Download PECU-28 Susceptibilidad de Diferentes Líneas

PECU-28
Susceptibilidad de Diferentes Líneas Celulares a la Infección del Virus de la Diarrea
Epidémica Porcina
Gómez-Núñez L.1, Vargas E.L., Zapata M.M.2, Solís-Galicia D.F.2, Lara-Romero R.2, De la
Luz A.J. 2, Ramírez M.H.2, * Rivera-Benitez José Francisco3
RESUMEN.
El virus de la diarrea epidémica (vDEP) es emergente en México, su primera detección se
realizó en 2014. El aislamiento viral y la posterior adaptación del vDEP en cultivos celulares
ha sido un procedimiento complicado, debido principalmente a su difícil adaptación y
multiplicación in vitro. En el presente estudio se analizó la susceptibilidad de diferentes
cultivos celulares para identificar el sutrato óptimo para la multiplicación del virus. Se
emplearon cuatro diferentes inóculos virales, dos directamente de muestras clínicas y dos de
sobrenadantes de cultivo de dos virus previamente aislados en la línea celular Vero. Se
obtuvieron resultados favorables en el aislamiento primario empleando la línea celular Vero
y MARC-145 y en la adaptación a diferentes sustratos celulares fue dependiente del genotipo
viral empleado. Con los resultados obtenidos se plantean alternativas para el aislamiento y
adaptación del vDEP a diferentes cultivos celulares.
PALABRAS CLAVE.
Aislamiento viral, adaptación in vitro, Alfacoronavirus porcino.
INTRODUCCION.
El virus de la diarrea epidémica porcina (vDEP) se reportó por primera vez en Estados Unidos
en mayo de 2013. Desde entonces, se ha extendido rápidamente en la mayoría de los estados
de EE.UU y, en ese mismo año, en toda América del Norte incluyendo países como Canadá
y México. Actualmente, se encuentran circulando cepas variantes y virulentas en la población
de cerdos, ya que el vDEP tiene una alta tasa de mutación (Oka et al., 2014). La producción
1
CENID-MA, INIFAP
2
UNAM
3
*Centro Nacional De Investigación Disciplinaria En Microbiologia Animal (*Autor de
correspondencia: [email protected])
de una vacuna contra la diarrea epidémica porcina, se ha visto limitada principalmente por la
dificultad del virus para adaptarse y replicarse en cultivos celulares. Se ha reportado la
propagación exitosa en líneas celulares como Vero y MARC-145 (ambas de riñón de mono),
mismas que se han utilizado para el aislamiento a partir de muestras clínicas, para la
propagación de virus y para estudios de titulación y neutralización viral, con cepas circulantes
en Estados Unidos (Collin et al., 2015). A su vez, en México, se busca desarrollar
herramientas de diagnóstico oficial mediante aislamiento viral, sin embargo, esto no se ha
logrado por la adaptabilidad del propio virus. El objetivo del presente estudio fue replicar el
vDEP en líneas celulares homólogas y heterólogas del cerdo, para identificar un sustrato
celular óptimo para su multiplicación.
MATERIALES Y METODO.
Muestras clínicas Se obtuvieron muestras clínicas de intestino de dos lechones de dos días
de edad (MI-1 y MI-2), mismos que fueron infectados experimentalmente con el virus
identificado como PEDV/MX/MICH/01/2013 proveniente del Estado de Michoacán y
aislado en el año 2013; los intestinos fueron colectados a la 48 horas posinfección. Los
órganos fueron macerados con DMEM en una proporción 1:10 p/v. Posteriormente las
muestras se centrifugaron a 1500 × g durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante fue filtrado
con membranas estériles de nitrocelulosa de 0.45µm y 0.22µm, el material filtrado fue
empleado como inóculo para el aislamiento del virus. Aislamiento viral El aislamiento
primario se realizó de acuerdo a lo descrito por Hoffman et al. (1988).
Las células Vero fueron mantenidas con DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium)
suplementado con 5% de suero fetal bovino y 10% de caldo triptosa fosfato. Para la infección
del monoestrato, se retiró el medio de mantenimiento de los cultivos celulares y se procedió
a realizar un lavado con tripsina (0.05%). Se empleó medio de infección (DMEM, 10% TPB
y tripsina a una concentración de 10µg/ml), se agregó 100µl del inóculo (previamente filtrado
en membranas de nitrocelulosa con un poro de .22µ) y 900µl de medio a cada botella de 25
cm2, se incubaron por una hora a 37 °C en una atmosfera de 5% de CO2, para permitir la
adsorción. Finalmente, se agregaron 4ml de medio. El aislamiento viral se confirmó al tercer
pase mediante la prueba de RT-PCR en tiempo real. Los dos inóculos empleados como virus
adaptados a la multiplicación in vitro fueron aislados con este mismo procedimiento, la
identificación de cada uno fue V1 (cepa virulenta) y V2 (cepa variante).
Estudios de susceptibilidad viral la adaptación del virus de diarrea epidémica porcina se
realizó en diferentes líneas celulares: Vero, MA-104, MARC-145, LLC-MK2, PK15, LLCPK1, SCP, BHK-21, RK-13. Se inocularon los cultivos celulares siguiendo el protocolo
previamente descrito para el aislamiento viral. Una botella de cada línea celular fue asignada
como testigo sin inocular. Los cultivos se congelaron al tercer y quinto día, para las muestras
de aislamiento primario y para las de virus de cultivo, respectivamente. RT-PCR en tiempo
real Se realizó una prueba de RT-PCR en tiempo real a los sobrenadantes obtenidos de los
diferentes cultivos celulares infectados. Se incluyeron en las pruebas ARN de los cultivos
testigos de cada línea celular, macerados de intestinos, testigos de la reacción (control sin
templado), ARN de virus de gastroenteritis transmisible y de Deltacoronavirus porcino,
además de ARN testigo positivo.
RESULTADO.
En el aislamiento primario se presentó replicación viral en las líneas celulares Vero, MARC145, LLC-MK2, BHK-21 y PK-15. Durante la cinética de la RT-PCR los valores de
cuantificación (Cq) más altos registraron en las líneas Vero y MARC-145. En las demás
líneas celulares los valores de Ct se registraron muy cercanos al límite de detección o
negativos. El patrón de multiplicación no se presentó de forma homogénea con los dos
inóculos empleados. En el caso de los virus adaptados a crecimiento in vitro, se detectaron
muestras positivas a la replicación en todas las líneas celulares, en las líneas MARC-145,
PK15, LLCPK1, RK-13 y MA-104 se registraron los valores más bajos de Cq, evidenciando
una mayor replicación del vDEP, esto fue particularmente evidente empleando la muestra
V1. La muestra V2 mostró valores de Cq menores en la línea celular PK15 y en la línea
LLCPK1. El pico de multiplicación viral se observó a las 72 h para ambos inóculos (Tabla
1).
Tabla 1: Resultados de la multiplicación del vDEP en las diferentes líneas celulares.
Después de que el virus de la diarrea epidémica porcina fue identificado en los Estados
Unidos en 2013, inició el trabajo para aislarlo, mantenerlo y replicarlo en cultivo celular. En
este estudio se realizó el aislamiento y adaptación del vDEP, utilizando las líneas celulares
reportadas en la literatura como Vero y MARC-145, así como otras líneas celulares, entre
ellas MA-104, PK15, LLCPK1, LLC-MK2 y BHK-21. Diferentes factores pueden estar
implicados en la baja replicación del virus y la difícil adaptación a las líneas celulares
utilizadas, tales como el tipo de muestra y su manejo, el título del virus, las condiciones del
cultivo celular y el tipo de línea celular (Collien et al., 2015). Por ello, es necesario modificar
los procedimientos de aislamiento y adaptación viral, para aumentar la tasa de éxito de
replicación del vDEP.
CONCLUSIONES.
Se obtuvieron resultados favorables en el aislamiento primario empleando la línea celular
VERO y MARC-145 y en la adaptación a diferentes sustratos celulares fue dependiente del
genotipo viral empleado. El vDEP es un virus ARN, por lo cual su sitio de replicación se
encuentra en el citoplasma de la célula, para que la producción del virus in vitro se vea
incrementada, se requieren técnicas para facilitar el ingreso del virus al sistema hospedador
utilizado, lo cual se intentó hacer con la tripsina. Los resultados obtenidos mediante RT-PCR
en tiempo real indican que no existe replicación abundante en ciertas líneas celulares. Se
sugiere emplear diversos métodos que optimicen la entrada del virus a la célula, repetir la
metodología antes descrita y posteriormente mediante técnicas moleculares evidenciar la
multiplicación mediante técnicas moleculares. Es posible replicar el virus en células
heterólogas al cerdo, lo cual nos permite utilizar diversas líneas celulares para los múltiples
pasajes. Se busca mantener la producción de viriones a través de un determinado número de
pases y observar el comportamiento del virus, esperando que se adapte a la multiplicación en
sustratos celulares y así poder obtener masa antigénica necesaria para el adecuado desarrollo
de un biológico inactivado. Agradecimientos El presente trabajo fue financiado por Proyecto
Recursos Fiscales INIFAP: No. 13592932977
REFERENCIAS.
Collin, E. A., Anbalagan, S., Okda., F. Batman, R., Nelson, E., Hause, B.M. (2015). An
inactivated vaccine made from a U.S. field isolate of porcine epidemic disease virus is
immunogenic in pigs as demonstrated by a dose-titration. BMC Vet Res, 15 (11), 62.
Hofmann, M., Wyler, R. (1988). Propagation of the virus of porcine epidemic diarrhea in
cell culture. J Clin Microbiol. 26 (11), 2235-2239.
Oka, T., Saif, L.J., Marthaler, D., Esseili, M.A., Meulia, T., Lin, C.M., Vlasova, A.N., Jung,
K., Zhang, Y., Wang, Q. (2014). Cell culture isolation and sequence analysis of genetically
diverse US porcine epidemic diarrhea virus strains including a novel strain with a large
deletion in the spike gene. Vet Microbiol. 10 (173), 258-269.
ACADEMIA VERACRUZANA DE CIENCIAS http://www.avc.org.mx