuntiva de todos los recién nacidos u otros compuestos antimicrobianos. Enfermedad gonocócica diseminada Es complicación que se registra con una frecuencia menor al 1% de los casos de gonorrea. Es más frecuente en mujeres y, como ya se mencionó, es causada por cepas pertenecientes al auxotipo AHU. Las manifestaciones incluyen monoartritis, tenosinovitis, fiebre y lesiones de piel (máculas o pústulas, hemorrágicas o necróticas) que afectan sobre todo extremidades y son debidas a arteritis séptica. Más raramente se produce meningitis, pericarditis o endocarditis. Portadores asintomáticos Un porcentaje no desdeñable de individuos que entran en contacto con N. gonorrhoeae, especialmente mujeres, desarrollan una infección asintomática. Como se comprenderá estos portadores asintomáticos representan un reservorio importante de la enfermedad. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO El examen directo de las secreciones uretrales con coloración de Gram es muy sensible y específico para el diagnóstico de uretritis gonocócica. Permite observar un exudado con abundantes polimorfonucleares y diplococos Gram negativos intra y extraleucocitarios. Su valor es menor en otras localizaciones. El cultivo es indispensable para realizar las pruebas bioquímicas de identificación y estudios de susceptibilidad. La inoculación en medios de cultivo, una vez obtenida la muestra, debe hacerse en forma inmediata o utilizar medios de transporte que aseguren la viabilidad del germen. Las muestras provenientes de las mucosas deberán ser sembradas en medios selectivos ya mencionados, para inhibir la flora normal. Las muestras de sectores del organismo habitualmente estériles (sangre, líquido sinovial, etc.) son sembradas en agar chocolate. Una vez obtenidas las colonias se identifican por su morfología con la coloración de Gram, reacción positiva de oxidasa y utilización de azúcares. SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS Si bien la penicilina fue la droga de elección para el tratamiento de la gonorrea por muchos años, en el momento actual, la alta prevalencia de cepas resistentes determina que esta droga no pueda ser utilizada para el tratamiento empírico de la enfermedad. La resistencia a los antimicrobianos puede deberse a múltiples mecanismos y ser: • plasmídica: debida a la presencia de ß-lactamasas en especial tipo TEM 1. Este tipo de resistencia puede ser detectada en el laboratorio por técnicas rápidas como por ejemplo mediante el uso de una cefalosporina cromógenica. La resistencia a la tetraciclina también es codificada por un plásmido (tet M). • cromosómica: que puede deberse tanto a una disminución de la afinidad de las proteínas fijadoras de penicilina (PBP) por la droga, como a una alteración en la permeabilidad de las porinas de la membrana externa de la bacteria. Esta resistencia requiere de otros estudios de susceptibilidad para ser detectada. Una cepa puede combinar más de un mecanismo de resistencia. También ha sido descrita la resistencia cromosómica para otras drogas, como por ejemplo tetraciclinas y espectinomicina. Las drogas recomendadas en el momento actual son ceftriaxona, azitromicina y ciprofloxacina, aunque ya se han comunicado resistencias, al menos in vitro. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 301 Para el tratamiento, además de la susceptibilidad del germen, se deben considerar factores tales como sitio anatómico afectado, presencia de complicaciones y posibilidad de otros patógenos asociados. Los planes terapéuticos recomendados para cada caso se tratarán en otro capítulo. PROFILAXIS Y POSIBLES CANDIDATOS AL DESARROLLO DE VACUNAS Muchos de los antígenos de superficie antes mencionados resultan atractivos para desarrollar vacunas que prevengan la adherencia y colonización de las células epiteliales del huésped. Desde hace tiempo se sabe que los pacientes que padecen gonorrea pueden experimentar reinfecciones y que una infección pasada determina una respuesta inmune vigorosa (sobre todo de anticuerpos), pero que no confiere protección frente a nuevas infecciones. Tanto los pilis como otras proteínas de superficie se hallan regulados por complejos mecanismos genéticos que, como ya se dijo, le otorgan a la bacteria la posibilidad de controlar la presencia o ausencia de esas moléculas (variación de fases), o controlar su composición (variación genética). La razón por la que una persona no desarrolla una respuesta protectora a la reinfección probablemente sea que N. gonorrhoeae es capaz de variar sus antígenos de superficie, especialmente la pilina. Para el caso de esta proteína la bacteria tiene un repertorio antigénico que puede ser tan grande como un millón de variantes antigénicas diferentes. Actualmente se trata de buscar antígenos de superficie altamente conservados. El desarrollo de una vacuna contra gonorrea probablemente sea uno de los mayores desafíos que enfrentan los investigadores. En tanto no se disponga de una vacuna los esfuerzos para prevenir la enfermedad deben basarse en: • diagnóstico precoz y tratamiento adecuado; • notificación de los contactos; debe recordarse que se trata de una enfermedad de denuncia obligatoria al Ministerio de Salud Pública; • promover, a nivel de salud pública, la educación que lleve a modificaciones en las conductas sexuales; • uso de colirio en todo recién nacido para prevenir la enfermedad ocular (obligatorio por ley). Haemophilus Los miembros del género Haemophilus son bacilos Gram negativos, pequeños y pleomórficos. Integran la flora normal de las mucosas del aparato respiratorio superior. La mayoría de las especies son no patógenas o oportunistas, aunque algunas de esas especies son patógenos primarios como H. influenzae, H. aegyptius y H. ducreyi. Haemophilus influenzae es la especie tipo y puede causar enfermedades graves, invasivas. En esta especie existen cepas capsuladas y no capsuladas. El antígeno capsular permite distinguir seis serotipos que se designan con letras de la a hasta la f. Antes que se dispusiera de una vacuna eficaz, H. influenzae serotipo b era una de las causas más importantes de meningitis y neumonía bacteriana en niños. CLASIFICACIÓN El género Haemophilus pertenece a la familia Pasteurellaceae, bacilos Gram negativos exigentes desde el punto de vista nutricional. Estos gérmenes requieren para su desarrollo de uno o dos factores, llamados V (NAD) y X (hemina o protoporfirina), presentes en la sangre. El 302 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA factor X es la protoporfirina IX para gérmenes que poseen una enzima quelante del hierro (como H. influenzae), o la hemina para gérmenes que no la poseen (como H. aegyptius). Los microorganismos que requieren de factor V no crecen en agar sangre convencional. El factor V puede ser agregado al medio o proporcionado por otro microorganismo que crezca en su proximidad (por ej. una colonia de Staphylococcus). Este crecimiento alrededor de una colonia que le proporciona factores de crecimiento se denomina “satelitismo” y no es exclusivo de Haemophilus, sino también de ciertos Streptococcus. IDENTIFICACIÓN Se hace sobre la base del aspecto en coloración de Gram, requerimientos de factor X y V, presencia o no de hemólisis, utilización de hidratos de carbono, y la producción de indol, ureasa y decarboxilasa de la ornitina. Estos tres últimos sirven para diferenciar biotipos de H. influenzae. La tipificación de las cepas capsuladas de H. influenzae se realiza con sueros específicos contra los seis serotipos existentes. Haemophilus influenzae MECANISMOS DE VIRULENCIA El mayor determinante de virulencia es, claramente, el polisacárido capsular, que le confiere a la bacteria resistencia a la fagocitosis. Para el caso del serotipo b es un polímero de ribosil ribosa fosfato. Este antígeno, como otros polisacáridos, no es procesado por el sistema inmune a través de las células T, sino por una vía independiente de ellas. La capacidad de generar esta respuesta inmune no está desarrollada en niños de menos de 18 meses. Las vacunas recientes han convertido a este antígeno en T dependiente por medio de su unión o conjugación a proteínas. Estas vacunas conjugadas provocan respuesta aun en lactantes pequeños. Otros posibles factores de virulencia son los pili, se ha demostrado que ciertas clases de pili permitirían la adherencia a células epiteliales, etapa fundamental en la colonización. PATOGENIA H. influenzae es una bacteria muy adaptada al ser humano. Desde los primeros meses de vida puede ser encontrada colonizando las mucosas del tracto respiratorio superior; en general se trata de cepas no capsuladas o de serotipos distintos del b. La enfermedad por H. influenzae tipo b es desarrollada sólo por un pequeño porcentaje de niños que entran en contacto con enfermos o portadores. La inmunidad natural frente al serotipo b se adquiere a medida que aumenta la edad. Muchas bacterias de la flora normal poseen epítopes que reaccionan en forma cruzada con el antígeno capsular b. El germen ingresa por el epitelio de la vía aérea superior; la bacteria tiene la capacidad de invadirlo. Una vez allí, dependiendo de factores del huésped y probablemente de su virulencia, puede producir enfermedades confinadas a las mucosas, o no invasivas, o bien enfermedades invasivas, graves. En la submucosa se produce una respuesta inflamatoria que a nivel del árbol respiratorio da como resultado bronquitis o neumonía. En algunos niños la bacteria invade la laringe causando inflamación y edema de las distintas estructuras, comprometiendo la vía aérea, lo que se denomina epiglotitis. La meningitis es el resultado de la invasión del torrente circulatorio y del espacio subaracnoideo. Los gérmenes sobreviven en la sangre en tanto no aparezcan anticuerpos anticapsulares específicos. Estos anticuerpos son opsoninas y hacen que la bacteria sea destruida por macrófagos. Los individuos que carecen TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 303 de bazo se hallan especialmente predispuestos a desarrollar enfermedades severas por esa y otras bacterias capsuladas. Una vez en la sangre los gérmenes llegan a las meninges por las arterias cerebrales. Inicialmente hay inflamación de los plexos coroideos. Estos plexos están altamente vascularizados, ya que es a ese nivel que se produce el LCR, y es por ello el sitio más lógico para atravesar la barrera hematoencefálica. El daño que causa H. influenzae tipo b a nivel local le permite ingresar al LCR, primero en los ventrículos laterales y luego en la cisterna magna. El LCR se llena de un exudado inflamatorio y la obstrucción al flujo determina un aumento de la presión intracraneana que se traduce clínicamente por cefalea, vómitos y depresión de la conciencia. La fagocitosis da como resultado la liberación de endotoxina y otros compuestos que aumentan aún más la respuesta inflamatoria. La endotoxina es la responsable de la fiebre, coagulación intravascular diseminada y tal vez otros fenómenos. H. influenzae tipo b, en forma característica, determina un daño mayor que otros gérmenes, con mayor porcentaje de niños que desarrollan secuelas tales como sordera, hidrocefalia obstructiva, ceguera y retraso mental. Los cuadros clínicos ocasionados por H. influenzae de otros serotipos capsulares o no tipificables son otitis media, sinusitis, conjuntivitis, etc. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Las muestras deberán ser enviadas de inmediato al laboratorio y procesadas en él lo más pronto posible. Para el aislamiento debe incluirse la siembra en agar chocolate suplementado con factores X y V. La identificación del germen se basa en sus requerimientos nutricionales, la coloración de Gram de la colonia aislada, presencia de hemólisis y los requerimientos de factores X y V para diferenciar las especies más frecuentes. Los aislamientos son identificados mediante diversas pruebas bioquímicas, determinación de biotipos y serotipificación. SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS Debido a que surgieron cepas productoras de ß-lactamasas capaces de inactivar la ampicilina, esta droga ha dejado de ser de elección para el tratamiento de la enfermedad grave por H. influenzae. También para este germen se ha descrito la resistencia a los ß-lactámicos debida a proteínas fijadoras de penicilina con baja afinidad. Otra droga que se utilizó (asociada a la ampicilina) fue el cloranfenicol, que atraviesa bien la barrera hematoencefálica y es bactericida para este germen; pero luego fueron reportadas cepas productoras de una enzima (cloranfenicol acetil transferasa) que lo inactiva; lo que determinó nuevamente cambios en los planes terapéuticos. Actualmente, para el tratamiento de las infecciones graves por esta bacteria, se recomienda ceftriaxona o cefotaxime que no son hidrolizados por la ß-lactamasa de H. influenzae. Para infecciones respiratorias se emplean además combinaciones de ampicilina con inhibidores de las ß-lactamasas. En el laboratorio, las cepas resistentes a ampicilina pueden ser detectadas mediante prueba de betalactamasas. El antibiograma por disco-difusión para Haemophilus es una adaptación de la técnica de Kirby Bauer a las exigencias del germen, y es necesario para detectar resistencia a otras drogas y mecanismos distintos a la producción de ß-lactamasas. PROFILAXIS, VACUNAS Actualmente en nuestro país es obligatoria la vacunación de lactantes y niños pequeños con vacuna anti H. influenzae tipo b. Son vacunas compuestas por polisacárido capsular (polímero 304 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA de ribosil ribosa fosfato) conjugado a proteína (por ej. toxoide diftérico o tetánico). Se administran integradas al esquema de vacunación a los 2, 4 y 6 meses, y al año de edad. A los contactos susceptibles (niños menores de 4 años, no vacunados) de pacientes con meningitis, se debe administrar quimioprofilaxis para prevenir la aparición de casos secundarios. En este caso la droga utilizada es rifampicina. Persiste el problema de hallar una vacuna para cepas de Haemophilus distintas al serotipo b, que causan enfermedades muy frecuentes, como otitis o sinusitis. Haemophilus aegyptius Tradicionalmente asociado a conjuntivitis aguda en países de clima cálido, en los años 80 fue sindicado como el agente de una nueva entidad, la fiebre purpúrica brasilera. Esta es una enfermedad grave que afecta sobre todo a niños y que cursa con conjuntivitis, fiebre, petequias, púrpura, shock y muerte, hasta en el 70% de los casos. Las cepas responsables de este cuadro clínico se distinguen de otras de la misma especie por la presencia de ciertas proteínas de membrana externa y perfiles plasmídicos. Haemophilus ducreyi Es el agente del chancro blando, enfermedad de transmisión sexual que cursa con úlcera genital no indurada y adenopatías inguinales. No se observa en nuestro país. Bordetella El género Bordetella comprende tres especies. B. pertussis es el agente de la tos convulsa o pertusis; B. parapertussis y B. bronchiseptica causan enfermedad con menor frecuencia. Bordetella pertussis MORFOLOGÍA Y METABOLISMO Son bacilos Gram negativos cortos, ocasionalmente presentan formas filamentosas, y son capsulados. Presentan gránulos metacromáticos bipolares al ser teñidos con azul de toluidina. Son exigentes, especialmente en cultivos de aislamiento inicial; su desarrollo se logra en medios suplementados con agar sangre, papa, glicerol y carbón activado (Bordet Gengou). Para el aislamiento a partir de muestras clínicas se agrega penicilina para inhibir la flora orofaríngea. Como otros gérmenes exigentes, son muy sensibles a las temperaturas extremas y a la desecación. La incubación se lleva a cabo a 35 ºC durante 3 a 7 días en ambiente húmedo, luego de lo cual las colonias se hacen visibles presentando un aspecto de “gotas de mercurio”. La hemólisis es característica de las cepas virulentas. Es un germen aerobio estricto. No requiere de factores V ni X. Desde el punto de vista metabólico son relativamente inactivos: no fermentan prácticamente azúcares, no reducen nitratos, no producen indol, no poseen ureasa ni utilizan el citrato como fuente única de carbono. VARIACIÓN DE FASES Las cepas recién aisladas, virulentas, producen colonias lisas o en fase I, que al ser sometidas a sucesivos pasajes in vitro experimentan variación de fase hacia formas no virulentas (fases II y III) o avirulentas, no productoras de toxina y rugosas (fase IV). TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 305 PATOGENIA La patogenia de la tos convulsa no ha sido aún bien aclarada; las investigaciones en esta área, destinadas al desarrollo de una nueva vacuna, han llevado al conocimiento de diversos factores de virulencia tales como: toxina de Pertussis, adenilato ciclasa extracelular, hemaglutinina filamentosa, toxina dermonecrótica, citotoxina traqueal y hemolisina. Adherencia B. pertussis se caracteriza por una predilección por el epitelio respiratorio ciliado, produce múltiples adhesinas que median la unión a los cultivos a células de mamíferos y que le permiten adherirse de forma específica al epitelio respiratorio. De éstas las más estudiadas son: la fitohemaglutinina (hemaglutinina filamentosa o Fha) y la toxina de Pertussis. • Fitohemaglutinina (Fha): es una proteína de alto peso molecular que forma estructuras filamentosas en la superficie de las células; aunque carecen de la organización de los pilis. Su nombre deriva de que aglutinan eritrocitos. Esta hemaglutinina se une a residuos de galactosa de glucolípidos sulfatados. Las células ciliadas presentan en sus membranas grandes niveles de estas sustancias, denominadas sulfátidos y esto puede explicar en parte la preferencia de B. pertussis en adherirse a ellas. • Toxina de Pertussis (Ptx): también llamada factor promotor de linfocitosis, esta toxina puede actuar como toxina y como adhesina. La Ptx es una proteína (exotoxina) hexamérica, pequeñas cantidades de ella pueden ser liberadas al medio, pero la mayoría permanece unida a la superficie bacteriana. Esta toxina es sin duda el mayor factor de virulencia. Es una proteína del tipo A-B cuya estructura hexamérica es similar a la de la toxina del cólera (aunque no idéntica), con una subunidad enzimática (S1) y 5 subunidades de unión (S2, S3, dos copias de S4 y S5). La subunidad S1 cataliza (al igual que la toxina colérica) la ribosilación del ADP de la célula del huésped a nivel de una proteína G, lo que determina finalmente un aumento del nivel del AMP cíclico. Esta aumenta los niveles de Gi activado. La proteína Gi pertenece a una familia de proteínas que regulan la actividad de la adenilato ciclasa de la célula eucariota. A diferencia de la toxina colérica, que actuando sobre la proteína Gs estimula la adenilato ciclasa, la toxina de Pertussis inhibe la desactivación de la adenilato ciclasa una vez que esta ha sido estimulada, actuando sobre Gi. Como se nota, a pesar de las similitudes estructurales con la toxina colérica, los cuadros clínicos que producen estas enfermedades son muy diferentes; lo que probablemente se vincule con el hecho de que estas bacterias tienen especificidad por distintos tipos de células. Ptx es responsable del aumento de las secreciones respiratorias y la producción exagerada de mucus que se observa en la tos convulsa. También se la ha responsabilizado de la encefalopatía que puede ser vista en los casos de enfermedad severa. Esta toxina puede además sensibilizar a la histamina, activar a las células de los islotes del páncreas y causar la tos paroxística que se ve en las primeras etapas de la enfermedad. • Adenilato ciclasa invasiva: B. pertussis produce una toxina que es capaz de producir AMP cíclico directamente, determinando una desregulación en la célula del huésped. Las cepas mutantes que carecen de esta toxina son avirulentas, aunque conservan la capacidad de colonizar las mucosas. Esto indica que esta toxina tiene un importante papel en los estadios tardíos de la enfermedad. Lipopolisacárido Este germen es capaz de producir al menos dos tipos de LPS. Las dos moléculas difieren a nivel del lípido A y en porciones de las cadenas de carbohidratos. Al igual que otros LPS, 306 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA activa el complemento y estimula la liberación de citoquinas. Probablemente también sea el responsable de algunos efectos secundarios de la vacuna. CUADRO CLÍNICO La tos convulsa o pertusis es una enfermedad severa de la infancia. Es sumamente contagiosa entre niños susceptibles. Entre sus manifestaciones locales se encuentran la bronquitis, con gran aumento de las secreciones respiratorias; éstas están compuestas por células epiteliales muertas, desprendidas de la mucosa respiratoria, células inflamatorias y bacterias. El flujo mucociliar está alterado por el daño de las células ciliadas y, debido a la sensibilización de los receptores de la tos, esta se desencadena fácilmente, en violentos accesos que le dan nombre a la enfermedad. La tos convulsa tiene además manifestaciones sistémicas como fiebre moderada y linfocitosis. Se ha estimado que alrededor del 20% de los casos son enfermedades atípicas, y esos pacientes son capaces de contagiar a otros individuos susceptibles. Después de la inhalación de gotitas infectadas, los gérmenes colonizan el tracto respiratorio. El período de incubación dura entre 5 y 21 días. En forma clásica se diferencian tres etapas en el curso de la enfermedad: • La etapa catarral o prodrómica dura 1 a 2 semanas; se trata de un cuadro clínico de infección inespecífica del aparato respiratorio superior. • La segunda etapa dura entre 1 y 6 semanas, y se caracteriza por la progresión hacia la tos paroxística. En cada episodio de paroxismo, el niño presenta entre 5 y 20 accesos de tos seca, forzada, emetizante. El paciente no tiene tiempo de respirar entre los diferentes accesos y puede ocurrir hipoxia. La inspiración final tiene lugar a través de la glotis estrechada, lo que produce un estridor característico. La ingestión de alimentos puede precipitar episodios de tos e impedir la adecuada alimentación. • La tercera etapa es la de convalecencia. La tos puede persistir durante varios meses y su curso no se altera con la administración de antibióticos. Es una enfermedad potencialmente mortal en lactantes con enfermedades cardíacas o respiratorias subyacentes, y puede ocasionar manifestaciones y secuelas neurológicas debido a la hipoxia. DIAGNÓSTICO La tos convulsa es una enfermedad que, en países donde se aplica la vacuna DPT (ver mas adelante), puede presentarse en forma atípica; por lo tanto se requiere alta sospecha clínica para establecer el diagnóstico. Incluso con cuadros clínicos muy característicos otros agentes infecciosos pueden producir síndromes similares. Paraclínica Los estadios tempranos de la enfermedad frecuentemente se asocian con una leucocitosis de 12000 a 20000 por mm3 con 60% de linfocitos. El diagnóstico etiológico definitivo se establece al aislar el germen del paciente; lo que se logra sobre todo al inicio del período catarral. Habitualmente el aislamiento del germen no se realiza en forma rutinaria en laboratorios clínicos debido a que el diagnóstico suele ser tardío, con la aparición de la tos paroxística el germen ya no se aísla de las vías respiratorias. La muestra apropiada es la extraída de la nasofaringe. El aislamiento del germen depende de un cuidadoso transporte y procesamiento en medios adecuados. Para la identificación se realizan pruebas bioquímicas y serológicas, con antisueros específicos. Para el diagnóstico rápido también puede utilizarse la inmunofluorescencia directa. Esta técnica puede emplearse además para la identificación de las cepas aisladas. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 307 SENSIBILIDAD DE BORDETELLA A LOS ANTIMICROBIANOS Eritromicina es la droga de elección para el tratamiento de la tos convulsa cuando éste esta indicado, aunque estudios in vitro indican que el germen es sensible a una amplia gama de agentes. Los antibióticos, en la segunda etapa de la tos convulsa no modifican los síntomas ni acortan la enfermedad, solamente disminuirían la diseminación y el contagio. Esto destaca la importancia de la profilaxis a través de la vacunación. INMUNIDAD La protección contra nuevas infecciones no se correlaciona bien con los niveles de anticuerpos. En la inmunidad probablemente estén involucrados además mecanismos celulares como las células T citotóxicas. Apoyan esta teoría el hecho de que este tipo de mecanismos se ven en gérmenes con fases de vida intracelular y que B. pertussis es capaz de sobrevivir en ciertas líneas celulares derivadas de macrófagos. Debido a ello se ha postulado la existencia de una fase de crecimiento intracelular de este germen que, además de estos hechos, explicaría la persistencia del mismo en el huésped y el establecimiento del estado de portador. VACUNAS La vacuna DPT, que se administra a los lactantes, consiste en gérmenes enteros muertos, junto con los toxoides tetánico y diftérico. Ciertos efectos secundarios indeseables de esta vacuna están determinados por el componente pertusis y no por los otros (tetánico o diftérico). Estos efectos secundarios son poco frecuentes, y se los puede agrupar en tres tipos: • Fiebre, malestar general y dolor a nivel del sitio de inyección, son los más frecuentes y se atribuyen a la reacción inflamatoria provocada por el lipopolisacárido de la pared celular y otras sustancias. • Convulsiones en aproximadamente 1 de cada 2000 niños vacunados; por ello la vacuna no se recomienda para niños con antecedentes de convulsiones. • Con una frecuencia muchísimo menor se producen enfermedades neurológicas severas, como encefalopatía; tal vez con una tasa de incidencia similar a la de poblaciones no vacunadas. La morbilidad por la enfermedad prolongada, la necesidad de hospitalización y la posibilidad de secuelas hacen comprender que los riesgos de la inmunización son mucho menores que los asociados a la enfermedad natural. La vacuna a células enteras contiene diversos antígenos Ptx, FHA, LPS, y aglutinógenos. Los niños vacunados con vacunas a células enteras muestran un aumento en los niveles de anticuerpos anti FHA, Ptx, LPS, aglutinógenos y proteínas de membrana externa. También se incrementan los títulos neutralizantes, sobre todo luego de tres dosis. Se han ensayado diversas vacunas acelulares; una de las más conocidas es la desarrollada en Japón. Es una vacuna que contiene diversos antígenos FHA, aglutinógenos y toxoide pertusis. Su eficacia es similar a la vacuna a células enteras; alrededor del 78%. No está desprovista de efectos secundarios, si bien son más leves. Se necesita adquirir más conocimientos acerca de epítopes que puedan ser útiles para desarrollar una vacuna acelular que no tenga efectos indeseables y cuyo costo permita usarla, aun en países subdesarrollados. Brucella Los integrantes del género Brucella producen enfermedad fundamentalmente en animales y ocasionalmente en humanos. Son parásitos intracelulares facultativos, con poca actividad metabólica. Se han descrito distintas especies que en ciertos casos presentan una adaptación 308 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA marcada por los distintos huéspedes. Brucella abortus infecta sobre todo a bovinos, B. suis al ganado porcino, B. melitensis a cabras y B. canis a perros. De estas especies las tres primeras son transmisibles al hombre, siendo B. abortus y B. suis las que causarían enfermedad en nuestro medio. En el hombre, la brucelosis se caracteriza por presentar una fase bacteriémica aguda, seguida de una etapa crónica que puede durar años y que afecta diversos parénquimas. MORFOLOGÍA Y METABOLISMO Son cocobacilos pequeños de 1,2µ de longitud, Gram negativos, pero que a veces se tiñen de manera irregular. Son aerobios, inmóviles y no esporulados. Pueden tener cápsula. Al igual que otros parásitos intracelulares tienen necesidades nutricionales complejas. Para su desarrollo se requieren medios enriquecidos, como TSA agar soya-tripticasa con sangre. Son capnófilas. En medios sólidos, las colonias se desarrollan lentamente, haciéndose visibles en 3 a 5 días. Las cepas capsuladas dan colonias mucoides que se asocian a la virulencia. In vitro, con pasajes sucesivos las colonias se tornan rugosas, avirulentas. En medios líquidos pueden no desarrollar turbidez, por lo que cuando se estudian hemocultivos se recomienda hacer subcultivos sistemáticos a ciegas, por ejemplo, a los 2, 7 y 14 días. El medio de Castañeda utilizado para el cultivo de Brucella contiene a la vez un medio sólido y caldo en el mismo frasco (bifásico) que permite la observación directa de las colonias. Brucella utiliza hidratos de carbono pero no producen grandes cantidades de ácido ni gas como para ser utilizados en su identificación. Pueden ser oxidasa y catalasa positiva, producir sulfuro de hidrógeno y reducir nitratos a nitritos. Son sensibles a la acción del calor (mueren al pasteurizar la leche) y a pH ácido. La diferenciación entre las especies se hace sobre la base de la especificidad de huésped, la sensibilidad a colorantes, la producción de sulfhídrico, presencia de ureasa y requerimientos de CO2. Dentro de cada especie existen biotipos. La identificación y biotipificación en general se reserva a laboratorios de referencia. HUÉSPED Existe cierta especificidad de huésped. En estos animales, se ha descrito la presencia de sustancias (una globulina y una lipoproteína) que suprimen el crecimiento de las variantes rugosas y por lo tanto favorecen la expresión de cepas lisas, virulentas. Los animales resistentes carecen de estas sustancias, de modo que en ellos ocurre un pasaje hacia formas rugosas. ESTRUCTURA ANTIGÉNICA Dos antígenos denominados A y M se encuentran en distinta proporción en las cuatro especies, por lo que existen reacciones cruzadas en las pruebas serológicas. Poseen además un antígeno de superficie denominado antígeno L, similar al antígeno Vi de Salmonella. PATOGENIA Si bien cada especie tiene un huésped principal, cualquiera de las especies puede infectar gran variedad de animales y al hombre. La puerta de entrada es a través de las mucosas o la piel. Una de las más comunes es el ingreso a través del aparato digestivo por la ingestión de leche no pasteurizada o sus derivados. El contacto de la piel con tejidos de animales infectados o la inoculación accidental con vacunas son otros factores que deben ser investigados. Desde la puerta de entrada y por vía linfática, los gérmenes llegan al conducto torácico y de allí a la circulación general que los distribuye por los diferentes órganos. Los sitios más afectados son TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 309 el tejido linfático, hígado, bazo, médula ósea y sistema reticuloendotelial. En esos lugares se producen nódulos granulomatosos que pueden evolucionar a la abscedación. Más raramente ocurre osteomielitis, meningitis o colecistitis. La anatomía patológica muestra granulomas, constituidos por células epitelioides y células gigantes, con zonas de necrosis central y fibrosis periférica. CLÍNICA En el ganado Brucella causa placentitis y aborto. Esto se ha vinculado a la presencia en las membranas fetales animales de eritrol, factor de crecimiento para el germen. La placenta humana no contiene eritrol y el aborto no es parte del cuadro clínico de la brucelosis humana. Cuadro clínico en el hombre Las cuatro especies tienden a producir cuadros clínicos de diferente gravedad. Así B. canis y B. abortus causan cuadros más leves, sin complicaciones supurativas. La infección por B. suis tiende a evolucionar a la cronicidad, con gran producción de focos de caseum y tendencia a la supuración. La infección por B. melitensis (Fiebre de Malta) causa cuadros más graves. Luego de un período de incubación de una a seis semanas, en forma insidiosa o repentina se inicia la enfermedad, con fiebre, astenia marcada, mialgias, artralgias, sudoración, a lo que se agregan adenopatías, esplenomegalia y, raramente, ictericia. En esta etapa los cultivos son positivos, si el paciente no ha recibido antibióticos. Los síntomas ceden en semanas o meses y las lesiones localizadas prosiguen su evolución. Luego de la etapa aguda puede desarrollarse una etapa crónica con astenia, artralgias, mialgias y otros síntomas. A veces se producen complicaciones serias tales como encefalitis, meningitis, neuritis periférica, espondilitis, artritis supurativa y endocarditis. En esta etapa los cultivos son negativos y puede ser difícil establecer el diagnóstico. El título de anticuerpos puede ser alto. DIAGNÓSTICO En el hombre, el diagnóstico de brucelosis se basa en la sintomatología, los antecedentes epidemiológicos y debe ser siempre confirmado en el laboratorio. Este diagnóstico se establece con certeza al aislar el germen. Siempre se deben realizar hemocultivos en casos sospechosos. También se puede aislar el germen de sitios como médula ósea, hígado, bazo, o LCR, dependiendo del curso de la enfermedad. Debe trasmitirse al laboratorio la sospecha de brucelosis, no sólo porque se requieren técnicas y procedimientos especiales para aislar el germen, sino porque las muestras deben ser manipuladas con ciertas normas de bioseguridad (nivel de bioseguridad 3) ya que se han reportado casos de transmisión por aerosoles al personal del laboratorio. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Se dispone de test de aglutinación usando antígenos de B. abortus que detectan anticuerpos circulantes (tanto IgG como IgM) contra B. abortus, B. melitensis y B. suis. Las muestras de suero deben ser obtenidas lo antes posible, al inicio de la enfermedad, y una segunda muestra a las 2 ó 3 semanas de evolución. Anticuerpos tipo IgM se producen al inicio de la enfermedad, pero también en la etapa de cronicidad. La presencia de anticuerpos puede ser puesta en evidencia por técnicas de aglutinación, la prueba de Rosa de Bengala, inmunofluorescencia indirecta y otras. Títulos de 1:320 o más, y títulos crecientes en muestras sucesivas, permiten establecer el diagnóstico de brucelosis, mientras que la ausencia de anticuerpos aleja considerablemente esta posibilidad. 310 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS Dado que se trata de un patógeno intracelular, de lento crecimiento, los test de sensibilidad in vitro no sirven para predecir la respuesta a los antibióticos. Se utilizan asociaciones de drogas por períodos prolongados y que sean activas intracelularmente. Los regímenes más aceptados incluyen combinaciones de tetraciclina (o doxiciclina) con rifampicina por seis meses. Otras combinaciones posibles son tetraciclinas más aminoglucósidos o rifampicina y trimetoprím, en especial en niños. EPIDEMIOLOGÍA, PROFILAXIS Y CONTROL Es fundamentalmente una zoonosis ocupacional, son patógenos animales y el contagio humano suele ser accidental, por contacto con tejidos, orina o leche de animales infectados. Las tasas de infección del ganado varían en los diferentes países. La leche no pasteurizada, sus derivados y la exposición laboral, son los antecedentes más frecuentes (veterinarios, personal de mataderos). Ocasionalmente el contagio ocurre por vía aérea. Los hombres se ven afectados con más frecuencia que las mujeres. Cierto porcentaje de infecciones pueden ser asintomáticas. La profilaxis de la enfermedad se logra a través de la vacunación del ganado con cepas vivas avirulentas. Para el control de la Brucelosis bovina se utiliza una vacuna preparada con B. abortus, cepa 19, que confiere inmunidad al animal de por vida, y es de bajo costo. El control de la enfermedad debe estar orientado a evitar la diseminación, erradicar los reservorios animales, pasteurizar la leche y disminuir el riesgo laboral. Helicobacter En 1982, Marshall y Warren publicaron un trabajo que informaba acerca de la presencia de bacilos Gram negativos espirilares en biopsias gástricas de pacientes afectados de gastritis. Originalmente esta bacteria se denominó Campylobacter pyloridis. En 1989 se creó el género Helicobacter que agrupa varias especies, de las cuales 3 son patógenas para el hombre (H. pylori, H. fennelliae y H. cinaedi). Otras especies se encuentran en animales. MORFOLOGÍA Y METABOLISMO Este género comprende bacilos Gram negativos curvos o espirilares. En cultivos viejos adoptan forma de bacilos o cocobacilos. Poseen fagelos únicos o múltiples. Se trata de gérmenes microaerófilos de lento desarrollo, cuya temperatura óptima de crecimiento es 37 °C. Presentan complejos requerimientos nutricionales y, habitualmente, son aislados en medios ricos con bases como agar brucella, suplementada con sangre y el agregado de antibióticos para inhibir otros gérmenes que puedan hallarse en la muestra. Las colonias demoran 3 a 4 días en hacerse visibles. Son catalasa y oxidasa positivos. Helicobacter pylori posee además una enzima ureasa que es útil para la identificación y el diagnóstico. HÁBITAT Su distribución es mundial, ha sido aislado en pacientes de países desarrollados y no desarrollados, tanto en adultos como en niños pequeños. La vía de transmisión no ha sido aún determinada, probablemente sea fecal-oral u oral-oral. En los países en desarrollo la infección se adquiere temprano en la infancia, mientras que en Estados Unidos la edad de adquisición es mucho más tardía. La mayor incidencia de esta infección se asocia a malas condiciones socioeconómicas. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 311 El hábitat natural de H. pylori es la mucosa gástrica humana. El estómago, con su pH ácido no es un sector propicio para el crecimiento bacteriano. La enzima ureasa, producida en grandes cantidades por la bacteria, convierte la urea en amonio lo que crea condiciones más favorables para la sobrevida del germen. Además, la forma de espirilo y la movilidad le conferirían la capacidad de resistir la peristalsis. La adherencia por medio de adhesinas específicas también contribuiría a la persistencia de H. pylori en la mucosa gástrica. Luego de adquirida la infección, la bacteria reside en la mucosa sin invadir el epitelio. Se desencadena una respuesta inmune de tipo humoral pero no es eficaz para curar la infección. MECANISMOS PATOGÉNICOS, PAPEL EN LA ENFERMEDAD GASTRODUODENAL H. pylori produce diversas sustancias que intervendrían en la patogenia de esta infección: ureasa, citotoxinas, mucinasa, lipasa, fosforilasa A, adhesinas y hemolisinas. El germen parece colonizar el estómago por años o décadas, causando inflamación gástrica leve y persistente; esta suele ser asintomática. En ciertos casos, y por factores aún no aclarados, (probablemente debido a características del huésped o de la cepa involucrada) la respuesta inflamatoria progresa. Entre los factores más estudiados que llevarían a la progresión de la inflamación están una citotoxina, una enzima con capacidad de producir vacuolización de las células y otras sustancias proinflamatorias. La asociación de gastritis crónica y úlcera péptica con la infección por H. pylori es muy fuerte y las tasas de infección por H. pylori son significativamente superiores en pacientes con úlcera péptica que en aquellos controles sanos. También existe asociación de la infección por H. pylori y úlcera duodenal; luego de un seguimiento de 10 años se demostró que pacientes con gastritis crónica superficial tienen un riesgo 13 veces mayor de desarrollar úlcera duodenal que los que no tienen gastritis. Por otra parte, el tratamiento de la infección lleva a la remisión de los síntomas o a la cura de la enfermedad, aunque no previene las recidivas. La gastritis superficial puede progresar a gastritis crónica atrófica, y más tarde desarrollar adenocarcinoma gástrico, por lo que H. pylori sería un factor de riesgo para este tipo de tumores. Se espera disponer, en un futuro no muy lejano, de modelos experimentales que permitan aclarar la patogenia de esta infección. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR H. PYLORI Bacteriología Se realiza a partir de biopsias de mucosa gástrica o duodenal. Dichas biopsias son homogeneizadas y procesadas mediante examen directo y cultivo en medios y condiciones de atmósfera y temperatura ya analizados. Luego de 4 a 7 días las colonias aisladas son identificadas mediante microscopía y pruebas de oxidasa, catalasa y test de ureasa rápida. A parir de esos cultivos se pueden realizar estudios de susceptibilidad a drogas. La actividad de la enzima ureasa es tan importante que si se coloca un trozo de biopsia gástrica en caldo urea, la presencia de H. pylori se evidencia por la alcalinización del medio de cultivo en minutos a horas, lo que también se utiliza para el diagnóstico. Histología El estudio anatomopatológico de las biopsias ha demostrado ser muy sensible y específico para el diagnóstico de esta infección. Permite visualizar a las bacterias y sirve para determinar el tipo de lesión histológica (por ej. gastritis crónica superficial, etc.) y otras lesiones asociadas. 312 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Al igual que el cultivo tiene la desventaja de ser invasivo ya que se requiere de endoscopía digestiva para obtener la muestra. Prueba de la urea marcada con carbono radiactivo Consiste en administrar al paciente por vía oral urea marcada con 13C. De estar presente H. pylori en el tubo digestivo, la urea es hidrolizada a nivel gástrico por la ureasa liberando CO2 marcado. Este es detectado por técnicas espirométricas. Serología La respuesta de anticuerpos puede ser detectada en suero mediante diversas técnicas, resta por aclarar el valor de la serología, en el diagnóstico y seguimiento de los pacientes. TRATAMIENTO Aún no se han establecido claramente la indicación ni el mejor plan terapéutico para erradicar la infección. En general se han usado planes que combinan uno o dos antibióticos activos a nivel gástrico con inhibidores de la bomba de protones. Campylobacter Es un género de bacilos Gram negativos, de forma curva semejante a una “gaviota”, o de aspecto espirilar. La especie C. jejuni es la responsable de más del 95% de los casos de diarrea por Campylobacter. La importancia de este enteropatógeno se demostró en época relativamente reciente, cuando se dispuso de técnicas y medios de cultivo especiales y se conocieron sus condiciones de crecimiento. Necesita de medios ricos para crecer, una temperatura óptima de 42-43 ºC y un ambiente escaso en oxígeno (microaerófilo). Es agente común de diarrea aguda comunitaria (EPEC, Rotavirus, Campylobacter, etc.). En niños hospitalizados es la causa más frecuente de diarrea con sangre, después de Shigella. Se acompaña en general de fiebre y dolores abdominales. La concentración de leucocitos fecales eliminados en estos procesos es menor que en las shigelosis. Igual ocurre para Salmonella o Yersinia enterocolítica. En algunos casos (0,15%) se produce invasión sistémica y bacteriemia; esto ocurre en especial en pacientes añosos o inmunocomprometidos. La infección por C. jejuni es actualmente reconocida como un antecedente de riesgo para el desarrollo del síndrome de Guillain-Barré, una neuropatía periférica que se atribuye a reacciones inmunopatológicas por similitud entre los antígenos lipopolisacáridos superficiales de esta bacteria y los del tejido neural. Las infecciones por este germen predominan en verano, pero se siguen observando en otoño y ya iniciados los fríos. El reservorio de Campylobacter es muy extenso, ya que la mayor parte de los animales domésticos pueden ser afectados y transmitir la infección por sus heces, o por los alimentos que de ellos se obtienen, si bien la bacteria no se multiplica habitualmente en los mismos. Es también frecuente la transmisión fecal-oral interhumana. La mayor parte de los infectados excretan el germen durante 4-7 semanas. Aun se discute la patogenia de la diarrea producida por C. jejuni. Muchas cepas son invasoras de las células epiteliales; algunas producen citotoxinas y otras elaboran enterotoxinas semejantes a las de Vibrio cholerae o de Escherichia coli. Existen otras especies como C. coli, C. laridis, etc., que han sido asociadas a diarrea en humanos. Campylobacter puede ser observado en frotis de materias fecales diarreicas teñidos con Gram, si la coloración de contraste se realiza con fucsina de Ziehl y no con safranina. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 313 El cultivo se realiza por siembra directa en medios ricos y selectivos, con agregado de antibióticos, o sin sustancias inhibitorias, si se filtra previamente la muestra a través de membranas de 0,45um, que pueden atravesar gracias a su delgadez y gran movilidad, como ocurre con Leptospira. Se pueden practicar cultivos de enriquecimiento con posterior reaislamiento. Las colonias de Campylobacter aparecen como gotas de agua extendidas sobre la placa, y su identificación debe ser confirmada por observación microscópica de su aspecto y movilidad, reacción de catalasa y oxidasa positivas, y otras características metabólicas. Es posible clasificarlos en serotipos según sus antígenos superficiales proteicos y lipopolisacáridos, o en genotipos por análisis de sus ácidos nucleicos. C. jejuni es habitualmente sensible a macrólidos y quinolonas, y resistente a betalactámicos. Bibliografía • Gorbach SL, Bartlett JG and Blacklow NR, editors Infectious Diseases 2nd. ed. Philadelphia: Saun- • Koneman E. Diagnóstico Microbiológico, Atlas Color y Texto. 5ta. ed. Buenos Aires: Editorial Medica ders;1998. Panamericana; 1999. 314 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 315 Página 315 19 Principales grupos de bacilos gramnegativos no exigentes G. Algorta, F. Schelotto Introducción El gran grupo de bacilos Gram negativos no exigentes incluye diferentes familias y géneros, muchos de ellos muy frecuentes en patología médica. Comparten algunas características tales como poseer en su pared externa un lipopolisacárido (LPS), que les otorga características patogénicas particulares, tóxicas, la llamada endotoxina de las bacterias Gram negativas. Muchos de ellos son ubicuos, encontrándose muy difundidos entre los animales y la naturaleza, pudiendo causar enfermedad en el hombre y los animales como es el caso de Salmonella; otros, aunque bien adaptados al medio ambiente, son patógenos humanos exclusivos, por ejemplo Vibrio cholerae; por último, otros se encuentran bien adaptados a su huésped, como por ejemplo Shigella. Algunos de estos bacilos Gram negativos poseen atributos de virulencia bien definidos, comportándose como patógenos primarios, Yersinia pestis, Salmonella typhi, responsables de la Peste y la Fiebre tifoidea respectivamente. Otros, tales como Acinetobacter y Pseudomonas producen infecciones oportunistas. Es de destacar que algunos de ellos, como Escherichia coli, forman parte de la flora normal del tubo digestivo y permanecen en él sin causar enfermedad, siempre y cuando no se modifiquen las condiciones de su hábitat. En este capítulo se hará énfasis en aquellas familias, géneros y especies que se encuentran más frecuentemente relacionados con la patología humana. Enterobacteriaceae Esta familia comprende un número muy variado de géneros y especies bacterianos cuyo hábitat natural es el tubo digestivo del hombre y los animales. No todos los bacilos Gram negativos que tienen este hábitat forman parte de la familia Enterobacteriaceae. Se los encuentra en el suelo, agua, frutas, vegetales y otras plantas, y en los animales, desde los insectos al hombre. La familia está definida por un conjunto de características fenotípicas (bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas) a las que se han agregado posteriormente otros elementos establecidos por técnicas de hibridación de ácidos nucleicos que miden distancias evolutivas y han definido mejor la interrelación de todos los microorganismos integrantes de la familia. Son bacilos Gram negativos rectos, con un diámetro de 0.3 a 1.5 micras. Si son móviles, presentan flagelos perítricos. No forman esporos. Desarrollan en presencia o en ausencia de oxígeno (aerobios-anaerobios facultativos). Desarrollan rápidamente en medios simples, no siendo exigentes desde el punto de vista nutricional. Algunos desarrollan en glucosa como 316 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA única fuente de carbono, mientras otros requieren el agregado de vitaminas o minerales en el medio de cultivo. Son quimioorganotrofos, poseen metabolismo fermentativo y respiratorio. Son catalasa positivos y oxidasa negativos; reducen los nitratos a nitritos. El contenido de Guanina + Citosina del DNA total es de 38 a 60 moles %. En los medios de cultivo forman colonias lisas, convexas y circulares de bordes definidos. Algunas especies desarrollan colonias más mucoides que otras (por ejemplo Klebsiella). CARACTERES BIOQUÍMICOS Los bacilos Gram negativos que integran esta familia pueden identificarse por medio de la expresión fenotípica de algunos caracteres genéticos. Los métodos utilizados tienen como principio: • La investigación de la fermentación de azucares o alcoholes en un medio peptonado con el agregado de un indicador de pH para detectar la producción de metabolitos ácidos. • La investigación de la utilización de un substrato como única fuente de C. • La investigación de producción de ciertas enzimas sobre substratos generadores de color. • La investigación de la producción de un metabolito, producto final característico de una vía metabólica. • La investigación de la aptitud de desarrollar en presencia de un inhibidor. CARACTERES ANTIGÉNICOS Los microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae poseen una estructura antigénica compleja. Los antígenos O, antígenos somáticos Son la parte más externa del LPS y están formados por unidades polisacáridas repetidas. Algunos contienen un único azúcar. Son termoestables y alcohol-estables, detectándose por aglutinación simple. La naturaleza de los grupos terminales y el orden en que estos azucares están dispuestos en las unidades repetitivas determina la especificidad de los numerosos antígenos O. Un mismo microorganismo puede poseer varios antígenos O. Cada género está asociado a grupos antigénicos específicos, por ejemplo la mayoría de los serotipos de Shigella comparten uno o más antígenos O con Escherichia coli (Shigella y E. coli pertenecen al mismo género). Por otra parte E. coli puede tener reacciones cruzadas con especies de los géneros Klebsiella y Salmonella. En E. coli algunos antígenos somáticos están asociados con fenotipos virulentos específicos, por ejemplo E. coli O:111 y O:119 son frecuentemente agentes etiológicos de diarrea aguda en los niños pequeños. Los antígenos K, externos a los antígenos O Algunos constituyen una verdadera cápsula visible al microscopio, como sucede con Klebsiella, mientras que en E. coli por ejemplo, su estructura no es visible al microscopio óptico y se los denomina antígenos de envoltura por comportarse como si envolvieran la bacteria volviendo inaglutinable el antígeno O de la pared. Son de naturaleza polisacárida. Otros antígenos de envoltura pero de naturaleza proteica se presentan como fimbrias. Los antígenos H, flagelares Son de naturaleza proteica. Esta proteína que constituye los flagelos es llamada flagelina. Este antígeno es termolábil y destruido por el alcohol. El contenido de aminoácidos y el TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 317 orden en que estos se encuentran en las flagelinas determina la especificidad de los diversos antígenos. Como ya fue mencionado, los flagelos bacterianos están compuestos de un solo tipo de proteína. En Salmonella existe variación de fase. Como resultado de ello, la proteína flagelar puede ser de dos tipos por medio de un mecanismo de regulación genética (inversión sitio específico), que involucra: • dos genes que codifican las dos proteínas, pero solo uno se expresa en cada momento; • un gen represor de uno de estos genes; • y la inversión de un segmento de DNA que modifica la dirección de la transcripción. CARACTERÍSTICAS PATOGÉNICAS Se ha asociado a cepas de Enterobacteriaceae con abscesos, neumonías, meningitis, septicemia, infecciones de heridas, infecciones de las vías urinarias e intestinales. Son el componente mayor de la flora normal intestinal, pero son relativamente poco frecuentes en otros sitios del organismo. Algunas especies son importantes como causa de infecciones nosocomiales. Significan el 50% de todos los aislamientos clínicos y el 80% de los bacilos Gram negativos. Representan el 50% de los casos de septicemia y más del 70% de las infecciones urinarias. Hasta 1940 solo Salmonella y Shigella estaban relacionadas con gastroenteritis humana. Actualmente es bien conocido que algunas variantes patogénicas de E. coli son causa significativa de enfermedad diarreica y que cepas invasivas de Yersinia enterocolítica son causa de diarrea y adenitis mesentérica. Clásicamente se han descrito a las especies no relacionadas con enfermedad diarreica, como agentes de infecciones oportunistas, capaces de producir enfermedad en el hospedero inmunocomprometido o por transposición de flora. Es importante destacar, algunas excepciones ya mencionadas. Por otra parte salvo Shigella que raramente causa infecciones fuera del tracto gastrointestinal, muchas especies de Enterobacteriaceae causan frecuentemente infecciones extraintestinales. ESCHERICHIA COLI Es llamada así en honor del pediatra que la aisló y caracterizó en 1885. Junto a otras especies de incidencia excepcional, forma el género Escherichia. Constituye la especie dominante de la flora aerobia del tubo digestivo, más de 10 serotipos coexisten normalmente en el mismo individuo. Son estas mismas bacterias integrantes de la flora normal las que pueden causar en diversas circunstancias infecciones abdominales, septicemias, meningitis, etc. El poseer determinadas características antigénicas, como el antígeno de envoltura K1, muy parecido por su composición en ácido siálico al antígeno capsular de Neisseria meningitidis del grupo B, daría a este germen potencialidades invasivas. El 80% de E. coli aisladas de meningitis del recién nacido poseen este antígeno K1. Por otra parte el poseer plásmidos que portan genes que codifican para la producción de diferentes adhesinas, enzimas o enterotoxinas otorga a E. coli características patogénicas particulares y la capacidad en una u otra circunstancia, dependiendo de la o las proteínas producidas, de dar infecciones urinarias o gastrointestinales. Los caracteres bioquímicos para la identificación de esta especie se describen en la tabla correspondiente. Es habitualmente fermentador de la lactosa, urea y citrato negativo, indol positivo y móvil. Desde el punto de vista antigénico en E. coli se han descrito más de 150 serogrupos O. Poseen antígenos de envoltura polisacáridos K, que, como es habitual en el mundo bacteriano, permiten a la bacteria resistir más fácilmente la fagocitosis que las bacterias no capsuladas. 318 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Asimismo se describen más de 56 antígenos H que permiten completar su clasificación en serotipos O:H. De lo dicho se desprende que una tipificación antigénica completa es resorte de laboratorios especializados y no forma parte del trabajo corriente de los laboratorios. Patogenia Como ya fue mencionado E. coli puede integrar la flora normal, causar diarrea, infección urinaria, meningitis, etc. Pero una cepa que causa diarrea no causara infección urinaria ni meningitis. La versatilidad de este microorganismo esta dado porque E. coli ha adquirido conjuntos diferentes de genes de virulencia. E. coli es un excelente ejemplo de que el poseer un conjunto de genes es lo que hace que una bacteria sea patógena, y no la designación de género o especie. Se ha propuesto para E. coli agente de diarrea una clasificación de acuerdo a sus mecanismos de virulencia, los llamados virotipos. Aunque arbitraria, esta clasificación es muy útil. Se describen 5 virotipos. E. coli enterotoxigenico (ETEC), E. coli enteroagregativo (EAggEC), E. coli enteropatogénico (EPEC), E. coli enterohemorrágico (EHEC), y E. coli enteroinvasor (EIEC). E. coli enterotoxigénico (ETEC) Se parece mucho a V. Cholerae; la enfermedad que produce es similar, pero más leve. Adhiere a la mucosa del intestino delgado, no la invade, y elabora toxinas que causan diarrea. No hay cambios histológicos en las células de la mucosa y hay muy poca inflamación. Clínicamente hay diarrea acuosa, vómitos y raramente fiebre. Es la llamada infección no inflamatoria del intestino delgado. Esta clase de E. coli causante de diarrea está integrada por numerosos serogrupos y serotipos (O:6, O:8, O:25, O:78, etc.), ya que los determinantes patogénicos (fimbrias y toxinas) están codificados en plásmidos transferibles. Su identificación es compleja, ya que requiere la detección de su DNA característico (por sondas o PCR), o la demostración por ELISA de la producción de toxinas en cepas que pueden encontrarse en forma minoritaria en el coprocultivo. Factores de virulencia Para adherirse a las células de la mucosa ETEC produce diversos tipos de pili. Un tipo de ellos, los llamados factores antigénicos de colonización I y II (CFA/I y CFA/II) y otros, parece contribuir fuertemente a la colonización por estos microorganismos. Los receptores para estas adhesinas están aun en estudio, pero se piensa que son glicoproteínas. Los genes que codifican para CFA están frecuentemente localizados en plásmidos. La diarrea producida por cepas de ETEC es causada por la acción de dos diferentes toxinas: toxina termolábil (LT) y toxina termoestable (ST). Hay dos LT y su estructura y mecanismo de acción es el de la toxina colérica. Tienen diferencias en la excreción de la célula bacteriana y en la regulación genética de su síntesis. ST es una familia de pequeñas toxinas polipeptídicas. Los genes que codifican para LT y ST son portados por plásmidos. A menudo el mismo plásmido lleva los genes de las adhesinas y toxinas. E. coli enteroagregativo (EAggEC) Son agentes de diarrea persistente en niños. Las cepas de EAggEC se parecen a ETEC en que se unen a las células intestinales, no son invasivas y no causan modificaciones histológicas TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 319 en las células de la mucosa. Difieren de ETEC en que no adhieren en forma uniforme sino que lo hacen en pequeños agregados. Factores de virulencia Estas cepas poseen unas estructuras fibrilares muy delgadas que se presumen son los pili de adherencia. Aunque es posible que estos pili promuevan la adherencia de estas bacterias entre sí, más que la adherencia a la célula del hospedero (forma de adherirse en agregados). Producen una toxina similar a ST llamada EAST (ST enteroagregativa). Otra toxina producida por EAggEC es una toxina muy similar a una hemolisina producida por cepas de E. coli que causan infecciones urinarias. Esta toxina no hidroliza eritrocitos pero produce poros en las membranas celulares del hospedero. E. coli enteropatógeno (EPEC) EPEC es causa de diarrea severa en niños pequeños, de gran trascendencia en países subdesarrollados. EPEC exhibe un patrón de adherencia en parches, pero no forma el mismo tipo de agregados que EAggEC. A diferencia de las anteriores, la adherencia de EPEC produce alteraciones importantes en la ultraestructura de las células del huésped. Las células a las que EPEC está adherida alargan las microvellosidades donde EPEC no se encuentra y éstas desaparecen en el sitio donde la bacteria está adherida. Este fenómeno se refiere como de unión y borramiento, y es el resultado de un reordenamiento de actina en la vecindad de la bacteria adherida. EPEC es más invasora que las anteriores y se produce una reacción inflamatoria. Esta clase de E.coli está integrada por varios serogrupos, en general los serogrupos asociados con EPEC están limitados a este virotipo (existen excepciones). Factores de virulencia La diarrea producida por EPEC es una enfermedad más compleja y se piensa que sucede en tres etapas. En un inicio, hay una asociación de la célula bacteriana a la célula del hospedero llamada unión no íntima, mediada por pili. Este pili llamado Bfp parece no ser la única adhesina de EPEC. Posteriormente a través de un sistema dependiente de contacto llamado sistema de secreción tipo III la bacteria infecta proteínas desde el citoplasma bacteriano directamente desde el citoplasma de la célula eucariota, produciendo alteraciones en la función de la céulla eucariota con activación de enzimas celulares y aumento de los niveles de Ca++ intracelular, probablemente debido a fosforilación de proteínas del citoesqueleto y la activación de enzimas despolimerizantes de actina. La bacteria se asocia entonces más próximamente con la célula del hospedero (unión íntima) produciéndose un reagrupamiento de actina en la vecindad de la superficie celular. Histológicamente la deformación de algunas microvellosidades y la destrucción de otras se acompaña de la formación de estructuras similares a pedestales en la célula, por debajo del sitio de adherencia de la bacteria. Estos pedestales son fibras densas de actina. La unión íntima esta mediada por una proteína de membrana externa llamada intimina, que adhiere a receptores translocados por la bacteria al enterocito junto a otras señales proteicas (TIR: translocated intimin receptor). Otras proteínas se encuentran también involucradas en este proceso. Algunas bacterias son posteriormente internalizadas dentro de vesículas fagocíticas. Los genes que codifican los pili Bfp están localizados en plásmidos EAF, pero la mayor parte de los factores patogénicos están codificados en el cromosoma bacteriano. 320 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA E. coli enterohemorrágico (EHEC) Se ha reconocido recientemente a EHEC como responsable de cuadros graves. Estas cepas causan una enfermedad que clínicamente se parece a la disentería producida por Shigella, aunque no invade las células de la mucosa. La enfermedad producida por EHEC puede complicarse con síndrome urémico hemolítico (SUH) que puede llevar al paciente a la muerte por falla renal aguda. O157:H7 es el serotipo característico de este grupo de EHEC. Los cultivos STEC abundan en el intestino de bovinos y otros animales. Pertenecen habitualmente a serotipos no frecuentes en infección humana, pero pueden transferir sus atributos patogénicos a cepas adaptadas al hombre. Un factor importante de diseminación de estas bacterias es la posibilidad de contaminación de la carne durante la faena. La mala cocción de la carne mezclada en hamburguesas y usada en la preparación de comidas rápidas ha llevado a la existencia de brotes de diarrea o SUH causados por STEC O157 en países desarrollados. En nuestro país, se han estudiado en los últimos años algunas decenas de pacientes con SUH, presentándose en forma de casos aislados, sin relación aparente entre ellos. Factores de virulencia VTEC posee adhesinas fimbriales codificadas en un plásmido de virulencia de 60 mda., y genes cromosómicos y plasmídicos que median en los enterocitos del colon un efecto de fijación y borramiento de las microvellosidades similar al que produce EPEC en el intestino delgado. A diferencia de EPEC, EHEC produce toxinas iguales o parecidas a la toxina Shiga, por lo cual se los llama también STEC (Shiga Toxin E. Coli). Estas sustancias proteicas constituyen una familia de exotoxinas (VT1, VT2, VT2vha, VT2vhb, etc.) llamadas también verotoxinas por su acción citotóxica sobre cultivos de células Vero de laboratorio. Cada bacteria puede codificar una o más variantes. La diarrea con sangre y el SUH asociado a STEC son principalmente debidas a la producción de toxinas Stx, aunque existen otros factores participantes como la enterohemolisina y otros productos microbianos. Las citotoxinas son producidas localmente y contribuyen a la patología intestinal, pero pasan a la sangre produciendo efectos sistémicos que derivan principalmente de la alteración endotelial microangiopática, que favorece la fragmentación globular, la glomerulopatía y otras alteraciones parenquimatosas. Los genes que codifican para las STX se encuentran en fagos temperados, lo que permite a otras cepas productoras de diarrea adquirir capacidad toxigénica y producir una forma grave de enfermedad. E. coli enteroinvasor (EIEC) EIEC produce una enfermedad indistinguible de la disentería producida por Shigella. Los pasos en la invasión y diseminación célula a célula parecen ser idénticos a los de Shigella. A diferencia de ésta no produce toxinas, por lo cual no se han descrito casos de SUH en relación a estas cepas. Al igual que Shigella muchos de los genes involucrados residen en un gran plásmido de virulencia. La mayoría de estos gérmenes son inmóviles, anaerogénicos, no decarboxilan la lisina y no utilizan la lactosa (lactosa negativos). Pertenecen a un conjunto de serogrupos característicos, bien estudiados por la escuela microbiológica brasileña. E. coli uropatogénico Las infecciones del tracto urinario comienzan generalmente con la colonización de la uretra por cepas originarias del colon previa colonización de la vagina. Una de las mayores defensas del huésped es la acción lavadora de la orina. Las bacterias que no se pueden adherir van a TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 321 ser lavadas más rápidamente de la vejiga de lo que tardan en multiplicarse. Por otra parte las bacterias que adhieren están más cerca de la mucosa y tienen mayores facilidades para provocar respuesta inflamatoria. Numerosas adhesinas de E. coli uropatógeno han sido estudiadas. Los pili tipo 1 contribuyen a la colonización de la vagina y parecen intervenir muy poco en la adherencia al resto del aparato urinario. La adhesina más importante, sobre todo en cepas que causan infección renal es pili P. Hay diversidad antigénica en estos pili pero todos reconocen el mismo carbohidrato como receptor, globobiosa. Este azúcar se encuentra unido a una ceramida anclada en la membrana de las células del huésped. Estas cepas pueden poseer otras adhesinas que no son pili, por ejemplo adhesinas afimbriales (AFAI, AFAIII) o la adhesina Dr, que reconoce al antígeno del grupo sanguíneo Dr como receptor. En general las cepas de E. coli uropatogénico producen múltiples adhesinas por combinación de diferentes tipos de pili o diferentes serotipos del mismo pili. Esto podría permitir a las bacterias adaptarse a diferentes superficies mucosas y ambientales, brindándole un mecanismo de evasión de las defensas del hospedero. En cuanto a la respuesta inflamatoria, hay evidencias de que LPS junto a pili P actúan sinérgicamente provocando esta respuesta. Por otra parte, algunas cepas uropatogénicas de E. coli producen una exotoxina llamada hemolisina, porque lisaba eritrocitos, aunque luego se vio que también lisaba otras células. Esta hemolisina (HlyA) pertenece a una gran familia de hemolisinas llamadas RTX. Todas ellas actúan creando poros en las membranas celulares de los eucariotas. En el ratón las cepas que poseen HlyA y pili P colonizan la vejiga, el riñón y matan dos tercios de los ratones testados, por otra parte cepas isogénicas que producen solo pili P, colonizan pero no causan daño renal ni muerte. Las cepas que no poseen pili y no producen hemolisina no colonizan. Al menos en el modelo animal la hemolisina media el daño renal. Los genes que codifican para pili P están agrupados en el cromosoma. El conjunto contiene genes para la subunidad mayor (pap A), para las proteínas del tip (pap E, F, G), para proteínas de procesamiento y ensamblado (pap C, D, H, J, K) y proteínas reguladoras (pap B, I). Salvo el gen I los demás forman un operón transcripto desde un solo promotor. Por otra parte los genes para hlyA también están agrupados y en proximidad de los genes para pili. A las regiones que contienen los genes de virulencia se las ha llamado islas de patogenicidad. SHIGELLA Como ya fue mencionado Shigella son bacterias estrictamente humanas. Como sucede frecuentemente esta adaptación se produce con pérdida de funciones. Shigella, que por hibridación se encuentra tan cercano a E. coli que podrían pertenecer a una misma especie, a diferencia de éste son auxotrofos, inmóviles, poco glucidolíticos, y prácticamente no producen gas en la fermentación de glucosa. Los caracteres bioquímicos se describen en la tabla correspondiente. En base a los caracteres bioquímicos y antigénicos se describen cuatro especies. S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii y S. sonnei. Estas especies se subdividen en serotipos sobre la base de un factor somático O característico. Shigella produce una enfermedad inflamatoria aguda del colon con diarrea sanguinolenta, que en su presentación más característica se manifiesta como una disentería o diarrea disenteriforme. Este síndrome clínico está caracterizado por deposiciones de poco volumen con mucus, pus y sangre; cólicos y tenesmo, acompañados de fiebre; además es característica la presencia de abundantes leucocitos en el frotis de materias fecales. Se trasmite de persona a persona directamente por las manos contaminadas o indirectamente por alimentos o agua contaminados con heces humanas. Se necesita una dosis infectante pequeña para causar 322 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA enfermedad; frecuentemente unas pocas centenas de bacterias ingeridas son suficientes para provocarla. En el adulto sano es una enfermedad autolimitada aunque molesta; en los niños pequeños y de poblaciones marginadas puede ser una enfermedad grave que lleve al niño a la muerte. Se trata de una enfermedad más frecuente en poblaciones con mal saneamiento. Puede ser esporádica o dar lugar a brotes extensos, e incluso a endemias en instituciones cerradas como cárceles u organizaciones para discapacitados. La eliminación fecal de los gérmenes puede prolongarse por varias semanas. Un porcentaje de los enfermos pueden complicarse, presentando alteraciones hidroelectrolíticas, neurológicas (letargia, cefalea, convulsiones) o fallo renal (HUS), esto ultimo cuando se trata de S. dysenteriae 1. Patogenia Shigella es un buen modelo de enfermedades en las cuales la bacteria invade las células del hospedero, se replica en su citoplasma y se disemina de célula a célula. Existen dificultades al no poseer un modelo animal claro, salvo el mono, para estudiar los factores de virulencia. La mayoría de las investigaciones han utilizado cultivos celulares (células HeLa, macrófagos o fibroblastos de pollo), el test de la queratoconjuntivitis de Sereny realizado en el ojo del cobayo y ensayos en asa ileal aislada de conejo. En estudios realizados en células HeLa, la bacteria se adhiere en una primer etapa a las célula del hospedero. Probablemente los receptores sean proteínas llamadas integrinas. Esta adherencia provoca reorganización de la actina (proteína mayor del citoesqueleto de la célula del huésped), polimerización y formación de filamentos no solubles en la vecindad de la unión bacteriana. Esto provoca la formación de seudópodos y de esta forma células normalmente no fagocíticas de la mucosa ingieren las bacterias adheridas. Esta invasión es mejor descrita como fagocitosis inducida. Jugando el papel activo la célula del hospedero, la bacteria tiene un papel relativamente pasivo luego de la estimulación inicial. Luego de ingeridas, las bacterias se liberan de su vesícula de endocitosis y se multiplican en el citoplasma de las células. Posteriormente las bacterias utilizan filamentos de actina en su vecindad y comienzan a moverse a través de la célula del hospedero. Eventualmente las bacterias pueden diseminarse a células adyacentes. Esto se ha llamado ICS (diseminación intercelular, en inglés: intercellular spread). En este movimiento se polimeralizan filamentos de actina en uno de los extremos de la bacteria, creando colas similares a cometas que propelen las bacterias a través del citoplasma. Una proteína bacteriana alojada en la membrana externa, llamada IcsA se requiere para este movimiento. IcsA se localiza en un extremo de la bacteria y tiene actividad ATPasa. Eventualmente la bacteria puede tomar contacto con la membrana que separa dos células, protruir y escapar a la célula vecina. En trabajos realizados en células polares, Shigella no se une a los polos apicales de estas células diferenciadas. Las integrinas se encuentran solo en la superficie basal de la mucosa. Por lo que otro modelo se ha propuesto para la entrada inicial de Shigella. Esta se haría en tres etapas. En primer lugar, Shigella atraviesa la mucosa a través de las células M de las placas de Peyer, células fagocíticas naturales cuyo papel principal es tomar antígenos del lumen intestinal por fagocitosis y presentarlos al tejido linfoide subyacente de las placas de Peyer. En una segunda etapa, Shigella usa sus invasinas para invadir las células de la mucosa desde abajo, donde están ubicadas las integrinas, para, en una tercera etapa, diseminarse a células adyacentes, causando la muerte de estas células e inflamación. La forma como se produce la muerte de las células no esta del todo aclarada. Por un lado, cuando las bacterias están multiplicándose en forma intracelular disminuyen los niveles de ATP de la célula y aumentan dramáticamente los niveles de piruvato, indicando una alteración del metabolismo energético. Por otra parte, Shigella puede inducir la muerte celular programada TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 323 en los macrófagos, un fenómeno llamado apoptosis, lo que sugiere otra vía de muerte celular y, por supuesto, de inflamación. El LPS contribuiría también al daño celular. Shigella dysenteriae fue aislada por primera vez por Shiga en 1896, durante una epidemia de disentería en Japón. Produce una toxina, denominada toxina de Shiga, que está asociada al espacio periplásmico y se libera durante la lisis bacteriana. Esta posee una subunidad denominada A que tiene acción enzimática y 5 subunidades chicas B, cuya acción es de fijación a la célula intestinal, endotelial, etc., a través de receptores glicolípidos Gb3 de la membrana celular. Una vez que ingresa a la célula por endocitosis, A inhibe la síntesis proteica, clivando un residuo adenina de la subunidad 28 S del ribosoma eucariota, e inhibiendo la función del factor de elongación 1. Se ha visto que la toxina no es esencial para la invasión ni para la muerte de la célula intestinal. Sí se piensa que juega un rol fundamental en la patogenia del SUH. En nuestro país, S. dysenteriae es una bacteria rara. Los 2 aislamientos que tenemos registrados en los últimos 30 años no corresponden al tipo 1. Los casos de SUH que se diagnostican localmente no parecen deberse a este germen, sino a VTEC. S. boydii se aísla también en forma esporádica. Las especies de Shigella prevalentes en nuestra población son S. sonnei, que es lactosa positiva tardía, y forma en agar MacConkey colonias relativamente grandes y rosadas, confundibles con otras enterobacterias, y S. flexneri, que predomina todos los años. Muchas de las cepas de S. flexneri recuperadas de los niños montevideanos son resistentes a la ampicilina, al cotrimoxazol, o a ambos productos, utilizados tradicionalmente para el tratamiento de estas infecciones. S. sonnei sigue siendo habitualmente sensible. Muchos de los genes que intervienen en la adherencia, invasión de la mucosa y diseminación se encuentran en un gran plásmido de virulencia. Los genes que intervienen en la invasión son llamados Ipa. Dos de las proteínas codificadas por estos genes, IpaB y IpaC se encuentran expuestas en la superficie de la bacteria y pueden encontrarse libres en el líquido extracelular. Otras proteínas no están aun bien estudiadas. IpaB no sólo intervendría en la invasión sino que también lo haría en la liberación en el citoplasma por lisis de las vesículas, probablemente por formación de poros en la pared de las mismas. Algunos loci cromosómicos contribuyen a la invasión pero codifican sobretodo proteínas reguladoras. Otros genes involucrados en las etapas posteriores de la patogénesis de Shigella se encuentran también en el cromosoma (por ej.: toxina Shiga). SALMONELLA La mayoría de los serotipos de Salmonella habitan el intestino del hombre y los animales. Hay algunos serotipos que se encuentran adaptados a una sola especie animal, como por ejemplo Salmonella typhi, responsable de la fiebre tifoidea, que se encuentra solamente en el hombre. Las características patogénicas son tan variadas como su hábitat natural. Las salmonelosis se pueden dividir según las presentaciones clínicas en: • Formas digestivas, gastroenteritis, el más frecuente de los cuadros clínicos causados por Salmonella. Estas son las diarreas del niño pequeño y las clásicas toxiinfecciones alimentarias, consecutivas a la ingestión de alimentos contaminados con una cepa de Salmonella. • Formas septicémicas, graves, prototipo de las cuales es la fiebre tifoidea. • Formas diversas de gravedad variable: meningitis, osteítis, etc.; mucho menos frecuentes. La clasificación de Salmonella es compleja. Dentro del género Salmonella prácticamente una única especie tiene importancia en patología humana y animal y una única subespecie 324 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA llamada Salmonella enterica subespecie enterica, pero se describen aproximadamente 2000 serotipos dentro de esta subespecie, por lo que corrientemente se los llama por el nombre del serotipo, por ejemplo Salmonella typhi, ya mencionada, o Salmonella enteritidis. Salmonella son móviles y, salvo los serotipos bien adaptados a una especie animal, son prototrofos. Las características bioquímicas se describen en la tabla correspondiente. Desde el punto de vista antigénico, poseen antígenos O somáticos, antígenos de envoltura y antígenos flagelares H con dos especificidades antigénicas expresadas alternativamente, como ya fue descrito. Presentaciones clínicas Gastroenteritis: los síntomas aparecen 6 a 24 horas luego de la ingestión del alimento o agua contaminados, y pueden durar hasta una semana o más. Náuseas, vómitos, dolor abdominal y diarrea, son los síntomas principales. La severidad varía de una persona a otra, pudiendo llegar a presentar dolores que hagan pensar en apendicitis y diarreas severas, inclusive con sangre. La mayoría de los casos ocurren en niños menores de 10 años y los síntomas pueden ser más severos en este grupo. La infección puede volverse sistémica. La infección sistémica es más frecuente en lactantes o enfermos inmunocomprometidos (cáncer, SIDA). En adultos inmunocompetentes, ello ocurre sólo con S. typhi, y a veces con S. choleraesuis y otras, pero en los niños puede ocurrir con muchos serotipos. Esto fue estudiado y descrito por la escuela microbiológica uruguaya, que contribuyó históricamente al estudio de las gastroenteritis infantiles y sus agentes etiológicos (identificación de Salmonella montevideo, S. cerro, S. berta y otras). Funciona actualmente en el Instituto de Higiene, Departamento de Bacteriología y Virología, el Centro Nacional de Salmonelas, que realiza la identificación bioquímica y antigénica de cepas aisladas en el país o en el exterior, y que contribuye al estudio y control de los últimos brotes. En general se trata de una enfermedad molesta pero poco peligrosa, aunque durante los grandes brotes se ven algunos enfermos graves y pueden morir algunos pacientes. S. enteritidis y S. typhimurium son los serotipos más frecuentes aislados en toxiinfecciones alimentarias. Diversos alimentos están involucrados, los derivados cárnicos y huevos son algunos de los más frecuentes. Las técnicas modernas en la cría de las aves, el hacinamiento y las dietas hiperprotéicas llevan a altos niveles de portación intestinal de Salmonella. En los mataderos es frecuente la contaminación de las carcasas y de las superficies de los huevos. Se ha demostrado también la transmisión transovárica de Salmonella de las gallinas a sus huevos. La idea de que huevos de cáscara sana son seguros es por lo tanto falsa. La enfermedad resulta del consumo de alimentos contaminados mal cocidos o de contaminación cruzada con alimentos crudos en las cocinas. Con escasa frecuencia esto último puede ocurrir a partir de portadores humanos del germen que manipulan alimentos, (el hombre puede excretar Salmonella durante meses después de la infección clínica, o en forma permanente con reservorio habitualmente biliar, xomo puede suceder con S. typhi. Otra forma de propagación de la enfermedad, no desdeñable, dejando de lado las toxiinfecciones alimentarias, es la transmisión interhumana, de persona a persona por medio de las manos contaminadas. S. typhi es el serotipo específico que causa la fiebre tifoidea. El hombre la adquiere por consumir alimentos o agua contaminados por heces humanas. La contaminación de los alimentos puede también ocurrir durante su preparación con manipuladores de alimentos portadores de S. typhi y que eliminan gran número de bacterias en sus materias fecales. Infectados asintomáticos y portadores que han padecido la enfermedad previamente, son los que mantienen la fuente de infección. En los países desarrollados y aquellos que han logrado buenos niveles TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 325 de saneamiento y educación no es un problema de salud pública. El período de incubación es de 1 semana a 1 mes. Puede presentar diarrea. Posteriormente el paciente presenta fiebre y anorexia que puede durar hasta 2 o 3 semanas. La enfermedad sin tratamiento antibiótico puede llevar al paciente a la muerte. Patogenia Es sorprendente lo limitado del conocimiento en la patogenia de las infecciones causadas por Salmonella. S. typhi atravesaría la mucosa por medio de las células M, se multiplicaría en la submucosa y de allí se diseminaría. Las bacterias se multiplican en hígado y bazo y pasarían desde allí a la circulación general. Se han visto, en otros serotipos, bacterias dentro de las células mucosas absortivas y en macrófagos asociados a la mucosa. No es claro el mecanismo por el que se produce la diarrea. S. typhimurium produce en el ratón un cuadro muy similar al de la fiebre tifoidea en el hombre por lo que se lo ha aceptado como un buen modelo para su estudio. Salmonella, al igual que otros patógenos digestivos, induce a las células del huésped a englobarlos, pero de modo algo diferente a la fagocitosis inducida ya descrita para otros patógenos. Luego de adherida la bacteria a la superficie celular, se produce un pliegue en la célula, que la rodea y la introduce en una vesícula de endocitosis. Hay intensa polimerización de actina en la vecindad y luego de introducida, ésta desaparece. La bacteria no escapa de la vesícula ni entra en el citoplasma, se multiplica en este fagosoma para ser posteriormente liberadas. Por otra parte, estas bacterias pueden sobrevivir a la fagocitosis, resisten la muerte por el complemento. Al menos 200 genes se encuentran involucrados. S. typhimurium posee un plásmido de virulencia cuya presencia otorga a la bacteria la capacidad de causar enfermedad sistémica en el ratón. En S. typhi todos los genes son cromosómicos. Los genes de virulencia de Salmonella están regulados por un gran número de factores ambientales, tales como falta de nutrientes, anaerobiosis, pH, etc. El LPS tiene un papel importante en la respuesta inflamatoria durante la invasión de la mucosa y es responsable de los síntomas de la infección sistémica. KLESBIELLA La principal especie de este género es Klebsiella pneumoniae, muy expandida en la naturaleza. Se la aísla frecuentemente de materias fecales del hombre y los animales, pero también de aguas, vegetales y alimentos. Son bacilos Gram negativos inmóviles, a menudo capsulados. La cápsula es de naturaleza polisacárida. Las propiedades bioquímicas se describen en la tabla correspondiente. Desde el punto de vista antigénico, es útil en epidemiología la determinación de los antígenos capsulares. Existen más de 70 tipos capsulares diferentes. Pueden existir reacciones cruzadas con antígenos capsulares de otras especies bacterianas. El poseer cápsula otorga a estas bacterias un aspecto colonial mucoide. Se trata de patógenos oportunistas, pueden provocar diversos cuadros clínicos en el hombre: infecciones urinarias, bacteriemias, neumonías, infecciones hepatobiliares, etc. Un porcentaje elevado de aislamientos de Klebsiella, particularmente aquellos de infecciones nosocomiales, contienen plásmidos de resistencia a los antibióticos. Puede ser resistencia a betalactámicos, aminoglucósidos, etc. ENTEROBACTER - SERRATIA Estos dos géneros comprenden diversas especies presentes en general en el tubo digestivo 326 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Tabla 1. Propiedades bioquímicas de Enterobacteriaceae Yersinia enterocolítica Edwarsiella Providencia Morganella Proteus mirabilis Proteus vulgaris Serratia Erwinia Enterobacter Klebsiella pneumoniae E. coli Shigella Citrobacter Salmonella Movilidad + + - +o- - + + + + + + + + Gas en glucosa Lactosa Test ONPG SH2 Ureasa + + - + +oX + + -(+) d - + +oX + - + + + + + +oX + - d d + - d -oX + - + + + + + + + + d - + + - -a 37ºC -(+) d + Ph.alanina deaminasa PDA Indol LDC Citrato de Simmons Manitol Adonitol Sacarosa Salicina Dulcitol RM VP - - - - - - - - + + + + - - + + + d - + d - + + d + + + + + - d d + - + + + + - d - + + + - + d d d + - d d + - + d d d + - + + + + d + + d + + + + d d d + + d + + + + + + - X d + d + - d d d + - + - Malonato ADH ODC -(+) d - d d d + - d d + d - -(+) + - + + - + + d X + +a 28ºC d +: positivo,-: negativo,X: irregularmente positivo,(+): positivo tardío,d: diferentes reacciones,ONPG: orotonitrofenil-B-D-galactopyrtanósido, PH-alanina DA: fenilalanina deaminasa, LDC: lisina decarboxilasa, ODC: orinitina decarboxilasa, ADH: arginina dihidrolasa, RM: rojo de metilo, VP: Voges-Proskauer del hombre y los animales, en el suelo, vegetales y en aguas. Las características bioquímicas se describen en la tabla correspondiente. Son patógenos oportunistas. Al igual que Klebsiella los aislamientos hospitalarios generalmente presentan resistencias a múltiples antibióticos. PROTEUS-MORGANELLA-PROVIDENCIA Estos tres géneros forman un grupo caracterizado por poseer la capacidad de desaminar oxidativamente los aminoácidos formando ácidos cetónicos. Habitan el tubo digestivo del hombre y los animales, encontrándose también en el suelo, vegetales y aguas. Las especies más frecuentemente aisladas en cada genero son Proteus mirabilis, Morganella morgagnii y Providencia rettgeri. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 327 Son bacilos Gram negativos muy polimorfos, móviles. Proteus spp. poseen una movilidad extrema que les permite invadir los medios sólidos bajo forma de “hauch”. Las propiedades bioquímicas se describen en la tabla correspondiente. Desde el punto de vista patogénico, son agentes de infecciones del tracto urinario, pudiendo causar infecciones sistémicas en huéspedes inmunocomprometidos. P. mirabilis ha sido más estudiado, encontrándose factores de virulencia para el aparato urinario, tales como adhesinas y una hemolisina; se ha sostenido por años el papel de la ureasa producida por Proteus y Morganella en la patogenia de pielonefritis. YERSINIA Este género comprende varias especies, entre ellas Y. pestis, agente de la peste o plaga bubónica o neumónica, comúnmente llamada la muerte negra, enfermedad de los roedores, trasmitida ocasionalmente al hombre por las pulgas, con pandemias históricas desde el siglo VI, donde mató a un tercio de la población en Europa. Luego de la edad media han habido brotes en diversas partes del mundo, sobre todo en relación con las guerras. Se han denunciado casos en 1995 y comienzos de 1996 en India, Madagascar y otros países africanos, en Brasil y Perú. Y. pestis es endémica en algunas regiones tales como Irán y el oeste de Estados Unidos. Otra especie, Y. enterocolítica es muy ubiquitaria. Algunos biotipos están relacionados con enterocolitis en el hombre. Raramente presenta infecciones sistémicas, sin embargo, las bacterias atraviesan con frecuencia la mucosa y se multiplican en los nódulos linfáticos mesentéricos. Debido a los intensos dolores abdominales el cuadro puede confundirse con apendicitis. Ocasionalmente puede haber una artritis reactiva 2 a 6 semanas luego de la infección. Esto se ve frecuentemente en pacientes con antígeno HLA-B27 de histocompatibilidad. Y. enterocolítica posee la característica de crecer mejor in vitro a 28 ºC que a 37 ºC, y de desarrollar también a 4 ºC, siendo esta última la causa de la existencia de brotes de infección intestinal a partir de agua o alimentos conservados (leche, pescado, carnes, especialmente porcina), o de infección parenteral con origen en derivados sanguíneos refrigerados. Son relativamente frecuentes como agentes de gastroenteritis en países fríos (Canadá, Suecia, Bélgica). En el nuestro son escasos los aislamientos clínicamente significativos. Y. enterocolítica posee un plásmido de virulencia de 40-45 mda. que le confiere expresión de ciertas proteínas de superficie, invasividad, resistencia al suero humano normal, y otras propiedades. También Y. pestis posee al menos un gran plásmido de virulencia. Vibrionaceae La familia Vibrionaceae agrupa diferentes géneros de bacilos Gram negativos con un hábitat primario acuático. Se los encuentra en el mar en aguas frescas y en relación con animales acuáticos. Diversas especies son patógenas para el hombre, peces, así como otros vertebrados e invertebrados. Aunque la familia fue definida inicialmente en un intento de agrupar especies oxidasa positivas y móviles por flagelos polares, para diferenciarlas de los integrantes de la familia Enterobacteriaceae, se vio que todos estos microorganismos comparten atributos distintivos que sugieren un origen evolutivo común. Son bacilos Gram negativos, rectos o curvos. Móviles por flagelos polares. No forman esporos. Quimioorganotrofos, desarrollan en medios simples, son anaerobios facultativos, capaces de tener un metabolismo fermentativo o respiratorio. La mayoría oxidasa positivos. La 328 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Tabla 2. Propiedades bioquímicas de Vibrionaceae Vibrio Aeromonas Manitol + + O129 S R Tween 80 estearasa + + LDC + ODC (+) ADH (+) Inositol +: positivo, -: negativo, (+): positivo tardío, S: sensible, R: resistente. Plesiomonas R + + + (+) Tabla 3. Propiedades bioquímicas de V. cholerae Oxidasa LDC ODC ADH Manitol Inositol Sacarosa VP Gelatinasa NaCl gr% + + + + + d + 0-5 LDC: lisina decarboxilasa, ODC: ornitina decarboxilasa, ADH: arginina dehidrolasa, VP: Voges-Proskauer. mayoría de las especies requiere 2-3% de ClNa o agua marina para desarrollar. El porcentaje G + C del ADN va de 38 a 63%. Los géneros que forman esta familia son: Vibrio, Photobacterium, Aeromonas y Plesiomonas, teniendo importancia médica especies de los géneros Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. Las propiedades bioquímicas se describen en la tabla correspondiente. Por muchos años la única especie que interesó a los microbiólogos fue V. cholerae, agente del cólera epidémico. Otras especies tales como V. parahemolyticus pueden causar toxiinfecciones alimentarias en el hombre luego de la ingestión de productos del mar; siendo la primera causa de diarrea en el Japón, donde se consume pescado crudo. Otras especies de Vibrio y Plesiomonas shigelloides también están relacionadas con gastroenteritis. Por otra parte, Aeromonas hydrophila es responsable de infecciones de heridas que han sido expuestas a aguas poluidas, y ocasionalmente, puede provocar infecciones sistémicas en enfermos inmunodeprimidos. VIBRIO CHOLERAE Es el agente del cólera, una enfermedad epidémica grave que ha matado millones de personas y continúa siendo un importante problema de salud en todo el mundo. Conocida desde la antigüedad, permanece endémica en las regiones del delta del Ganges y en el Sudeste Asiático. A partir del comienzo del siglo XIX la enfermedad se ha expandido en todo el mundo en ondas sucesivas, junto a grandes movimientos poblacionales. La historia moderna del cólera comienza en 1817 con la primera de las 7 pandemias. El continente americano estuvo libre de cólera desde el comienzo del siglo XX, la última epidemia en Uruguay fue en 1895. Luego de cada introducción todas duraban unos años y parecían haber desaparecido. En 1950 sólo había cólera en Asia. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 329 En 1961 V. cholerae O:1 biotipo el Tor se diseminó fuera de Indonesia, primero a otros países asiáticos y Medio Oriente luego en la década de 1970 a Africa, Sureste europeo e islas del Pacífico. En enero de 1991 se notificaron los primeros casos de cólera en Perú. En unas semanas se diseminó rápidamente en el país. La enfermedad afectó todas las edades con una muy alta incidencia y al principio alta mortalidad. Esta última fue disminuyendo a medida que se implementó la asistencia médica. Entre 1991 y 1992 el número acumulativo de casos en Perú, representó el 2,5% de la población. Dada la alta incidencia de la epidemia y asumiendo que además muchas de las infecciones fueron asintomáticas, luego de 2 años, la mayoría de la población había estado infectada. Hacia 1993 todos los países de América Central y América del Sur, salvo Uruguay, habían reportado casos. Y todos los afectados en 1991 continuaron reportando en los siguientes años. El comportamiento es de oscilación estacionaria, apareciendo el mayor número de casos en los meses cálidos. Luego de la diseminación epidémica inicial, es posible que el cólera persista en algunas áreas por años en un estado de endemia. Es indiscutible que la mejor forma de controlar el cólera en las poblaciones es el poseer agua potable y un adecuado saneamiento, que, junto a la educación, son los pilares fundamentales del control de estas epidemias y además contribuyen al desarrollo de estas poblaciones. De todas formas, desde 1880 se ha tratado de desarrollar vacunas; los intentos más recientes se dirigen a la utilización de vacunas orales, atenuadas, buscando una respuesta IgA secretoria. V. cholerae es un bacilo Gram negativo, curvo, con forma de coma. Desarrolla bien en medios simples. Aunque su desarrollo está estimulado por la presencia de sodio, esta especie, a diferencia de las otras especies del género, desarrolla en medios sin el agregado de ClNa. V. cholerae tolera condiciones de alcalinidad y es capaz de desarrollar a pH 10. Estas propiedades se utilizan para aislar el germen de las muestras clínicas, de alimentos o del agua. Las cepas epidémicas de V. cholerae se dividen en dos biotipos: clásico y el Tor. Estructura antigénica Se puede dividir en base a sus antígenos somáticos. Se describen al menos 139 serogrupos diferentes. Todos comparten un mismo antígeno flagelar. Las cepas pertenecientes al serogrupo O:1 hasta 1992 fueron las únicas asociadas con cólera epidémico. Desde 1992 un nuevo serogrupo O:139 ha sido relacionado con cólera epidémico en India y Bangladesh. Los biotipos son aplicables solamente a V. cholerae O:1. Las cepas pertenecientes a los otros serogrupos se asocian a casos de diarrea ocasional o enfermedades extraintestinales. Las cepas del serogrupo O:1 se dividen clásicamente en 3 serotipos: Ogawa, Inaba e Hirojima. Las cepas aisladas pueden sufrir conversiones de Inaba a Ogawa, por lo que los serotipos son de escaso interés epidemiológico. Patogenia V. cholerae causa enfermedad en el hombre porque es capaz de colonizar el intestino delgado luego de ingerido. Se adhiere a la superficie mucosa y produce una enterotoxina, la toxina colérica que actúa en las células mucosas intestinales. Esta acción está dirigida a alterar el balance hidroelectrolítico de estas células, disminuyendo la entrada de sodio y aumentando la salida de cloro y agua hacia la luz intestinal, resultando en diarrea importante y disbalance electrolítico, que puede llevar al paciente a la muerte por shock hipovolémico. Con un buen soporte de líquido y electrolitos el paciente sobrevive, siendo una enfermedad autolimitada. Factores de virulencia Hasta hace cinco años se creía entender muy bien los mecanismos patogénicos de V. cholerae. 330 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Estos se explicaban por tres factores: flagelo, que permitía a la bacteria nadar hasta la mucosa intestinal; pili, que mediaba la adherencia a las células de la mucosa; y la toxina colérica, que producía diarrea severa. Investigaciones recientes demuestran una mayor complejidad en este modelo. Primero, la regulación de los factores de virulencia ha demostrado ser mucho más compleja de lo esperado, con muchos cambios adaptativos al huésped humano. Segundo, muchas cepas producen otras toxinas además de toxina colérica, aunque esta es indiscutiblemente la causa más importante de los síntomas en el cólera. Tercero, las células del huésped no son sólo blancos pasivos de la acción de la toxina. Colonización de la mucosa del intestino delgado. Además de las evidencias descritas de que la motilidad flagelar puede ayudar a V. cholerae a alcanzar la mucosa intestinal, la mayoría de las investigaciones han sido dirigidas a ver lo que sucede cuando V. cholerae alcanza la mucosa. Una contribución importante a la colonización es la presencia de largos filamentos formando un agrupamiento en la superficie de la bacteria. Cepas que carecen de estos pili son avirulentas. Se los ha llamado Tcp pili (pili coregulado con la toxina). Tres genes están involucrados en la regulación de la expresión de los genes de la pilina, y al menos cuatro lo están en la secreción y ensamblaje. Son un conjunto de 15 genes que tienewn origen fágico y forman una isla de patogenicidad. A diferencia de lo que sucede en otras bacterias estos pili están localizados solamente en una porción de la superficie celular. Por otra parte, V. cholerae produce una hemaglutinina que podría contribuir a la adherencia, además de otra posible adhesina codificada por unos genes llamados factores de colonización accesorios (acf). V. cholerae secreta una proteasa originalmente llamada mucinasa que no parece tener un papel importante en la virulencia. Toxina colérica No hay dudas sobre la relevancia de esta toxina como factor de virulencia. Es una toxina que actúa por ADPribosilación tipo A-B. Posee una subunidad A (enzimática), y 5 subunidades B idénticas (unión). Tienen un peso molecular de 27 y 11,7 kDa respectivamente. La subunidad A debe ser clivada para ser enzimáticamente activa en A1 y A2. Los genes que codifican la subunidad A (ctxA) y la subunidad B (ctxB) son parte del mismo operón y se encuentran en el cromosoma, en un segmento móvil que tiene origen fágico. Los pili Tcp, constituyen los receptores del fago codificante de la toxina. El gen ctxB es más activamente transducido, produciéndose en exceso. Las subunidades A y B transducidas son secretadas al espacio periplásmico donde son ensambladas. Una proteína (TcpG) que actúa en la formación del pili, intervendría también en la liberación de la toxina. La toxina excretada en la proximidad de las células de la mucosa intestinal, se adhiere a la célula del hospedero por unión a los gangliósidos Gm1 celulares, que son oligosacáridos que contienen ácido siálico unido covalentemente a una ceramida. El oligosacárido es reconocido por la subunidad B. Luego la toxina cambiaría su configuración y, presumiblemente por reducción de un puente disulfuro, el fragmento A1 es liberado de la toxina y entra a la célula del hospedero por un mecanismo aun no aclarado. El fragmento A1 ADPribosila una proteína de membrana llamada Gs. Gs son proteínas de la familia GTP hidrolizantes que regulan muchos aspectos de la función de las células eucariotas. Las proteínas G están compuestas de tres subunidades (Gα, Gß, Gτ). La asociación y disociación de estas subunidades, junto a la hidrólisis de GTP, activa o desactiva la proteína G. Gs es la proteína G que regula la actividad de la adenilciclasa de la célula del hospedero de una forma hormonodependiente y esto determina los niveles de AMP cíclico (cAMP) TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 331 de las célula. La forma activa de Gs (unida a GTP) aumenta la actividad de la adenilciclasa, mientras que la inactiva vuelve la adenilciclasa inactiva. Normalmente la forma activa se produce en respuesta a una estimulación hormonal y luego de un tiempo se convierte a la forma inactiva. La ADPribosilación de Gs cortocicuita este control natural, dejando a Gs activada y los niveles de cAMP descontroladamente elevados. La variedad de efectos que se producen incluye la alteración de las actividades de los transportadores de sodio y cloro. Esto lleva a un disbalance iónico que causa la pérdida de agua asociada al cólera. En células polarizadas como las de la mucosa intestinal, la adenilciclasa se localiza en la membrana basolateral, por lo que la toxina unida a la superficie apical debe actuar al otro lado de la célula. Diversos modelos buscan explicar este mecanismo, aunque queda claro que la acción de la toxina es un proceso complicado que involucra A1, Gs, adenilciclasa y otras proteínas del hospedero. Cualquiera sea los pasos que se produzcan en esta interacción, la célula del hospedero es un participante activo en la acción de la toxina. OTRAS TOXINAS A pesar que la toxina colérica es indiscutiblemente la toxina más importante en la patogenia de V. cholerae, este germen produce otras toxinas. En ensayos para producir vacunas se vio que cepas desprovistas de A1 eran capaces de seguir produciendo la enfermedad en voluntarios, administradas en forma oral. Recientemente se han clonado los genes que codifican para la producción de dos enterotoxinas: toxina Zot y toxina Ace. El descubrimiento de estas nuevas toxinas abre grandes expectativas sobre factores de virulencia aun no determinados. Bacilos Gram negativos no fermentadores Este gran grupo de bacilos Gram negativos incluye gérmenes pertenecientes a diferentes familias y otros géneros de incierta clasificación. Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Acinetobacter, son algunos de ellos, en general desprovistos de grandes atributos de virulencia demostrables, no producen enfermedad en el individuo sano, pero pueden comportarse como oportunistas en enfermos inmunodeprimidos. PSEUDOMONAS De las numerosas especies de Pseudomonas descritas sólo unas pocas tienen importancia en patología humana. Pseudomonas mallei y P. pseudomallei causan enfermedad severa en el hombre, pero se aíslan raramente en el hemisferio occidental. Por otra parte P. cepacia es un oportunista poco frecuentemente asociado con enfermedad en el hombre. Nos referiremos en particular a la especie Pseudomonas aeruginosa por su frecuencia en patología humana y por estar mejor estudiada que otros. Es un microorganismo versátil, ampliamente distribuido en el suelo, agua, plantas e intestino de animales. Puede causar enfermedad en el hombre, ciertos animales, plantas e insectos. El agua contaminada puede ser una fuente de infección para el hombre. Es susceptible a la desecación, pero sus habilidades metabólicas le permiten sobrevivir y multiplicarse en líquidos y ambientes húmedos de los hospitales. Sus requerimientos nutricionales son variados, se ha aislado P. aeruginosa de aguas termales, e incluso de soluciones desinfectantes en el hospital. La mayoría de las infecciones humanas están restringidas a los pacientes hospitalizados, que adquieren el microorganismo de fuentes ambientales (infección exógena) por contacto con vectores humanos o inanimados. 332 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA P. aeruginosa desarrolla bien en medios simples, utilizándose para su aislamiento los medios de cultivo de uso corriente en el laboratorio clínico. La identificación de cepas de P. aeruginosa típicamente productoras de pigmento no es difícil, pero las cepas no pigmentadas pueden presentar un problema. La mayoría se identifican por la producción de un pigmento, pyocyanina, soluble en agua, azul, no fluorescente. P. aeruginosa produce además otro pigmento, pyoverdina, soluble en agua, verde-amarillento, fluorescente; otras especies del género Pseudomonas también producen pyoverdina. Otros pigmentos, menos frecuentes pueden ser producidos por P. aeruginosa. La morfología colonial y el olor frutado de aminoacetofenona son elementos de una identificación sencilla, y aunque existen caracteres de identificación confirmatorios, son de uso poco corriente. Son bacilos Gram negativos, rectos o ligeramente curvos, móviles, con un solo flagelo polar. Oxidasa y catalasa positivos, aerobios estrictos, no fermentan glucosa, utilizan diversos azúcares oxidativamente con producción de ácido. Uno de los caracteres más constantes es su capacidad de desarrollar a 42 ºC. Producen varias enzimas, proteasas, lipasas, lecitinasas. Patogenia Las defensas inespecíficas del huésped son en general suficientes para prevenir la infección por P. aeruginosa, pero brechas en esta barrera permiten a P. aeruginosa invadir y causar infecciones de diversa gravedad. Producen el 10% de las infecciones nosocomiales, infectan heridas y quemaduras y causan infecciones pulmonares, sobre todo, neumonía nosocomial e infecciones respiratorias en pacientes con fibrosis quística. La fibrosis quística es una enfermedad genética asociada a un defecto en la secreción de cloro, caracterizada por la producción de mucina con una alteración de su composición iónica, inusualmente espesa. Esto lleva a una menor eficiencia de la mucina para limpiar las bacterias del pulmón y las vías aéreas y puede impedir el movimiento de las células fagocíticas. Estos hechos explican la susceptibilidad de los pacientes con fibrosis quística a la colonización con P. aeruginosa. Si los enfermos son tratados los síntomas pueden desaparecer pero las bacterias permanecen, presentando infecciones recurrentes. Las condiciones del paciente se ven agravadas con la infección a P. aeruginosa por las dificultades terapéuticas que se plantean debido a su alta resistencia a los antimicrobianos. Factores de virulencia P. aeruginosa posee los mismos tipos de factores de virulencia que otras bacterias capaces de causar enfermedad en el hombre inmunocompetente. Pero algo interesante es ¿por qué P. aeruginosa no es un patógeno franco y sólo es capaz de producir infecciones oportunistas? Es probable que P. aeruginosa sea ineficiente en su habilidad para llevar a cabo los primeros pasos de la infección; puede colonizar pero no invadir piel y mucosas sanas y tampoco dar infecciones persistentes con producción concomitante de factores tóxicos que dañen los tejidos del huésped. Adhesinas Produce al menos dos tipos de adhesinas proteicas, pili y adhesinas no pili. Los pili son pili tipo 4, similares a los de N. gonorrhoeae y se parecen también a los pili Tcp de V. cholerae. Permiten a la bacteria adherirse a las células epiteliales, preferentemente a receptores asialo-GM1. P. aeruginosa produce una neuraminidasa que saca los residuos de ácido siálico de GM1, creando sitios de unión para la pilina. Por otra parte, P. aeruginosa es capaz de unirse a la mucina TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 333 y lo hace por medio de las adhesinas no pili. Además del gen que codifica para la proteína estructural del pili otros genes codifican proteínas ensambladoras y reguladoras. Exoenzima S Es una enzima excretada que puede actuar como exotoxina. Tiene actividad de ADPribosilación como otras toxinas, pero aplicada en forma exógena no daña las células del huésped. Luego de internalizada intervienen proteínas de las células del huésped en la activación de la toxina para lograr su máxima actividad. Se sostiene que actuaría dificultando la acción de los fagocitos lo que facilitaría la sobrevida de P. aeruginosa en el torrente sanguíneo y órganos. En el pulmón actuaría inhibiendo la muerte intrafagocítica de las bacterias y promoviendo la infiltración fagocítica en el área. También puede presentar efecto tóxico directo en los pulmones. Exotoxina A Esta exotoxina tiene el mismo mecanismo que la toxina diftérica. Es una toxina A-B con tres unidades funcionales: • dominio R (región de unión al receptor celular); • dominio T (región que media la translocación de la porción enzimática al interior de la célula); • dominio C (región catalítica). Los dominios R y T se localizan en la cadena B y el dominio C en la cadena A. La cadena A es enzimáticamente activa por ADPribosilación del factor de elongación 2 (EF-2) de la síntesis proteica, que lo vuelve inactivo. Su receptor es una glicoproteína de las células del hospedero. La mayoría de los aislamientos clínicos la producen, y actuaría produciendo daño en los tejidos y disminuyendo la actividad de los fagocitos. Elastasas Elastina es el 30% de las proteínas del tejido pulmonar. Además está presente en la pared de los vasos sanguíneos. Es responsable de las propiedades elásticas de estos órganos que se expanden y contraen. P. aeruginosa tiene actividad elastolítica, produce dos enzimas que actuarían concertadamente: LasA y LasB. LasA actuaría clivando la elastina y permitiendo la acción de LasB, que es una zinc metaloproteasa, uno de cuyos substratos es la elastina. Estas enzimas actuarían en las etapas tempranas de la enfermedad, por daño directo de los tejidos, pero no en infecciones crónicas, debido a la presencia de anticuerpos antielastasas. También pueden intervenir degradando componentes del complemento e inhibidores de α1 proteinasa (inhibe el daño de los tejidos por las proteasas de los polimorfonucleares). En las infecciones crónicas, altos niveles de anticuerpos producidos pueden llevar a la formación de complejos inmunes y su depósito en el pulmón activar complemento y atraer polimorfonucleares (PMNs). Los PMNs producen su propia elastasa, más potente que LasA-LasB. Pequeñas cantidades de LasA pueden facilitar la degradación de la elastina pulmonar causada por la elastasa de los PMNs. Otras enzimas extracelulares Produce varias enzimas además de las mencionadas. Una lipasa alcalina y dos fosfolipasas, no bien estudiadas. Por otra parte, pyocianina puede funcionar como factor de virulencia. Puede dañar el tejido endotelial in vitro, lo que sugiere una acción in vivo. Un atributo de virulencia muy importante es la producción de alginato. Es un polímero de ácido mannurónico 334 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA y gulurónico que forma un gel viscoso alrededor de la bacteria. Las colonias que lo producen tienen aspecto mucoide. Para las bacterias marinas esto es un atributo importante para su supervivencia. P. aeruginosa ha adaptado esto a su supervivencia en el pulmón. En medios de cultivo ricos pierde esta propiedad. Esta capa que rodea a la bacteria y a las colonias de bacterias en el pulmón puede actuar como adhesina y probablemente, previene la ingestión fagocítica de la bacteria. Los genes que intervienen en su codificación están agrupados en un sector del cromosoma y organizados en un operón, poseen un sistema de regulación extremadamente complejo. El LPS también varía durante la transición mucoide-no mucoide. En cepas no mucoides el antígeno O del LPS tiene cadenas largas y carga negativa mientras que las cepas mucoides tienen cadenas más cortas y una composición de azúcares que lo hacen mucho más neutro; esto sería importante en la alta resistencia a algunos antibióticos que presenta P. aeruginosa, situación problemática en pacientes internados, pero dramática en los pacientes con fibrosis quística, que muchas veces presentan infecciones por P. aeruginosa resistente a todos los antibióticos disponibles. Práctico de bacilos Gram negativos B. Amorín • CASO 1: paciente de 30 años, sexo femenino, que comienza hace cuatro días con fiebre, disuria, polaquiuria y tenesmo. El día de la consulta agrega dolor en fosa lumbar izquierda. Al examen físico se presenta dolorida, febril (39 ºC axilar). Abdomen: dolor en puntos ureterales superior y medio. Tacto vaginal: punto ureteral inferior positivo. Diagnóstico clínico: infección urinaria. Práctico: se observarán placas de agar sangre y agar Mac Conkey, sembradas con la orina de la paciente, en las cuales se podrán apreciar colonias bacterianas. Se realizará, a partir de ellas, siembra con punta en medios de TSI (Triple azúcar hierro), citrato, urea y SIM (Movilidad-Indol-Sulfídrico), (ver descripción de medios y procedimiento al final del capítulo). Se mostrarán tiras reactivas comerciales, método que determina distintos parámetros urinarios, entre ellos esterasas leucocitarias. Discusión: se hablará de posibles etiologías, factores determinantes de las infecciones urinarias (gérmenes, mecanismos de agresión y vías de llegada), factores predisponentes (anatómicos, higiénicos y malformaciones). Se discutirá cómo se realiza la toma de muestra, el transporte, el procedimiento a emplear para sembrar un urocultivo. • CASO 2: paciente de 30 años, sexo femenino, con antecedentes personales de ser portadora de litiasis renal, que se encuentra internada desde hace varias horas con el diagnóstico de infección urinaria. A las 48 h del ingreso presenta picos febriles de 39 ºC, chuchos de frío y mal estado general. Al examen físico: depresión de conciencia, fascies tóxica, piel pálida y sudorosa. FC: 120 cpm, oliguria. Examen abdominal: hepatomegalia. Con el diagnóstico de sepsis a punto de partida urinario se comienza inmediatamente con el tratamiento. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 335 Práctico: se observarán placas de agar sangre sembradas a partir del hemocultivo en caldo de la paciente. Las colonias se sembrarán en medios de TSI, citrato, urea y SIM. Discusión: se discutirá el significado de la sepsis, como se expresa clínicamente, el punto de partida de la infección, diseminación y multiplicación del germen, mediadores y efectos fisiopatológicos de la sepsis, y se mencionarán que antibióticos se pueden utilizar en estos casos. • CASO 3: paciente de 52 años, con antecedentes personales de ser un alcoholista crónico, es traído al hospital. Al examen físico se encuentra somnoliento, en mal estado general. Febril (38,5 ºC axilar) y taquicárdico. Frecuencia respiratoria 36 rpm. Pleuropulmonar: el hemitórax derecho se moviliza menos con la respiración. A la percusión dolor y matidez en dos tercios superiores de dicho hemitórax. A la auscultación: murmullo alveólovesicular abolido en esa topografía y soplo tubario. La radiografía de tórax muestra una imagen homogénea que ocupa los dos tercios de la superficie del hemitórax derecho, con borramiento del fondo de saco pleural. Diagnóstico: neumonía aguda con derrame pleural. El cultivo del esputo y los hemocultivos fueron positivos para un bacilo Gram negativo. Práctico: observaremos placas de agar sangre y medio Mac Conkey. Las colonias sospechosas se sembrarán en TSI, citrato, FA y SIM. Se observarán frotis teñidos con tinta china para observación de la cápsula. Discusión: discutiremos los agentes etiológicos, factores predisponentes y los mecanismos defensivos a nivel del aparato respiratorio. • CASO 4: paciente de 4 años que recibe quimioterapia por leucemia linfocítica aguda (en remisión). Ingresa por fiebre de 41 ºC rectal y fatiga. Al examen físico: pálido, polipneico y taquicárdico. Frialdad periférica y sudoración. En el cuello presenta una vía venosa central, sin signos inflamatorios. Pleuropulmonar: sin particularidades. El resto del examen físico fue normal. Luego de las tomas para hemocultivo se inició antibioticoterapia por vía i/v. En las horas siguientes su estado se agrava, requiriendo intubación orotraqueal, asistencia respiratoria mecánica y reposición de fluidos. Diagnóstico: shock séptico. Los hemocultivos fueron positivos para Pseudomonas aeruginosa. Práctico: se observarán en placas de agar sangre, TSA y Mac Conkey, las colonias sospechosas, y se sembrarán con punta en TSI y el medio OF (óxido-reducción). También realizaremos la prueba de oxidasa. Discusión: enfatizaremos en los factores predisponentes que explican en este niño la infección por Pseudomonas aeruginosa; qué otros cuadros clínicos puede ocasionar, sus mecanismos patogénicos y la terapéutica antibiótica que se emplea en estos casos. • CASO 5: paciente de 20 años, sexo masculino, internado en el CTI por sufrir politraumatismos al chocar con su moto. Por presentar traumatismo de tórax con neumotórax e 336 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA insuficiencia respiratoria, requirió un tubo de drenaje bajo agua, intubación orotraqueal y conexión a un ventilador mecánico. A los 4 días de internación se presenta febril con 40 ºC, fascies tóxica, palidez cutaneomucosa. Taquicardia. Presión arterial de 70/50. Abdomen: hepatoesplenomegalia. Diagnóstico: shock séptico. Se realizaron tres hemocultivos que fueron negativos. Se realiza fibrobroncoaspiración de secreciones respiratorias, donde se aísla bacilo Gram negativo. Práctico: se procederá a la observación del crecimiento en placas de agar sangre y de TSA. Las colonias sospechosas se sembrarán con punta en TSI. Realizaremos la prueba de oxidasa y mostraremos otro método de diagnóstico comercial que es fácil de realizar y rápido. MEDIOS Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS Para el cultivo de los bacilos Gram negativos se utilizarán diferentes tipos de medios: • Medios simples: son aquellos que contienen pocas sustancias nutritivas. Ejemplo: agar nutriente. • Medios ricos: son aquellos a los cuales se añaden ingredientes nutritivos, habitualmente de composición química no bien definida, como peptona, extracto de carne, extracto de levadura, líquidos orgánicos; que permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos de la más amplia exigencia nutricional. Ejemplo: agar sangre. • Medios diferenciales: son aquellos a los que se agrega un indicador de pH de distinta índole y que contienen un azúcar degradable por la bacteria, el cual cambiará de color (viraje del indicador) cuando un grupo de organismos determinado se desarrolla en él utilizando ese carbohidrato. Ejemplo: agar-lactosa-rojo-fenol. • Medios selectivos y diferenciales: son medios a los que se agrega por ej. lactosa, rojo neutro y otras sustancias tales como cristal violeta, que permite el crecimiento de bacilos Gram negativos e inhibe el desarrollo de los Gram positivos. Ejemplo: agar Mac Conkey. Medios de identificación Se incluyen bajo este nombre todos aquellos medios que ponen en evidencia distintas propiedades fisiológicas de las bacterias, por ejemplo: reacciones bioquímicas o enzimáticas, movilidad, producción de pigmento, etc. Prueba de la oxidasa Pone en evidencia la enzima indofenol-oxidasa, mediante la oxidación de un colorante previamente reducido, que cambia de color en su presencia. Permite diferenciar entre bacilos Gram negativos no fermentadores, como Pseudomonas, que son oxidasa positivos, de aquellos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Se toma una porción de una colonia pura de 24 horas, con una pipeta pasteur, se deposita sobre una tira de papel impregnada en el reactivo de oxidasa. LECTURA: Reacción positiva: aparición de un color rojo violáceo entre los 10 y 60 segundos. 337 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Metabolismo energético (oxidativo-fermentativo) El medio utilizado se denomina OF, que es semisólido y tiene azul de bromotimol como indicador de pH, y una baja concentración de glucosa. Se siembra en dos tubos en profundidad con una punta, un tubo sin vaselina y el otro con vaselina. Se incuba a 37 ºC por 24 h. Ver tabla 4 Tabla 4. Tipo de metabolismo oxid./ferm. oxidativo inactivo Tubo abierto amarillo en todo el tubo amarillo en superficie no viraje Tubo cerrado amarillo en todo el tubo no viraje no viraje Metabolismo de los carbohidratos Se explora por la adición al medio (que puede ser sólido, semisólido o líquido), de el o los carbohidratos deseados más un indicador de pH. Ejemplo: TSI. Este medio sirve de guía como primera aproximación al estudio de bacilos Gram negativos. Es un medio sólido con una concentración de lactosa y sacarosa al 1% y de glucosa al 0,1%, peptonas, sulfato ferroso y rojo fenol como indicador de pH (pH ácido = amarillo, pH alcalino = rojo, pH neutro = rojo pálido). Se reparte en tubos dejando una superficie inclinada (slant), y un fondo (butt) de 3 a 4 cm de profundidad. Se siembra por puntura y en superficie. Se incuba a 37 ºC por 18-24 horas. LECTURA: se lee el cambio de pH (viraje del indicador) desde la superficie al fondo, la producción de gas (burbujas) y de gas sulfhídrico; registrándolo del modo siguiente: por ej. A/A gas (+) H2S (-). Si el único carbohidrato utilizado es la glucosa, se observará la superficie roja y el fondo amarillo (K/A). La superficie alcalina indica que luego de la degradación aeróbica de la glucosa, debido su baja concentración en el medio, el organismo comienza a utilizar las peptonas como nutrientes, cuyos productos finales son alcalinos. En el fondo, la degradación de la glucosa produce metabolitos ácidos que viran el indicador al amarillo y no pueden ser transferidos al ambiente. Si además de usar la glucosa, la bacteria utiliza la lactosa o la sacarosa, se produce una reacción ácida tanto en la superficie como en el fondo del tubo. Si ninguno de los azúcares es metabolizado, se observa un viraje al rojo por la utilización de las peptonas del medio. Si hay producción de gas sulfhídrico el medio se observa de color negro. Metabolito proteico Puede ser explorado estudiando los procesos de desaminación y decarboxilación de varios aminoácidos, como por ejemplo, la prueba de la desaminación de la fenilalanina a ácido fenil pirúvico por actividad enzimática microbiana. Es un medio sólido repartido en tubo inclinado, se siembra en superficie con asa y se incuba a 37 ºC por 18 a 24 h. Para la lectura se agrega al cultivo 4 o 5 gotas de cloruro férrico al 10%. LECTURA: la reacción es positiva si se observa un color verde en la superficie. Es negativa si no hay cambios, observándose un color amarillo característico del cloruro férrico. Prueba del citrato Determina la capacidad de un germen de utilizar el citrato como única fuente de carbono y energía. El desarrollo bacteriano provoca un viraje del indicador de pH (azul de bromotimol) del verde (neutro) al azul (alcalino), porque los gérmenes producen metabolitos alcalinos a 338 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA partir de las sales de amonio contenidas en el medio. Es un medio sólido repartido en tubo inclinado; se siembra en superficie y se incuba 24 a 48 h a 37 ºC. LECTURA: reacción positiva: se observa un intenso color azul. Reacción negativa: no hay desarrollo ni cambio de color. Prueba de la ureasa Determina la habilidad de un microorganismo de hidrolizar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa. La alcalinización del medio por el hidróxido de amonio hace virar el indicador de pH (rojo fenol). Es un medio líquido, de color naranja pálido que se siembra con asa, y se incuba a 37 ºC por 24 horas. LECTURA: reacción positiva: cuando hay viraje del indicador al rosa intenso. Reacción negativa: el color permanece incambiado. SIM Es un medio semisólido que contiene 0,3% de agar. Se siembra con punta en profundidad. Se incuba 24 horas a 37 ºC. Se observan tres características: • Movilidad, cuando el desarrollo se produce en todo el medio causando turbidez difusa; o inmovilidad, cuando el desarrollo se produce sólo a lo largo de la línea de siembra. • Producción de sulfhídrico: se observa un precipitado de color negro. • Producción de indol a partir del triptofano: al agregar un reactivo (Kovacs o Ehrlich) se forma un anillo rojo intenso en la superficie del medio. Bibliografía • Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiología. 20ª ed. BsAs. Panamericana; 1994. • Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC (h). editores. Diagnóstico Microbiológico, Texto Atlas Color. 5ª ed. Bs As. Panamericana. 1999. • Salyers AA, Whitt DD. editors. Bacterial Patogenesis, a molecular approach.2nd. ed. Washington, D.C. ASM Press. 2001. • Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. editors. Bailey & Scott´s. Diagnostic Microbiology. 11th. ed. St. Louis, Missouri. 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Como veremos, esto tiene grandes implicancias médicas, en la industria alimentaria, en los procesos de esterilización e increíblemente, en el bioterrorismo. La endospora puede, en condiciones favorables, germinar y dar lugar a la célula vegetativa. Deben diferenciarse las esporas bacterianas, que constituyen una forma de resistencia y no tienen función reproductora, de las de los hongos, que tienen función reproductora, son externas, numerosas y que no confieren resistencia. Recuérdese que una espora bacteriana da lugar a una única célula vegetativa. Si bien dentro de los bacilos Gram positivos (BGP) se encuentran algunos de los patógenos más agresivos para el ser humano, la gran mayoría de las especies bacterianas de este grupo no son patógenos primarios. Muchos forman parte de la flora normal del cuerpo humano (piel, tracto gastrointestinal, cavidad oral) y se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente. Por este motivo, se debe ser cuidadoso en la interpretación del hallazgo de un BGP en un estudio microbiológico, ya que frecuentemente se trata de contaminantes. De acuerdo a su comportamiento frente al oxigeno los BGP se dividen en: a) aerobios: Bacillus spp, Listeria spp, Corynebacterium spp, Erysipelothrix spp, etc. b) anaerobios: Clostridium spp, Eubacterium spp, Propionibacterium spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Mobiluncus spp, etc. En este capítulo nos referiremos únicamente a los BGP aerobios de importancia médica. Éstos pueden ser clasificados según su morfología en: 1. Esporulados: Bacillus spp 2. No esporulados: 2a. regulares: Listeria spp.; Erisipelothrix spp. 2b. irregulares: Corynebacterium spp.; Nocardia spp. 340 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Esporulados BACILLUS Características generales Este género es prototipo de la familia Bacillaceae. Son BGP grandes y esporulados, no exigentes y en general móviles. Incluye bacterias aerobias y anaerobias facultativas. Están ampliamente distribuidos en la naturaleza; algunos forman parte de la flora normal y suelen ser contaminantes del laboratorio. El manual Bergey’s de sistemática bacteriana describe 34 especies, pero Bacillus anthracis es el más importante en microbiología médica y veterinaria. Existe una gran diversidad de contenido G+C en su genoma, 32-62 mol % dentro del género, lo que refleja su gran heterogeneidad. Ciertos miembros del género tienen implicancias médicas por la producción de antibióticos como polimixina y bacitracina, además de uso industrial en la producción de solventes, enzimas, vitaminas, etc. Bacillus anthracis El carbunco o ántrax (evitar la confusión con el término carbunclo) fue una de las primeras infecciones bacterianas para las cuales se estableció definitivamente la causa. Dio lugar al desarrollo de la primera vacuna bacteriana que fue desarrollada por Louis Pasteur. Es una enfermedad que afecta sobretodo a animales herbívoros, en particular ovinos y bovinos. El hombre la adquiere de forma accidental: en el contexto agrícola como una infección cutánea local, en el contexto industrial (manipuladores de cuero y pelo de animal) como una neumonía (poco frecuente). Es entonces, una zoonosis y una enfermedad laboral. Por producir endosporas altamente resistentes y ser capaz de producir infecciones respiratorias graves, es un arma biológica potencial. De hecho, es conocido el episodio de bioterrorismo que ocurrió en Estados Unidos hace algunos años, que dio lugar a varias muertes y que alarmó enormemente al mundo entero. Morfología y fisiología de B. anthracis Microscopía: bacilos rectos de extremos cuadrados de 3-5 µm de largo y 1-1.2 µm de ancho, aislados o en pares. Es inmóvil a diferencia de la mayoría de las otras especies del género. Cuando desarrolla in vivo presenta cápsula, pero para demostrarla in vitro debe cultivarse en medios especiales (por ej. medios con bicarbonato e incubación a 6% de CO2). La endospora es elíptica, ubicada centralmente, y no modifica el soma bacteriano; no se produce en tejidos de animales vivos, pero si en cultivos de varios días, suelos o animales muertos. Macroscopía: luego de 24 horas de cultivo, las colonias son grandes (2-3 mm de diámetro), sobreelevadas, blanco-grisáceas, opacas y de bordes irregulares, en aspecto de “cabeza de medusa”. Tienen una consistencia membranosa con dificultad para emulsionarlas. No producen hemólisis. Características del cultivo: se realiza en aerobiosis, crecen bien en cualquier medio, pero se visualiza mejor la morfología de las colonias en agar sangre al 5%, pH 7-7,4 y 37 ºC. Resistencia: la célula vegetativa es comparable con otras bacterias no esporuladas pero, debido a su capacidad para esporular, es sumamente resistente. Las esporas permanecen viables durante años en el ambiente. Esta propiedad fue demostrada por experimentos de guerra biológica realizados en Escocia, que consistieron en la dispersión de 4 x 1014 esporas, cuya persistencia se demostró por más de 20 años, lo que requirió posteriormente la desinfección de la zona con formaldehído. Pueden ser destruidas si son sometidas a esterilización, siendo la TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 341 estructura viva más resistente (solo los priones son más resistentes, pero difícil considerarlos como estructuras vivas). En base a esto esporas de especies de Bacillus distintas a B. anthracis, son utilizadas como controles biológicos de esterilización (ver capítulo de Esterilización, desinfección y antisepsia). Estructura antigénica Poseen tres antígenos principales: • Polipéptido capsular de gran peso molecular formado casi exclusivamente por ácido Dglutámico. Esta es la única especie bacteriana de importancia médica que posee cápsula peptídica en lugar de polisacárida. Existe un único determinante antigénico. Por razones no muy bien conocidas los anticuerpos anticápsula no son protectores. Los genes que codifican esta estructura se encuentran en un gran plásmido. • Antígeno somático polisacárido, es un componente de la pared celular. Los anticuerpos no son protectores. Reacciona en forma cruzada con la sangre de tipo A y Streptococcus pneumoniae tipo 14. • Toxinas: factor edema y toxina letal. Determinantes de patogenicidad de B. anthracis No todas las cepas de B. anthracis son capaces de producir carbunco. Los principales atributos de virulencia de las cepas que producen enfermedad están codificados en dos plásmidos y son: • Toxinas Produce dos toxinas modelo A-B, que poseen idéntica subunidad B. La subunidad B se conoce como antígeno protector. Es la porción de la toxina que se fija al sitio blanco y permite el ingreso a la célula. – Toxina edema: su subunidad A es el componente enzimáticamente activo; se denomina factor edema. Es una adenilato-ciclasa calmodulina-dependiente. Es responsable del importante edema en los sitios de infección, la inhibición de la función de los neutrófilos y obstaculiza la producción de factor de necrosis tumoral (TNF) e interleuquina 6 (IL-6) por parte de los monocitos. – Toxina letal: su porción A, llamada factor letal, es una metaloproteasa que inhibe la señalización transduccional intracelular. Estimula la liberación de TNF e IL-1 por parte de los macrófagos; este mecanismo parece contribuir a la muerte por bacteriemia. • Cápsula Al igual que sucede con otras bacterias la cápsula es un importante factor de virulencia al inhibir la fagocitosis. Infección clínica de B. anthracis Epidemiología La infección veterinaria tiene una alta tasa de mortalidad por sepsis. En los humanos es una enfermedad actualmente poco frecuente. Dependiendo de la vía de transmisión, produce dos clases de infecciones principales: una cutánea relativamente benigna y una respiratoria que compromete la vida del paciente. La infección cutánea se produce por contacto directo con animales infectados. La infección respiratoria requiere la vía inhalatoria, la cual, para ser efectiva, requiere que los ésporos bacterianos sean aerosolizados. Por este motivo, esta vía raramente ocurre de manera natural y despierta la sospecha de intencionalidad (bioterrorismo), aunque se han asociado casos de ántrax inhalatorio con el procesamiento a gran 342 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA escala de pelos y lana de animales contaminados realizado en espacios pequeños y cerrados. Excepcionalmente se produce una forma gastrointestinal por la ingesta de esporas bacterianas, a partir de carne contaminada. No se transmite de persona a persona. Patogenia El carbunco cutáneo se produce por contacto de la piel con material infectado. Los ésporos ingresan a través de una lesión de la piel. Al ser ingeridos por los macrófagos en el sitio de entrada, los ésporos germinan y las células se multiplican produciendo cápsula y toxinas. El carbunco pulmonar ocurre cuando las esporas ingresan a la vía aérea y se depositan en los espacios alveolares, donde son fagocitadas por los macrófagos alveolares. En el interior de los mismos germinan y producen las toxinas, para ser luego transportadas por la circulación linfática a los ganglios mediastinales. Alcanzan el torrente sanguíneo pudiendo causar shock séptico. La germinación puede ocurrir hasta 60 días después del ingreso de las esporas a la vía respiratoria; de ahí la importancia de que la profilaxis antibiótica en casos de exposición se prolongue por 60 días. Se estima que la dosis inhalatoria letal para los seres humanos es de 2500 a 55000 esporas. Manifestaciones clínicas La infección cutánea, que comprende el 95% de los casos humanos, se manifiesta por una pápula indolora de centro color negro-azulado con un gran borde edematoso. Sin tratamiento tiene un 20% de mortalidad. La infección pulmonar es una severa infección respiratoria que evoluciona a la insuficiencia respiratoria aguda y tiene una muy alta tasa de mortalidad (100% sin tratamiento). Sensibilidad antibiótica Es sensible a penicilina (aunque existen informes de unos pocos casos resistentes), eritromicina, tetraciclina, gentamicina, cloranfenicol y quinolonas. Prevención El control del carbunco humano depende fundamentalmente del control del carbunco animal. Así, deben tomarse medidas como la vacunación del ganado y manejo adecuado del ganado muerto, ropa y material de trabajo, etc. Inmunización activa Se dispone de vacuna elaborada con subunidades B, obtenidas por filtración. Actualmente no se usa en forma sistemática, solo es utilizada en situación de mayor riesgo (personal militar, sobre todo). A nivel veterinario se utiliza una vacuna de mayor eficacia, elaborada a partir de esporas vivas, de cepa no capsulada. Esta en estudio una vacuna recombinante de subunidades B. Otros Bacillus de importancia B. cereus: es agente de toxiinfección alimentaria, es capaz de producir una enterotoxina termoestable que produce vómitos y una termolábil responsable del síndrome diarreico. El arroz y otros vegetales son los principales vehículos de transmisión. En Uruguay, entre 1995 y 2001, se notificaron 3 brotes de enfermedad transmitida por alimentos (ETA). Morfológicamente es similar a B. anthracis pero se diferencia por ser móvil y resistente a la penicilina. Produce una β-lactamasa y es también resistente al trimetoprim-sulfametoxazol. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 343 Es agente también de infecciones oculares. B. stearothermophilus: se utiliza como control biológico en el autoclave. B. subtilis: presente en el aire y polvo, es un contaminante del laboratorio pero puede producir enfermedad en inmunodeprimidos. Se utiliza como control biológico en el horno Pasteur y esterilización con ETO gas. B. thuringiensis: es utilizado como pesticida por producir una toxina letal para ciertos insectos. No esporulados regulares LISTERIA Género de cocobacilos cortos ubicuos en la naturaleza. El más importante en microbiología médica es L. monocytogenes, ya que es el principal patógeno humano. Excepcionalmente se han reportado infecciones por L. ivanovii (en animales es responsable de abortos). Las mujeres embarazadas son especialmente susceptibles a las infecciones por Listeria, también afecta a otros individuos con alteraciones del sistema inmune, en especial de la inmunidad celular: personas añosas, recién nacidos, cirróticos, trasplantados, personas afectas de cáncer, las que reciben terapia inmunosupresora, etc. L. monocytogenes Morfología y fisiología Microscopía: cocobacilos, Gram positivos, de 0,5 - 2 µm por 0,5 µm, que se presentan aislados o agrupados en cadenas cortas; móviles por presentar de 1 a 5 flagelos a 28ºC. Macroscopía: colonias pequeñas (0,5 – 1,5 cm.), translúcidas. En agar sangre produce colonias similares a Streptococcus spp. Las cepas patógenas producen un halo muy estrecho de β-hemólisis; frecuentemente es necesario remover las colonias para visualizar la hemólisis. Fisiología y características bioquímicas: son aerobios facultativos, pero su crecimiento es estimulado con la disminución en la tensión de O2 y CO2 al 5-10%. Su crecimiento óptimo es a 30-37ºC pero puede proliferar a 4ºC en unos días; esta característica fisiológica es útil para su aislamiento selectivo, ya que otras bacterias de interés médico no son capaces de desarrollar a tan bajas temperaturas (técnica de enriquecimiento en frío). Por otra parte, le confiere a la bacteria una ventaja ya que es capaz de desarrollar en alimentos refrigerados y así dar origen a infecciones a partir del consumo de los mismos. No son exigentes nutricionalmente. Son catalasa positivos (a diferencia de los Streptococcus spp), fermentan azúcares como la glucosa, manosa y ramnosa, pero no el manitol (a diferencia de otras especies no patógenas); también hidrolizan la esculina. Tienen cuatro flagelos, los que se pierden cuando ingresan al ser humano. Cuando se siembran en medios semisólidos en tubo y se incuban a 25ºC, muestran una movilidad característica en aspecto de “sombrilla”, la cual no se observa cuando se incuba a 37ºC. Estructura antigénica Los determinantes antigénicos más caracterizados son el antígeno O (somático) y antígeno H (flagelar) que permiten la clasificación en diferentes serotipos. Hasta la fecha se han descrito 13 serotipos. La mayoría de las infecciones humanas son producidas por un serotipo en particular (4b), mientras que en alimentos predominan otros serotipos diferentes. La serotipificación es útil en estudios epidemiológicos. 344 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Determinantes de patogenicidad Explicarían en parte la capacidad de L. monocytogenes de proliferar dentro de las células ya que es un microorganismo intracelular facultativo (principalmente en macrófagos y células epiteliales). • Productos solubles excretados: listerolisina O (LLO), es una hemolisina. Su prototipo es la estreptolisina O y la pneumolisina, de los estreptococos. Rompe la membrana del fagosoma y permite la reproducción de la bacteria en un medio menos hostil, el citoplasma de la célula huésped. Además, inhibe el procesamiento del antígeno mediado por macrófagos. Recientemente se ha demostrado que genera un influjo de calcio extracelular que estimula el ingreso de la bacteria en las células epiteliales. Codificada por el gen hly. • Internalinas: se conocen dos proteínas, A y B, que están involucradas en el ingreso a las células. • Sideróforos: componentes bacterianos que captan hierro, mineral indispensable para la supervivencia bacteriana. • Otros: fosfolipasas, etc. Infección clínica Epidemiología De distribución mundial, ubicuo en la naturaleza se encuentra en diferentes animales, suelos, plantas y agua. Al parecer su hábitat primario es el suelo y la materia vegetal en descomposición. Además se halla en el intestino del 5 al 10% del hombre, sin causar enfermedad. Es un importante patógeno veterinario y se transmite al hombre por el consumo de alimentos contaminados de origen animal. Es por lo tanto, otro ejemplo de zoonosis y ETA. Tiene una tasa de mortalidad mayor a la de otras bacterias de transmisión alimentaria. Patogenia Es importante recordar que la inmunidad del huésped es en general efectiva contra Listeria y que se desarrolla enfermedad dependiendo de la dosis infectante (se requiere altas dosis, mayor a 109), de los determinantes de virulencia, y de la inmunidad celular del huésped. Ingresan por vía digestiva e inducen la fagocitosis por parte del enterocito, siendo incluidas en un fagosoma (antes de formarse el fagolisosoma), del cual escapan rápidamente para multiplicarse en el citoplasma de la célula huésped. Una de las proteínas responsables de esto es la LLO. En el interior del citoplasma celular son capaces de polimerizar los filamentos de actina en uno de los polos bacterianos. De esta forma es impulsada hacia la periferia, a la membrana citoplamática, formando allí protrusiones o pseudópodos lo que le permite luego penetrar en otra célula adyacente. Así, es capaz de moverse célula a célula sin estar expuesta a los anticuerpos, el complemento o los polimorfonucleares. Por ello es más importante la inmunidad celular que la humoral. Finalmente alcanzan el torrente circulatorio y de allí alcanzan otros órganos, teniendo predilección por el sistema nervioso central y la placenta. La infección connatal se trasmite de diferente manera. Las mujeres embarazadas infectadas pueden transmitir la infección al feto por vía transplacentaria. No se ha demostrado claramente la transmisión en el canal de parto. Manifestaciones clínicas Se describen dos tipos de listeriosis: materno-fetal y no materno-fetal. En el primer caso, la mujer embarazada sufre infecciones en general leves y autolimitadas TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 345 (excepto cuando se produce corioamnionitis) que pueden incluso pasar desapercibidas, o que se manifiestan por malestar general, cefaleas, mialgias, fiebre de bajo grado. En cambio la infección en el feto es grave y puede dar lugar a óbito o al parto prematuro de un recién nacido infectado. El espectro de manifestaciones clínicas en el recién nacido es similar al producido por Streptococcus agalactiae, son: un cuadro de instalación precoz de sepsis, y un cuadro de instalación tardía que se manifiesta en general por meningitis. Es discutido si este último ocurre cuando la transmisión se produce en el canal de parto, ya que esta vía de infección no se ha demostrado claramente. La principal forma de presentación de la listeriosis no materno-fetal es la bacteriemia sin foco evidente. Le sigue en frecuencia la meningitis. En los últimos años, varias investigaciones han sugerido que Listeria puede causar gastroenteritis, incluso en adultos inmunocompetentes. Debido a que por lo menos un 5% de personas sanas son portadoras intestinales de Listeria, es difícil determinar si son agentes etiológicos de diarrea. Otras infecciones mucho menos frecuentes incluyen: endocarditis, infecciones localizadas (conjuntivitis, infecciones de piel, linfadenitis), abscesos profundos, etc.; se descartó como agente de infección cervicovaginal clínica. Sensibilidad antibiótica Es sensible a penicilina, ampicilina, eritromicina, tetraciclina, cloranfenicol y rifampicina. Es moderadamente sensible a las quinolonas y las cefalosporinas de tercera generación carecen de efectividad in vitro. Recientemente aparecieron cepas resistentes a cloranfenicol, macrólidos y rifampicina. Para el tratamiento es necesario que estos antibióticos penetren las células, y en casos de meningitis que atraviesen la barrera hematoencefálica; para esto se utiliza ampicilina con un aminoglucósido como gentamicina. Prevención No se dispone de vacunas. La profilaxis depende de las medidas de control que se aplican para cualquier enfermedad de transmisión alimentaria, con especial cuidado en las mujeres embarazadas y personas inmunocomprometidas. ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE La enfermedad humana por este agente es muy poco frecuente y se limita a trabajadores de la pesca, de mataderos, carniceros, etc., configurando una enfermedad laboral. Es un microorganismo ampliamente distribuido en la naturaleza. Es un bacilo Gram positivo, microaerófilo y exigente, que no produce cápsula ni esporas. Es inmóvil, catalasa negativo, produce H2S y alfa hemólisis. Como uno de los mecanismos de patogenicidad presenta hialuronidasa y neuraminidasa. Produce una celulitis “erisipeloide” caracterizada por una lesión eritematosa púrpura, dolorosa, no supurada, pruriginosa. En general el proceso es autolimitado y rara vez causa enfermedad sistémica. Produce además endocarditis. Es sensible a penicilina (puede sustituirse por eritromicina en alérgicos). No esporulados irregulares CORYNEBACTERIUM Es un género con numerosas especies (más de 46), algunas de ellas forman parte de la flora normal de mucosas y piel del ser humano; excepcionalmente algunas de ellas causan enfer- 346 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA medad en pacientes inmunodeprimidos. La especie patógena por excelencia es C. diphtheriae, responsable de una grave enfermedad: la difteria. Son bacilos pleomórficos, no esporulados y no ácido-alcohol resistente. La mayoría fermentan la glucosa y son catalasa positivos. Su genoma contiene de 51 a 68 mol % de G + C, y mediante el estudio del 16s rARN se lo encontró estrechamente relacionado con Mycobacterium, Nocardia y Rhodococcus. Corynebacterium diphtheriae Es por excelencia la especie más importante del género. Se describen cuatro biotipos: gravis, mitis, belfanti e intermedius; su importancia es epidemiológica. Morfología y fisiología de C. diphteriae Microscopía: bacilo delgado en forma de clava, mide 1,5-5 µm de ancho y 0,5-1 µm de largo; es Gram positivo, no esporulado e inmóvil. Aparecen agrupados formando estructuras que semejan letras chinas. Con azul de metileno se observan gránulos metacrómaticos característicos que los diferencian de otras especies de Corynebacterium. Macroscopía: las colonias típicas son pequeñas, blanco grisáceas brillantes. En medios selectivos con telurito se ven grisáceas a negras. La presencia y el tipo de hemólisis es variable. Es un microorganismo anaerobio facultativo, pero crece mejor en medios aerobios. Es exigente desde el punto de vista nutricional. Su pared celular está compuesta por ácido mesodiaminopimélicos (no L-lisina), polímeros de arabino galactano y ácidos micólicos de cadena corta (por ello su posición taxonómica y su relacionamiento con Nocardia, Mycobacterium y Rhodococcus). Resistencia: dentro de las bacilos no esporulados C. diphtheriae es uno de los más resistentes a la luz, desecación y congelamiento. Pero son susceptibles a los desinfectantes de uso habitual. Estructura antigénica Los más caracterizados son: • Antígeno K: son proteínas termolábiles localizadas sobre la superficie, son uno de los principales factores de virulencia. Responsables de la especificidad de tipo. • Antígeno O: es un polisacárido que contiene arabinogalactanos y es el antígeno responsable de la reactividad cruzada con Mycobacterium y Nocardia. • Factor de cordón: glicolípido un muy importante factor de virulencia. • Toxina Determinantes de patogenicidad Los más importantes son: • Factor de cordón: contiene los ácidos micólicos propios de C. diphtheriae, tiene actividad similar al de Mycobacterium spp; en las células del ratón provoca rotura de las mitocondrias, disminución de la respiración y la muerte. • Antígeno K: antes mencionado, responsable de inmunidad antibacteriana, hipersensibilidad e inmunidad antitóxica. Provee invasividad junto al factor de cordón. • Neuraminidasa y N-acetilneuraminato liasa. • Exotoxina: es el principal determinante de patogenicidad y explica casi todos los síntomas sistémicos de la enfermedad. Dicha toxina es producida por las cepas de C. diphtheriae infectadas por un bacteriófago TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 347 temperado que transporta el gen estructural para la toxina; en general es un fago β tox+. La expresión del gen tox está sumamente regulada por factores genéticos y fisiológicos. La toxina sólo se produce a niveles máximos cuando declina el crecimiento bacteriano, cuando las concentraciones de hierro en el medio disminuyen. Esto parece estar regulado de forma que cuando hay hierro en el medio se forma un complejo represor-hierro que se une específicamente al operador tox del fago β. En condiciones de baja concentración de hierro en el medio, el complejo se disocia y el gen tox, se desreprime y se sintetiza la toxina. La toxina se sintetiza a nivel de los polisomas de la membrana de C. diphtheriae y es secretada co-traduccionalmente como una cadena polipeptídica no tóxica. Adquiere su toxicidad al actuar la tripsina que pone al descubierto sus sitios enzimáticos activos. Es un modelo A-B de toxina: la subunidad B (sitio de unión a la célula eucariota) unida a la subunidad A (sitio enzimático activo) por un puente disulfuro. Acción: la toxina ingresa a la célula y al llegar al citoplasma altera la síntesis proteica. La subunidad A produce una ADP-ribosilación del factor de elongación EF-2 de los ribosomas celulares, lo que produce su inhibición. Los ribosomas al poseer un solo EF-2 quedan inhibidos por una sola subunidad A. Se produce así la inhibición de la síntesis proteica lo que lleva rápidamente a la lisis celular, produciendo necrosis e inflamación local de la mucosa. Además, esta toxina es la responsable de los efectos sistémicos de la enfermedad ya que produce toxicidad cardíaca, del sistema nervioso central y periférico, y daño renal. Infección clínica de C. diphteriae Epidemiología La difteria es una enfermedad de distribución mundial, pero con una incidencia notablemente variable según el grado de inmunización en la región. En nuestro país, la vacunación se incluyó en el PAI (programa ampliado de inmunización) por lo que todos los niños están vacunados; lo que disminuye la frecuencia y la severidad de la enfermedad. La vacunación ha logrado que no existan casos notificados en nuestro país actualmente, el último caso se notificó hace alrededor de 30 años. El ser humano es el único huésped natural de C. diphtheriae. Los portadores asintomáticos y los individuos en etapa de incubación son las principales fuentes de infección. Inmunidad Se adquiere por la presencia en sangre de la antitoxina (anticuerpos antitoxina), adquirida de manera pasiva (como los lactantes de hasta 6 meses) o por inmunización activa (infección natural o vacunación). El estado inmune de una persona puede ser evaluado por medio de la prueba de Schick, similar al PPD utilizado en la tuberculosis. Patogenia Se trata de una enfermedad toxigénica. La bacteria no tiene gran capacidad de invasión y en general persiste en la superficie de las mucosas y la piel, desde donde produce la toxina con actividad sistémica. La infección respiratoria se trasmite principalmente por las gotitas de Pflügge y las lesiones cutáneas altamente infectantes son fuente de enfermedad faríngea y cutánea. Dicha transmisión se ve favorecida por el hacinamiento y el frío. Los microorganismos se establecen en la orofaringe y amígdalas y se reproducen con rapidez. Luego comienzan a secretar la exotoxina que produce necrosis local y gran respuesta inflamatoria con la producción de exudados fibrinosos, que se van organizando y forman una seudomembrana gruesa y muy adherente. 348 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA Dicha pseudomembrana junto con el edema y las importantes adenomegalias locales producen obstrucción respiratoria alta (crup). Las manifestaciones sistémicas de la enfermedad se deben a la toxicidad cardíaca y del sistema nervioso periférico que produce la toxina. Manifestaciones clínicas • Enfermedad respiratoria: es una amigdalitis con fiebre y malestar general. Puede ser leve o muy grave cuando compromete nasofaringe y tráquea; las seudomembranas, características de esta faringoamigdalitis, y el edema que se forman pueden llevar a la asfixia y a la muerte del paciente. • Cutánea: se produce más frecuentemente en zonas cálidas del mundo. • Complicaciones: disfunción miocárdica, afección de los pares craneanos y polineuritis periférica; todas lesiones reversibles. Sensibilidad antibiótica Es sensible a penicilina y eritromicina, como alternativa para pacientes alérgicos. Debe ser administrada tempranamente junto con la antitoxina. Prevención Inmunización activa En nuestro país se realiza mediante la vacunación con la vacuna pentavalente en el 1er año de vida que contiene toxoide diftérico, tetánico y gérmenes muertos de B. pertussis, además de polisacárido capsular de H. influenzae y antígenos del virus de la hepatitis B. Luego se hace refuerzo administrada solamente junto al toxoide tetánico. El toxoide diftérico se prepara a partir de la toxina diftérica tratada con formalina al 0,3% a 37ºC. NOCARDIA Pertenece a la familia Nocardiaceae, suborden Corynebacterineae, perteneciente a los Actinomycetes. En el suborden se encuentran además otras familias como Mycobacteriaceae y Corynebacteriaceae. Comparte con estas dos familias los componentes de su pared: ácidos micólicos, galactosa, arabinosa, ácido mesodiaminopimélico, etc. Comprende numerosas especies, pero las especies que infectan al hombre son: complejo N. asteroides y N. brasiliensis. Las infecciones producidas por este microorganismo son infrecuentes, pero está aumentando el número de casos reportados. Causa infecciones localizadas tanto como diseminadas en humanos, frecuentemente inmunodeprimidos, y en animales. Morfología y fisiología Macroscopía y microscopía: son cocobacilos ramificados que frecuentemente forman hifas aéreas (formando colonias algodonosas), parcialmente ácido-alcohol resistentes. Las colonias son de color naranja, de superficie y bordes irregulares, con un característico olor a tierra mojada, variable según la especie. Son aerobios y moderadamente exigentes desde el punto de vista nutricional. Son de crecimiento lento, los cultivos en agar infusión, en Sabouraud, en Lowenstein-Jensen o en agar sangre pueden ser examinados al cabo de algunos días. Se pueden utilizar medios selectivos con antibióticos. Infección clínica La nocardiosis es una infección mundialmente distribuida. Afecta fundamentalmente a pacien- TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 349 tes inmunodeprimidos, pero no en forma exclusiva. La resistencia del huésped a la infección depende del número y de la capacidad fagocítica y lítica de los polimorfonucleares y otras células de defensa. El hecho que la enfermedad afecte de forma importante a los pacientes VIH positivos reafirma la importancia de la inmunidad celular en este tipo de infecciones. La transmisión de la enfermedad se produce por la inhalación de partículas contaminadas, ocasionando nocardiosis pulmonar, o mediante inoculación cutánea directa en donde se produce celulitis y linfangitis. No existe evidencia aún de transmisión persona-persona. La infección se manifiesta clínicamente por: • Nocardiosis pulmonar: es una neumonía de evolución aguda o subaguda con formación de abscesos y cavitación. Habitualmente provocada por N. asteroides • Nocardiosis cutánea y subcutánea: puede producir el clásico micetoma (enfermedad crónica de la piel y el tejido celular subcutáneo que destruye progresivamente la piel, el celular subcutáneo, las fascias, el músculo, llegando al hueso) además de celulitis, pústulas, etc. En general causada por N. brasiliensis. • Nocardiosis sistémica: a partir de las dos formas anteriores pueden producirse bacteriemias y afectar el sistema nervioso central, la piel y tejido subcutáneo, los riñones, articulaciones, huesos, corazón y ojos. Tanto la infección pulmonar como la sistémica no son infecciones autolimitadas por lo que requieren de correcto tratamiento antibiótico y muchas veces cirugía. Determinantes de patogenicidad La composición diferente de su pared y la presencia de factor de cordón o dimicolato de trehalosa parecen permitirle la vida en el interior celular. También los niveles altos de lactosa y superóxido dismutasa. Sensibilidad antibiótica Son sensibles a las sulfonamidas, trimetoprim-sulfametoxazol y dapsona con sulfato de estreptomicina. Son sensibles además a amicacina, que muestra actividad sinérgica con imipenem, con cefalosporinas de tercera generación y con trimetoprim-sulfametoxazol. Se tratan habitualmente con sulfas o con cotrimoxazol. RHODOCOCCUS Es otro género bacteriano que integra la familia Nocardiaceae y comparte muchas de sus características biológicas. Crece formando colonias rosadas extendidas sobre agar infusiónsangre con o sin sustancias selectivas agregadas. Produce infecciones oportunistas, en especial de pulmón y de partes blandas, en pacientes inmunocomprometidos (VIH positivos), con frecuente invasión sanguínea. Identificación de bacilos Gram positivos (BGP) Al igual que para la identificación de cualquier especie bacteriana, lo primero a realizar es un frotis con tinción de Gram. Luego debemos conocer los requerimientos atmosféricos de la cepa a identificar, ya que sabemos que este grupo posee tanto bacterias aerobias como aerobias facultativas y anaerobias. Para esto sembramos en un caldo de tioglicolato. Realizaremos posteriormente un cultivo en medios agar simple, agar sangre y las diferentes pruebas bioquímicas. 350 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA * Lecitinasa: se siembra la bacteria en agar yema de huevo (agat TSA con el agregado de 10% de yema de huevo) y se observa luego un halo de opacificación del medio alrededor de la colonia Con las características observadas, nos orientamos al género (por ej.: la presencia de ésporos en un BGP aerobio o facultativo nos orienta a Bacillus; la presencia de cocobacilos pequeños nos orienta a Listeria; los bacilos irregulares en letras chinas o empalizadas nos orientan al género Corynebacterium). GÉNERO BACILLUS Microscopía: se observan bacilos Gram positivos grandes (1 por 3 a 10 µm) de extremos rectos, aislados, en pares o cadenas con tinción de Gram. Se observan áreas claras sin teñir que corresponden a endosporas, ovoides, de posición subterminal, que no deforman el soma bacteriano. Pueden teñirse con técnicas de coloración especiales como el verde de Malaquita. La endospora solo se observa a partir de cultivos viejos o mediante técnicas que provoquen la esporulación, no a partir de muestras clínicas. Lo opuesto sucede con la expresión de la cápsula, que se pierde al ser cultivada en medios artificiales. Macroscopía: para su observación deben ser cultivados en medios ricos y simples tales como agar sangre, agar chocolate y agar nutriente. Su morfología es variable según la especie: • B. anthracis: colonias grandes, grises, opacas, chatas, de bordes irregulares que remedan una cabeza de medusa. Son no hemolíticos. • B. cereus: colonias grandes, blancogrisáceas, opacas, betahemolíticas. • B. subtilis: colonias grandes, chatas, con pigmento naranja, pueden ser beta hemolíticas Para su cultivo a partir de muestras clínicas con contaminantes pueden realizarse técnicas que eliminan las formas de vida vegetativa y solo permiten la sobrevida de esporas; estas técnicas son shock de calor o shock de alcohol. También se utilizan medios selectivos como el PLET para B. anthracis. Algunas pruebas para identificación de especie Es un desafío para el microbiólogo diferenciar B. anthracis de las muchas especies no patógenas que se encuentran en el ambiente como contaminantes. Las pruebas más comúnmente realizadas son las que se observan en el diagrama (en la parte superior): lecitinasa, movilidad, susceptibilidad a la penicilina, y otras como indol, nitratos, citrato, voges proskauer, etc.; además de la observación de la macroscopía y microscopía, bastante características de cada especie en particular. También se pueden utilizar técnicas de biología molecular como análisis de los fragmentos de restricción o métodos inmunológicos para detección de las toxinas. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 351 GÉNERO LISTERIA Microscopía: cocobacilos (0,4 por 1,0 a 2,0 µm), dispuestos al azar. Pueden parecerse a Corynebacterium y a los estreptococos. Macroscopía: no son exigentes desde el punto de vista nutricional pero conviene cultivarlas en agar sangre. Para las muestras provenientes de alimentos o muestras clínicas de sitios no estériles existen numerosos medios de enriquecimiento. Pueden ser cultivadas a 35ºC. El enriquecimiento se suele hacer a temperaturas menores. La movilidad en medio semisólido se observa mejor a 25ºC y no a 35 o 37ºC. En agar simple se observan colonias pequeñas, grises translúcidas, circulares, de bordes lisos. En agar sangre producen β-hemólisis estrecha. Requerimientos atmosféricos: se observa turbidez a lo largo de todo el tubo de tioglicolato, por lo que concluimos que es anaerobia facultativa. Algunas pruebas bioquímicas para identificación del género Listeria • Catalasa positivos (excepto algunas cepas), oxidasa negativos. • Fermentación de hidratos de carbono: glucosa positivos. • Hidrólisis de la esculina positiva. • TSI A/A sin gas ni sulfhídrico. • Rojo de Metilo y Vogues Proskauer: ambos positivos. Especie L. monocitogenes • Fermentación de hidratos de carbono: xilosa negativo, manitol negativo, ramnosa positivo, salicina positivo. • Hemólisis: beta, angosta. Es importante, ya que la diferencia de L. innocua (contaminante de alimentos pero no patógena) que no la posee; y de L. ivanovii, que posee una amplia zona de hemólisis beta. • Catalasa positivo. Esta prueba es importante ya que permite diferenciar a L. monocytogenes de Streptococcus beta hemolíticos, que poseen características morfológicas similares. • CAMP: se observa potenciación de la beta hemólisis en forma de cabeza de fósforo. Esto es debido a la presencia de alfa lisina y listeriolisina O (similar a la estreptolisina de Streptococcus). L. seeligeri también es positivo. • SIM: a 37ºC no se observa movilidad, a 25ºC se observa movilidad en forma de paraguas. Existen métodos inmunológicos para la detección de listerias a partir de alimentos pero aún no han sido desarrollados para muestras clínicas. Los métodos serológicos (para la detección de anticuerpos) aún no están bien desarrollados para diagnóstico clínico. Para la tipificación se pueden utilizar técnicas de biología molecular como: fagotipificación, ribotipificación, electroforesis en campos pulsados (de las técnicas más utilizadas al momento), entre otras. CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE Microscopía: se observan bacilos Gram positivos delgados, pleomórficos (en forma de clava), de alrededor de 1,5-5 µm de largo y 0,5-1 µm de ancho. Aparecen agrupados formando estructuras que semejan letras chinas. Con azul de metileno se visualizan los característicos gránulos metacromáticos. Macroscopía: para su observación deben ser cultivadas por 24-48 h, en medios exigentes a 37ºC y en una atmósfera enriquecida con 5% de CO2. En agar sangre se observan colonias características: pequeñas, blanco grisáceas brillantes. Puede sembrarse en medio de Löeffler, 352 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA ya que si bien no se visualizan las colonias características, este medio aumenta la producción de gránulos metacromáticos. Para el cultivo directo de muestras clínicas se utilizan medios selectivos y diferenciales con telurito y cisteína como el CTBA o el Tinsdale. En estos medios las colonias se visualizan gris-negruscas, ya que reducen el telurito, y con un halo marrón alrededor de la colonia por poseer actividad cistinasa. Luego pueden realizarse las siguientes pruebas: catalasa, metabolismo fermentador u oxidador, motilidad, producción de ureasa, reducción de nitritos, fermentación de diferentes hidratos de carbono, etc. Para comprobar si la cepa en cuestión posee la toxina deben realizarse pruebas que solo son realizadas por laboratorio de referencia: • Prueba de Elek modificada: consiste en cultivar la cepa a estudiar en una placa de Petri con un medio especializado, junto con un disco impregnado en antitoxina; si la bacteria presenta la toxina, se visualiza luego de la incubación una zona de precipitación. • Pruebas de biología molecular como PCR del gen tox; tiene la ventaja de poderse realizar directamente a partir de la muestra clínica. Otras pruebas como electroforesis en campos pulsados, análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción, ribotipificación, etc. son realizados para estudios epidemiológicos. • ELISA: fue desarrollada recientemente para la detección de la toxina. La cromatografía para la búsqueda de ácidos micólicos y otros componentes de la pared, también es utilizada en laboratorios de referencia para la identificación de cepas de C. diphteriae. GÉNERO NOCARDIA Microscopía: bacilos Gram positivos delgados, dispuestos en cadenas cortas o largas. Puede realizarse una variante de coloración para bacilos ácido-alcohol resistentes (Kinyoun) en donde se pueden ver tanto ácido alcohol resistente (AAR) como no-AAR. Las hifas aéreas pueden visualizarse tanto microscópicamente como macroscópicamente. Macroscopía: observamos colonias secas, con un tinte anaranjado (N. brasiliensis) con particular olor a tierra mojada, dependiendo su aspecto de la especie, la temperatura y el tipo de medio de cultivo. Para su cultivo pueden utilizarse medios tales como: agar Sabouraud dextrosa, agar cerebrocorazón infusión, agar sangre, Lowenstein Jensen y Middlebrook. Deben incubarse a 37ºC, en donde se visualizarán colonias entre el segundo día de incubación y las 3 semanas. Para la identificación se utilizan las características micro y macroscópicas además de requerimientos de cultivo, tipo de metabolismo de la glucosa, producción de arylsulfatasa, crecimiento en presencia de lisozima y caracterización molecular. Bibliografía • Joklik WK, Willett HP, Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiología. 20ª ed. BsAs. Panamericana; 1994. • Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC (h). editores. Diagnóstico Microbiológico, Texto Atlas Color. 5ª ed. Bs As. Panamericana. 1999. • Salyers AA, Whitt DD. editors. Bacterial Patogenesis, a molecular approach.2nd. ed. Washington, D.C. ASM Press. 2001. • Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. editors. Bailey & Scott´s. Diagnostic Microbiology. 11th. ed. St. Louis, Missouri. Mosby. 2002. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA • 353 Mandell GL, Douglas, Bennett JD. editors. 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Las bacterias anaerobias precedieron largamente a las aeróbicas y sin duda, predominaron largamente en un mundo vivo que comenzaba a desarrollarse. El reconocimiento de la naturaza anaerobia de determinados microorganismos se acredita a Pasteur, quien en 1863 observó que la motilidad de ciertas bacterias desaparecía con la exposición al aire. El conocimiento sobre las bacterias anaerobias es poco y relativamente reciente, ya que para poder lograr condiciones de anaerobiosis en el laboratorio se necesitaban, hasta los años 60, equipos costosos y técnicas bacteriológicas muy dificultosas. A partir de la introducción de sistemas simples para producir anaerobiosis con equipos y reactivos de bajo costo, el conocimiento de los anaerobios se desarrolla intensamente. Aun así, no hay un gran número de microbiólogos que se dediquen al tema, la taxonomía está en permanente revisión e infinidad de aspectos se mantienen oscuros. Definiciones Anaerobios son aquellos gérmenes que sólo pueden desarrollarse en ausencia de cantidades significativas de oxígeno (O2) y bajo condiciones de potenciales redox (Eh) muy reducidos, por tanto son estrictos en cuanto a sus exigencias de medio ambiente. Las formas vegetativas mueren cuando son expuestos al oxígeno molecular libre en la atmósfera, aunque el grado de resistencia bajo estas condiciones es variable (aerotolerancia). Los esporos bacterianos no son afectados por tratarse de formas biológicas metabólicamente inertes y con muy escasa proporción de agua en su composición. Si bien se considera bacteria anaerobia aquel germen que puede crecer sólo en ausencia de oxígeno, la sensibilidad frente al oxígeno varía ampliamente de una especie a otra. Así, distinguimos bacterias microaerófilas, aerotolerantes y anaerobios estrictos u obligados. Las bacterias microaerófilas resultan dañadas por niveles altos de oxígeno como el atmosférico (21%) y requieren niveles bajos de O2 para crecer, en el rango de 2 a 10%. Anaerobios aerotolerantes son aquellos microorganismos que toleran exposiciones breves al oxígeno atmosférico desarrollando óptimamente en condiciones anaerobias. Los anaerobios estrictos no toleran 356 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA el oxígeno y mueren en su presencia, por tanto sólo desarrollan en condiciones anaerobias; (de aquí en adelante los denominaremos simplemente anaerobios). Potencial de óxido-reducción El potencial de óxido-reducción (Eh) de una pareja redox es la medida en voltios de la tendencia espontánea a donar o recibir electrones por parte de uno de los integrantes de la pareja (flujo de electrones). Una pareja redox posee una forma reducida (dador de electrones) y una forma oxidante (receptor de electrones): reductor <---> oxidante + electrones. En consecuencia cuanto menor sea la cantidad de formas oxidantes menor o más bajo será el potencial redox. Es por esto que el oxígeno debe ser eliminado imprescindiblemente del microclima de desarrollo de las bacterias anaerobias (O2 atmosférico y en solución), ya sea en los medios de cultivo o en el medio natural. Aún más, el descenso del potencial de óxido-reducción debe afirmarse con la presencia en el medio de sustancias reductoras que superen en gran número a las oxidantes. Oxígeno sensibilidad Si bien el oxígeno es potencialmente tóxico para cualquier forma de vida, los anaerobios son intolerantes al mismo aunque en diferentes grados. Existe un espectro que va desde los extremadamente intolerantes (aerointolerantes) hasta los aerotolerantes moderados los cuales pueden sobrevivir a la presencia de O2 durante breves períodos. Esta diferente relación con el oxígeno parece deberse a varios factores. En primer lugar, el oxígeno es un poderoso agente oxidante, es decir, un ávido receptor de electrones, por lo tanto su presencia en solución es incompatible con potenciales redox bajos. En esta situación el flujo de electrones se ve interferido por un receptor extraño al usual de los gérmenes provocando shunts letales. En segundo lugar, el oxígeno puede interactuar directamente con enzimas o cofactores, a través de la oxidación de grupos químicos sensibles (por ej.: sulfhidrilos), causando inactivaciones irreversibles. En tercer lugar y aparentemente, la causa más importante de la oxígeno-toxicidad, se atribuye a la producción de sustancias tóxicas derivadas de la reducción parcial de la molécula de O2. Estos productos son el radical superóxido, peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo: O2 + e - → O2- (radical superóxido) O2- + e - + 2 H+ → H2O2 (peróxido de hidrógeno) H2O2 + e - + H+ → H2O + OH (radical hidroxilo) Estos productos son extremadamente tóxicos porque son agentes oxidantes poderosos y provocan destrucción de constituyentes celulares rápidamente. Los neutrófilos y macrófagos utilizan estos productos tóxicos del O2 para destruir los patógenos invasores. Muchos microorganismos poseen enzimas que los protegen de estos productos tóxicos del oxígeno. Las bacterias aerobias y las facultativas poseen las enzimas superóxido dismutasa (SOD) y catalasa, que catalizan las siguientes reacciones respectivamente: dismutasa O 2 + H 2 O2 2O2- + 2H+ superóxido → 2H2O2 catalasa 2H2O + O2 → TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 357 Los microorganismos aerotolerantes pueden carecer de catalasa pero la mayoría tiene SOD; más aún, las SOD han sido postuladas como factores de virulencia en los anaerobios, ya que estas enzimas permitirían la sobrevida de las bacterias en tejidos oxigenados hasta que el consumo de oxígeno determina el ambiente adecuado para la multiplicación y desarrollo. Los anaerobios estrictos carecen de ambas enzimas o las tienen en bajas concentraciones y por eso no toleran el oxígeno. Generalidades BIOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS Los anaerobios en general poseen un metabolismo de tipo fermentativo, en el cual sustancias orgánicas son los aceptores finales de electrones, aunque también pueden obtener energía a partir de la respiración anaerobia. Otras características comunes a los microorganismos anaerobios son sus requerimientos nutricionales complejos, su lento crecimiento y su labilidad, lo cual, sumado a sus requerimientos atmosféricos estrictos (de O2 y CO2) hace que su aislamiento sea difícil; además, al ser la mayoría de las infecciones mixtas (aerobios y anaerobios) otros microorganismos menos exigentes y de crecimiento más rápido pueden crecer e inhibirlos si no se toman las precauciones necesarias. Los plásmidos están ampliamente difundidos entre los anaerobios especialmente a nivel de especies de Clostridium y Bacteroides. Un muy buen porcentaje de estos elementos no han demostrado funciones específicas. Entre los plásmidos funcionalmente conocidos encontramos: • Plásmidos que codifican la producción de bacteriocinas. Similares a las colicinas, son producidas por especies de Clostridium y Bacteroides. • Plásmidos toxigénicos, ampliamente distribuidos entre las especies de Clostridium productoras de exotoxinas (toxigénicas). La correlación fehaciente entre plásmido y producción de toxina no se ha podido establecer en muchos casos. El caso con más evidencia de la relación plásmido-toxina es el de Clostridium tetani donde puede afirmarse que la toxina tetánica está codificada en un plásmido. • Plásmidos que codifican la resistencia a los antibióticos. Existen evidencias de que entre diferentes especies de Clostridium, Bacteroides y cocos anaerobios existen plásmidos de diferente tamaño que codifican la resistencia a macrólidos, tetraciclinas y cloramfenicol. FACTORES DE VIRULENCIA Se pueden separar en dos categorías según su importancia. Por un lado existen las poderosas toxinas producidas por los clostridios; por otro, una serie de estructuras y sustancias de mucho menor poder patógeno que se observan en varias especies de microorganismos no esporulados. Se conocen los lipopolisacáridos de superficie de varias especies de Fusobacterium, Veillonella y Bacteroides. Estas sustancias tienen una actividad “endotoxina” similar a las de los bacilos gramnegativos facultativos. Su actividad es algo menos potente pero se ha demostrado su capacidad (en Bacteroides) de participar en la producción de abscesos y de causar hipercoagulabilidad. El polisacárido capsular de Bacteroides del grupo fragilis es otro factor de virulencia importante, ya que se comporta en forma similar a las cápsulas de otras bacterias, es decir, le confiere al germen “la lanza y el escudo” en cuanto favorece su poder invasivo y dificulta la acción defensiva de los leucocitos polimorfonucleares. Aun más, está claramente demostrada su participación en la formación de abscesos. Diversas enzimas producidas por los microorganismos anaerobios deben considerarse como 358 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA factores de virulencia: colagenasas, hialuronidasas, DNAsas, elastasas, heparinasas son las principales. También deben incluirse aquellas enzimas que protegen contra la acción letal del O2 tales como catalasa y superóxido-dismutasa, en cuanto permiten la sobrevida del germen en un ambiente adverso hasta que se presenten las condiciones favorables. Estos factores de virulencia no deben considerarse como “toxinas”. EPIDEMIOLOGÍA Las bacterias anaerobias están diseminadas en la naturaleza. La mayoría de las bacterias anaerobias que causan infecciones en humanos son parte de la flora normal de piel y mucosas, superando en cantidad a las bacterias facultativas en el intestino por un factor de 1000:1, mientras que en piel, boca, vías aéreas superiores y tracto genital inferior femenino la relación anaerobios-facultativos es de 5-10:1. Otros patógenos anaerobios como Clostridium botulinum y Clostridium tetani se encuentran en suelos y no son considerados parte de la flora humana. Aunque la transmisión persona-persona de C. difficile entre los pacientes hospitalizados representa un gran problema, la mayoría de las infecciones por anaerobios ocurren cuando microorganismos de la flora normal del paciente acceden a un sitio normalmente estéril como resultado de la ruptura de alguna barrera anatómica. Por esto el conocimiento de esta flora normal es importante pues nos permite sospechar qué microorganismos pueden estar involucrados en determinado proceso infeccioso y en consecuencia, establecer una antibioticoterapia empírica racional, así como seleccionar los medios de cultivo apropiados para el aislamiento e identificación bacterianos. La tabla 1 muestra la frecuencia de los microorganismos anaerobios más comunes como flora normal humana en diferentes localizaciones. Tabla 1. Incidencia de las bacterias anaerobias como flora normal humana Piel Tracto res- Boca piratorio superior Bacilos grampositivos esporulados Clostridium 0 0 1 Bacilos grampositivos no esporulados Actinomyces 0 2 2 Intestino Genitales externos Uretra Vagina 3-4 0 1 1 1 0 0 0 Bifidobacterium 0 0 2 1 0 0 2 Eubacterium 1 1 2 3-4 d d 1 Lactobacillus* 0 0 2 2 0 1 3-4 Propionibacterium Bacilos gramnegativos Bacteroides 3-4 2 1 1 d 0 2 0 2 3-4 2 2 2 2 Fusobacterium Cocos Gram positivos Cocos Gram negativos 0 2 0 2 2 2 3-4 3-4 3-4 2 3-4 2 2 2 0 2 1 d 1 2 2 Tracto respiratorio superior incluye vías nasales, nasofaringe, orofaringe y amígdalas.(*) Incluye anaerobios, facultativos y microaerófilos, (d=desconocido) (0=no encontrados o raros) (1=hallazgo irregular) (2=habitualmente presentes) (3-4=presentes en gran número). TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 359 RECOLECCIÓN DE MUESTRAS Teniendo en cuenta que los anaerobios están presentes en gran número en prácticamente toda la superficie cutaneomucosa, es difícil muchas veces evitar la contaminación de la muestras con estos microorganismos. Es por esto que las siguientes muestras son inaceptables para cultivar en anaerobiosis: • Exudado faríngeo, nasofaríngeo o bucal. • Expectoración. • Secreciones obtenidas por aspiración oro o nasotraqueal. • Cepillado o lavado bronquial (salvo el obtenido por catéter de doble luz). • Contenido gástrico e intestinal (salvo excepciones). • Materias fecales (salvo para la búsqueda de C. difficile) • Exudado rectal. • Orina obtenida por sonda o espontáneamente. • Exudados vaginales y cervicales. • Exudado uretral. La expectoración no debe cultivarse en anaerobiosis porque el esputo se contamina con la flora anaerobia normal de la faringe y la boca en su pasaje al exterior; igualmente pasa con el esputo obtenido por fibroscopía o los aspirados nasotraqueales ya que el tubo arrastra en su introducción flora normal en su extremo distal. La orina emitida espontáneamente o con sonda se contamina por la colonización natural de la porción distal de la uretra y el meato, o por la colonización de la sonda. Si existen catéteres suprapúbicos o renales pueden utilizarse para tomar la muestra con resultados aceptables. Una recolección de muestra adecuada debe evitar siempre la más mínima contaminación con flora normal. Las muestras más adecuadas para el cultivo de anaerobios son las siguientes: • Bilis. • Sangre. • Médula ósea. • Líquido cefalorraquídeo. • Otros fluidos de sitios normalmente estériles (por ej: líquido articular). • Líquido de ascitis. • Orina obtenida por punción suprapúbica. • Tejidos obtenidos por biopsia o autopsia. • Líquido pleural obtenido por toracocentesis. • Lavado bronquial obtenido con cepillo protegido. • Aspirado transtraqueal. • Punción pulmonar transparietal (PPTP). • Aspiración con aguja de abscesos cerrados. • Contenido uterino colectado con cepillo protegido. TRANSPORTE DE MUESTRAS Otro factor crucial para el éxito en el aislamiento de anaerobios es el transporte adecuado de la muestra. Se debe proteger a los microorganismos de los efectos nocivos del oxígeno atmosférico durante el tiempo que transcurre entre la extracción y la siembra anaeróbica de la muestra. La primera y más efectiva medida es “correr” ya que en ninguna otra ocasión como esta el envío inmediato al laboratorio es tan fundamental. Las muestras deben ser colocadas en un sistema de transporte que asegure la anaerobiosis. Existen tubos, comercialmente dis- 360 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA ponibles en los que se ha sustituido el aire por otro gas, como CO2 o N2, denominados tubos gaseados y que contienen un indicador de anaerobiosis. Dichos tubos sirven para el transporte de muestras líquidas que se inyectan a través de un tapón de goma luego de eliminar todo el aire de la jeringa y aguja. Un sistema similar sirve para transportar hisopos. Si la muestra es un tejido o una biopsia, esta puede mantenerse en un tubo o recipiente con suero fisiológico y éste a su vez en una bolsa o sobre de anaerobiosis, que describiremos más adelante. En casos de extracción de material con aguja y jeringa, si la demora no supera los 30 minutos puede enviarse el material en la misma jeringa expulsando el aire residual y obturando la aguja con un tapón de goma. Las muestras deben conservarse a temperatura ambiente hasta ser procesadas en el laboratorio ya que la refrigeración puede oxigenar la muestra. MÉTODOS DE CULTIVO Luego de sembrar la muestra en un medio de cultivo adecuado, la incubación en anaerobiosis se consigue por medio de alguno de los siguientes sistemas: jarras anaeróbicas, bolsas de anaerobiosis y la cámara de anaerobiosis o “cámara de guantes”. El último método es muy caro, requiere equipamiento complejo, es lento y se usa para estudios de flora normal y en laboratorios altamente especializados. Desde el punto de vista práctico las jarras y los sobres o bolsas son equiparables en rendimiento a los sistemas más sofisticados y son aceptables para el aislamiento de bacterias anaerobias en el laboratorio clínico. Con estos sistemas son posibles los cultivos en medios sólidos para la obtención de aislamientos que permitan la identificación bacteriana. Jarras de anaerobiosis Es el sistema más utilizado para generar una atmósfera anaeróbica. Consiste en una jarra de plástico con una tapa que cierra herméticamente. La atmósfera anaerobia puede lograrse por dos métodos diferentes. El más sencillo utiliza un sobre comercial generador de hidrógeno y CO2 que es activado, ya sea mediante la adición de agua o por la humedad de las placas de agar. El H2 se combina con el O2 del aire para formar agua generando la anaerobiosis. Esta reacción es catalizada por granallas de zinc recubiertas de paladio que se encuentran depositadas en una canastilla fija a la tapa de la jarra. El segundo método consiste en la extracción del aire contenido en la jarra a través de la generación de vacío, sustituyendo el mismo por otro gas libre de O2 como el nitrógeno. El contenido final de la jarra consiste en una mezcla de gases conteniendo generalmente 80-90% de nitrógeno, 5-10% de hidrógeno y 5-10% de CO2. Una tirilla de papel impregnada en azul de metileno (azul en presencia de O2, incoloro en su ausencia) introducida en la jarra es el indicador de anaerobiosis. Bolsas de anaerobiosis Consiste en una bolsa plástica transparente, gas impermeable, un indicador de anaerobiosis (azul de metileno o resarzurina) y un sobre generador de anaerobiosis igual al utilizado para las jarras. Una o dos placas de Petri pueden introducirse antes de sellar la bolsa. Este sistema tiene las ventajas de su economía y practicidad, además de poder observar directamente si existe crecimiento en las placas de Petri sin abrir el sistema; también se puede utilizar para los sistemas de identificación tipo API-20A. Estas bolsas sirven además para el transporte de muestras como habíamos visto anteriormente. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 361 IDENTIFICACIÓN DE LOS ANAEROBIOS Examen macroscópico de la muestra Al recibir la muestra en el laboratorio debe ser examinada en busca de algunas características que sugieren la presencia de anaerobios, como: olor fétido, gránulos de azufre (asociados a la presencia de Actinomyces spp., Propionibacterium spp., o Eubacterium nodatum), fluorescencia bajo luz ultravioleta (que ocurre ante la presencia de cepas pigmentadas de Prevotella o Porphyromonas). Tinción de Gram Una característica general de los microorganismos anaerobios es su tendencia a tornarse gramnegativos cuando se aplica la coloración de Gram, sea por la poca estabilidad frente a la decoloración lo que los convierte en Gram inestables al examen directo de los materiales, sea porque existe una variación tintorial en los cultivos bacteriológicos. Por esto es que pueden realizarse las siguientes modificaciones a la técnica de la tinción de Gram: • efectuar la decoloración solamente con alcohol etílico prescindiendo de la acetona • prolongar el tiempo de contacto con lugol hasta 1 minuto. Cultivo Los medios de cultivo primarios para la siembra de una muestra de anaerobios son varios, pero en general incluyen un medio no selectivo como el agar sangre y algún medio selectivo. Además otra placa de agar sangre, una de agar chocolate y una de agar MacConkey son inoculadas e incubadas en aerobiosis, ya que la mayoría de las infecciones por anaerobios son polimicrobianas e incluyen bacterias aerobias y facultativas. Un medio de cultivo líquido habitualmente caldo tioglicolato se utiliza como medio de enriquecimiento cuando la muestra proviene de un sitio estéril. Existen varios medios líquidos comercialmente disponibles para hemocultivos. Algunos contienen (SPS) sodium polyanetol sulfonate, el cual estimula el desarrollo de los anaerobios, aunque al parecer sería inhibidor para Peptococcus anaerobius. Se trata de frascos de 100 ml, al vacío, con el agregado de CO2, una base nutritiva (digerido tríptico de soja o peptonas) y un agente reductor (tiol o tioglicolato). El porcentaje de sangre a inocular es del 5 al 10 % v/v. Los frascos se examinan diariamente buscando turbidez, hemólisis o gas; se consideran negativos definitivamente a los 10 días de incubación previo subcultivo final. Las placas inoculadas deben ser inmediatamente incubadas en condiciones anaerobias a 37 ºC durante 48 horas, al cabo de las cuales si no hay desarrollo deben ser incubadas al menos 5 días antes de ser descartadas. Identificación La morfología colonial así como la presencia de hemólisis, olor, etc. son algunas características a tener en cuenta como primera aproximación a la identificación. Todas los morfotipos coloniales de la placa de agar sangre incubada en anaerobiosis deben ser examinados con una tinción de Gram y subcultivadas para determinar su aerotolerancia. Para ello cada colonia debe ser subcultivada en una nueva placa de agar sangre en anaerobiosis y en una placa de agar chocolate en CO2. En la placa de agar sangre se colocan los siguientes discos de antibióticos para una identificación preliminar de los anaerobios y no con fines de probar la susceptibilidad antibiótica: kanamicina, colistina, vancomicina. La identificación completa de los anaerobios es bastante costosa, frecuentemente requiere varios tests bioquímicos, cromatografía gas-líquido de los productos metabólicos derivados 362 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA de la fermentación de la glucosa, y cromatografía de ácidos grasos de cadena larga. Es por esto que en general la identificación completa o confirmatoria queda reservada a laboratorios de referencia. La mayoría de los laboratorios clínicos deben conformarse con una identificación presuntiva que además es suficiente para guiar la terapia antimicrobiana adecuada. Una agrupación preliminar de los anaerobios se obtiene de la combinación de las siguientes características: origen de la muestra, morfología microscópica, reacción al Gram, morfología colonial, prueba de aerotolerancia. En el diagrama siguiente se esquematizan los pasos a seguir: Registrar Morfología de colonias Pigmento Hemólisis Fluorescencia Susceptibilidad a: Vancomicina Kanamicina Colistin SPS Actividad lipasa Actividad lecitinasa Cultivo en placa Realizar Gram Indol Catalasa Test NO3 Susceptibilidad a los antibióticos La antibioticoterapia de las infecciones por anaerobios es habitualmente empírica ya que los cultivos y el aislamiento son lentos y dificultosos. Por otra parte, las pruebas de sensibilidad realizadas en los laboratorios clínicos no dan resultados confiables. De manera pues, que nos debemos guiar por las pruebas realizadas en los laboratorios de referencia internacionales que aportan datos sobre sensibilidad y nos permiten predecir con un nivel razonable de seguridad cuales son los antibióticos de elección para cada germen. Las pruebas de sensibilidad se realizan de forma similar a las de gérmenes aerobios. Bacilos grampositivos no esporulados Este grupo diverso de microorganismos incluye bacterias anaerobias estrictas y aerotolerantes que forman parte de la flora normal de piel y mucosas. Todos comparten la característica de ser poco virulentos o de escaso poder patógeno, produciendo infecciones oportunistas en el caso de Actinomyces, Mobiluncus, Propionibacterium. Lactobacillus, Eubacterium y Bifidobacterium muy rara vez causan enfermedad. ACTINOMYCES Se trata de bacilos grampositivos largos y ramificados, delgados y delicados, bajo ciertas circunstancias, frotis o cultivos pueden fragmentarse simulando bacilos del tipo difteroides. En general son facultativos, aunque crecen mejor en anaerobiosis. A. meyeri es el único anaerobio estricto. Son capnófilos. Crecen lentamente y en el hospedero suelen producir infecciones crónicas. Forman parte de la flora normal de las mucosas del tracto respiratorio superior, tracto TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 363 digestivo y aparato genital femenino, pero normalmente no están presentes en la superficie cutánea. La cavidad oral es su hábitat principal. Los microorganismos tienen un bajo potencial de virulencia, por lo tanto producen enfermedad sólo cuando las barreras mucosas normales se alteran por traumatismos, cirugía o infección. La enfermedad producida por Actinomyces se llama actinomicosis y se caracteriza por el desarrollo de lesiones granulomatosas crónicas que se hacen supurativas y forman abscesos conectados mediante fístulas. En los abscesos y los tractos fistulosos se pueden observar colonias macroscópicas que recuerdan a los granos de arena, llamadas gránulos de azufre por su aspecto amarillo o naranja y están formadas por masas de microorganismos unidos entre sí por fosfato cálcico. Las zonas de supuración están rodeadas por un tejido fibroso de granulación lo que da a la superficie que cubre a los tejidos afectados una consistencia dura o de madera. Actimomyces israelii es el patógeno humano más importante. La actinomicosis es entonces una enfermedad endógena y se clasifica según los órganos que afecta en: • actinomicosis cervicofacial constituye aproximadamente el 50% de los casos de actinomicosis. Ocurre en personas con mala higiene bucal o que han sido sometidas a un procedimiento dental invasivo o a un traumatismo oral. De esta manera los microorganismos presentes en la boca invaden los tejidos enfermos y producen una enfermedad piógena aguda o, más frecuentemente, un proceso inflamatorio de evolución lenta, relativamente indoloro, con fibrosis y cicatrización, así como con fístulas de drenaje a lo largo del ángulo de la mandíbula y del cuello. Producen también enfermedad periodontal. • actinomicosis torácica se produce por aspiración del agente desde el tracto respiratorio superior y la boca o por extensión de lesiones cervicofaciales. Al inicio de la enfermedad se produce un absceso pulmonar. Conforme la enfermedad progresa ocurre fistulización al exterior a través de la pared torácica pudiendo interesar costillas y vértebras. • actinomicosis abdominal ocurre en pacientes sometidos a cirugía digestiva o que han sufrido un traumatismo en el intestino. Puede extenderse por todo el abdomen y afectar a cualquier órgano. Es posible la extensión vertebral y la fistulización al exterior. • actinomicosis pélvica puede presentarse como una vaginitis o más frecuentemente puede haber una gran destrucción de tejidos con formación de abscesos tubo-ováricos. Se ha descrito infección en mujeres que utilizan dispositivos intrauterinos con sintomatología escasa y sin presencia de gránulos. • actinomicosis del sistema nervioso central se produce generalmente por diseminación hematógena desde otros tejidos infectados, como los pulmones. La manifestación más frecuente es un absceso cerebral solitario, pero también puede ocasionar meningitis, empiema subdural y abscesos epidurales. La confirmación en el laboratorio de la actinomicosis es difícil. Si se detectan gránulos de azufre en una fístula o en un tejido, el gránulo se debe aplastar entre dos láminas, teñirse y mirarse al microscopio óptico. Se pueden ver en la periferia de los gránulos bacilos grampositivos delgados y ramificados. Actinomyces spp. son exigentes y crecen lentamente en condiciones anaerobias, se pueden tardar 2 semanas o más en aislar los microorganismos. Las colonias son blancas y tienen una superficie en forma de cúpula que se puede volver irregular luego de una incubación de una semana o más, lo que recuerda a la parte superior de una muela. Las especies individuales de Actinomyces se pueden diferenciar mediante pruebas bioquímicas. El tratamiento de la actinomicosis implica la asociación del desbridamiento quirúrgico de los tejidos afectados y la administración prolongada de antibióticos. La penicilina es el 364 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA antibiótico de elección. El mantenimiento de una buena higiene bucal y el uso de profilaxis antibiótica adecuada cuando se realizan maniobras invasivas en la boca o el tubo digestivo disminuyen el riesgo de estas infecciones. PROPIONIBACTERIUM Son bacilos grampositivos pequeños que se disponen en cadenas cortas o en agregados. Integrantes de la flora normal de piel (en contraposición a Actinomyces), conjuntiva, oído externo, orofaringe y aparato genital femenino. Son anaerobios estrictos o aerotolerantes, inmóviles, catalasa positivos y capaces de fermentar hidratos de carbono produciendo como principal residuo ácido propiónico (de ahí su nombre). Las especies que se aíslan con mayor frecuencia son Propionibacterium acnes, P. granulosum y P. propionicus. P. acnes es responsable del acné en adolescentes y adultos jóvenes así como de infecciones oportunistas en pacientes con prótesis (valvulares o articulares) o dispositivos intravasculares. Las propionibacterias se aíslan también a partir de hemocultivos, pero suele deberse a contaminación con bacterias de la piel en el sitio de venopunción. El papel principal de P. acnes en el acné es estimular la respuesta inflamatoria. La producción de péptidos de bajo peso molécula por parte de los bacilos que habitan en los folículos sebáceos atrae a los leucocitos. Luego de fagocitar a los bacilos los fagocitos liberan enzimas hidrolíticas que junto a una variedad de toxinas bacterianas como lipasas, proteasas, neuraminidasa e hialuronidasa estimulan la respuesta inflamatoria lo que lleva a la destrucción del folículo. Las propionibacterias crecen en la mayoría de los medios de cultivo pero puede tardarse entre 2 y 5 días en evidenciar el crecimiento. LACTOBACILLUS Se trata de bacilos grampositivos largos, de bordes paralelos y extremos rectangulares, facultativos, microaerófilos o anaerobios estrictos. No producen la enzima catalasa ni citocromos. Producen ácido láctico como principal producto de fermentación y tienen requerimientos nutricionales complejos. Llevan a cabo la fermentación homoláctica a través de la vía de Embden-Meyerhof o la fermentación heteroláctica a través de la vía de las pentosas fosfato. Su crecimiento es óptimo en condiciones ácidas (pH entre 4.5 a 6.4). Se encuentran en la superficie de las plantas así como en la carne, el agua, frutas y otros productos alimenticios. Son indispensables para la industria del alimento donde se utilizan para la fermentación de alimentos y bebidas, como pickles, cerveza, vino, jugos, quesos y yogurt. En el hombre se encuentran formando parte de la flora normal de la boca, estómago, intestino y tracto genitourinario (constituyen la flora vaginal predominante en mujeres en edad reproductiva). Son los microorganismos más frecuentes en la uretra, por lo tanto su recuperación en los urocultivos procede invariablemente de la contaminación de la muestra. La razón por la cual los lactobacilos rara vez producen infecciones del tracto urinario es su incapacidad para crecer en la orina. Generalmente no son patógenos. Por el contrario, su efecto beneficioso ha sido demostrado cuando se administran en forma de probióticos (suplemento alimentario que contiene microorganismos vivos con efectos beneficiosos en el huésped al mejorar el balance microbiano intestinal) en la prevención y el tratamiento de algunas enfermedades como la diarrea aguda infantil, diarrea asociada a antibióticos, diarrea del viajero, colitis alérgicas y probablemente otras como la candidiasis vaginal, etc. De todas maneras pueden invadir el torrente circulatorio ocasionando bacteriemias transitorias de origen genitourinario (por ej: después del parto o de un procedimiento ginecológico), endocarditis y sepsis en pacientes inmunodeprimidos. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 365 Son uniformemente resistentes a la vancomicina. Se obtiene actividad antimicrobianas sinérgica mediante la combinación de penicilina más un aminoglucósido. Mobiluncus Los miembros de este género bacteriano son bacilos gramvariables o gramnegativos, a pesar de tener una pared celular grampositiva, carente de lipopolisacárido, y sensibles a vancomicina, clindamicina, eritromicina y ampicilina, pero resistentes a colistina. Bacilos curvos con extremos en forma de punta, son anaerobios estrictos. Son exigentes desde el punto de vista nutricional y crecen lentamente incluso en medios enriquecidos. En humanos se han identificado dos especies, Mobilunucs mulieris y M. curtisii. Los microorganismos colonizan el tracto genital femenino en un número bajo, pero son abundantes en las mujeres con vaginosis bacteriana. Su aspecto microscópico es una marcador útil para esta enfermedad, pero no está claro el papel preciso de estos microorganismos en la patogénesis de la vaginosis bacteriana. Bifidobacterium y Eubacterium Los microorganismos pertenecientes a estos dos géneros se encuentran con frecuencia en la orofaringe, intestino grueso y vagina. Estas bacterias se pueden aislar en las muestras clínicas pero tienen un potencial de virulencia muy bajo y generalmente se aíslan como contaminantes sin significación clínica. La confirmación de su papel etiológico en una infección requiere el aislamiento repetido del microorganismo a partir de múltiples muestras y la ausencia de otros microorganismos patógenos. Cocos grampositivos PEPTOSTREPTOCOCCUS A pesar del nombre del género la morfología de estos gérmenes incluye formas en pares, tétradas, racimos, y cadenas. Un estudio microscópico cuidadoso muestra a estos cocos con tamaño irregular y alguna decoloración parcial, lo que permite diferenciarlos de sus similares aerobios. Forman parte de la flora de la boca, intestino y genitales. Se encuentran involucrados en infecciones pleuropulmonares, abscesos, infecciones ginecológicas, sinusitis. Casi constantemente son sensibles a los betalactámicos. Bacilos grampositivos esporulados CLOSTRIDIUM Los clostridios son bacilos anaerobios formadores de esporas y en general Gram positivos. Casi todas las especies son anaerobias obligadas pero unas pocas especies son aerotolerantes. Las especies patógenas producen toxinas solubles, algunas de las cuales son extremadamente potentes. Los clostridios están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se encuentran en los suelos y en el tracto gastrointestinal de los seres humanos y los animales. Los clostridios patógenos pueden dividirse para su estudio en cuatro grandes grupos de acuerdo al tipo de enfermedad que producen: 1. Los clostridios histotóxicos típicamente causan una variedad de infecciones tisulares, en general luego de heridas abiertas y otras lesiones traumáticas. 2. Los clostridios enterotoxigénicos producen intoxicación alimentaria y formas más severas de enfermedad gastrointestinal. 366 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 3. Clostridium tetani, agente causal del tétanos, produce la enfermedad por medio de una potente exotoxina que es elaborada durante la proliferación limitada en los tejidos. 4. Clostridium botulinum es el agente etiológico del botulismo, enfermedad que resulta de la ingestión de una poderosa exotoxina formada previamente por los microorganismos en alimentos contaminados. Clostridios histotóxicos Pueden ocasionar una severa infección a nivel muscular denominada mionecrosis por clostridios (antes conocida como gangrena gaseosa o miositis por clostridios). Clostridium perfringens es la especie más importante responsable del 80-90% de los casos de mionecrosis. C. novyi, C. septicum, C. histolyticum, C. sordellii, C. fallas también ocasionan estas infecciones. Todos ellos producen una variedad de toxinas con potencias diferentes; para cada especie las toxinas se designan con letras griegas. Ninguno de ellos se comporta como un patógeno altamente invasivo, sino que cada uno juega un papel oportunista que requiere un conjunto de condiciones en los tejidos para que se inicie la infección. Determinan un espectro de compromiso clínico en infecciones de heridas que va desde la simple contaminación hasta la mionecrosis. Dada su amplia distribución en la naturaleza, la contaminación de heridas es muy común (39%). Sin embargo una pequeña proporción de heridas contaminadas evoluciona a la verdadera mionecrosis. Por lo tanto el aislamiento de clostridios histotóxicos a partir de heridas o material de drenaje no indica por sí mismo la presencia de mionecrosis: el diagnóstico de dicha afección es clínico. Clostridium perfringens Existen cinco tipos diferentes: A, B, C, D y E, que se diferencian por la producción de cuatro toxinas letales principales: alfa, beta, epsilon y theta. C. perfringens tipo A es el principal responsable de enfermedad humana; produce alfa toxina y otras de menor poder (omega, kappa, micrón); habita suelos e integra la flora normal del tracto gastrointestinal de hombre y animales. Los tipos B, C, D y E existen en el tracto gastrointestinal de animales y sólo de forma ocasional en el hombre. Producen una variedad de enfermedades en animales domésticos; no habitan de forma permanente los suelos como lo hace el tipo A. BIOLOGÍA DEL MICROORGANISMO Es un bacilo netamente grampositivo, corto y grueso, de bordes redondeados, con formas hasta cocoides. En los frotis directos de muestras clínicas no se observan esporos y es característica la ausencia de células eucariotas debido a la intensa citólisis tóxica; pueden observarse cápsulas. En los frotis realizados a partir de cultivos pueden observarse esporos medianos o subterminales que no deforman el soma vegetativo. Es anaerobio aerotolerante, algunas cepas producen la enzima superóxido dismutasa. Desarrolla a un pH variable (5.5 a 8) y en un rango de temperatura que va de 20 ºC a 50 ºC. Es el único inmóvil de los clostridios patógenos. Crece rápido en agar sangre, pudiendo observarse colonias a las 24-48 hs de incubación. ESTRUCTURA ANTIGÉNICA C. perfringens produce por lo menos 12 exotoxinas diferentes, de naturaleza proteica y antigénicas. De los cuatro antígenos letales principales, alfa es la más importante y es producida por TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 367 los cinco tipos de C. perfringens. Los antígenos menores son enzimas y no son letales: antígeno K es una colagenasa, antígeno V es una desoxirribonucleasa, antígeno u tiene actividad hialuronidasa. La serotipificación de acuerdo a antígenos somáticos ha tenido aplicación en estudios epidemiológicos de brotes de intoxicación alimentaria, donde existe una correlación entre los serotipos de C. perfringens de tipo A aislado en heces de pacientes y los serotipos recuperados de alimentos contaminados. FACTORES DE VIRULENCIA La toxina alfa posee actividad letal, dermonecrótica y hemolítica; es una lecitinasa C o fosfolipasa C (degrada la lecitina en fosforilcolina y un diglicérido), también hidroliza la esfingomielina; es activada por Ca++ y Mg++. Es un antígeno excelente, tanto que la protección o el tratamiento in vivo dependen totalmente del título antitoxina alfa. In vivo actúa sobre complejos lipoprotéicos que contienen lecitina en la membrana celular y probablemente sobre la membrana mitocondrial; produce además alteración de las membranas de eritrocitos, plaquetas, leucocitos y células endoteliales ocasionando lisis de estas células; aumenta la permeabilidad vascular con hemólisis masiva y hemorragia, así como destrucción tisular y edema observados durante la enfermedad. Recientemente se ha descrito su comportamiento como superantígeno (es decir que es capaz de estimular la proliferación policlonal de linfocitos T). La toxina beta tiene actividad necrotizante (enteritis necrotizante) e induce hipertensión por liberación de catecolaminas. La toxina epsilon aumenta la permeabilidad vascular de la pared gastrointestinal. La toxina theta posee actividad necrotizante e induce un aumento de la permeabilidad vascular. La enterotoxina producida por cepas de C. perfringens principalmente tipo A, pero también de los tipos C y D, es una proteína termolábil producida en el colon y liberada durante la esporulación. Posee estructura y función similar a las toxinas LT y CT de E. coli y V. cholerae respectivamente. También tiene cierta actividad citotóxica. Produce enteritis, la dosis infectante es elevada. Los antígenos omega, kappa y mu tienen un papel auxiliar en la diseminación local de la infección a través de los tejidos y en la provisión de nutrientes para la proliferación de los microorganismos; en bajas concentraciones la toxina omega es tóxica para los leucocitos humanos y puede ser responsable de la ausencia inusual de células polimorfonucleares en el tejido muscular infectado. EPIDEMIOLOGÍA C. perfringens es un microorganismo ubicuo: el tipo A (principal responsable de enfermedad en humanos) se encuentra en el tracto gastrointestinal de hombre y animales, y son numerosos en suelos, tanto las formas vegetativas como las esporuladas; también están en aguas contaminadas con heces. La infección por estos microorganismos puede tener un origen endógeno o exógeno. En lesiones traumáticas la fuente de clostridios en general es la tierra presente en las heridas (la incidencia de contaminación e infección de heridas depende de la concentración de C. perfringens en los suelos, lo que varía según la localización geográfica). En las infecciones endógenas la fuente de clostridios es la flora fecal presente en la piel 368 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA o las vestimentas introducidas en las heridas, o clostridios que escapan del intestino cuando este es perforado, ya sea por enfermedad, lesiones traumáticas o intervenciones quirúrgicas. PATOGENIA Los clostridios son incapaces de iniciar una infección en tejidos sanos (Eh normal). Factores primordiales que predisponen a la mionecrosis son la isquemia y necrosis muscular, que proporcionan una tensión de O2 y un potencial de oxido-reducción disminuidos, condiciones necesarias para la proliferación de estos microorganismos. Esto explica que aún con alta incidencia de contaminación de heridas, la incidencia de mionecrosis continúe siendo baja. En áreas con menor tensión de O2 en el músculo, se acumula ácido láctico y el pH desciende. La combinación de la disminución del Eh y la caída del pH, puede activar enzimas proteolíticas endógenas y dar como resultado autólisis tisular. Esta liberación de nutrientes y la disminución del potencial de óxido-reducción proporcionan condiciones adecuadas para el desarrollo de las microorganismos anaerobios. La proliferación de los microorganismos se acompaña de producción de toxinas solubles. En la mionecrosis estas toxinas difunden desde el sitio inicial, proliferan y atacan músculo y tejidos circundantes sanos. Estos tejidos son destruidos por las toxinas permitiendo la diseminación de la infección hacia nuevas áreas necróticas. El líquido de edema (producido por acción de la toxina y enzimas de clostridios sobre los tejidos) y el gas del metabolismo bacteriano, aumentan la presión del compartimiento muscular agravando la isquemia, disminuyendo aún más el potencial de óxido-reducción y el pH, proporcionando nuevas áreas adecuadas para la proliferación de clostridios. ESPECTRO • • • • • • • DE MANIFESTACIONES CLÍNICAS Contaminación simple de heridas. Celulitis, fascitis y otras infecciones de partes blandas. Mionecrosis por clostridios. Infecciones uterinas. Septicemia por clostridios. Intoxicación alimentaria. Enteritis necrotizante. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN Tinción de Gram: el examen directo muestra bacilos Gram positivos rectos sin esporas ni leucocitos Cultivo: en agar sangre incubado en anaerobiosis a 37 ºC durante 24-48 h, colonias planas extendidas, 2-4 mm diámetro • Patrón característico cuando crece en agar sangre: hemólisis doble, compuesta por una estrecha zona de hemólisis completa producida por la toxina alfa y una zona más amplia de hemólisis incompleta producida por la toxina omega. • B-hemólisis sinérgica al sembrarlo junto a S. agalactiae: prueba CAMP inversa • Precipitación (opalescencia) en medios que contienen lecitina, causada por la toxina alfa e inhibida de forma específica por la antitoxina. • Fermentación “tormentosa” en medios con leche: la fermentación de la lactosa produce gran cantidad de ácido, lo que provoca la coagulación de las proteínas (caseína); luego el coágulo es alterado y roto por el gran volumen de gas formado a partir de la fermentación TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA • 369 de la lactosa (esta reacción también es producida por otras especies como C. septicum y otras) Producción de gas a partir de glucosa, fermentan lactosa, producción de ácido a partir de glucosa y lactosa, etc. SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA Todos los microorganismos del género Clostridium son uniformemente sensibles a penicilina. Clostridios enterotoxigénicos Intoxicación alimentaria C. perfringens es la tercera causa de toxiinfección alimentaria bacteriana después de Salmonella spp. y Staphylococcus aureus. Es causada por C. perfringens, usualmente cepas tipo A, productoras de enterotoxina. Dicha toxina es una proteína que se comporta como un superantígeno promoviendo la liberación de mediadores de la inflamación en forma masiva. EPIDEMIOLOGÍA La enfermedad se produce cuando el individuo ingiere alimento contaminado con un elevado número de microorganismos productores de enterotoxina (100 millones). Los alimentos que pueden estar contaminados son carnes vacuna, suina, pollo, salsas cocinadas y no refrigeradas. Cuando los alimentos llegan al intestino delgado se produce la esporulación y la liberación de enterotoxinas. No son comunes los brotes familiares pero sí los producidos a través de alimentos preparados comercialmente destinados a restaurantes o instituciones. En Uruguay según datos recogidos por el Sistema de Información Regional para la Vigilancia Epidemiológica de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) se han declarado 3 brotes en el período 1993-2001, con 37 individuos afectados, no registrándose muertes. Los alimentos implicados fueron carnes rojas y carnes de aves. Dos ocurrieron en comedores y uno en una vivienda. PATOGENIA Todos los síntomas son atribuibles a la enterotoxina, que en general se sintetiza durante la esporulación de los microorganismos en el intestino delgado. La enterotoxina se une a un receptor de membrana del ribete en cepillo e induce una alteración de la permeabilidad calcio dependiente resultando en una pérdida de iones y metabolitos. Esta pérdida electrolítica altera la función metabólica intracelular provocando daño morfológico y eventual lisis. CLÍNICA Entre 7 y 15 horas luego de la ingestión de alimento contaminado los pacientes experimentan dolor abdominal agudo y diarrea; estos síntomas duran 12-18 horas y la recuperación suele ser completa, salvo raros casos de muerte en pacientes de edad avanzada y personas debilitadas. DIAGNÓSTICO Para confirmar el diagnóstico debe recuperarse el agente del alimento y del paciente. El diagnóstico se establece mediante el recuento de más de 100.000 UFC (unidades formadoras de colonias) por gramo de alimento o 1.000.000 UFC por gramo de materia fecal en el primer día de enfermedad. También puede buscarse la presencia de enterotoxina en las heces utilizando 370 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA ELISA o hemaglutinación pasiva reversa; se han desarrollado además técnicas moleculares para la detección de estos agentes TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN En general no requiere tratamiento antimicrobiano, sólo medidas de sostén. Como acción preventiva debe ser mantenida una refrigeración adecuada de los alimentos cocidos de no ser consumidos de inmediato. Enteritis necrotizante Es causada por C. perfringens tipo C y es más severa que la intoxicación alimentaria causada por el tipo A. Tiene un período de incubación de menos de 24h luego del cual aparecen dolor abdominal intenso y diarrea; en algunos pacientes ocurre pérdida de la mucosa intestinal con enterorragia. Puede ser letal con shock u oclusión intestinal y peritonitis. La toxina beta producida por C. perfringens tipo C es responsable de los síntomas; la administración de antitoxina reduce la mortalidad. Enterocolitis seudomembranosa Clostridium difficile es el microorganismo responsable de esta entidad. Se trata de una gastroenteritis asociada a antibioticoterapia de severidad variable desde diarrea autolimitada a colitis seudomembranosa grave, potencialmente mortal. C. difficile es un microorganismo anaerobio obligado, sacarolítico y débilmente proteolítico, a través de la fermentación ácida produce un conjunto de productos detectables por medio de cromatografía gas-líquida. Es parte de la flora normal del intestino del hombre y los animales. FACTORES DE VIRULENCIA C. difficile produce dos toxinas proteicas principales, antigénicamente diferentes, ambas implicadas en la patogenia: la toxina A, una enterotoxina potente y la toxina B citotóxica. La toxina A o enterotoxina es quimiotáctica para neutrófilos, produce infiltración de leucocitos polimorfonucleares en la lámina propia del íleon e induce la liberación de citoquinas por parte de macrófagos y polimorfonucleares, potenciando la respuesta inflamatoria a nivel local, con la resultante hipersecreción de líquidos y necrosis hemorrágica. La citotoxina o toxina B depolimeriza la actina ocasionando destrucción del citoesqueleto celular. Otros factores de virulencia: factor de adherencia o adhesina (in vitro se une específicamente a células del colon humano), una hialuronidasa que hidroliza el ácido hialurónico del tejido conjuntivo, favoreciendo la diseminación; la formación de endosporas permite la supervivencia de estos moo en el medio ambiente hospitalario durante meses. PATOGENIA El tratamiento antibiótico extenso altera la flora entérica normal, permitiendo la proliferación de C. difficile relativamente resistentes o la colonización exógena (las cepas infecciosas de C. difficile pueden ser endógenas o exógenas); los antibióticos más a menudo vinculados a colitis seudomembranosa son ampicilina, clindamicina y cefalosporinas. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 371 TRATAMIENTO La interrupción del antibiótico usado suele alcanzar para el caso de enfermedad leve. Los cuadros graves pueden tratarse con metronidazol o vancomicina vía oral. Puede haber recidivas por esporas resistentes al tratamiento antibiótico. PREVENCIÓN Es importante conocer el potencial para generar enfermedad gastrointestinal de la administración de antibióticos. Ante la presencia de diarrea sin otra causa evidente en pacientes que están recibiendo antibióticos es aconsejable suspender el tratamiento antibiótico o sustituirlo por otro que se asocie menos con diarrea y colitis. Clostridium tetani Agente causal del tétanos, una enfermedad rara hoy en día en países desarrollados. Sin embargo, en países pobres, el tétanos neonatal tiene un impacto significativo sobre la mortalidad global. En el adulto la enfermedad ocurre clásicamente luego de una herida punzante y se caracteriza por espasmos musculares, el más típico de los cuales es el del maxilar inferior, de ahí el término de trismus. La naturaleza anaerobia de C. tetani fue responsable en parte de la demora en su descubrimiento y aislamiento, que fue logrado en 1889 por Kitasato. Así se llegó al descubrimiento de la toxina tetánica y a la detección poco tiempo después de la antitoxina específica. Biología del microorganismo C. tetani es un bacilo largo y delgado en comparación con otros clostridios patógenos. Son grampositivos, aunque como todas las bacterias anaerobias tienden a tornarse Gram variables, sobre todo en los cultivos más viejos. Producen esporas terminales de mayor diámetro que la célula vegetativa, dando la característica imagen de palillo de tambor. Tienen flagelos peritricos que le confieren activa motilidad. Es anaerobio estricto, difícil de cultivar por su extremada sensibilidad al oxígeno. Posee requerimientos nutricionales complejos (entre ellos ciertos aminoácidos y vitaminas); es capaz de crecer en agar sangre y en caldo con carne cocida. No fermenta ningún hidrato de carbono, tiene escasa actividad metabólica. Estructura antigénica Poseen antígenos flagelares o antígenos H (10 serotipos) y antígeno somático o antígeno O (un solo serogrupo). Todas las cepas de C. tetani producen un solo tipo antigénico de toxina y su efecto es neutralizado por una sola antitoxina lo que tiene una enorme importancia práctica en cuanto a la profilaxis de esta enfermedad. Factores de virulencia Toxina tetánica: todos los síntomas del tétanos son atribuibles a una neurotoxina sumamente tóxica, la tetanospasmina, toxina intracelular liberada por autólisis celular. El gen estructural de la toxina se localiza en un plásmido. Es una proteína termolábil (inactivada por calentamiento a 60ºC durante 20 min). Se trata de una toxina tipo A-B. Por analogía con estas toxinas, se cree que la toxina tetánica es captada por endocitosis mediada por receptores y que el bajo pH presente en al luz endosómica hace que la toxina se inserte en la bicapa lipídica y atraviese la membrana endosómica para llegar al citoplasma. La toxicidad de la toxina tetánica intacta se asocia con la cadena liviana A. El fragmento B purificado de la cadena 372 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA pesada forma canales en las membranas lipídicas y posee el sitio de unión a los receptores celulares (sitio fijador de gangliósidos). La toxina tetánica es una de las sustancias más tóxicas que se conocen (sólo la toxina botulínica y la toxina Shiga tienen una toxicidad comparable). El toxoide producido a partir del tratamiento de la toxina con formaldehído es útil para la inmunización contra la enfermedad. El toxoide no es tóxico pero conserva los determinantes antigénicos de la toxina tetánica que dan origen a los anticuerpos antitoxina. La molécula de la toxina tetánica contiene 20 determinantes antigénicos diferentes como mínimo, y los anticuerpos contra por lo menos 9 de ellos son capaces de neutralizar la toxicidad de la toxina. La tetanolisina es una hemolisina oxígeno lábil relacionada serológicamente con hemolisinas de otros clostridios y con la estreptolisina O de S. pyogenes. Las esporas de C. tetani son capaces de persistir en el medio ambiente (suelo, tracto gastrointestinal de humanos y animales) durante meses o años. Epidemiología Si bien la incidencia del tétanos ha disminuido en las regiones del mundo donde se alcanza un alto porcentaje de inmunización de la población, continúa siendo una enfermedad común y no controlada en algunos países en desarrollo. Patogenia Las esporas de C. tetani son ubicuas: se recuperan en 20-64% de muestras de suelos recolectadas para cultivos así como del tracto gastrointestinal de humanos y otros animales. Si se efectúan cuidadosos cultivos de material de heridas traumáticas la presencia de C. tetani también puede demostrarse con mucha frecuencia. Sin embargo es bastante raro que se desarrolle tétanos a partir de estas heridas. El aspecto más significativo de la patogenia del tétanos es el contexto de la herida donde el potencial de oxido-reducción debe tener el equilibrio apropiado para permitir la multiplicación del microoorganismo y la toxigénesis. Clásicamente las heridas halladas en la práctica son las heridas punzantes producidas por clavos, astillas o espinas, pero también en otros contextos como las fracturas expuestas, el uso drogas intravenosas, las úlceras de decúbito y las varicosas, las otitis externas y las extracciones dentales, se dan las condiciones adecuadas. La forma más temida de tétanos, el tétanos neonatal es una causa importante de morbimortalidad en países en desarrollo y es producida por el corte del cordón umbilical con instrumentos no estériles o por el cuidado inapropiado del muñón umbilical. Un factor contribuyente importante es la presencia de bacterias aerobias que pueden proliferar hasta el punto de eliminar el O2 y luego continuar proliferando de forma facultativa en anaerobiosis. Esta proliferación puede reducir el Eh hasta el punto en el cual las esporas tetánicas pueden germinar. Después de la germinación de las esporas se elabora la toxina, que ingresa en el sistema nervioso central. La infección por C. tetani permanece localizada con reacciones mínimas a menos que se encuentren otros microorganismos. La forma de acción de la toxina involucra la unión a gangliósidos GT1 en las membranas de las terminaciones nerviosas periféricas a través la subunidad B, seguida de la internalización de la subunidad A y su desplazamiento hacia el sistema nervioso central por transporte axonal retrógrado. Cuando llega a la región del núcleo es transportada hacia las interneuronas inhibidoras, donde inhibe la liberación de neurotransmisores inhibidores (GABA, glicina) conduciendo a una actividad sináptica excitadora descontrolada dando lugar a una parálisis espástica. Esta inhibición de la liberación de sustancias inhibitorias permite que prevalezcan los músculos más poderosos: espasmos musculares de los maseteros con trismus, flexión de TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 373 las extremidades superiores y extensión de las inferiores con arqueamiento de la espalda (opistótonos). Manifestaciones clínicas Tétanos generalizado: afectación maseteros o trismo, dando lugar a la risa sardónica, salivación, sudoración, irritabilidad y espasmos persistentes de los músculos de la espalda (opistótonos). Además puede haber afectación del sistema nervioso autónomo dando lugar a arritmias cardíacas, fluctuaciones de la presión arterial, sudoración intensa y deshidratación. Tétanos localizado: afecta la musculatura sólo de la zona de infección primaria. Aislamiento e identificación Para su aislamiento debe sembrarse de inmediato en medios sólidos prerreducidos y medios de cultivo líquidos para anaerobios. Las colonias son translúcidas con borde que avanza filamentoso y delicado, betahemolíticas. La prueba final para la identificación de C. tetani es la demostración de la producción de toxina tetánica in vivo cuando se inyecta en ratones, y la neutralización de su toxicidad en ratones previamente inoculados con antitoxina. Tratamiento Se basa en el debridamiento de la herida y la administración de penicilina (en pacientes alérgicos se puede administrar tetraciclinas o metronidazol), la inmunización pasiva con inmunoglobulina antitetánica humana (que neutraliza la tetanoespasmina libre) y la inmunización activa con toxoide tetánico. Para los espasmos musculares se utilizan drogas como curare o, en tetanoespasmos leves, barbitúricos y diazepam, además del soporte de las funciones vitales. Prevención Se realiza a través de la vacunación con toxoide tetánico (toxina tratada con formalina); se administran 3 dosis al principio y luego dosis de refuerzo cada 10 años. La inmunización de embarazadas en el tercer trimestre del embarazo asegura la inmunización pasiva del neonato (mediante el pasaje de anticuerpos maternos a través de la placenta), disminuyendo el riesgo de tétanos neonatal. La enfermedad natural no confiere inmunidad contra infecciones posteriores, por lo tanto los pacientes que se recuperan de la enfermedad deben ser inmunizados activamente para prevenir la reinfección exógena o la recurrencia a partir de esporas retenidas dentro del organismo. Clostridium botulinum C. botulinum produce la exotoxina más potente que se conoce, que es una neurotoxina causante del botulismo, una severa enfermedad neuroparalítica caracterizada por comienzo súbito y evolución rápida que culmina en un parálisis marcada y un paro respiratorio. La enfermedad es rara en el ser humano, muy común en los animales. A diferencia de la toxina tetánica, hay ocho toxinas botulínicas serológicamente diferentes, denominadas A, B, C1, C2, D, E, F, G. La forma mas común de botulismo es el transmitido por los alimentos, una intoxicación causada por la ingestión de la toxina botulínica preformada en los alimentos contaminados. El empleo del autoclave con temperaturas lo bastante elevadas como para destruir las esporas en la industria del enlatado ha reducido la importancia relativa de los alimentos comercialmente enlatados como fuente de la enfermedad, excepto cuando se producen errores en el proce- 374 TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA dimiento. Dado que la toxina es destruida por el calor, la cocción de rutina de los alimentos enlatados en el hogar limita la frecuencia de éste tipo de intoxicación. Además del botulismo transmitido por los alimentos la enfermedad también ocurre cuando la toxina es producida por miembros de la especie C. botulinum que contaminan heridas traumáticas (botulismo de las heridas) y cuando se elabora la toxina en el tracto gastrointestinal de los lactantes (botulismo infantil o de los lactantes). Biología del microorganismo Son bacilos grampositivos largos, rectos a levemente curvos, con extremos redondeados. Forman esporas ovales y subterminales que distienden los bacilos. Poseen flagelos peritricos que le confieren movilidad. Son anaerobios estrictos, con requerimientos nutricionales complejos. Existen siete tipos de toxina botulínica (A a G). Es posible dividir a los microorganismos en cuatro tipos (I a IV) según la toxina que producen y su actividad proteolítica. La enfermedad humana está vinculada a los tipos I y II y a la toxina A principalmente. La resistencia al calor de la espora es mayor que la de cualquier otro microorganismo anaerobio (sobreviven varias horas a 100 ºC y hasta 10min a 110 ºC). Las esporas son también resistentes a las radiaciones y pueden sobrevivir a –190 ºC. Estructura antigénica C. botulinum ha sido dividido en ocho tipos serológicamente diferentes sobre la base del tipo de toxina producida. Factores de virulencia La toxina botulínica es una proteína tipo A-B con una subunidad A o cadena ligera A que posee actividad neurotóxica y una o más subunidades B o cadenas pesadas B no tóxicas, responsables de la unión al receptor celular y posterior internalización de A; además protege a la subunidad A de la inactivación por el pH gástrico. Se clasifica como una exotoxina debido a su potencia y antigenicidad elevadas, sin embargo se diferencia de una exotoxina clásica por cuanto no es liberada durante la vida del microorganismo sino que aparece en el medio solo después de la muerte y la autólisis de éste. La toxina es sintetizada como un polipéptido de cadena única; el clivaje o la formación de muescas en la molécula por medio de proteasas bacterianas en el curso de su liberación de la célula dan como resultado una molécula compuesta por una cadena pesada y una cadena liviana unida por enlaces no covalente y un puente de disulfuro. La producción de la toxina botulínica esta dirigida por bacteriófagos específicos. Patogenia Los casos de botulismo se clasifican en cuatro categorías: 1. El botulismo transmitido por los alimentos es un intoxicación alimentara letal que es resultado de la ingestión de la neurotoxina en alimentos procesados de manera incompleta y contaminados por los microorganismos. 2. El botulismo infantil relacionado con la ingestión por los lactantes de esporas de C. botulinum, la multiplicación de los microorganismos en el tracto gastrointestinal y la posterior absorción de la toxina. 3. El botulismo de las heridas, el menos común, enfermedad neuroparalítica asociada con las heridas, las cuales muestran pocas evidencias clínicas de infección activa. TEMAS DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA MÉDICA 375 4. El botulismo no clasificado se produce en las personas de más de un año de vida que tiene síntomas de botulismo clínico, sin un vehículo de transmisión identificable. Las manifestaciones clínicas del botulismo son atribuibles a la toxina de C. botulinum presente en los alimentos ingeridos en el tracto gastrointestinal de los lactantes o en las heridas. Es una de las toxinas más potentes que se conocen: 1µg es suficiente para matar a toda la humanidad. El botulismo humano en general es resultado de la ingestión de toxina botulínica preformada en los alimentos contaminados. Luego de la ingestión, la toxina es absorbida en el estómago y el intestino delgado, también en el colon. Después de un periodo de incubación que se relaciona de forma inversa con la dosis, la intoxicación conduce a una alteración funcional del sistema nervioso periférico que resulta de la inhibición de la liberación de acetilcolina desde las terminaciones nerviosas colinérgicas en la unión neuromuscular producida por la toxina botulínica. La toxina actúa en tres pasos: 1) unión a un receptor en la superficie en la membrana plasmática, 2) translocación o internalización de la toxina y 3) suceso intracelular cuyo resultado final es el bloqueo de la liberación de acetilcolina inducida por el estímulo nervioso. Además la toxina botulínica afecta la transmisión colinérgica en el sistema autónomo, tanto en los ganglios simpáticos como en las placas terminales motoras parasimpáticas ubicadas de forma periférica. En el botulismo de las heridas, C. botulinum contamina una lesión traumática. Es probable que la rareza de ésta forma de botulismo se deba a la incapacidad de las esporas para germinar con rapidez en los tejidos. El papel de la infección del tracto gastrointestinal como fuente de botulismo es menos claro. Los lactantes son especialmente susceptibles a la colonización del tracto intestinal por C. botulinum y a la producción de la toxina in vivo. La resistencia relativa del adulto a la colonización intestinal se adjudica a los cambios evolutivos de la dieta y a la flora bacteriana del intestino. Sin embargo en la actualidad se están observando casos de botulismo infantil en los adultos en especial en aquellos con anormalidades del tracto gastrointestinal como consecuencia de una enfermedad inflamatoria intestinal o de un procedimiento quirúrgico. Las alteraciones de la flora intestinal normal como resultado de aclorhidria o de la administración de antibióticos de amplio espectro, son factores de riesgo adicionales para el desarrollo por infección de C. botulinum y la producción de la toxina in vivo. Epidemiología Se encuentran esporas de C. botulinum en suelos y agua de todo el mundo. Existen tres formas de botulismo: botulismo clásico o transmitido por alimentos, botulismo infantil y de las heridas. La toxiinfección alimentaria se manifiesta en brotes relacionados con alimentos comercialmente preparados como enlatados mal conservados, pero más frecuentemente por vegetales, frutas y
