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¿Sabı́as que existen microorganismos que no hemos podido cultivar?
Humberto González y Reyna Fierro
Recibido: 26 de noviembre de 2008
Aceptado: 18 de febrero de 2009
nes ribosomales que se encuentran en todas las bacterias. Los fragmentos sintetizados se pueden clonar
en vectores o se determina su secuencia nucleotı́dica directamente. Las secuencias obtenidas de los genes del RNA ribosomal se comparan con las existentes en los bancos de datos (ej. Ribosomal Database Project [6]), hay más de 30,000 secuencias existentes de un número casi igual de especies bacterianas. Con este enfoque, se ha revelado una diversidad de microorganismos que no es posible detectar con los métodos de microbiologı́a tradicional [4,
13, 21]. También existen programas (tanto libres como comerciales) para verificar que las secuencias obtenidas de ADN ambientales no sean artefactos o
quimeras (hı́bridos de genes de diferentes microorganismos) [11]. Si las secuencias no se parecen a la
de ningún microorganismo existente en más de un
97 %, es posible que se trate de una bacteria nueva, tal vez aún no cultivada. La secuencia obtenida permite también identificar fragmentos de secuencia que no se encuentran en ninguna otra especie reportada, o sea que son exclusivos de esta especie. Estas secuencias particulares pueden sintetizarse marcadas con nucleótidos fluorescentes y pueden utilizarse en las muestras originales para ver al microscopio de epifluorescencia o confocal, el tipo y distribución de las bacterias que presentan los genes
marcados.
La vida en la tierra tiene muchas manifestaciones,
desde animales y plantas de gran tamaño, hasta microorganismos. Todos juegan un papel muy importante en la naturaleza. Si se toma una muestra de tierra, se coloca en agua estéril, se agita y se inocula medio de cultivo rico en nutrientes, se esperarı́a que todas las bacterias y hongos presentes, se desarrollaran en ese medio. Sin embargo, esto no es ası́, ya que
por medio de técnicas de biologı́a molecular, particularmente la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), se ha descubierto la existencia de microorganismos que no se desarrollan en los medios de cultivo comúnmente utilizados y que, hasta la fecha, no
se han podido cultivar en el laboratorio. A estos microorganismos se les ha dado el nombre de “microorganismos no cultivables” [8, 14].
Estos microorganismos no cultivables viven, se desarrollan y se dividen en condiciones muy particulares,
y ¡no se han podido cultivar en el laboratorio!. En este trabajo se describe cómo se descubrió que existen estos microorganismos y se discute por qué no
se han podido cultivar en en laboratorio.
En general, para obtener muestras del DNA de cualquier organismo, se requiere una cantidad considerable de material; para obtener dicho material, se cultiva al organismo y se colectan las células por centrifugación, a este paso se le llama enriquecimiento. Con el avance de la tecnologı́a, se ha logrado aislar DNA de: muestras de aire filtrado a través de tamices que logran detener microorganismos; esto se
ha realizado en una diversidad de suelos que no tienen señales de vida, del interior de plantas y de aguas
oceánicas o de fuentes termales, sin pasar por el paso de enriquecimiento, o sea sin cultivar a los microorganismos. Este DNA se usa como molde para la amplificación, por PCR, de los genes ribosomales existentes en la muestra. Esta técnica se realiza con una DNA-polimerasa termoestable y oligonucleótidos complementarios (primers, o cebadores
universales) con las regiones conservadas de los ge-
Visualizar a las bacterias es un paso hacia su aislamiento, pero cultivar a muchas de las que han sido detectadas de este modo, ha sido difı́cil. Whitesides en 1997 logró cultivar bacterias del género Vibrio de un estado no cultivable, aunque es importante resaltar que el desarrollo de estas bacterias se inhibe con altas concentraciones de nutrientes [20], y estos resultados se prestaron a controversia [4]. Ası́mismo, se logró desarrollar un Bacillus a partir de esporas de aproximadamente 250 millones de años [18].
Encontrar las condiciones para cultivar bacterias no
cultivables continúa siendo un reto para los microbiólogos [7].
Se ha acordado que a las bacterias “no cultivables”
detectadas sólo por su secuencia de genes riboso42
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el crecimiento de microorganismos que, en condiciones naturales, viven precariamente; a estos microorganismos se les ha designado como oligótrofos.
Los microorganismos con comportamiento opuesto, que pueden vivir en medios ricos, se designan
copiótrofos [10].
Entre hongos y bacterias se han identificado oligótrofos [1, 12, 19]; éstos poseen sistemas de transporte
de nutrientes de alta afinidad que les permiten tomarlos del medio aún en concentraciones muy bajas, prácticamente sin nutrientes. Estos microorganismos pueden crecer sobre vidrio, en agua destilada, sobre plásticos, o bien tomando las trazas de
compuestos volátiles del ambiente.
Figura 1. Cultivo en placa de Streptococcus thermophilus.
males se les designe como “candidatos”. Algunos
ejemplos de éstas son las bacterias magnetotácticas
acuáticas (obtenidas de un lago en Alemania) que
se caracterizan por pegarse a imanes, y son llamadas “Magnetobacterium bavaricum” [17]; o el candidato “Liberobacter”, un patógeno de cı́tricos [9] que
es cercano a bacterias simbiontes benéficas del género Mesorhizobium que crecen con facilidad en el laboratorio. La posición filogenética de las bacterias
no cultivables se ha empezado a estudiar recientemente. Además, no sólo se han detectado bacterias no cultivables sino también hongos, en particular, los que forman endo-micorrizas asociados a muchas plantas [2, 16].
Algunas bacterias oligótrofas toman trazas de amonio de la atmósfera pero no fijan nitrógeno. Se ha
calculado que en los laboratorios y hospitales existen concentraciones de amonio suficientes para mantener el crecimiento de oligótrofos (debido a agentes limpiadores o vapores de orina). Los oligótrofos deben considerarse como posibles agentes para la biorremediación, ya que se ha observado que,
una vez que los contaminantes alcanzan concentraciones bajas, algunas bacterias no pueden tomarlos ni degradarlos. Los oligótrofos, con alta afinidad
por los contaminantes, tal vez pudieran finalizar la
limpieza [3, 5, 15].
Existen diversas opiniones en torno al problema de
no poder cultivar microorganismos de los cuales se
ha documentado su existencia. Se ha pensado que
éstos pueden requerir nutrientes particulares que
sólo se encuentran en condiciones naturales. Algunos nutrientes tal vez sean proporcionados por microorganismos asociados.
En la naturaleza, es común encontrar comunidades bacterianas en las que coexisten varias especies y géneros de bacterias. En estas comunidades
pueden existir dependencias metabólicas complejas.
El enfoque de la microbiologı́a tradicional tiene como primer paso el obtener cultivos puros de bacterias (axénicos) y, tal vez, esto ocasiona que sólo se
desarrollen parte de los miembros de la comunidad.
Otro factor que puede influir, es que los medios tı́picos de crecimiento son demasiado ricos en nutrientes, aún los medios mı́nimos tienen un exceso de carbono, de nitrógeno o de fósforo, y podrı́an inhibir
Figura 2. Reactivos para preparar medios de cultivo.
En resumen, existen bacterias y hongos que no se
han logrado cultivar en el laboratorio. Estos microorganismos se detectaron amplificando parte de los genes ribosomales que son variables en todos los organismos. Una buena parte de la investigación en microbiologı́a se dedica actualmente a encontrar me-
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dios de cultivo adecuados para estos organismos “no
cultivables” para conocer más acerca de la gran variedad de formas de vida que habitan en la Tierra?
Glosario
Biorremediación. Limpieza de contaminantes mediante agentes biológicos como bacterias.
Confocal. Sistema de microscopı́a en donde la fuente luminosa es un láser que ilumina la muestra barriendo zonas muy pequeñas y que es analizado por
computadora.
DNA-polimerasa. Enzima que sintetiza DNA a
partir de un molde y desoxinucleótidos, requiere un
cebador o primer complementario a una parte del
molde.
Epifluorescencia. Sistema de microscopı́a en donde se ilumina la muestra con un haz de luz ultravioleta que pasa por el ocular y se analiza la fluorescencia que produce la muestra.
Filogenética. Es la disciplina encargada de la reconstrucción de la historia evolutiva de los taxones es decir, los grupos de la clasificación de los
seres vivos, que se representa en forma de árbol
filogenético.
Genes ribosomales. información genética codificada en el DNA que dirige la sı́ntesis del RNA
ribosomal.
PCR. reacción en cadena de la polimerasa, sı́ntesis
del mismo fragmento de DNA varias veces ( 30), tipo producción en cadena. Para esto se requiere una
enzima polimerasa de DNA que sea resistente a temperaturas elevadas (95◦ C) para que pueda desnaturalizarse el DNA antes de cada sı́ntesis.
Primers. cadenas cortas de residuos de nucleótidos
(normalmente 20 para PCR) que presentan un extremo 3’ OH en donde la DNA polimerasa puede empezar la sı́ntesis de DNA.
Vectores. vehı́culos genéticos en donde puede clonarse un fragmento de DNA y amplificarse o expresar la proteı́na que tiene codificada.
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Figura 3. La familia de lo vivo se ha agrupado en tres dominios (grupos muy grandes). Las ramas que están alejadas
no son muy similares, las que están más cercanas son grupos relacionados. Se han descrito aproximadamente 1.75
millones de especies en la tierra. Todavı́a se describen nuevas especies, entre ellas muchas de los microorganismos
no cultivables. Los grupos son: Archaea: microorganismos procariontes muy primitivos; Bacteria: Procariontes que se
separaron de los primeros muy temprano en la evolución; Eukarya: Todas las formas de eucariontes incluyendo plantas
y animales.
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