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AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL VIRUS DE LA DIARREA EPIDÉMICA PORCINA
Macías M*, Massa A, J.R. Figueroa, Flores A, Vargas E, Torres N, Chávez A, Ramírez G, Raya R, Franco A.
Laboratorio de Diagnóstico.
Lapisa SA de CV.
[email protected]
INTRODUCCIÓN:
La diarrea epidémica porcina es una enfermedad
producida por un virus RNA perteneciente al orden
Nidoviridae, la familia Coronaviridae y género
Alfacoronavirus, tiene un genoma de aproximadamente
28 kb cuenta con dos regiones conservadas UTR 3´ y 5´ y
7 ORFs.
Se caracteriza por ser una enfermedad aguda y altamente
contagiosa causando alta mortalidad en cerdos lactantes
y difícilmente las lesiones provocadas por esta
enfermedad se diferencian de aquellas producidas por
Gastroenteritis Transmisible (GET), otro alfacoronavirus.
Esta enfermedad fue reportada en el 2013 en los Estados
Unidos donde al igual que en nuestro país ha
representado grandes pérdidas económicas en la
porcicultura.
MATERIAL Y MÉTODOS.
De las muestras recibidas en el laboratorio de diagnóstico
de Lapisa se seleccionaron aquellas que tuvieron una
mejor replicación en cultivo celular y una mayor carga
viral estas se procesaron para inoculación en cultivo
celular, para lo que se utilizaron microplacas de 6 pozos y
botellas de cultivo de 25 cm2 con células VERO a las
cuales se les dio tratamiento con tripsina para la
infección, y al final del tiempo de incubación se adicionó
Medio Dulbeco de mantenimiento.
Las células fueron incubadas a 37°C con 5% de CO2 y
revisadas diariamente hasta observar la presencia de
efecto citopatogénico, el cual varió entre cada una de las
cepas. Una vez que el efecto fue evidente se tomó el
fluido de las botellas y de las placas para enviarse al área
de biología Molecular y las placas fueron lavadas y
fijadas para tinción de inmunuhistoquímica, para
secuenciación se purificaron los productos obtenidos de
PCR utilizando primers forward y reverse marcados
con IRdye en 700 y 800 nm y ésta se realizó en un
equipo Li-cor 4300 DNA Analizer. Los fragmentos
analizados fueron de 651-bp, 833-bp y 808 bp
respectivamente para el gen Spike (S), membrana( M) y
ORF3
Para el análisis de las secuencias obtenidas programa
BioEdit Sequence Alignement Editor 7.2.5.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
De las muestras seleccionadas para aislamiento viral se
obtuvieron los siguientes resultados:
En cultivo celular fue evidente el efecto citopático de las
muestras entre los 3 y 6 días post-infección:
PCR y Secuenciación.- Las cosechas de estos fluidos
fueron enviadas al área de Biología Molecular para
detección del virus de la Diarrea Epidémica Porcina,
obteniéndose resultados positivos para su posterior
comparación en GenBank.
CONCLUSIONES:
De acuerdo a los resultados obtenidos, se puede concluir
que los fluidos virales obtenidos a partir de las muestras
procesadas e inoculadas en la línea celular VERO son
efectivamente aislados de virus de la Diarrea Epidémica
Porcina.
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