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Las enzimas difieren de los catalizadores químicos en los siguientes aspectos: Mayor velocidad de reacción: La velocidad de una reacción catalizada por enzimas es 106 a 1012 veces mayor que la de una no catalizada y varios órdenes de magnitud mayor que la reacción correspondiente catalizada químicamente. Condiciones de reacción suaves: Las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren a temperaturas bajo los 100ºC, presión atmosférica y pH cercano a la neutralidad. En contraste, las catalizadas químicamente requieren temperatura y presión elevadas y pH extremos. Gran especificidad de reacción: Las enzimas tienen una mucho mayor especificidad que las reacciones catalizadas químicamente respecto de los sustratos y sus productos. En las reacciones enzimáticas no hay productos secundarios. Capacidad de regulación: La actividad catalítica de muchas enzimas varía en respuesta a sustancias diferentes del sustrato. La catálisis enzimática de las reacciones químicas que ocurren en las células es indispensable para los organismos vivos. Ya que, en condiciones fisiológicas: - La mayoría de las reacciones químicas tienden a ser muy lentas. - La mayoría de las moléculas orgánicas son muy estables a pH neutro, a la temperatura de los organismos vivos, y en el ambiente acuoso de las células. - Muchas de las reacciones bioquímicas más comunes involucran eventos químicos desfavorables energéticamente o muy improbables en el ambiente celular. - Es decir, estas reacciones no ocurren a la velocidad requerida si no son catalizadas. Considerando estas propiedades catalíticas tan destacadas, surge una pregunta central: ¿Cómo funcionan las enzimas? A + B C + D - Un equilibrio favorable no significa que la reacción sea rápida. - Un ∆Gº’ negativo significa que el equilibrio favorece la formación de los productos, pero no que la reacción ocurra en forma espontánea. - Se debe traspasar una barrera energética. Velocidad = Frecuencia Colisión x Factor Energía x Factor Probabilidad Colisión. • Para que ocurra una reacción química, la colisión entre las moléculas reaccionantes es un evento crítico y necesario. • El número de colisiones es tan grande que sólo una fracción de ellas son efectivas para producir la reacción química. Energía: • La velocidad de una reacción química depende del contenido calórico, H, necesario para efectuar la conversión del reactante en producto. • Todas las reacciones químicas deben pasar a través de un estado de transición inestable de alta energía. • El estado de transición es el punto de máxima de energía, donde el estado de los sustratos o productos es igualmente probable. • El estado de transición no es una especie química con una estabilidad significativa. Es una especie fugaz y no un intermediario de la reacción. • La diferencia en el contenido calórico entre el estado de transición y el contenido calórico de los reactantes se llama calor de activación, ∆H*. Una aproximación para comprender como las enzimas aumentan la velocidad de reacción es suponiendo que el estado de transición (S‡) y el sustrato (S) están en equilibrio. En donde K‡ es la constante de equilibrio para la formación de S‡, y v es la velocidad de formación del producto a partir de S‡. La velocidad de reacción es proporcional a la concentración de S‡. Ya que solo S‡ puede convertirse en producto. La concentración de S‡ se relaciona con la diferencia de energía libre entre S‡ y S, ya que se supone que estas especies están en equilibrio. Ya que la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de S‡, y la concentración de S‡ depende de ∆G‡, la velocidad de reacción V depende de ∆G‡. Específicamente, k es la constante de Boltzmann, y h es la constante de Planck. Probabilidad • Refleja el cambio en el orden (o desorden) del sistema de reacción. • Este factor puede ser representado en forma mas precisa y cuantitativa por la función termodinámica, entropía. ∆S* = S* - Sr S* = Entropía estado de transición Sr = Entropía reaccionantes Tomando en cuenta tanto ∆H y ∆S, se puede definir la Energía de Activación como: ∆G = ∆H - T∆S ∆G = Energía de Activación ∆H = Calor de Activación ∆S = Entropía E + S ES EP E + P Teoría del Estado de Transición • Teoría de la “llave - cerradura” . Complementariedad de la enzima con el sustrato. • Mayor afinidad de la enzima por el estado de transición que por el o los sustratos • Las interacciones óptimas se obtienen en el estado de transición. • Compuestos semejantes al estado de transición se unen varios órdenes de magnitud mas fuerte que los sustratos. • Compuestos no relacionados químicamente, pero que tienen en común una semejanza estructural, son potentes inhibidores. La teoría supone: - La velocidad de la reacción está determinada por la descomposición del complejo en el estado de transición. - El estado de transición se encuentre en equilibrio con los sustratos. Inhibición por análogos del Estado de Transición. (A) La isomerización de l-prolina a d-prolina por prolina racemasa, una enzima bacterial, procede a través de un estado de transición plano en el cual el carbono a es trigonalal mas que tetrahedrico. (B) Pyrrole 2-carboxylate, un análogo del estado de transición es un potente inhibidor por su geometría trigonal. Sitio Activo Enzimas - Eficientes Reacciones químicas energéticamente favorables - Específicas Un sustrato – una reacción - Regulables Actividad Masa Sitio Activo - Es una porción relativamente pequeña de la molécula completa. - Residuos de aminoácidos participan en la unión del sustrato y en la catálisis propiamente tal. Aminoácidos - Unión de sustrato - Catálisis - Mantención de integridad estructural Clasificación de las Reacciones Catalizadas por Enzimas. 1. Desplazamiento o sustitución, donde una base o un nucleofilo reemplaza a otro. 2. Adición, en la cual un reactivo se agrega a un doble enlace. 3. Eliminación, se remueve un grupo creando un doble enlace. Este tipo es la reacción reversa de las reacciones de adición. Nombre y Clasificación de las Enzimas. Clase 1. Oxido-reductasas. Catalizan reacciones de oxidación y reducción. Incluyen a las deshidrogenasas, oxidasas, reductasas, peroxidasas, oxigenasas, hidrolasas, hidroxilasas y catalasas. Clase 2. Transferasas. Transfieren grupos químicos de una molécula a otra, o dentro de una molécula. Incluyen a las amino, acil, metil, glucosil, y fosforil transferasas, quinasas, fosfomutasas, transaldolasa y transcetolasa. Clase 3. Hidrolasas. Usan el agua para romper una molécula en dos moléculas. Incluyen a las esterasas, glicosidasas, peptidasas, tiolasas, fosfolipasas, amidasas, ribonucleasas y dexoiribonucleasa. Nombre y Clasificación de las Enzimas. Clase 4. Liasas. Rompen moléculas en un proceso no hidrolítico, produciendo dobles enlaces, o alternativamente, agregando grupos al doble enlace. Incluyen a decarboxilasas, aldolasas, hidratasas, deshidratasas y sintetasas. Clase 5. Isomerasas. Convierten estructuras isoméricas por rearreglos intramoleculares. Incluyen a las isomerasas, transferasas intramoleculares (mutasas), y liasas intermoleculares. Clase 6. Ligasas. Unen dos moléculas separadas por la formación de un nuevo enlace químico a expensas de la hidrólisis de ATP. Incluyen a las enzimas que forman enlaces C-O, C-S, C-N, y C-C. Sintetasas y ligasas. Coenzimas. Muchas enzimas requieren la presencia de coenzimas para llevar a cabo su actividad catalítica. Las coenzimas pueden actuar como transportadores: aceptando o donando grupos, átomos de hidrógeno, o electrones. Las coenzimas se pueden agrupar en tres diferentes categorías: 1. Compuestos con grupos con alto potencial de transferencia tales como ATP y GTP, que participan en el metabolismo energético en las células. 2. Compuestos, generalmente derivados de las vitaminas, unidas en el sitio activo que reaccionan con el sustrato alterando su estructura de ma nera que la nueva forma del sustrato es mas reactivo y por lo tanto la reacción ocurre mas fácilmente. 3. Coenzimas oxidativas tales como NAD, NADP, FAD, que tienen estructuras que le permiten participar en reacciones de oxido reducción, donde actúan como transportadores de átomos de hidrógeno o electrones. Sitio Activo de la Lisosima Modificación de Aminoácidos - A nivel de proteína - A nivel génico Mutagénesis Sitio dirigida - Rol de aminoácidos en actividad enzimática - Producir enzimas con características especiales Estudio de aminoácidos del sitio activo: - Mapeo mediante métodos químicos tradicionales - Medición de constante de unión de inhibidores y derivados - Alteración de estructura del sustrato Modificación química de proteínas. - Las cadenas laterales de los aminoácidos reaccionan con una gran cantidad de reactivos químicos formando enlaces covalentes. - Los reactivos son inespecíficos y reaccionan con cualquier residuo que se encuentre accesible. - La modificación puede llevar a una pérdida irreversible de la actividad: - Si se bloquea un residuo catalíticamente esencial. - Si se impide estéricamente la unión del sustrato. - Si se distorsiona la proteína. - Si se impide su movilidad. El objetivo de la modificación química de las proteínas es: - Obtener información respecto del mecanismo de reacción. - Modificar su actividad. Modificación de Aminoácidos • • • • Intermediario enzima-sustrato estable: Unión covalente Estabilizar intermediario: Reducción base de Schift Utilizar cuasi sustratos (Sus-X) Modificación en presencia de sustrato o inhibidor competitivo 100 % Actividad Remanente o Contenido de Aminoácido X5 X 5o X2 X 2o X1 X1o X4 X 4o A Ao 10 Tiempo de Reacción Desventajas de la modificación • Inespecificidad • Condiciones de marcación extremas • Grupos no accesibles Inhibidores irreversibles Dirigidos hacia el sitio activo. El inhibidor es un compuesto químico que se parece al sustrato de la enzima, se une específicamente al sitio activo y forma enlaces covalente con los residuos de la proteína. Algunas de las características de la inhibición irreversible son: - La velocidad de inactivación es inhibida por inhibidores reversibles o sustratos de la enzima. - La velocidad de inhibición es función del pH, con una curva similar a la observada con la velocidad de una reacción enzimática. - La enzima inactivada tiene 1 mol de inhibidor unido por mol de sitios activos. - La inhibición sigue una cinética de saturación. Inhibición por Diisopropylphosphofluoridate (DIPF), un reactivo grupo-específico. DIPF Puede inhibir la enzima modificando covalentemente un residuo de serina clave. Inactivación de la enzima por Iodoacetamide, un reactivo grupo-específico. Iodoacetamide puede inactiva la enzima reacionando con un residuo de ciste ína clave. Marcación por Afinidad. (A) Tosyl-l-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK) es un reactivo Análogo al sustrato normal de la quimotripsina. (B) TPCK se une al sitio activo de la enzima y modifica un residuo de histidina esencial. Bromoacetol Phosphate , un marcador por afinidad de la Triosa Fosfato Isomerasa (TIM). Bromoacetol phosphate , un análogo de dihidroxiacetona fosfato, se une al sitio activo de la enzima y modifica covalentemente un residuo de ácido glutámico necesario para la actividad de la enzima. Inhibidores irreversibles Activados por enzimas. Hay mucho interés en la generación de inhibidores irreversibles de enzimas por el gran potencial terapéutico que tienen. Su selectividad se logra por unión al sitio activo de la enzima blanco. Además de utilizar la unión específica a su enzima blanco, utiliza específicamente su aparato catalítico para su activación química. Un inhibidor normalmente inocuo se convierte en un potente inhibidor irreversible. Estos inhibidores que no son reactivos en ausencia de la enzima blanco, son llamados inhibidores suicidas: las enzimas se suicidan al activar al inhibidor. Un inhibidor suicida efectivo debe tener las siguientes características: 1. Debe ser no reactivo químicamente en ausencia de la enzima. 2. Debe ser activado específicamente por su enzima blanco. 3. Debe reaccionar, en su forma activada, más rápido con su enzima blanco que disociarse de ella. Inhibición basada en el mecanismo de reacción. Monoamino oxidasa, una enzima importante para la Síntesis de neurotransmisor, requiere del cofactor FAD (flavin adenin dinucleotido). N,N-Dimetilpropargilamina inhibe la monoamino oxidasa por modificación covalente del grupo prostético flavina solo después que el inhibidor es oxidado. El aducto N-5 flavina se estabiliza por la adición de un protón. Mutagénesis Sitio - dirigida - Técnicas que cambien específicamente algún aminoácido resultará en proteínas con propiedades diferentes a las de las proteínas nativas, lo cual puede ser de interés en su aplicación industrial. - Determinar cual aminoácido debe ser cambiado para obtener el cambio deseado en las propiedades es fácil si se conoce la estructura tridimensional de la proteína (análisis por cristalografía de rayos X u otras técnicas analíticas). - Para la mayoría de las proteínas no se dispone de esta información detallada, por lo tanto la mutagénesis dirigida es una estrategia de “prueba y error”, en la cual se introducen modificaciones en aquellos nucleótidos que probablemente producen un cambio en una propiedad específica de la proteína. La mutagénesis sitio - dirigida ha sido utilizada para producir enzimas, para uso industrial o terapéutico, cuyas propiedades sean mejores que las enzimas naturales. 1. La modificación de la Km y de la Vmax, produce un aumento de la eficiencia catalítica (Vmax/Km). 2. Cambio de la estabilidad térmica o de pH de la enzima, permite que ésta sea utilizada en condiciones de pH y temperatura que inactivarían la forma nativa. 3. La modificación de la reactividad de una enzima en solventes orgánicos, permite que ésta sea usada en condiciones no fisiológicas. 4. La modificación del sitio de unión de sustrato para aumentar su especificidad, puede disminuir reacciones secundarias no deseadas. 5. La alteración de la regulación alostérica de una enzima, disminuye la inhibición feedback y por consiguiente aumenta la producción de ciertos metabolitos. Para producir la mutagénesis sitio - dirigida es necesario: 1) Saber que aminoácido es el que debe ser cambiado. 2) Conocer la secuencia de nucleótidos en la región del DNA que codifica el codón del mRNA que se desea cambiar. ¿Cómo se hace? El método mas común es introducir el gen clonado en un vector de doble hebra. La simple hebra del vector recombinante se aísla y se mezcla con un oligonucleótido sintético. El oligonucleótido tiene, a excepción de un nucleótido, la secuencia complementaria exacta del segmento del gen clonado. El nucleótido cambiado coincide con el nucleótido del codón del mRNA que codifica para el aminoácido que se quiere cambiar. El oligonucleótido hibridará y el extremo 3’ actuará como primer para la síntesis de DNA. Las moléculas completas de doble hebra que contienen, ahora, los nucleótidos cambiados se introducen a células de E. coli por transformación. Ya que el DNA se replica semiconservativamente, la mitad de las células contiene el gen nativo y la otra mitad tiene el gen mutado (con el nucleótido cambiado) Mutagénesis sitio -dirigida de Subtilisin. Residuos de la triada catalítica fueron cambiados por Ala y se midió la actividad de la enzima mutada. La mutación de cualquier componente produce un dramático cambio en la actividad enzimática. S: serina, H: histidina, D: Aspártico. La actividad está en escala logarítmica. Aumento del número de enlaces S-S Aminoácidos Enzima 3 9 21 54 97 142 164 Nº de SS Actividad (%) T (ºC) wt Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 41.9 A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46.7 B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 48.3 C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52.9 D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 57.6 E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9 F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 3 0 65.5 Reemplazo de un aminoácido por otro Aminoácidos Enzima 14 78 Vida Media (min) Wt Asn Asn 13 A Asn Thr 17 B Asn Ile 16 C Thr Ile 25 D Asp Asn 11 Tyr + ATP Tyr-A + PPi Tyr-A + tRNATyr Tyr-tRNA + AMP Enzima kcat (s-1) Km (mM) kcat / Km (s-1 M-1) Thr-51 4.7 2.5 1,860 Ala-51 4.0 1.2 3,200 Pro-51 1.8 0.019 95,800 Proteasa Subtilisin. Especificidad: X-Ala-Pro-Phe-, P4=X es un residuo hidrofóbico El principal determinante de la especificidad de esta enzima radica en el subsitio S1 el cual es hidrofóbico y une la cadena lateral del residuo P1 del sustrato. La actividad mas alta de esta enzima es hacia un sustrato que tenga tirosina en P1, siendo menos activa con fenilalanina, metionina y alanina. Gly-166 se encuentra en parte de atrás de donde se une P1. Al aumentar el tamaño de la cadena lateral del residuo 166, disminuye la actividad hacia tirosina en P1. La actividad hacia residuos más pequeños en P1 aumentan. Proteasa Subtilisin. En S4 se encuentra un residuo hidrofóbico voluminoso, Ile-107. Esto permite reconocer sustratos que tengan en P4 grupos hidrofóbicos. La velocidad catalítica es similar para cualquier residuo hidrofóbico en P4. La mutación de Ile por Gly-107 aumenta el tamaño del bolsillo. Produce una disminución de 200 veces en la velocidad catalítica para Ala. Solo tiene pequeños efectos para Phe, Ile o Leu. Las cadenas más grandes complementan la lesión causada introduciendo una cavidad en la proteína. Los mecanismos catalíticos se pueden clasificar en: • Catálisis Acido – Base • Catálisis Covalente • Catálisis por ion metálico • Catálisis Electrostática • Catálisis por Efectos de proximidad y Orientación • Catálisis por Unión preferente al complejo del estado de transición Catálisis Acida General La transferencia parcial de un protón desde un ácido de Bronsted (especie capaz de donar un protón) baja la energía libre del estado de transición de la reacción. Catálisis Básica General Se aumenta la velocidad de la reacción por la captación de un protón por una base de Bronsted (especie que puede combinar un protón). Catálisis Acido-Base General Se combinan ambos procesos. Mecanismos de la Catálisis. Ya que la velocidad de una reacción es función de la energía libre, lo que hace un catalizador es bajar esta barrera energética; esto es estabilizar el estado de transición. Lo que hace a las enzimas poderosos catalizadores son dos propiedades relacionadas: su especificidad de unión del sustrato combinada con una óptima orientación de los grupos catalíticos. 1. Catálisis ácido – base. La catálisis ácido general es un proceso en el cual la transferencia parcial de un protón desde un ácido disminuye la energía de activación del estado de transición. También la reacción se puede acelerar por la captación de un protón por una base. Algunas reacciones pueden estar sometidas a ambos procesos simultáneamente: catálisis ácido - base general concertada. Entre los muchos tipos de reacciones bioquímicas que son susceptibles de catálisis ácido y/o base se incluyen: - Hidrólisis de péptidos y ésteres - Reacción de grupos fosfatos - Adiciones al grupo carbonilo Las cadenas laterales de los aminoácidos Glu, Asp, Lys, Arg, Cys, His, Ser,Tyr tienen pKs en el rango de pH fisiológico, lo cual les permite actuar como catalizadores ácido o básicos, en analogía con los mecanismos orgánicos conocidos. Catálisis Acido-Base: Reacción catalizada por la ribonucleasa. En el sitio activo hay dos His: His12 e His119 La reacción ocurre en dos etapas: 1. His12 actúa como una base general, atrae un protón desde el grupo 2’ OH del RNA, promoviendo el ataque nucleofílico al átomo de P adyacente. His119 actúa como ácido general, promueve el rompimiento del enlace protonando al grupo saliente. 2. El intermediario 2’,3’ es hidrolizado haciendo esencialmente el camino inverso del paso 1 en el cual el agua reemplaza al grupo saliente. Así, His12 actúa como ácido general e His119 como base general produciendo el RNA hidrolizado y dejando a la enzima en su estado original. 2. Catálisis Covalente. Este tipo de catálisis involucra el aumento de la velocidad a través de la formación (transiente) de un enlace covalente entre el catalizador y el sustrato. La catálisis covalente conceptualmente se puede descomponer en tres etapas: 1. Reacción nucleofílica entre el catalizador y el sustrato para formar el enlace covalente. 2. El retiro de los electrones desde el centro de reacción. 3. La eliminación del catalizador, una reacción esencialmente inversa a la etapa 1. Mientras mas estable sea el enlace covalente formado, se descompone menos fácilmente en las últimas etapas de la reacción. Un buen catalizador covalente debe combinar dos propiedades aparentemente contradictorias: - Una alta nucleofilicidad y - La capacidad de formar un buen grupo saliente, es decir, que la formación del enlace covalente sea fácilmente reversible. La nucleofilicidad de una sustancia está estrechamente relacionada con su basicidad. Si la formación el enlace covalente es la etapa limitante de la reacción catalizada covalentemente, la velocidad de reacción tiende a aumentar con la basicidad del catalizador. Decarboxilación de acetoacetato catalizado químicamente por aminas primarias. La amina ataca nucleofílicamente el grupo carbonilo del acetoacetato para formar una base de Schiff (enlace imino). El átomo de nitrógeno protonado del intermediario covalente actúa como un resumidero de electrones, reduciendo la alta energía que de otra forma tiene el enolato en el estado de transición. Catálisis Covalente - Ser195 ataca nucleofílicamente el grupo carbonilo del enlace peptídico que se va a romper, formando un complejo conocido como intermediario tetrahédrico. - Estudios de rayos X muestran que Ser 195 está en una posición ideal para llevar a cabo este ataque (proximidad y orientación) - El anillo imidazol de His57 capta el protón liberado, formando un ion imidazolium (catálisis general básica). - Este proceso es facilitado por el efecto polarizante carboxilato del Asp102, el cual forma un enlace de H con His57 (catálisis electrostática). - Si se cambia Asp102 por Asn, no cambia Km pero la kcat se reduce a menos del 0,05% de su valor original. - El intermediario tetrahédrico se descompone al intermediario acil-enzima dirigido por la cesión de un protón de N3 de His57 (catálisis general ácida). El intermediario acil-enzima es deacilado por reacciones reversas de los pasos anteriores. 3. Catálisis por iones metálicos. De acuerdo a la fuerza con que se une el metal, las enzimas se clasifican en: Metaloenzimas. El ion metálico se encuentra unido fuertemente y son iones tales como Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, o Co2+. Enzimas activadas por metales. Unen metal libremente de la solución y son del tipo Na+, K+, Mg2+ o Ca2+. Los iones metálicos participan en el proceso catalítico principalmente de tres maneras: - Uniéndose al sustrato de manera de orientarlo apropiadamente. - Mediando reacciones de oxido-reducción a través de cambios reversibles en el estado de oxidación del ion metálico. - Estabilizando o enmascarando electrostáticamente cargas negativas. 4. Catálisis electrostática. La unión del sustrato generalmente excluye al agua del sitio activo. La constante dieléctrica local se parece a un solvente orgánico, donde las interacciones electrostáticas son mucho mas fuertes que en solución acuosa. 5. Catálisis a través de efectos de proximidad y orientación. Aunque las enzimas utilizan mecanismos que se parecen a reacciones orgánicas modelos, ellas son catalíticamente mas eficientes que esos modelos. Esta eficiencia puede surgir de condiciones físicas específicas en el sitio catalítico de la enzima que promueve la reacción química correspondiente. Los efectos mas obvios son: - Proximidad - Orientación Los reaccionantes deben estar juntos y en la disposición espacial correcta para que ocurra la reacción. Efectos de Proximidad y Orientación. Reacciones con cada vez menos grados de libertad. Ataque de un ácido carboxílico sobre un éster en un anillo aromático. Si ambos grupos están en la misma molécula, es decir R1 y R2 se encuentran juntos. (Ar = methoxyphenyl group.) Efectos de Proximidad y Orientación. Efectos de Proximidad y Orientación. OH O O + COOH A OH COOH CH3 B CH3 CH3 H2O 6. Catálisis por unión preferente al estado de transición. El aumento de la velocidad enzimática es a menudo mucho mayor que lo que pueden explicar los mecanismos descritos. El factor mas importante de la catálisis enzimática es la unión al estado de transición con mayor afinidad que los correspondientes sustratos y productos. La unión al estado de transición produce una tensión a sus sustratos para que adopten la geometría de éste en un sitio donde no encaja el sustrato no distorsionado. Esto se basa en las evidencias que existen respecto del rol de la tensión en reacciones orgánicas. El reactivo tensado se parece mas al estado de transición de la reacción que el correspondiente reactivo no tensado. Si una enzima une preferentemente su estado de transición, análogos de éste se comportan como potentes inhibidores de la enzima. Inhibidor análogo al estado de transición En resumen, las enzimas ejercen su poder catalítico: 1. Manteniendo los sustratos juntos y en la orientación adecuada. 2. Proveyendo los grupos ácidos y básicos en la orientación apropiada para promover la transferencia de protones dentro del sustrato. 3. Los grupos en la enzima (especialmente los grupos nucleofílicos) pueden formar enlaces covalentes con el sustrato para formar estructuras que son mas reactivas que las originales. 4. La enzima es capaz de introducir torsión en los sustratos, quizás acompañada con cambios conformacionales de la proteína. Inmunoglobulinas o Anticuerpos: Proteínas grandes (150.000 daltons), Formadas por cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas Contienen regiones variables Altamente específicos Anticuerpos Catalíticos: Abzymes Aprovechando la gran especificidad de unión por el antígeno que tienen los anticuerpos, se han desarrollado estrategias experimentales para producir anticuerpos que catalizan reacciones químicas. Estos anticuerpos catalíticos, o abzymes, se seleccionan desde anticuerpos monoclonales generados por inmunización de ratones con haptenos que semejan el estado de transición de la reacción catalizada por la enzima. Estrategias para generar anticuerpos con actividad catalítica: i) Usar los anticuerpos para estabilizar estados de transición, ii) Usar anticuerpos como trampas entrópicas, iii) Generar anticuerpos con grupos catalíticos o cofactores. Por ejemplo, abzyme 28B4 cataliza la oxidación por periodato de p-nitrotoluen-metil sulfuro a sulfoxido, donde los electrones del átomo de S se transfieren al oxigeno. La velocidad de esta reacción es acelerada por enzimas que estabilizan el estado de transición de la reacción. Para generar abzymes complementarias en estructura al estado de transición, los ratones son inmunizados con un hapteno cuya estructura es un espejo de la estructura y propiedades electrostáticas del estado de transición. De los anticuerpos monoclonales generados con este hapteno, se encontraron muchos que catalizan la oxidación del sulfuro, pero con un rango de afinidad de unión y eficiencia catalítica muy amplio. Abzyme 28B4 une el hapteno con alta afinidad (Kd = 52 nM) y tiene una alta eficiencia catalítica (k3/KM = 190,000 M-1s-1). Las enzimas aumentan la velocidad de una reacción química a través de mecanismos catalíticos concertados: - Efectos de proximidad y orientación, - Catálisis covalente - Catálisis ácido-base general. Introducción de Grupos Catalíticos: - Introduciendo modificaciones al antígeno es posible generar grupos catalíticos en los sitios de unión del anticuerpo. - Uso de la mutagénesis sitio dirigida. Es posible introducir aminoácidos específicos para aumentar la capacidad catalítica del anticuerpo. - Modificación química Las enzimas inmovilizadas pueden ser clasificadas en las siguientes cuatro categorías: i) ii) iii) iv) Absorbidas fuertemente a soportes insolubles Unidas covalentemente a un soporte sólido Atrapadas en una matriz (geles) Microencapsuladas. Unión a un soporte sólido: la enzima se une a un soporte insoluble. - Adsorción física - Unión iónica - Unión covalente Enzimas atrapadas en matriz: se incorpora la enzima en la trama de un gel semipermeable o se encierra la enzima en una membrana semipermeable. Entrecruzamiento de moléculas de enzimas por reactivos bi o multifuncionales. Adsorción Física Este método se basa en la adsorción física de la enzima sobre la superficie de un soporte insoluble. Por eso, el método provoca poco o ningún cambio conformacional de la enzima o destrucción de su sitio activo. Si se encuentra el soporte adecuado, este método es simple y económico. Desventaja: La enzima adsorbida se puede soltar durante su uso debido a lo débil que son los enlaces de unión entre la enzima y el soporte. Debido a los enlaces débiles involucrados, la desorción de la proteína es provocada por cambios de temperatura, pH, fuerza iónica o aún la presencia de sustrato. Ventajas: Generalmente no requiere de reactivos y sólo de un mínimo de etapas de activación. La adsorción tiende a ser menos disruptiva de la enzima que los medios químicos de unión ya que la unión es principalmente por enlaces de hidrógeno, enlaces electrostáticos, etc . El método de la unión iónica se basa en la interacción iónica de la enzima con grupos de intercambio iónico en el soporte insoluble. Polisacáridos y polímeros sintéticos que tienen grupos de intercambio iónico son los mas usados como soportes. La unión se lleva a cabo fácilmente y las condiciones son mucho mas suaves que las necesarias para la unión covalente. Este método de unión provoca pocos cambios en la conformación y sitio activo de la enzima. Las enzimas inmovilizadas con este método tienen alta actividad. La enzima se puede soltar desde el soporte en condiciones de alta fuerza iónica o variaciones de pH, porque las fuerzas de unión entre las proteínas y el soporte son débiles. La principal diferencia entre la unión iónica y adsorción física es que la unión de la enzima al soporte es mucho mas fuerte en la unión iónica aunque mas débil que la unión covalente. La unión covalente se basa en la unión de la enzima a soportes insolubles a través de enlaces covalentes. Los grupos funcionales que pueden participar de esta unión son: Amino, Carboxilo, Sulfidrilo, Hidroxilo, Imidazol, Fenólico, Tiol, Treonina, Indol - Las condiciones de inmovilización por enlaces covalentes son mucho mas complejas y mas drásticas que en el caso de la adsorción física y unión iónica. - La unión covalente puede alterar la conformación y sitio activo de la enzima, resultando en una mayor pérdida de la actividad y/o cambios de afinidad por el sustrato. - La unión entre la enzima y el soporte es tan fuerte que la enzima no se suelta aún en presencia de sustrato o de soluciones de alta fuerza iónica. Aminoácido Grupo Nº Reacciones Porcentaje ε-amino 27 7,0 Cisteína Sulfihidrilo 31 3,4 Aspártico Carboxilo 4 4,8 Glutámico Carboxilo 4 4,8 Tirosina Fenol 16 3,4 Arginina Guanidinio 6 3,8 Histidina Imidazol 13 2,2 Triptofano Indol 7 1,2 Metionina Tioester 7 1,6 Serina Hidroxilo 0 7,8 Metionina Hidroxilo 7 1,6 Lisina Inmovilización en diferentes soportes sólidos. Al momento de seleccionar el soporte es importante considerar los siguientes factores: 1. Propiedades mecánicas: rigidez y durabilidad. 2. Forma física: gránulos, láminas, pared interna de un tubo. 3. Resistencia a ataque químico o microbiano. 4. Hidrofilicidad, manifestada por la capacidad de incorporar agua en su estructura. 5. Permeabilidad. 6. Capacidad para ser derivatizada sin modificar sus características. 7. Precio y disponibilidad. Reactor Tanque con agitación Un reactor en un tanque con agitación es el tipo mas simple de reactor. Se compone de un reactor y de un mezclador, agitador. Este reactor es útil para soluciones de sustratos de alta viscosidad y para enzimas inmovilizadas con relativamente baja actividad. Sin embargo, las enzimas Inmovilizadas tienden a inactivarse con la agitación. Este sistema es utilizable para la producción de pequeñas cantidades de reactivos. Una modificación es un reactor en tanque continuo con agitación, el cual es mas eficiente que el anterior, pero el equipamiento es levemente mas complicada. Reactor en columna Son los reactores mas ampliamente usado para las enzimas inmovilizadas. Se debe considerar la velocidad de flujo y el efecto de las dimensiones de la columna en la velocidad de la reacción. Este tipo de reactores puede ser del tipo: 1. Flujo hacia abajo 2. Flujo hacia arriba 3. Reciclaje Hidrólisis de Lactosa: Una importante aplicación de las enzimas inmovilizadas El objetivo es convertir el disacárido lactosa, vía hidrólisis, en sus componentes: glucosa y galactosa. Lactosa está normalmente en la leche humana y de vaca y es muy usada en fórmulas lácteas infantiles. Un gran problema con la lactosa es que muchas personas son intolerantes a la lactosa, es decir el organismo es incapaz de digerirla. Se estima que anualmente se acumulan 1.2 millones de toneladas de lactosa por el procesamiento de la leche para producir diversos productos lácteos, como en el suero generado en la elaboración de quesos. La conversión de lactosa en glucosa y galactosa representa una manera de agregar valor al suero y sus productos. Para la hidrólisis enzimática de la lactosa se han descrito varias ß-glicosidasas, alguna de las cuales ya se encuentran en el mercado. Independiente de la técnica utilizada para generar un sistema de enzima inmovilizada, es importante tener en cuenta lo siguiente: a) b) c) d) Enzima cargada Comportamiento cinético Estabilidad Configuración del reactor. Aplicaciones. - Estudios Bioquímicos. - Biotecnología.