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ARTÍCULO DE REVISIÓN
Perspectivas en la genómica del retinoblastoma:
Implicaciones del gen supresor de tumor RB1
Maricela Rodríguez-Cruz,* Martha del Prado,* Mauricio Salcedo**
* Unidad de Investigación Médica en Nutrición.
** Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas.
Coordinación de Investigación en Salud, Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS.
RESUMEN
Genomic retinoblastoma perspectives:
Implications of supressor gene of tumor RB1
ABSTRACT
In order to define the molecular and cellular bases of the development of retinoblastomas it is necessary to know its etiology, and to apply the advances in genome technology to
this kind of neoplasia. Retinoblastomas are childhood tumors of the eye with an average incidence of one case in every 15,000-20,000 live births, which occur in sporadic and
hereditary forms. The sporadic form appears regularly as a
unilateral tumor, while in the familial form of the disease,
tumors may be unilateral and bilateral. This neoplasia is
characterized by leukocoria, strabism, and heterochromia.
The retinoblastoma gene (RB1) is a molecular marker of retinoblastoma tumors. This gene is located in chromosome
13q14.2 and encodes a nuclear phosphoprotein (pRB) of 110
KDa, which plays a major role in cell proliferation control
through cell cycle-regulated phosphorylation/dephosphorylation cycles of this protein. The RB1 gene is mainly affected by point mutations, which occur most frequently in
exons 3, 8, 18 and 20. At the end of the last century, DNA
technology has improved notably, allowing for its application to the study of a vast array of diseases. The aim of this
work is to show the molecular aspects involved in retinoblastoma which are currently deciphering; this is possible
thanks to new technology platforms that have been developed. This will allow us in a near future, to offer tests for
the early diagnoses, prognoses, and the determination of individual predisposition towards this neoplasia.
Key words. Retinoblastoma. RB1, PRB1 protein.
El retinoblastoma es una neoplasia embrionaria que se manifiesta en dos formas: esporádica (no heredada) o familiar
(heredada). En los casos esporádicos el tumor es unilateral y
en la forma familiar puede presentarse de manera unilateral
o bilateral. Esta neoplasia tiene una incidencia promedio de
1/15,000 nacidos vivos, presentando signos y síntomas que
incluyen leucocoria, estrabismo, midriasis unilateral y heterocromía. El gen que predispone al desarrollo de retinoblastoma es RB1 y se localiza en el cromosoma 13 en la región
q14.2. El gen RB1 codifica para una fosfoproteína nuclear
que participa de manera importante en la regulación del ciclo celular. De acuerdo con la hipótesis de Knudson, para que
se desarrolle la neoplasia se deben presentar dos mutaciones
en el gen RB1. Las mutaciones puntuales son las que más
frecuentemente se presentan en el gen RB1; la mayoría de
los estudios indican que los exones 3, 8, 18, 19 y 20 son las
regiones de mutación preferencial. En la última década ha
habido un gran avance en la tecnología del DNA, lo cual hace
posible su aplicación en diferentes enfermedades. Estas herramientas moleculares podrían ser de gran utilidad en el
diagnóstico o conocimiento de la predisposición a desarrollar
un retinoblastoma. Entre estas valiosas herramientas se
cuenta con la hibridación fluorescente realizada in situ, hibridación genómica comparativa, las microhileras y por último la identificación de polimorfismos de un sólo nucleótido.
En conclusión, actualmente se están descifrando los aspectos
moleculares que están relacionados con el retinoblastoma,
gracias a la aplicación de nuevas plataformas tecnológicas.
Esto permitirá en un futuro próximo ofrecer pruebas para
un diagnóstico temprano o para conocer el pronóstico y la
predisposición de individuos a desarrollar esta patología. Con
el fin de entender las bases celulares y moleculares del desarrollo del retinoblastoma, el objetivo del presente trabajo es
mostrar el estado del arte del conocimiento de esta neoplasia,
así como su origen y los avances en la genómica aplicada al
retinoblastoma.
pdf
elaborado
por
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Palabras clave. Retinoblastoma. RB1 proteína PRB1.
572 de Investigación Clínica
Rodríguez-Cruz
et al.
del retinoblastoma:
Gen supresor de tumor RB1. Rev Invest Clin 2005; 57 (4): 572-581
Revista
/ Vol. 57,M,
Núm.
4 Genómica
/ Julio-Agosto,
2005 / pp 572-581
INTRODUCCIÓN
En la actualidad existe una gran cantidad de información acerca del estudio del retinoblastoma y su
origen. El objetivo de este trabajo es tener de primera instancia, lo más relevante en el ámbito clínico y
molecular sobre esta neoplasia, mencionando aspectos de uno de los genes que probablemente está involucrado en su desarrollo, el gen de retinoblastoma,
RB1. Además, se abordan las principales estrategias
moleculares de gran escala que actualmente tienen
impacto en las enfermedades neoplásicas y que se están utilizando en el diagnóstico y pronóstico temprano de éstas. Se menciona la aplicación de estas tecnologías en el conocimiento de la genómica del
retinoblastoma.
LA GENÉTICA CLÍNICA
DEL RETINOBLASTOMA
El retinoblastoma es un tumor maligno de las células de la retina que surge en niños menores de siete
años y afecta en promedio a 1/15,000 nacidos vivos.1
Esta incidencia es similar en nuestro país tal como lo
reporta Amozorrutia, et al.2 Esta neoplasia se puede
manifestar en dos formas: la forma esporádica o no
heredada y la familiar o heredada. La clínica de esta
enfermedad ha demostrado que en los casos esporádicos, el tumor es unilateral de manera unifocal; generalmente se presenta a los dos años de edad y representa 60% de todos los casos de retinoblastoma. Por el
contrario, los casos hereditarios aparecen a una edad
más temprana. Éstos representan 40% de todos los casos de retinoblastoma, en donde 10% son trasmitidos
de algún padre afectado y el restante 30% originado
por una mutación germinal de novo en alguno de los
progenitores no afectados. Los casos hereditarios pueden presentarse de forma unilateral o bilateral. Se
considera que en los casos heredados, la neoplasia es
transmitida como una enfermedad clásica mendeliana
autosómica dominante con penetrancia incompleta
(90%) y expresividad variable.3 Con respecto a la edad
de aparición de esta neoplasia, existen diversos trabajos incluidos los realizados en nuestro país, que mencionan que dicho padecimiento puede presentarse durante los primeros seis años de edad.2,4,5
Los primeros síntomas que presentan los pacientes con retinoblastoma es leucocoria (conocida como
“ojo de gato”), que resulta del reemplazo del humor
vítreo por el tumor o por crecimiento de éste en la
mácula. Otro síntoma es el estrabismo que ocurre
cuando pequeños tumores maculares interfieren con
la visión.6
LA HIPÓTESIS DE
KNUDSON EN EL RETINOBLASTOMA
Actualmente existen diversas teorías acerca del origen genético del retinoblastoma. Sin embargo, continúa vigente la hipótesis propuesta por Knudson en la
década de los 70’s, la cual establece que son necesarias
dos mutaciones para el desarrollo de esta enfermedad,
es decir, la pérdida de heterocigocidad. En la forma heredada, la primera mutación se encuentra en todas las
células del individuo (de manera germinal), en donde el
alelo mutado se hereda de uno de los progenitores. La
segunda mutación es somática y afecta células de la
retina que tienen la primera mutación, generando la
homocigocidad de alelos mutados. En la forma no heredada ambas mutaciones somáticas ocurren en la misma célula de la retina.7
ASPECTOS MOLECULARES
DEL RETINOBLASTOMA
El gen del retinoblastoma
Uno de los genes más relacionados con esta patología es el gen RB1. Una amplia variedad de reportes
indican que de 17 a 83% de los pacientes con retinoblastoma tienen algún tipo de alteración en RB1.
Este gen tiene una longitud de 180,388 pares de bases (pb) y está formado por 27 exones. Además codifica para un ácido ribonucleico mensajero (RNAm) de
4.7 kb que se traduce en una fosfoproteína nuclear
(pRB) constituida por 928 aminoácidos con un peso
de 105-110 kDa (Figura 1A-1C).8,9
El gen RB1 se localiza en el cromosoma 13 en la
región q14.2. El análisis citogenético de linfocitos de
pacientes afectados con retinoblastoma ha demostrado que sólo en 5% de los casos se observa la pérdida
de esta región cromosómica involucrando a este
gen.10 Es importante considerar que en el retinoblastoma existen otras anormalidades cromosómicas, las
cuales parecen estar asociadas con el desarrollo del
tumor más que con la iniciación del mismo. Aun
cuando el retinoblastoma es el cáncer intraocular
más frecuente en niños, en reportes internacionales aparece sólo un estudio del tipo citogenético de
nuestro país, en el cual se caracterizó a este tipo
de pacientes pediátricos. 11 Este estudio mostró al
igual que lo reportado en otros países, la presencia
de sólo 5% de alteraciones citogenéticas en el cromosoma 13. Estos resultados muestran que en
cierta medida debe existir otro tipo de alteraciones
más finas, las cuales no pueden ser detectadas con
esta tecnología.
Rodríguez-Cruz M, et al. Genómica del retinoblastoma: Gen supresor de tumor RB1. Rev Invest Clin 2005; 57 (4): 572-581
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D
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En el caso específico del gen RB1 en la entidad
del retinoblastoma, a la fecha se han reportado todo
tipo de mutaciones como: eliminaciones, inserciones, duplicaciones, inversiones, transiciones en regiones CpG y mutaciones puntuales. Las mutaciones puntuales son las más frecuentes contando
cerca de 50% de las alteraciones en el gen RB1. La
mayoría de los estudios concuerdan con que los exones 3, 8, 18, 19 y 20 son las regiones preferenciales
de mutación (“hot spots”). Estas mutaciones se localizan en el dominio amino (en los exones 3 y 8) y en
el dominio “B” (exones 18-20), figura 1D;12-14 en este
último se encuentra una de las regiones reguladoras de la pRB.
Recientemente en un trabajo de nuestro grupo,15
se realizó la búsqueda de alteraciones estructurales
574
Figura 1. Aspectos moleculares del gen
RB1. A. Gen RB1 de 200 kb, constituido de
27 exones representados por las líneas verticales numeradas en colores y 26 intrones mostrados en color azul. B. Estructura del RNAm del
gen RB1 de 4.7 kb, los números indican la posición de los exones. Los colores indican las regiones que codifican para los diferentes dominios de la proteína pRB. C. Proteína pRB en
donde se observan los dominios N (amino), A,
región espaciadora, B, NLS (señal de localización nuclear), DEADG (sitio consenso que es
hidrolizado por caspasa-1),20 C y los sitios de
fosforilación; esta proteína está formada por
elaborado
por 19 D. Representación
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928 aminoácidos.
de la
distribución de mutaciones en el gen RB1 en
pacientes con retinoblastoma. En la parte superior las flechas rosas señalan la distribución de
las mutaciones en la línea germinal reportadas
por Blanquet y col. (1995).13 En la parte inferior
se indica con flechas verdes el espectro de mutaciones en la línea germinal de pacientes con
retinoblastoma hereditario, datos tomados de
Lohmann y col. (1996).12 Los números indican
los exones en diferentes colores que representan los dominios de la proteína pRB mostrados
en 1C.
en el gen RB1 en pacientes pediátricos afectados con
retinoblastoma de nuestro país. En dicho trabajo se
analizaron 19 casos con retinoblastoma: tres del tipo
hereditario y 16 no hereditario. De manera interesante, encontramos cinco mutaciones puntuales en
pacientes sin antecedentes heredofamiliares; estas
mutaciones se localizaron en los “hot spots” de los
exones 8, 18 y 20 que no habían sido reportadas previamente; estos datos sugieren probables diferencias
respecto a la zona geográfica.15 Esto es apoyado por
estudios realizados en la población mexicana por Coral R, et al.,16 en donde reportan mutaciones diferentes en el gen de la distrofina a las previamente reportadas en los principales sitios calientes mayor y
menor, característicos de la distrofia muscular de
tipo Duchenne.
Rodríguez-Cruz M, et al. Genómica del retinoblastoma: Gen supresor de tumor RB1. Rev Invest Clin 2005; 57 (4): 572-581
Por otro lado, diversos estudios indican que las secuencias CpG son regiones hipermetiladas susceptibles
a mutaciones, debido a la desaminación de las citosinas
metiladas originando cambios de citosina por timina
(C→T). Estas transiciones conducen a la formación de
codones UGA (codón de terminación), dando como resultado la terminación prematura de la síntesis de la
proteína. Este tipo de secuencias susceptibles a metilación pueden encontrarse dentro de la secuencia codificadora del gen RB1. A la fecha se han identificado mutaciones en los codones CGA de los exones 8 y 14 del
gen RB1, por lo que estas citosinas hipermetiladas son
puntos calientes para mutaciones.17
En el contexto de explotación o minería de datos,
analizamos las mutaciones puntuales en el gen RB1
reportadas a la fecha (base de datos de la página
www.lohman.pointmutations/RB1.com). De manera
interesante, observamos que la mayoría de las mutaciones son transiciones C→T. Aunque no podemos
comprobarlo en estos momentos, proponemos que estas citosinas están hipermetiladas permitiendo su desaminación generando así las mutaciones. Así que,
la desaminación de las citosinas pudiera ser uno de
los principales mecanismos que generan las mutaciones en RB1 en cualquiera de las formas de presentación del retinoblastoma (Cuadro 1). Otro dato importante por mencionar es que es dos veces más frecuente
encontrar alteraciones germinales (heredadas) C→T
que somáticas. Además, resalta la observación que
en el exón 8 esta alteración es cinco veces más fre-
cuente en el tipo germinal que en el tipo somático.
Por otro lado, también se encuentran mutaciones en
otros exones, que pudieran ser específicas del tipo de
entidad, es decir, mutaciones en los exones 11, 18 y
23 para el tipo germinal.
Asimismo, es interesante mencionar que las mutaciones presentadas en el cuadro 1, dan como resultado
el cambio simple de base o SNP (del inglés single nucleotide polymorphism SNP) C→T. Esta observación
se presenta en más de 95% de las mutaciones puntuales reportadas, favoreciendo el cambio a treonina,
aminoácido susceptible de ser fosforilado (Cuadro 1).
Estos hallazgos sugieren una tasa mayor de fosforilación alterando así la funcionalidad de la proteína pRB.
Por otro lado, otros estudios han mostrado que en
las secuencias promotoras de RB1 también puede
presentarse una metilación anormal, es decir, una
pérdida de impronta genómica que conlleva la inhibición de la expresión del gen.18 Resumiendo estos dos
mecanismos, la función regulatoria alterada de pRB
puede darse por:
1. Metilación anormal de secuencias exónicas generando una desaminación.
2. Nuevos sitios de fosforilación por la ganancia de
treonina.
Sin embargo, debe tomarse en cuenta que la alteración del gen RB1 no es el único mecanismo que predispone al desarrollo del retinoblastoma. De manera que
Cuadro 1. Frecuencia de mutaciones puntuales en el gen RB1 en el retinoblastoma.
Región
Mutaciones germinales
Exón 8
Exón 11
Exón 14
Exón 17
Exón 18
Exón 23
Mutaciones somáticas
Exón 4
Exón 8
Exón 10
Exón 14
Exón 17
Mutación
Aminoácido
alterado
Frecuencia de
mutaciones
germinales (%)
Frecuencia de
mutaciones
totales (%)
16.0
6.9
6.9
9.7
10.4
10.7
4.6
4.6
6.5
7.0
6.9
100%
4.6
66.9
7.0
7.0
14.0
11.2
8.4
100%
2.3
2.3
4.6
3.7
2.8
33.1
CGA
CGA
CGA
CGA
CGA
CAA
CGA
>
>
>
>
>
>
>
TGA
TGA
TGA
TGA
TGA
TAA
TGA
A>T
A>T
A>T
A>T
A>T
V>I
A>T
GAA
CGA
CGA
CGA
CGA
>
>
>
>
>
TAA
TGA
TGA
TGA
TGA
L>I
A>T
A>T
A>T
A>T
Rodríguez-Cruz M, et al. Genómica del retinoblastoma: Gen supresor de tumor RB1. Rev Invest Clin 2005; 57 (4): 572-581
575
en los casos en que el gen RB1 se encuentra normal, es
probable que otros factores o proteínas (factores de
transcripción como la familia E2F, desacetilasas
de histonas, desaminasas, cinasas, ciclinas, etc.) que
regulan la función de la proteína pRB, sean los que estén alterados favoreciendo de manera indirecta el desarrollo de retinoblastoma. Actualmente se conocen otras
dos proteínas que pertenecen a la familia de la pRB, la
p107 y la p130. Todos los miembros de esta familia
comparten el dominio funcional que es muy importante para el control de la división celular. Se desconoce si
la alteración en estas proteínas pudiera relacionarse
con el origen de esta neoplasia.
La función del guardián
principal del ciclo celular
A la fecha no ha sido cristalizada la proteína pRB,
sin embargo, se ha mostrado que pRB está formada
por seis dominios (Figura 1C):113. El dominio amino
terminal (aa 1 al 395), 2. El dominio A (aa 395 al
579), 3. El dominio B (aa 639 al 771), a su vez estos
dos dominios forman el dominio “bolsa” A/B, el cual
abarca los aminoácidos del 395 al 876; además, entre
A y B existe una región a la que se le ha llamado dominio inserto (ID) que incluye los aminoácidos 579 al
639; 4. El dominio carboxilo terminal incluye los aa
del 771 al 928; 5. Una señal de localización nuclear
(NLS) y 6. Una región que es hidrolizada por la familia de caspasas-3/ICE (aa 886 y 887) durante la
respuesta a la muerte celular. Es importante mencionar que la proteína pRB como la p53, presenta
una actividad dual, es decir, está involucrada en el
ciclo celular y en el proceso de apoptosis.19
A los dominios A y B se pueden unir proteínas celulares y virales.20 Una de las proteínas celulares
que se unen a la pRB es el factor regulador E2F.
Este factor de transcripción se une a los dominios
“bolsa” A/B y al extremo carboxilo terminal. De esta
manera, pRB secuestra a E2F y evita la activación
de genes dependientes de E2F como: timidina cinasa,
myc, myb, reductasa de ribonucleótido, reductasa del
dihidrofolato y DNA polimerasa α, los cuales están
involucrados en la progresión de la célula hacia la
fase de síntesis (fase S).21,22 Actualmente, se acepta
que la proteína pRB es una proteína reguladora del
ciclo celular, en donde su forma hipofosforilada suprime la transcripción de genes que regulan la división celular.23
Las otras proteínas p107 y p130/RB2 que forman
parte de la familia de proteínas de retinoblastoma,
tienen un dominio que presenta una alta homología
con el dominio “bolsa”, el cual está altamente conser-
576
vado entre especies. De manera interesante, estas
proteínas también se unen específicamente a los
miembros de la familia E2F.23
Se ha demostrado que algunas oncoproteínas virales como el antígeno T grande de SV40, E1A tipo 5 del
adenovirus humano y E7 del virus del papiloma humano de alto riesgo, forman complejos con pRB, la
cual además de ser secuestrada es marcada para su
degradación por el sistema de ubiquitina. Dicha interacción provoca alteraciones en el control del ciclo celular permitiendo que la célula permanezca dividiéndose de manera descontrolada.24
Mecanismos moleculares
de represión mediada por pRB
La familia de proteínas pRB es regulada por mecanismos de fosforilación. Así, en la fase G1 las proteínas están activas (hipofosforiladas) y unidas a E2F.
La proteína pRB es fosforilada (110-116 kDa) al final
de la fase G1 por cinasas dependientes de ciclinas (ciclina D-CDK4 o CDK6 o ciclina E-CDK2).25 En esta
etapa, la pRB fosforilada libera a E2F, el cual activa
la transcripción de genes que regulan el ciclo celular
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y la célula elaborado
entra a la fase S;por
la proteína
pRB permanece fosforilada en las fases G2 y M.26
Se ha sugerido que el mecanismo molecular de la
pRB para regular el ciclo celular es formar un puente entre el factor E2F y una desacetilasa de histonas
(HDAC1); este complejo evita la expresión de promotores dependientes de E2F.27-29 De manera que la
asociación entre pRB y HDAC1 parece ser fisiológicamente importante para controlar el ciclo celular.
Expresión del gen
RB1 en tejidos humanos
En estudios de expresión utilizando la técnica de
inmunohistoquímica clásica, se ha observado que la
pRB se expresa en todos los tejidos del organismo.30
Estos datos han sido apoyados por experimentos de
análisis de expresión en que se utilizan microhileras
en los diferentes tejidos del humano (para mayor información
visite
la
página
web:
http://
genome.ucsc.edu/cgi-bin donde se encuentra una
base de datos para todos los genes conocidos del humano). Sin embargo, se ha visto heterogeneidad
en su expresión dependiendo del estrato celular en
donde se observe, del estado de maduración celular o
de la fase del ciclo celular en que se encuentre la célula. Por ejemplo, en la capa interior de la retina del
ojo normal, que incluye células ganglionares y amácrinas, se presenta un patrón inmunorreactivo nu-
Rodríguez-Cruz M, et al. Genómica del retinoblastoma: Gen supresor de tumor RB1. Rev Invest Clin 2005; 57 (4): 572-581
clear intenso, mientras que la capa externa compuesta de células fotorreceptoras muestra un patrón
de tinción débil.30
Por otro lado, algunos estudios sugieren que los
patrones alterados de la expresión de la pRB se asocian con formas diferentes de cáncer humano. Tal es
el caso de algunos tumores benignos y en etapas
tempranas de invasión de diversas neoplasias donde
se expresan altos niveles de la pRB. También se ha
reportado que en algunas neoplasias malignas (sarcomas, cáncer de células pequeñas de pulmón, carcinomas primarios de células no pequeñas de pulmón,
carcinoma hepatocelular y cáncer de mama) los niveles
de la pRB fluctúan en un rango de niveles bajos a no
detectables, correlacionando esta baja expresión con
un pronóstico clínico desfavorable.31-35 Resultados recientes de nuestro grupo muestran que en lesiones
invasoras del cervix uterino humano, la expresión de
la pRB es casi nula a diferencia de lo que sucede con
las lesiones premalignas del cervix, en donde existe
una gran expresión de dicha proteína.36 Estos resultados apoyan la idea que la ausencia de la pRB en algunos tipos de cánceres, puede indicar un pobre pronóstico clínico de los pacientes.
A la fecha son escasos los estudios reportados sobre
la expresión de la pRB en retinoblastomas. En uno de
estos estudios se indica que la proteína pRB no se expresa en dichos tumores. Los autores explican que la
ausencia de esta proteína podría ser la responsable del
desarrollo del retinoblastoma.37 Sin embargo, es importante ahondar en este tipo de estudios si se considera que diferentes mutaciones sobre el gen RB1 pue-
Figura 2. Inmunodetección de la proteína pRB en un retinoblastoma.
Tumor diferenciado que presenta tinción positiva para todas las células del
tumor, observándose la disposición de las rosetas de Flexner Wintersteiner (RFW) características de este tipo de tumor. La intensidad de la tinción fue mediana tinción (+++) e intensa (++++). Aumento 40X.
den tener diferentes efectos a nivel de la transcripción
y esto puede repercutir en la expresión parcial, total o
nula de la proteína correspondiente.38
En este contexto, recientemente en un estudio realizado por nuestro grupo, se encontraron retinoblastomas
con diferentes grados de diferenciación: tumor diferenciado en rosetas de Flexner-Wintersteiner (Figura 2),
tumor medianamente diferenciado y tumor indiferenciado (datos no publicados). Con excepción de sólo un
caso tipo Flexner, todos los tumores presentaron la proteína, sugiriendo que otras alteraciones moleculares
por ejemplo una mayor fosforilación de la pRB, podrían
estar presentes además de la alteración estructural del
gen RB1 en retinoblastoma.
APLICACIÓN DE NUEVAS
HERRAMIENTAS PARA EL DIAGNÓSTICO Y
PRONÓSTICO DEL RETINOBLASTOMA
En la última década ha habido un gran avance en
la tecnología del DNA, lo cual está permitiendo su
aplicación en el diagnóstico y pronóstico de algunas
enfermedades.
Se sabe que ciertas alteraciones citogenéticas pueden ser el “sello” característico de tumores malignos
específicos, por ejemplo, la translocación t(9;22) en
leucemias, y t(8;14) en linfomas y probablemente en
el caso del retinoblastoma la pérdida de 13q14.2.
Para identificar la pérdida de esta región citogenética se ha utilizado la técnica de hibridación in situ
fluorescente (FISH, o fluorescence in situ hybridization).39 Esta metodología de citogenética molecular
es muy útil, pero tiene algunas desventajas: es cara
y laboriosa. Afortunadamente, gracias al continuo
avance tecnológico se ha propuesto una alternativa al
FISH en donde el marcaje es in situ (PRINS primed
in situ), lo cual permite evaluar eliminaciones génicas en metafases usando la reacción en cadena de la
polimerasa. Así, usando PRINS, se ha evaluado la
detección de eliminaciones pequeñas del gen RB1 en
pacientes con alteraciones hematológicas con resultados satisfactorios.40 Desafortunadamente, a la fecha
no existe ningún reporte de esta tecnología aplicada
a los retinoblastomas.
Se sabe que en todos los tumores existen diferentes tipos de alteraciones genéticas. El análisis citogenético convencional de tumores sólidos es técnicamente difícil e involucra un alto costo. Para evitar
estas dificultades, se desarrolló la técnica de hibridación genómica comparativa (HGC), útil para identificar desbalances cromosómicos utilizando 3 fluorocromos diferentes a la vez. Es decir, con esta técnica
global es posible detectar todos los desbalances cro-
Rodríguez-Cruz M, et al. Genómica del retinoblastoma: Gen supresor de tumor RB1. Rev Invest Clin 2005; 57 (4): 572-581
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Figura 3. Desbalances cromosómicos en
retinoblastomas. La figura muestra el ideograma completo de las alteraciones observadas en
retinoblastomas en general, conteniendo casos
unilaterales como bilaterales (A) y retinoblastomas esporádicos unilaterales (B). El color verde al lado derecho de cada ideograma muestra
la ganancia de secuencias, por el contrario, la
pérdida se muestra en color rojo, al lado izquierdo. Los datos de hibridación genómica comparativa fueron normalizados por pruebas estadísticas específicas y posteriormente sujetas a
agrupamiento jerárquico tipo aglomerativo, en la
cual se observan mayoritariamente las alteraciones estadísticamente significativas (C). Los
datos fueron tomados de la página de datos de
www.progenetix.com
mosómicos en todos los cromosomas en un experimento. Además, no hay necesidad de utilizar cultivos celulares, por lo que los tejidos incluidos en parafina pueden usarse en esta metodología. Debido a su
aplicación en diversas neoplasias, actualmente se están obteniendo las “firmas” cromosómicas de todos
los tumores que afectan al ser humano. La aplicación de HGC en retinoblastomas, tanto esporádico
como familiar, ha mostrado dos regiones que se ganan más frecuentemente; 1q31 (más de 50% de los
casos) y 6p22 (más del 65% de los casos) y una región
578
que más frecuentemente se pierde es 16q22 (aproximadamente en 25% de los casos) (Figura 3). De manera interesante, no se encontró desbalance en la región 13q14.2.41-43 Esto sugiere que algunos grupos de
genes localizados en las regiones 6p22 (por ejemplo;
serina proteinasa 16, factores de transcripción E2F3
y E2F1), 16q22 (por ejemplo, proteína serina cinasa
H1 y factor de transcripción E2F4) y 1q31 (por ejemplo, catepsina E, proteínas reguladoras G, interleucina 10, oncogén TRK, BAX, etc., entre otros) (Figura
4), podrían tener la importancia biológica clave que
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Cromosoma 6
Cromosoma 1
PTPRC
RGS2
RGS1
NEK7
16q22→
PCTK3
PRSS16
E2F3
E2F1
NEK6
1q31→
RGS13
RGS18
TRK
PCTK1
Cromosoma 16
PSKH1
←16q22
E2F4
Figura 4. Ideograma de los cromosomas humanos 1, 6 y 16. Para el
caso de los cromosomas 1 y 6 se muestran los genes potenciales relacionados con el cáncer, que se encuentran localizados en las regiones cromosómicas mostradas que se ganan (derecha) frecuentemente en los retinoblastomas. En el cromosoma 16 se muestran los genes potenciales
relacionados con carcinogénesis que frecuentemente se pierden (izquierda) en los retinoblastomas. Esta información se logró de la búsqueda en la
base de datos provenientes del proyecto del genoma humano
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap99/).
permitiera entender las bases moleculares del desarrollo de esta neoplasia. De esta manera, contamos con una probable firma cromosómica del retinoblastoma disponible en bases de datos públicas
(www.progenetix.com).
Recientemente, se han investigado los mecanismos moleculares del desarrollo del retinoblastoma
para identificar potenciales blancos moleculares para
posibles futuras intervenciones terapéuticas. En dicha investigación, se ha utilizado la tecnología del
“chip” de Affymetrix-ADNc el “Affychip” para determinar el perfil de expresión de los retinoblastomas
primarios. Mediante el análisis del agrupamiento de
tipo “no supervisado” de las clases de datos de expresión de este tipo de tumores, se logró detectar un par
de grupos que nos permite clasificar como retinoblastomas benignos (retinomas) y otro como retinoblastomas malignos. Estos datos de expresión también son
interpretados sobre el fondo genético de alteraciones
de la dosis génica identificado por HGC. La región
q31-32 del cromosoma 1, presentó una gran dosis gé-
nica en la mayoría de los retinoblastomas.43 Actualmente se está precisando por HGC en matriz, la definición de los genes conocidos que presentan dichos
desbalances cromosómicos. De esta manera, el papel
de las alteraciones moleculares en el gen RB1 en
el retinoblastoma podría ser menor a lo que se pensaba.
Gracias al desarrollo de proyectos como el del Genoma Humano, han surgido nuevas tecnologías útiles en la identificación de regiones citogenéticas y de
expresión de genes. Una de ellas son las microhileras o biochips. De tal manera que, actualmente contamos con el desarrollo de la HGC en microhileras
haciendo el estudio más fino. A la fecha, no ha sido
explorado en retinoblastomas, la definición de los genes marcadores alterados; esto podría resolverse
aplicando cualquier variante de microhileras, siendo
éste un campo virgen para ser explotado.
En otros tipos de cánceres como en el cáncer colorrectal, cáncer mamario, se están construyendo microhileras dirigidas para estas patologías, seleccionando genes que son expresados de manera específica. En
este contexto, se incluyeron los principales genes sospechosos involucrados en la carcinogénesis colorrectal
de acuerdo con la literatura. Así, usando este “colonchip” se han identificado 59 genes, posibles candidatos
para el diagnóstico y la terapia de esta neoplasia.44
Para el caso del cáncer mamario, la utilización de 70
clonas de secuencias conocidas, pueden dar la firma
para el buen o pobre pronóstico a desarrollar metástasis. Existen en el mercado otros chips diseñados ex
profeso para otras patologías: por ejemplo los hepatochips, oncochips, cardiochips, etc.
En el caso del retinoblastoma sugerimos dos diseños de “retinochips”, uno genómico que incluya entre
otros a las regiones cromosómicas 6p22, 16q22 y
1q31, útil para determinar los genes marcadores en
el pronóstico de la neoplasia. El otro, un “retinochip
de expresión” que incluya los genes RB1, p53, E2F y
todos aquellos genes relacionados con la expresión
y regulación del gen RB1. Este tipo de diseño dependerá de los datos que se obtengan a partir de experimentos con microhileras y la posterior aplicación de
herramientas bioinformáticas tales como GenMAPP,
Gene Ontology, BodyMAP, etc.
Otro de los grandes campos de investigación que
surge del Proyecto del Genoma Humano, es la definición de las bases de susceptibilidad para determinada
patología, mediante el uso de un sistema de genotipificación basado en microhileras para identificar polimorfismos de un solo nucleótido o SNPs, directamente de
una muestra de DNA genómico. Este procedimiento es
altamente sensible y específico, lo cual sugiere que pue-
Rodríguez-Cruz M, et al. Genómica del retinoblastoma: Gen supresor de tumor RB1. Rev Invest Clin 2005; 57 (4): 572-581
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de constituir una poderosa herramienta para el análisis de
la variación genética que podría aplicarse en los casos
de retinoblastoma hereditario y más aún ser útil como
una prueba pronóstica y de susceptibilidad para el probable desarrollo de esta neoplasia.45 A la fecha, se conocen algunos polimorfismos de una base en el gen RB1
sin que se tenga una validación poblacional. De acuerdo con la base de datos del portal del Centro Nacional
de Biotecnología (http://www.genelynx.org/cgi-bin/
record?glid=8262) existen al menos 30 polimorfismos
diferentes a todo lo largo del gen RB1. Se desconoce
cuáles son los polimorfismos relacionados con el retinoblastoma. Esto abre la necesidad de definir primero
cuál es el patrón de polimorfismos de una base, característicos del gen RB1 presentes en nuestra población y
posteriormente relacionarlos con la susceptibilidad al
desarrollo de un proceso neoplásico, en este caso para el
retinoblastoma.
Finalmente, con toda la información vertida a la fecha referente a los estudios genómicos, en conjunto con
la explotación de datos, hoy en día se está logrando entender las bases celulares y moleculares del retinoblastoma, aplicando las nuevas plataformas tecnológicas
como las que ofrece la medicina genómica nueva.
El total conocimiento de la genética, la epidemiología, la patología, los mecanismos celulares y moleculares que se llevan a cabo en el retinoblastoma, nos
permitirá un rápido desarrollo en el diagnóstico y pronóstico de esta neoplasia, proporcionando al paciente o
individuo susceptibles una mejor calidad de vida.
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Reimpresos:
M. en C. Maricela Rodríguez-Cruz
Apartado postal C-029 C. S. P. I. “Coahuila”
Coahuila No. 5,
Col. Roma
06703, México, D.F.
Tel.: (5) 5627-6900 Ext. 22483 o 22484
Fax (5) 5627-6944
Correo electrónico: [email protected]
Recibido el 28 de enero de 2004.
Aceptado el 14 de febrero de 2005.
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