Download Enzimas degradadoras de pared celular

Fitopatología
Desintegración de
tejidos
2016
Dra. Laura Levin
Laboratorio de Micología Experimental
Depto. de Biodiversidad y Biología
Experimental
FCEN – UBA
E-mail: [email protected]
Mecanismos involucrados en la defensa de las plantas a fitopatógenos
Defensa pasiva o preformada (preexistente)
Barreras estructurales o físicas (pelos, cera cuticular, grosor de la cutícula y de la
pared celular, composición de la pared celular, tamaño de los estomas, lenticelas,
tejido interno de la planta, suberificación).
Primera línea defensiva de las plantas.
Ej. cera cuticular: repele al agua y previene la formación sobre el tejido de una
película de agua en la cual el patógeno puede germinar (hongos) o multiplicarse
(bacterias).
Barreras interiores
a) La estructura de las paredes celulares.
b) Tejidos protegidos por paredes celulares gruesas que obstaculizan el avance del
patógeno.
Barreras bioquímicas preformadas (compuestos fenólicos (catecol y el ácido
protocatecuico), saponinas, leticinas, etc.).
Las moléculas preformadas pueden ser no tóxicas, pero dan lugar a la liberación del
componente tóxico del precursor al ser dañado el tejido vegetal durante los
procesos de infección ej. ácido cianhídrico a partir de compuestos cianogénicos
contenidos en sorgo y lino.
Defensa activa o inducida, dinámica, resulta de estructuras o sustancias
producidas como respuesta a la penetración del patógeno.
• Estructuras histológicas de defensa: ej.
-Formación de capas de corcho, bloquean flujo de nutrientes y agua del área
sana a la infectada privando al patógeno de nutrientes. Aparecen lesiones
necróticas resultantes de la muerte del tejido y el patógeno.
-Formación de capas de abscisión: banda circular de células que rodean al punto
de infección comienzan a dividirse y a formar células de paredes delgadas, la
laminilla media que se encuentra entre esas dos capas de células se disuelve
completamente separándose el área del resto de la hoja.
-Formación de tílides, en respuesta a la infección en tejidos vasculares,
producen la obstrucción de los vasos, conducen a la marchitez vascular.
-Depósito de sustancias gomosas: en espacios intercelulares y dentro de las
células alrededor de las lesiones.
• Estructuras celulares (citológicas) de defensa: incluyen cambios
morfológicos en la pared celular (hinchamiento de la pared de células
epidérmicas y subepidérmicas) o la envainación de la hifa penetrante.
• Estructuras de defensa citoplasmáticas:
+común muerte celular (defensa necrótica)
• Mecanismos de defensa bioquímicos:
- Aumento en compuestos fenólicos normalmente presentes (ej. inactivan
enzimas pectinolíticas en la infección de árboles por Sclerotinia
fructigena).
Defensa del patógeno producción de fenoloxidasas.
- Producción de fitoalexinas (polifenoles, cumarinas, flavonoides y
antocianinas).
Defensa del patógeno producción de fenoloxidasas.
- Formación de sustratos resistentes a enzimas del patógeno (ej.
acumulación de Ca alrededor de lesiones, inhibe poligalacturonasa, en el
caso de los ataques de Rhizoctonia al poroto).
- Inactivación de las toxinas del parásito.
Penetración del patógeno: en la superficie de las plantas en forma directa, a través
de aberturas naturales de la planta o a través de heridas.
La penetración del patógeno no siempre produce una infección.
Patógenos: se pueden clasificar en función de las estrategias que emplean al utilizar a
la planta como sustrato:
Necrótrofos: matan a las células de su huésped y descomponen el tejido para
utilizarlo en su crecimiento.
Biótrofos: infectan a su huésped sin causar muerte celular, ya que necesitan
mantenerlo vivo para cumplir su ciclo de vida.
Hemibiótrofos: mantienen a las células vivas en etapas iniciales de la infección,
pero las matan en etapas avanzadas.
Los patógenos liberan: enzimas, toxinas, reguladores del crecimiento y polisacáridos.
Enzimas: desintegran componentes estructurales de las células del hospedante.
Toxinas: actúan directamente sobre el protoplasto y alteran permeabilidad de membranas y su
funcionamiento.
Reguladores del crecimiento: aumentan o disminuyen capacidad de las células para dividirse y
crecer.
Polisacáridos: serían importantes sólo en las enfermedades vasculares, en las que interfieren
pasivamente con la translocación del agua en las plantas, o bien en un momento dado, pueden
llegar a ser tóxicos.
Superficies vegetales
Cutícula (aéreas)
ceras (jóvenes)
Celulosa (raíces)
Ceras
cuticulares
>>> hongos
Gránulos
láminas
proyecciones
Puccinia ordei
Pestalotia malicola
fuerza mecánicas
enzimas
Esquema en el que se muestra
la estructura y composición de
la cutícula y de la pared celular
de las células epidérmicas
foliares
Ceras
Cutícula
Cutina
Pectina + celulosa
>>> hongos
>>> bacterias
Cutina: principal componente
de la cubierta cuticular. La
parte superior de esta
cubierta se encuentra
combinada con ceras, mientras
que la inferior (a nivel de la
zona donde se une con las
paredes externas de las
células epidérmicas) está
mezclada con pectina y
celulosa.
Cutina: poliéster insoluble que
proviene de los derivados no
ramificados de hidroxiácidos
grasos C16 y C18.
Cutinasas
Estearasas
específicas
Poliester de
ác. grasos
insoluble
Constitutivas
constitutivaso
inducibles
reguladas x glu
C 16
C18
Producción de cutinasa también estimulada por ácidos grasos de la cutícula.
Mutantes deficientes en cutinasa < virulencia.
En Fusarium cepas con > producción de cutinasa > virulencia.
Inhibición de cutinasas por inhibidores químicos o por anticuerpos enzimáticos
aplicados sobre la superficie celular
protegen a la planta de la infección.
Ej. Botrytis cinerea produce cutinasa y lipasa: con anticuerpos antilipasa las
esporas no pueden penetrar la cutícula y no producen enfermedad.
En Monilia fructicola (podredumbre morena de los frutales de carozo) las
cutinasas son inhibidas por compuestos fenólicos como el ácido cafeíco, que
abunda en el pericarpio de frutos jóvenes resistentes a la infección, su
concentración declina en frutos maduros y entonces aumenta la actividad
cutinasa y penetra el hongo.
Materiales lignocelúlosicos en las paredes celulares vegetales
La pared primaria tiene una composición muy
variable en distintos tejidos y especies
vegetales, pero está compuesta de aprox. (en
peso seco):
• 9-25% de celulosa
• 25-50% de hemicelulosas
• 10-35% de pectinas
• Con alrededor de 1-10% de proteína
estructural (ppal. extensina)
Matriz (hemicelulosas, pectinas, y proteína
estructural) en ella embebidas microfibrillas
de celulosa.
La pared secundaria se forma después de que
la célula ha terminado su crecimiento.
La pared secundaria tiene una composición
más constante que la primaria y está
constituida por:
• 41-45 % de celulosa
• 30 % de hemicelulosas
• 22-28 % de ligninas.
Degradación de polímeros vegetales
Almidón – reserva vegetal
Materiales lignocelulósicos (paredes celulares):
Celulosa
Hemicelulosa
Pectina
Lignina
polisacáridos
polímero fenólico
Sustancias Pécticas Son heteropolisacáridos ácidos de alto PM
Forman parte de paredes celulares primarias
y laminilla media
En los árboles la laminilla media de los elementos
xilemáticos jóvenes está constituida
mayoritariamente por pectina, pero al envejecer
se torna altamente lignificada.
Son sustancias solubles en agua, con alto poder gelificante
Pectina: cadena principal ácido galacturónicos, con uniones a- 1,4,
parcialmente esterificados con metanol y acetato, azúcares neutros
en cortas cadenas laterales.
Acido péctico: polímero de ácido galacturónico.
Protopectina: es la sustancia péctica madre, insoluble en agua,
presente en las plantas.
Enzimas pectinolíticas:
 Protopectinasas: que solubilizan la protopectina para formar pectina
Tipo A: reaccionan con el ácido poligalacturónico en el interior de la molécula
Tipo B: actúan sobre uniones de la protopectina con otros componentes de la pared.
 Pectin-esterasas: catalizan la desesterificación de la pectina
pectina
ác. péctico + metilo
 Enzimas despolimerizantes (pectinasas):
Actúan sobre uniones a- 1,4
* preferencia por sustrato: pectina (polimetilgalacturonasas)
pectato (poligalacturonasas)
* modo de acción:
al azar (endoP)
a partir del extremo no reductor (exoP)
* mecanismo de clivaje: Hidrólisis (hidrolasas) rompen las cadenas al
añadir una molécula de agua.
Transeliminación (liasas)
rompen las cadenas
eliminando una molécula de agua del enlace
rompiéndolo y liberando productos que
poseen un doble enlace insaturado.
Degradación de pectina
Fusarium
Fusariosis en paps
Monilinia fructicola:
Moniliasis en durazno
Pectobacterium
Enzimas pectinolíticas:
Participan en el desarrollo de muchas
enfermedades, en particular las que se
caracterizan por pudrición blanda de los
tejidos (se ve maceración y
amarronamiento por liberación de
fenoles durante la maceración, pérdida
de agua y luego encogimiento de los
órganos atacados).
Pectinasas también actúan en conjunto
con cutinasas y celulasas en la
penetración.
Rhizopus
En cosecha
La degradación de la pectina principalmente en laminilla media provoca la
maceración de los tejidos (ablandamiento y pérdida de la cohesión de los
tejidos de la planta y la separación de las células individuales, que finalmente
mueren).
La muerte se asocia con cambios en la permeabilidad, indicando que hay daño
de membrana.
El debilitamiento de las paredes celulares y la maceración de los tejidos
indudablemente facilitan la invasión por parte del patógeno (a nivel
intercelular o intracelular), de los tejidos de su hospedante.
Las enzimas pécticas también proporcionan los nutrientes para el patógeno
en los tejidos infectados.
Dichas enzimas, debido a los desechos que producen, al parecer intervienen
en la formación de obstrucciones y oclusiones vasculares propias de los
marchitamientos vasculares.
Producen enzimas pectinolíticas: hongos, bacterias y nematodes.
En nematodes juegan rol en la penetración de raíces ej. nematodo de la agalla
Meloidogyne spp, facilitan movimiento a través de laminilla media e
intervienen posiblemente en la formación de los agallas.
Enzimas degradadoras de pared celular (CWDE)-Factores de virulencia
•Hongos y bacterias producen enzimas degradadoras de pared celular (CWDE)
involucradas en romper las barreras a la penetración constituidas por las paredes
celulares y absorber nutrientes.
•Estas enzimas son también factores de virulencia.
Primer factor de virulencia identificado:
Pectato liasa en Erwinia chrysanthemi (1985).
Endopoligalacturonasa (EndoPG) en Aspergillus flavus (en algodón) (1997).
Para que una enzima actúe debe existir pH y temp adecuado en el hospedante. Ej.
El pH del pericarpio de 1 variedad de fruto de aguacate resistente a
Colletotrichum gleosporiodes era < a 5.8 y de una susceptible > 6.3. Se observó
que el hongo sólo produce pectato liasa en cultivo líquido a pH > 5.8.
Algunos Colletotrichum secretan amonio para mantener pH alto en el sitio de
infección para activar a la pectin liasa.
La secreción de amonio es también un factor de virulencia en Colletotrichum.
Temperatura:
La mayoría de los patógenos infectan a temperatura moderada pero Botrytis
cinerea infecta plantas incluso a 2ºC (a esa temperatura ya se detecta endoPG).
Acción concertada de las enzimas:
La EndoPG no puede clivar pectina, mientras que la Pectinmetilesterasa demetila
pectina sin afectar la estructura de la cadena.
Solas no degradan completamente, sí en conjunto.
En Uromyces vicia fabae la penetración va acompañada por secreción de las 2
enzimas por el haustorio, pero luego, se va regulando de acuerdo al estadío de
infección cuál se produce.
A veces también contribuye la actividad pectinasa del hospedante. Ej. en la
maduración del tomate disminuye el grado de metilación de la pectina que
posiblemente incrementa su susceptibilidad a patógenos.
Acción concertada de celulasa y xilanasas: xilosa activa transcripción de genes de
celulasas y celulosa de xilanasas, ej. en Aspergillus niger .
Arabinosa induce expresión de genes de EndoPG en Colletotrichum lindemuthianum.
EndoPG + impacto sobre la integridad del polímero que ExoPG pero contribuye
menos a proveer de nutrientes, por eso para ingresar liberan EndoPG, y en un
estadío posterior cuando necesitan nutrientes también ExoPG .
Maceración: EndoPG y endopectato liasas. Grado de maceración proporcional a la
concentración enzimática.
Biótrofos: regulan secreción de CWDE para causar daño restringido (en cultivo
escasos títulos enzimáticos) en contraste: necrótrofos mucha producción
enzimática y daño generalizado.
celulosa
longitud
especie
edad
estado
metabólico
Valonia 18.000 glu/mol
Gossypium 14.000 glu/mol
madera
2.000 glu/mol
Celulosa
Polímero lineal de monómeros de glucosa unidos por enlaces ß-1,4.
Organización en microfibrillas (30-36 cadenas de celulosa, 2-10 nm de diámetro).
La ausencia de cadenas laterales, permite la formación de agregados moleculares
(microfibrillas) estabilizados por puentes de hidrógeno entre cadenas paralelas.
Las microfibrillas están conformadas por zonas cristalinas donde las moléculas
de celulosa se hallan ordenadas y regiones paracristalinas donde se desorganizan.
Tipos de celulosa:
1- Nativa o cristalina: alto grado de cristalinidad u ordenamiento y de polimerización,
insoluble (avicel, papel de filtro)
2- Celulosa modificada: menor grado de cristalinidad y de polimerización,
soluble (celulosa amorfa, carboximetilcelulosa)
Sólo ciertos hongos y bacterias son capaces de degradar completamente la celulosa.
• Organismo modelo: Trichoderma reesei
Enzimas celulolíticas:
Endoglucanasas Cortan al azar sobre el polímero
Liberando mayormente oligosacáridos
Generan extremos no reductores
Actúan sobre zonas amorfas de la fibrilla
Disminuyen el grado de polimerización
Sustratos sobre los que actúan: carboximetilcelulosa
celulosa amorfa, celooligosacáridos
Exoglucanasas o Celobiohidrolasas (CBH)
Actúan en general a partir de extremos no reductores
Liberan celobiosa
Actúan sobre la celulosa cristalina (ejp. avicel)
Glucohidrolasas (+ raras) liberan unidades glucosa
b-glucosidasas Actúan sobre oligómeros, entre ellos celobiosa liberada
por CBH
Actividades oxidativas auxiliares: ej. remueven productos que pueden generar
represión catabólica (Celobiosa deshidrogenasa, glucosa oxidasa)
Swollenin (en T. reesei) sin poder hidrolítico, función expandir las fibrillas para
facilitar la entrada de las otras celulasas.
Endoglucanasas
Corta celulosa
al azar
Libera extremos
no reductores
exoglucanasas
celobiosa
Glucosa
b-glucosidasa
b-glucosidase
• Enzimas oxidativas involucradas en la degradación de celulosa:
Teóricamente, las hidrolasas son suficientes para degradar la
celulosa completamente hasta glucosa. Sin embargo, la porción
cristalina de la celulosa sólo es parcialmente atacada por enzimas
hidrolíticas y en la práctica su degradación es lenta e incompleta.
• Recientemente se descubrió una familia de enzimas oxidativas que
juegan un papel importante en la degradación de polisacáridos
cristalinos: clivando oxidativamente en las regiones cristalinas:
Monooxigenasas polisacárido-líticas (LPMOs).
Enzimas celulolíticas que secretan los patógenos tienen una
importancia en el ablandamiento y desintegración de las
sustancias de la pared celular y además permiten que el
patógeno penetre y se propague en los tejidos del hospedante.
Además, las enzimas celulolíticas liberan, de las cadenas de
celulosa, azúcares solubles que sirven de alimento al patógeno.
En las enfermedades vasculares, liberan en la corriente de la
traspiración grandes moléculas de celulosa que dificultan el
movimiento normal del agua en la planta.
Producen enzimas celulolíticas: hongos, bacterias y nematodes.
Hemicelulosas
Heteropolisacáridos, uniones β- 1,4 y ramificaciones de 1-2 azúcares,
pueden estar acetilados.
Monosacáridos componentes: pentosas, hexosas y ácidos urónicos.
Macromoléculas ramificadas y amorfas.
Se nombran según el/los azúcares predominantes.
El más abundante:
Xilano: xilosa, β - 1,4
Arabinoxilano
Glucuronoxilano
Glucuroronoarabinoxilano
Aparecen en las paredes celulares en forma amorfa, Asociados a las microfibrillas de
celulosa por puentes de hidrógeno y mediante uniones covalentes a la lignina.
Hemicelulosas interactúan entre sí y con la celulosa mediante interacciones no
covalentes. Aglutinan las fibras de celulosa principalmente en la pared 2aria.
Pectinas aglutinan las fibras de celulosa en la pared 1aria mediante enlaces covalentes.
Las hemicelulosas son a menudo los primeros componentes de la pared celular que son
atacados por los hongos causantes de pudrición, debido a la menor extensión de sus cadenas,
solubilidad y localización expuesta alrededor de las microfibrillas de celulosa.
Enzimas xilanolíticas: son enzimas hidrolíticas
Patrón de ataque análogo al de degradación de celulosa por las celulasas. Sin embargo, las
exoenzimas están ausentes, reflejando probablemente el bajo grado de polimerización de
las hemicelulosas (200)
La hidrólisis de estas moléculas complejas requiere la interacción de numerosas enzimas que
corten la cadena principal y también las laterales. Las distintas enzimas actúan
sinérgicamente en la degradación del sustrato.
Endoxilanasa: actúa sobre la cadena de xilano al azar, disminuyendo el grado de
polimerización con liberación de: xilooligosacáridos, xilobiosa, xilosa.
b-xilosidasa: actúa luego de la endoxilanasa. Actúa sobre xilooligosacáridos (a partir de los
extremos no reductores) o sobre xilobiosa, dando como producto xilosa.
Se producen tempranamente en los procesos de pudrición y están asociadas con la
degradación de lignina.
Degradarían las hemicelulosas en la pared celular inmediatamente adyacente al lumen y se
introducirían progresivamente en la pared secundaria, abriendo canales de suficiente
tamaño como para permitir el acceso de las enzimas degradadoras de lignina de mayor
peso molecular.
Las hemicelulosas también proveerían de energía a los hongos causantes de deterioro ya que
la lignina sola aparentemente no puede servir como sustrato para el crecimiento.
La pérdida de hemicelulosas siempre acompaña la remoción de lignina.
1 – endoxilanasas
2 - α-L-arabinofuranosidasas
3 – glucuronidasas
4 – feruloyl y coumaroyl esterasas
5 – acetil xilano esterasas
6- β-xilosidasas
Liberación de:
hexosas
pentosas
ac.hurónicos
Enzimas que actúan sobre ramificaciones: a-arabinofuranosidasas (que remueven cadenas laterales de a
-arabinosa), a-glucuronidasas (que liberan ácidos glucurónicos de las cadenas laterales),
acetil esterasas (que remueven los grupos sustituyentes acetílicos de la xilosa),
feruloylesterasas (clivan enlaces éster entre ácidos hidroxicinámicos: ferúlico-cumárico y
arabinoxilanos y ciertas pectinas).
•
Hongos
por su capacidad hidrolítica y por su distribución, son
los organismos lignocelulolíticos por excelencia.
•
Secretan enzimas extracelulares que actúan sinérgicamente en la
degradación los materiales lignocelulósicos (paredes de las células
vegetales, constituidas por pectina, celulosa, hemicelulosa y lignina).
•
Nutrición absortiva: sólo son capaces de incorporar moléculas
pequeñas que utilizarán como fuente de materia y energía para su
crecimiento.
•
Al ser incapaces de utilizar polímeros, el paso inicial para su
nutrición a partir de éstos, es la secreción al medio de enzimas
extracelulares que pueden degradarlos a moléculas pequeñas que
serán incorporadas.
•
El hecho de secretar enzimas extracelulares y su particular forma
de crecimiento filamentoso, células alargadas de crecimiento apical,
hace que sean los organismos mejor adaptados al aprovechamiento
del sustrato, ya que además de degradarlo pueden penetrar en él.
•
Las formas fúngicas levaduriformes no son típicamente
degradadoras de polímeros, prefiriendo hábitats donde abundan los
azúcares solubles.
Características de enzimas que degradan polisacáridos
de pared
Extracelulares y la mayoría inducibles
Sistemas enzimáticos: endoenzimas que actúan sobre el polímero al azar,
dentro de la molécula, produciendo oligosacáridos y reduciendo
la viscosidad del sustrato
exoenzimas que actúan a partir de un extremo,
el extremo no reductor de la molécula,
liberando mono o disacáridos de modo secuencial.
enzimas que actúan sobre oligosacáridos
Sinergismo
Regulación de la síntesis: inducción (polímero)
represión (glucosa)
Modelo de
Estructura
de la Lignina
Lignina
Polímero aromático, de alto PM (peso molecular promedio: 105 daltons), tridimensional,
estructura estereo-irregular amorfo, insoluble en agua.
Compuesto por unidades fenilpropano (unidades hidroxifenílicas, guaiacílicas y siringílicas)
Se sintetiza por polimerización oxidativa de los alcoholes p-cumarílico, coniferílico y sinapílico
Unidades diferentes tipos de enlaces inter-monoméricos no hidrolizables: C-C, C-O-C
Enlace β-O-4 → Unidades de tipo no fenólico
Sólo un 5–25% de las unidades fenilpropano en el polímero presentan su grupo hidroxilo libre
(tipo fenólico).
Laminilla media y pared secundaria
contienen lignina
Pared secundaria > porcentaje del volumen total celular,
por lo tanto > parte de la lignina se localiza allí.
Sin embargo, la laminilla media y los ángulos celulares
contienen la mayor concentración de lignina.
Debido a su estructura la
lignina es altamente resistente
a la degradación, y hasta el
momento los únicos organismos
capaces de mineralizarla
eficientemente llevándola a
CO2 y H2O como productos
finales son los hongos de
pudrición blanca.
Degradación de lignina
Lignina
- Se forma por polimerización al azar originando una estructura compleja e
irregular.
- La diversidad de uniones presentes e irregularidad de su estructura, dificultan la
producción de enzimas capaces de reconocer y romper todos los enlaces.
- Solución: producción de enzimas de baja especificidad que inician, pero no
dirigen, reacciones oxidativas en la lignina.
Kirk y Farrell (1987) llamaron a este proceso “combustión enzimática”: la enzima
activa la lignina para superar una barrera energética e iniciar una fragmentación
oxidativa termodinámicamente favorecida, sin un control posterior de los
mecanismos de reacción por parte de la enzima.
La biodegradación de lignina no procede removiendo ordenadamente las unidades
aromáticas periféricas, también involucra la oxidación de anillos aromáticos y
cadenas en el interior del polímero, incrementando así la solubilidad y
higroscopicidad del núcleo del polímero, paralelamente a la liberación de
fragmentos de diferentes tamaños. La naturaleza desordenada de este proceso
de degradación concuerda con el concepto de combustión enzimática.
Debido a que la lignina es un polímero insoluble, los estadíos iniciales de la
biodegradación deben ser extracelulares. Los estadíos finales que conducen a la
mineralización de la lignina que culmina en la liberación de CO2 posiblemente se
lleven a cabo en el interior de las hifas fúngicas.
Características de ligninasas:
Extracelulares
Inespecíficas
Alto potencial redox
Actividades catalíticas sobre la lignina:
•Clivaje Ca-Cb (1)
•Clivaje unión b -O -4 (2)
•Clivaje del anillo (3)
•Demetoxilación
•Oxidación de Ca a cetona
•Otras
Los hongos de pudrición blanda y castaña degradan también
lignina pero en menor grado, principalmente se dan
reacciones de demetoxilación.
Enzimas ligninolíticas
white-rot fungi:
Lignin-peroxidasa (LiP)
Manganeso peroxidasa (MnP)
Lacasa (fenoloxidasa)
 Otras: Versátil peroxidasa, Peroxidasa
decolorante de tintes (DyP)
No todos los hongos
causantes de pudrición
blanca poseen todas las
enzimas de este sistema
Distintas estrategias de
degradación
* Enzimas productoras de H2O2:
Glucosa oxidasa
intracelular
Aril alcohol oxidasa
Glioxal oxidasa
extracelular
•Celobiosa dehidrogenasa (CDH)
Oxida celobiosa y reduce quinonas, radicales fenoxi
Amilasas:
La mayoría de los patógenos utilizan el
almidón y otros polisacáridos de reserva
en sus actividades metabólicas
Principales enzimas fúngicas
amilolíticas:
 a-amilasa: endoenzima, solo
uniones a- 1,4
 glucoamilasa: exoenzima, a1,4 y a- 1,6 con menor afinidad
 a-glucosidasa, a- 1,4 y 1,6 de
di- oligosacáridos (exo)
a-am ila sa
glucoamilasa
dextrinas
a-lím ite
glucosa
oligosacárido lineal
Almidón
Amilosa: glc, a-1,4
Amilopectina: glc a-1,4,
ramificaciones a- 1,6
a-glucosidasa
glucosa
m altosa
glucosa
Fig. 1: Degradación del almidón por las principales amilasas fúngicas.
Proteasas:
Proteínas: enzimas, constituyentes de membranas celulares, de pared, etc., →
su degradación por proteasas de patógenos afecta organización y funcionamiento de las
células hospedantes.
Proteínas estructurales de pared (+importante extensina: constituye 0.5% de la pared en
tejidos sanos y entre 5-15% en tejidos infectados por hongos aumenta rigidez de la pared).
Por ahora se desconoce rol proteasas en el desarrollo de las enfermedades.
PROTEASAS: Clivan hidrolíticamente las uniones peptídicas
1. Según el sitio de acción:
Endopeptidasas (clivan uniones distantes de los extremos)
Exopeptidasas (clivan uniones peptídicas próximas a los extremos amino o carboxilo del
sustrato, se clasifican en: aminopeptidasas y carboxipeptidasas)
2. Según el grupo funcional presente en el sitio catalítico: aminoácidos o metales
serin-proteasas
aspartil-proteasas
cistein-proteasas
metalo-proteasas
3. Según el pH de actividad:
proteasas ácidas
proteasas neutras
proteasas alcalinas
Lipasas actúan sobre:
• Aceites y grasas que se encuentran en muchas células, especialmente en las
semillas (almacenan energía).
• Lípidos céricos, que se encuentran en la mayoría de las células epidérmicas
expuestas a la atmósfera.
• Fosfolípidos y glucolípidos de las membranas celulares de la planta.
LIPASAS: hidrolizan la liberación de los ácidos grasos de una molécula lipídica.
Patógenos utilizan los ácidos grasos.
lipasa (triacilglicerol-acilhidrolasa)
triglicérido
glicerol-P
ácidos grasos
DESINTEGRACIÓN DE PARENQUIMA
(ÓRGANOS CARNOSOS)
pudriciones blandas
Pectinasas
Celulasas
Pudrición: reblandecimiento, decoloración y con
frecuencia desintegración de un tejido vegetal
suculento como resultado de una infección
bacteriana o fúngica.
Penicillium expansum
Pectobacterium sp.
Pectinasas,Celulasas
Proteasas
Meloidogyne javanica
nematodo de la agalla
pudriciones secas
Entrada y colonización
de raíces
Cladosporium cucumeris
Alternaria alternata
DESINTEGRACIÓN DE CORTEX Y FLOEMA
Cancros
Cancro: lesión necrótica y con
frecuencia profunda que se produce
en el tallo o ramas de una planta.
Xanthomonas arboricola pv. pruni
Cancrosis del ciruelo
Fusarium/ pino
Cryphonectria
parasitica
Damping off
Pythium Phythophthora
Rhizoctonia Fusarium
Post-emergencia
Pérdida de rigidez y
caída de los órganos de
la planta que por lo
general se debe a la
falta de agua en su
estructura
Pre-emergencia
Pudriciones de raíz
y cuello
(no leñosas)
Helmintosporium
Fusarium
NECROSIS Y DESTRUCCIÓN DE FOLLAJE
Diplocarpon rosae
Antracnosis
Fusarium
Colletotrichum
Tizones (blight) Destrucción general y rápida de las hojas, flores y tallos.
Toxinas
no enzimático
Sclerotinia
Manchas foliares
Mecanismo de defensa
Células muertas
Tizón
bacteriano
Erwina amylovora
Destrucción del xilema
Marchitamientos vasculares
Enzimas?
Fusarium
lam media?
Ceratocystis ulmi
gomas mucílagos
Xanthomonas,
taponamientos
Pudrición de madera- caries (wood-rot)
centro
PUDRICION BLANCA
Basidiomycota y
algunos Ascomycota
Degradación:
lignina + (celulosa
hemicelulosa)
-
Más frecuente en Angiospermas
Exoenzimas liberadas por hifas
Senderos de erosión
Pérdida de peso
Sistema enzimático
Lignin-peroxidasa (LiP)
Manganeso peroxidasa (MnP)
Lacasa
Inespecífico
Alto potencial oxidativo
Extracelular
2 Patrones de degradación de lignina
Simultánea
Lignina
hemicel
celulosa
= veloc
Sobre
S2 y S1
Paredes
adelgazadas
Células perforadas
Aspecto fibroso
y blanqueado
(Rara en Gimnospermas,
S3 resistente)
Selectiva
Eliminan
lignina de LM
y pared 2ria
Células con
celulosa en S2
Células separadas
Aspecto fibroso
moteado
Estos patrones varían
según:
- Especie fúngica
- Madera degradada
- ≠ Zonas de la
madera: tipos celulares
que la componen, tipo
de lignina (S o G) y su
concentración
- Factores
ambientales
(temperatura,
humedad, O2)
Motivos que originan
diferentes formas de
ataque a la pared
celular:
- Todavía no han sido
elucidados
- Probablemente estén
relacionados con
diferencias en las
enzimas oxidativas
producidas por el
hongo y también
sistemas de represión
de las enzimas
celulolíticas y
hemicelulolíticas
Tinción con
Safranina Fast Green
Zonas lignificadas ( en rojo)
No lignificadas (en celeste)
Degradación simultánea (Trametes trogii en
Populus sp.)
Degradación selectiva (Trametes trogii en
Populus sp.)
PUDRICION CASTAÑA
Basidiomycota
Degradación:
celulosa
hemicelulosa
Laetiporus sulphureus
Roble
Más frecuente en coníferas
Degradan “a distancia” en pared secundaria S1 y S2
S3 poco modificada
P 1ria y LM no atacadas
Sistemas enzimáticos “móviles”
enzimático
No enzimático
sistema celulasa
Fe2+ y Mn2+
H2O2
La madera queda de color marrón,
consiste principalmente de lignina
modificada y a menudo se rompe en
fragmentos cúbicos.
Fomitopsis pinicola/abeto
Carecen de las fenol oxidasas características
de hongos de pudrición blanca.
Cierto grado de degradación de lignina,
principalmente a través de reacciones de
demetoxilación.
No tienen exoglucanasa y en cambio llevarían a
cabo la solubilización de la celulosa nativa por
un mecanismo que involucra a la endoglucanasa
y a factores no proteicos, entre ellos H2O2 y
Fe(II) (reactivo de Fenton: que produce
radicales libres *OH muy reactivos que oxidan
las cadenas de celulosa).
Clivan completamente a través de las regiones
amorfas de las microfibrillas antes de utilizar
la celulosa; En estadíos tempranos del
decaimiento hay reducción de la fuerza
mecánica de la madera pero no pérdida de
peso seco.
Movilización de celulosa de S2 y S3
Enriquecimiento en lignina
Madera oscurecida
Pérdida de birrefringencia (celulosa) << birrefringencia
Separación celular
Patrón cúbico
separación de células + zonas amorfas
Depolimerización en estadíos tempranos
<<< resistencia
poca pérdida de peso
Laetiporus sulphureus/acacia
PUDRICION BLANDA
Degradación:
Celulosa en S2
Ascomycota y Deuteromicetes
Hifas en la S2 dan ramificaciones en T y L
(tipo 1) común en coníferas.
Erosión y cavidades (tipo 2) común en
Angiospermas.
Madera inmersa en agua o impregnada.
Preferencia para degradar celulosa pero
también degradan hemicelulosa y en menor
proporción lignina (siringil).
Dejan la madera húmeda (podredumbre
húmeda) blanda, amarronada, quebradiza
cuando seca.
Tipo 1
Tipo 1
Tipo2
tipo1
Hongos activos
sólo en capas
externas de la madera
Agentes de PB y PC
facultativos
en pudrición blanda
Dos formas de pudrición blanda:
Tipo I (común en coníferas), se observan cadenas de cavidades romboidales
dentro de la S2, normalmente alineadas con las microfibrillas de celulosa (las
cavidades se producen por fases de crecimiento oscilatorio de las hifas que
penetran en la pared celular, seguida por la degradación de la pared celular
secundaria que las rodea).
Tipo II (común en angiospermas), se observa una erosión gradual de toda la
pared secundaria. La laminilla media persiste aún en estadios avanzados del
deterioro (esto distingue al tipo II de pudrición blanda de la degradación no
selectiva causada por hongos de pudrición blanca que erosionan y pueden
destruir completamente la laminilla media).
Las peroxidasas ligninolíticas producidas por hongos causantes de pudrición
blanda no tendrían el potencial oxidativo suficiente para atacar a la G lignina,
pero se comprobó que sí mineralizan la S lignina.
Formación de cavidades estaría influida por: tipo y concentración de lignina
En las coníferas, ricas en G lignina, se observa formación de cavidades en la S2,
mientras que la pared terciaria, lindante con el lumen celular, con alto contenido
de fenoles no es atacada.
La alta concentración de G lignina en la laminilla media, le conferiría resistencia
al deterioro.
Pudrición blanca
Aspecto
Blanqueado, más claro, esponjoso,
húmedo. Pérdida de resistencia en
estadíos avanzados
Hospedantes
Simultánea:
Angiospermas
<< Gimnospermas
Selectiva:
Angiospermas
y Gimnosperm
Componentes
degradados
en la pared
Celulosa
Hemicelulosa
Lignina
simultánea
prim. Lignina +
Hemicelulosa
luego Celulosa
Ataque desde
lumen, canales
de erosión
Lam media +
P2ria
cavidades
radiales en
pared
Caracteres
anatómicos
Basidiomycota
Agentes
Trametes
Heterobasidium
Ascomycota
(Xylaria)
Pudrición castaña
Pudrición
blanda
Oscurecido, seco, se
quiebra en cubos hasta
polvo.
Pérdida de resistencia
desde estadíos iniciales
Consistencia blanda
en superficies
húmedas.
Oscura y desintegrable
en ambientes secos.
Gimnospermas
raramente Angiospermas
Maderas en servicio
Gral. Angiospermas
Maderas inundadas,
arqueológicas, postes
en servicio.
Celulosa y hemicelulosa
Lignina modificada
Celulosa y
hemicelulosa
Degradación a distancia
Mecanismos de difusión
Toda la pared atacada
Cavidades
romboidales alargadas
en la S2 (tipo1)
Erosiones desde el
lumen (tipo2).
Ascomycota
Basidiomycota
Ganoderma
Phellinus
Phlebia
Sólamente Basidiomycota
Laetiporus, Gloeophyllum,
Serpula, Coniophora.
(Chaetomium, Ustulina).
Basidiom facultativos
Deuteromicetes
(Alternaria, Thielavia,
Phialophora)
Hongos
cromógenos
TEÑIDURAS
Madera manchada
(Verde, azul, negra)
carbohidratos simples
Deuteromycetes
No reducen la resistencia
Cambios estéticos
Disminuyen el valor económico de la madera
Piso realizado con
madera manchada
Blue stain: mancha azul
Ophiostoma
Almacenamiento
Pino
Cepa albina de Ophiostoma
piliferum Cartapip 97®
prevención de teñiduras y
biopulpado→ eliminación de pitch
BACTERIAS
•
Degradan la madera lentamente.
•
En superficies de madera con un alto contenido de humedad (incluso anoxia). A menudo
actúan en conjunto con hongos de pudrición blanda.
•
Algunas de ellas pueden hacer la madera más permeable y en períodos prolongados pueden
afectar resistencia de la madera.
•
Debido a la falta de habilidad para penetrar, usualmente invaden las células de la madera en
forma simultánea con el hongo, colonizando primero las células parenquimáticas.
•
Segregan pectinasas para disolver las membranas de las puntuaciones simples del
parénquima, que son de naturaleza péctica, pero en casos de ataque intenso destruyen
también las puntuaciones areoladas que comunican las traqueidas entre sí, aumentando la
permeabilidad de la madera.
•
A pesar de que las bacterias pueden atacar directamente fibras, vasos y traqueidas, pocas
especies pueden degradar todos los componentes de la pared celular.
•
Sin embargo, se han encontrado bacterias capaces de degradar células de madera
lignificadas: especies de Nocardia, Pseudomonas y Streptomyces tienen la habilidad de
degradar y remover lignina de coníferas, latifoliadas y gramíneas.
DEGRADACION POR INSECTOS
Insectos xilófagos, atacan desde árboles en pie hasta madera seca puesta en servicio, en
general constituyen una amenaza menor que los hongos.
Termitas (más dañinas) (Isoptera), escarabajos (Coleoptera), abejas, avispas y hormigas
(himenópteros).
El daño generalmente lo produce la fase de larva, que horada la madera para obtener alimento
y protección. Sin embargo, los insectos en su fase adulta también contribuyen al deterioro,
como en el caso de las termitas que forman grandes galerías en el interior de la madera, y
algunos coleópteros que penetran la madera con el fin de poner sus huevos y criar sus larvas.
No se conoce ningún insecto capaz de degradar completamente la lignina de la madera, pero
hay protozoarios, bacterias y hongos que pueden hacerlo en simbiosis alojados en su tracto
gastro-intestinal. De un mecanismo semejante se valen en general para la degradación de los
polisacáridos.
Ciertas especies de termitas construyen túneles en la madera. Allí crecen hongos con las
enzimas capaces de degradarla. Ej. Heterotermes tenuis cultiva sus propios hongos. Otros
géneros como Termitomyces son simbióticos de algunas especies de termitas. En Macrotermes
mulleri, el hongo simbionte hace una degradación inicial de la celulosa mejorando la hidrólisis
del enlace glucosídico, que continúa con 2 enzimas que podrían ser producidas en las glándulas
salivales del insecto. Sólo unas pocas especies de termitas son capaces de digerir por sí
mismas la celulosa ej. Mastotermes darwiniensis.
Herramientas de diagnóstico desintegración de la madera
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No-invasivo: Evaluación visual (Visual Tree Assessment)
Semi – Invasivos (sólo se elimina o penetra la corteza) Arborsonic Decay
Detector (ADD) – Utiliza sonidos ultrasónicos. Más sensitivo, puede detectar
descomposiciones tempranas. Puede “mapear” el árbol. Ultrasonido atraviesa la
madera entre un transmisor y un receptor (los transductores). ƒLa señal
atraviesa el medio sólido pero no el líquido ni el gaseoso. ƒSi la madera está
sana, el tiempo necesario (tiempo de propagación) es menor que si existe
descomposición.
Micro – Invasivos. ƒSe utilizan microtaladros con un daño mínimo.
Resistógrafo: Mide resistencia a la penetración. Precio elevado. Introduce la
broca en la madera a una velocidad constante independientemente del operario,ƒ
con software específico para capturar los datos y procesarlos.
Shigómetro: Requiere un taladrado previo de un hueco de pequeño diámetro en
el árbol, se inserta luego una sonda de alambre retorcido/eléctrico, que utiliza
una corriente continua para medir la resistencia de los tejidos a la corriente.
La madera deteriorada presenta menor resistencia eléctrica que la sana.
Macro – Invasivos. Precisa Barrena de Pressler. Extrae un pequeño cilindro
de madera donde se pueden observar los modelos de descomposición.
Shigómetro
Resistógrafo
Pilodyn
Mide
densidad y
fuerza