Download Ejemplo de Anteproyecto (convocatoria 2013).
Document related concepts
Transcript
EFECTOS DE LAS OREXINAS EN LA CONDUCTA SEXUAL DE LA RATA HEMBRA ANTEPROYECTO DE INVESTIGACIÓN M. en C. NORMA SARAI GÓMEZ TORRES ANTECEDENTES El proceso reproductivo de los mamíferos está regulado por una cascada compleja de la combinación de actividades del sistema nervioso, glándulas secretoras de hormonas y tejidos diana. Es importante destacar que la reproducción de la hembra y del macho está regulada por la interacción finamente sincronizada de las acciones y reacciones de varias hormonas (Melatonina, FSH, GnRH, LH, estrógenos, inhibina, progesterona, prostaglandina F2a, etc.) (Ptaszynska y Molina, 2007). Ciclo estral El estro se define como el momento del ciclo reproductivo en que la hembra de mamífero acepta al macho y permiten la monta y la cópula. Esta conducta del apareamiento, inducida por un estado endocrino con predominio de estrógenos, tiene su asiento en la actividad cíclica del ovario. El estro se manifiesta en todos los mamíferos con excepción de la mujer y otros primates, en estos últimos, el ciclo ovárico se pone en evidencia mediante la menstruación (Ramírez, 2006). Ciclo estral de la rata El ciclo estral, tiene una duración variable en las distintas especies domésticas. La rata hembra presenta un ciclo reproductivo que dura de 4 a 5 días. Las concentraciones de estradiol (E) en sangre son basales (14 a 20 pg/ml) durante el estro y el metaestro, mientras que durante la noche del diestro se presenta un incremento que continúa hasta el proestro alcanzando su valor máximo durante esta etapa. En la tarde del proestro, los niveles de LH 1 presentan un rápido incremento, este incremento induce la ruptura folicular y la ovulación, la cual ocurre en las primeras horas de la mañana siguiente: en el estro. Durante esta etapa se presenta la conducta de cópula (García-Horsman y Paredes, 2004). Conducta de cópula de la rata hembra Durante la conducta sexual de la rata hembra existen tres componentes relacionados con los aspectos de atracción, acercamiento y consumación de la conducta sexual: atractividad, proceptividad y receptividad. La atractividad y proceptividad se conocen como el componente motivacional o apetitivo de la conducta de cópula. Las conductas proceptivas incluyen: pequeños saltos o brincoteo “hopping” que consiste en pequeños saltos efectuados por la hembra sobre sus cuatro patas que terminan con la adopción de una postura agazapada, movimientos en zig-zag o arrancones “darting” se caracterizan por carreras cortas en forma de zig-zag, que terminan con la inmovilidad de la hembra, movimientos repetidos de orejas u oregeo “ear-wiggling” se caracteriza por un movimiento de alta frecuencia de la cabeza que provoca vibración de las orejas y emisión de sonidos ultrasónicos (Pacheco et al. 2002; García-Horsman y Paredes, 2004; González-Flores et al. 2004; Corona y Paredes, 2011). La receptividad está asociada con el componente de ejecución de la cópula y se manifiesta con la postura de lordosis que la hembra despliega como un reflejo-respuesta a la montaintromisión de un macho. Consiste en el arqueamiento del lomo con elevación de la cabeza y el tren posterior y un movimiento de la cola hacia un lado para permitir una intromisión. La lordosis, constituye la fase consumatoria de la secuencia de eventos que conforman el comportamiento de apareamiento y puede variar desde un ligero arqueo del lomo hasta una 2 respuesta muy pronunciada (García-Horsman y Paredes, 2004; González-Flores et al. 2004; Corona y Paredes, 2011). Un componente importante de la conducta sexual de la rata hembra es la posibilidad de regular y espaciar la estimulación que recibe, lo hace mediante movimientos de acercamiento y alejamiento del macho. La calidad de estimulación que la hembra recibe durante la cópula regulada es fundamental para el inicio de cambios neuroendócrinos necesarios para la preñez. La conducta de aproximación y alejamiento permite que la hembra evite una sobreestimulación. La cópula regulada por la hembra se caracteriza por presentar intervalos de tiempo más amplios entre cada intromisión, y un mayor tiempo de duración de las intromisiones lo que incrementa la estimulación vagino-cervical que la hembra recibe en cada intromisión (Corona y Paredes, 2011). Asociación de las orexinas con la fisiología reproductiva Aunque se han hecho muchos progresos en las últimas décadas, todavía falta mucho para comprender totalmente la enorme complejidad del proceso reproductivo (Ptaszynska y Molina, 2007). Estudios recientes han planteado la posible participación de dos neuropéptidos hipotalámicos llamados orexinas en la fisiología reproductiva. Las orexinas A y B, también llamadas hipocretinas 1 y 2, son dos neuropéptidos hipotalámicos que derivan de la proteólisis del precursor prepro-OX. Desde su descubrimiento en 1998, las orexinas han sido relacionadas principalmente con la conducta de alimentación y el ciclo sueño/vigilia (Murillo-Rodríguez y Arias-Carrión, 2007; AriasCarrión, 2009). Las terminales de neuronas orexinérgicas presentes en el hipotálamo lateral proyectan a diversas estructuras cerebrales, lo que ha llevado a proponer que las orexinas 3 participan en múltiples mecanismos fisiológicos. Algunos estudios muestran que las orexinas participan en la regulación de la función de los macrófagos, en la estimulación de la secreción de ácido gástrico, en la regulación de la motilidad gástrica e intestinal, en la secreción de fluidos gástricos y duodenales, regulación del sistema neuroendócrino, presión sanguínea, temperatura corporal y en la regulación cardiovascular, adicionalmente algunos datos experimentales sugieren que la orexina-A induce analgesia, e incrementa el flujo sanguíneo cerebral y la actividad simpática renal, se ha encontrado además que las neuronas productoras de orexinas envían proyecciones a las neuronas productoras de dopamina (DA) en el área tegmental ventral (VTA) (Sakurai, 2002; Shirasaka et al. 2003; Beiras-Fernández et al. 2004; Muschamp et al. 2007; Heinonen et al. 2008). Adicionalmente, se han encontrado receptores a orexinas en las gónadas (ovarios). En la rata hembra, el número de receptores a orexinas en los ovarios podría ser regulado por las concentraciones de gonadotropinas, ya que algunas investigaciones muestran que: 1) el número de receptores a orexinas varía de acuerdo a la etapa del ciclo estral, aumentando significativamente durante el proestro tardío; 2) cuando los receptores a GnRH son bloqueados, el aumento de la expresión de los receptores a orexinas en el ovario durante el proestro tardío se inhibe completamente; 3) cuando los picos de gonadotropinas son bloqueados con Cetrorelix y Nembutal hay una reducción en la expresión de los receptores a orexinas en ovarios; y 4) la administración del antagonista a orexina-A SB-334867-A disminuye significativamente la concentración de LH y FSH, lo que sugiere que ambos receptores están involucrados en el control de la secreción de gonadotropinas (Silveyra et al. 2007). Los ovarios de ratas tratadas con los antagonistas a orexinas principalmente con SB-334867-A muestran cambios macro y microscópicos y pequeñas hemorragias (Silveyra et al. 2007). Otros estudios han mostrado en ratas, que las neuronas orexinérgicas están 4 rodeadas por neuronas productoras de GnRH, expresión de OX-R1 (receptor a orexinas 1) en las neuronas GnRH. Mediante triple inmunofluorescencia se observó que las fibras orexinérgicas hacen sinapsis con las neuronas secretoras de GnRH que expresan OX-R1 (Campbell et al. 2003). Un trabajo similar realizado por Su et al. (2008) muestra la localización de Orexina-B y GnRH en la misma neurona. De igual manera observaron asociaciones sinápticas entre las neuronas Orexinérgicas y GnRH en estructuras relacionadas con la reproducción en el hipotálamo del cerdo. Estos estudios sugieren la existencia de una vía neuroanatómica entre el sistema orexinérgico y el sistema GnRH y LH en el hipotálamo de la cerda, la oveja y la rata. Así, se ha propuesto que las orexinas y sus receptores pueden actuar a diferentes niveles del eje hipotálamo-hipófisis-gónadas, modulando la conducta sexual y reproductiva de la hembra. Resultados preliminares de nuestra investigación muestran que al administrar el antagonista de los receptores a orexina-A hay una disminución significativa de saltos, carreras cortas y movimiento de orejas en el grupo de hembras tratadas con el fármaco. Sin embargo la disminución de la frecuencia de conductas proceptivas parece deberse a la pérdida del equilibrio y dificultad para caminar que presentaron las hembras cuando fueron tratadas con el antagonista, ya que, aun cuando las hembras presentaron disminución de la locomoción cuando fueron montadas por el macho presentaron lordosis normal, así mismo no se encontraron diferencias significativas en el tiempo promedio que las hembras pasaron dentro del redondel donde se encontraba el macho. Estos datos sugieren que la orexina-A no están implicada directamente en el mantenimiento de la cópula per se, si no que la función primaria de esta consiste en facilitar la actividad somatomotora durante una motivación como el hambre o la cópula. 5 Sin embargo algunos estudios proponen que las funciones de las orexinas A y B pueden ser diferentes ya que se ha mostrado que la orexina-A puede tener mayor actividad fisiológica que la orexina-B, esto puede ser por su resistencia a la degradación causada por sus dos intracadenas disulfuro por tal razón se han realizado más investigaciones con la orexina-A que con la B (Sakurai et al. 1998; Edwards et al. 1999). Por tal motivo es necesario verificar si los resultados obtenidos al administrar un antagonista de los receptores a orexina –B son similares a lo encontrado cuando se administró el antagonista a orexina-A. OBJETIVOS General Determinar si existe relación entre las orexinas y la conducta sexual de la rata hembra. Particulares Evaluar el efecto del antagonista de los receptores a orexina-B en la expresión de la conducta sexual de la rata hembra. Evaluar el efecto de la cópula regulada por la rata hembra en la activación de las neuronas productoras de orexinas. Identificar si hay diferencia en la actividad de las neuronas productoras de orexinas de acuerdo al grado de estimulación que la hembra recibe durante la cópula. 6 METODOLOGÍA Sujetos: Se utilizarán 12 grupos de ratas hembra (n=10) de la cepa Wistar sexualmente inexpertas con pesos entre 220-270gr, dos grupos de machos sexualmente expertos (n=10) y dos grupos de machos sexualmente inexpertos (n=10). Todos los animales serán mantenidos bajo un ciclo luz-oscuridad invertido de 12x12hrs, a temperatura ambiente, agua y alimento ad libitum. Se les dará 15 días de habituación antes del inicio de cualquier experimento. Procedimiento: Después del periodo de habituación cada una de las hembras serán supervisadas diariamente en presencia de un macho sexualmente experto para identificar la conducta de estro (el contacto entre macho y hembra es nasonasal). Cuando la hembra exprese conductas proceptivas (saltos cortos (hoping), carreras cortas (darting) o vibración de la cabeza (movimientos de orejas: wiggling) será retirada y se procederá a la administración de los antagonistas (grupo experimental) o solución salina más DMSO (grupo vehículo) según sea el caso. El estro será corroborado con frotis vaginales. Para el experimento 1, se formarán 3 grupos (n=10). Al grupo uno se le administrará el antagonista de antagonista de orexina-B (JNJ-10397049) 10 mg / kg de peso corporal diluidos en 50% DMSO y 50% de solución salina., al grupo dos se le administrarán ambos antagonistas 10 mg / kg de (SB-334867-A) más 10 mg / kg de (JNJ-10397049), al grupo cuatro se le administrarán 50% de DMSO más 50% de solución salina. En cada grupo, los 7 fármacos serán administrados vía intraperitoneal 30 minutos antes de la evaluación de la conducta sexual femenina (Silveyra et al. 2007). Experimento dos: Se formarán cuatro grupos de hembras (n=10) como los previamente descritos y se les administrarán esterotaxicamente bajo anestesia (Halotano 2% en 95% O2 y 5% CO2) los antagonistas de los receptores a orexinas intracerebralmente en el área del hipotálamo lateral (1 μg disuelto en 0.25μl de dimetilsufoxido y 0.25μl de solución salina) de acuerdo al atlas de Paxinos y Watson, 1998, (2.5 posterior al bregma ± 1.8 lateral a la línea media y 7.5 mm de la superficie del cráneo) mediante cánulas de inyección (0.4 de diámetro externo), un volumen de 50 µl, a una velocidad de inyección de 1µl/min. Dos horas después de la inyección se evaluará la conducta sexual. Evaluación de la conducta sexual El registro de conducta sexual será bajo luz roja siempre durante la etapa de obscuridad del ciclo diario, se realizará en una caja de cópula regulada o “pacing” durante treinta minutos, se considerará la receptividad y proceptividad de la hembra. La receptividad se medirá mediante el cociente de lordosis (CL) calculado de la siguiente manera: Número de montas permitidas por la hembra/ número de montas realizadas por el macho. Adicionalmente, se identificará la intensidad de la lordosis en cada una de las hembars (lordosis marginal, lordosis normal o lordosis exagerada) de acuerdo con Hardy y DeBold 1971. Para evaluar la proceptividad se cuantificará la frecuencia de saltos cortos (hopping), carreras cortas (darting) y número de veces que presentan movimiento de la cabeza (movimiento de orejas, wiggling), así como el número de veces que la hembra entra y sale 8 del compartimento donde se encuentra el macho y el tiempo que permanece dentro y fuera del compartimento. Con el fin de que cada conducta sea identificada correctamente se tomarán videos por cada episodio precopulatorio y copulatorio identificado. Activación de las neuronas productoras de orexinas después la cópula Una vez terminada la fase de habituación las hembras serán supervisadas diariamente para identificar la conducta de estro como ya fue descrito. Las hembras identificadas en estro serán separadas y colocadas cada una en una caja con un macho sexualmente experto. Se les permitirá el despliegue de conducta sexual, hasta la primera eyaculación del macho. Una vez que el macho eyacule la hembra será retirada, después de noventa minutos será anestesiada con pentobarbital sódico (100 mg/kg) y perfundida con fosfato buffer salino (PBS) 1M, Ph 7.4 y 4% de paraformaldehído en PBS. En seguida, el cerebro será extraído, fijado y se mantendrá en una solución crioprotectora compuesta por 20% de sacarosa más PBS durante 3 días. Posteriormente el cerebro será seccionado a 40µm de espesor hasta identificar el área del hipotálamo lateral siguiendo el atlas de Paxinos y Watson, 1998. Se aplicará la técnica de doble inmunohistoquímica para cfos y orexina-A (Torterolo, 2002; Muschamp et al. 2007). De la misma forma se realizarán cortes del área tegmental ventral y del cuerpo estriado y serán procesados por doble inmunohistoquímica como ya fue descrito anteriormente con el fin de identificar si la administración de los antagonistas causa algún efecto en la ejecución de movimientos lo que impida realizar la conducta de cópula o afecta aspectos motivacionales de la conducta sexual. 9 Inmunohistoquimica para doble marca de anticuerpos (c-fos y orexina-A) Primera parte Preincubación Los cortes se ponen en una solución de peróxido de hidrógeno 180µl en 10ml de PB 0.1M por 10 minutos.Incubar en suero normal de cabra 3µl de suero en 1ml de PBT 0.03% por una hora. Incubación Primer anticuerpo. Se recupera el suero anteriormente utilizado en un vaso de precipitado y en él se diluye el primer anticuerpo c-fos (hecho en conejo) a una concentración de 1/5000 (1µl en 5ml de suero recuperado) por 48 a 72 horas en el refrigerador. Primer revelado Lavado del tejido. Se realizan tres lavados con PB 0.1M de 10 minutos y un lavado en PBT 0.01%. Preparación del anticuerpo puente. Cuando se inicia el ultimo lavado se saca del refrigerador el α-IgG, 5 µl en 995µl de PBT 0.03%. Para controlar mejor la concentración del anticuerpo se elabora la mezcla con el anticuerpo y PBT 0.03% para todos los cerebros. Se incuba a temperatura ambiente durante una hora y moviendo suavemente el tejido. Lavado del tejido. Pasado el tiempo se realizan nuevamente tres lavados de diez minutos cada uno con PB 0.1M y el último con PBT 0.01%. Incubación del complejo AB. Se debe preparar el complejo avidina-biotina se utiliza 4.5 µl del componente A y 4.5µl del componente B en 991µl de PBT 0.03%. Se deja incubando durante una hora a temperatura ambiente y con movimientos suaves. Lavado del tejido. Se lavan tres veces los tejidos con PB 0.1M diez minutos cada uno. 10 Activación de la reacción. Se realiza una reacción de diaminobenzidina utilizando una alícuota de 1ml para cada 50 ml de agua. 200µ de Ni y 200µl de Co más diez gotas de peróxido de hidrógeno. Segunda parte. Segundo anticuerpo (orexina-A) Incubar en suero ahora en suero normal de conejo 3µl de suero en 1ml de PBT 0.03% por una hora. Se recupera el suero anteriormente utilizado en un vaso de precipitado y en él se diluye el primer anticuerpo orexina-A (hecho cabra) a una concentración de 1/1000 (1µl en 1ml de suero recuperado) por cuatro días en el refrigerador y se deben agitar suavemente dos o tres veces por día. Segundo revelado. Lavado del tejido. El tejido se distribuye en las tinas en un orden tal que cada corte se vierte en una división. Se realizan tres lavados con PB0.1M de diez minutos cada uno y un último lavado en PBT 0.01%. Preparación del anticuerpo puente. Cuando se acaba de iniciar el ultimo lavado se saca del refrigerador el α-IgG (biotinilado anticabra hecho en conejo) 5µl en 995µl de PBT 0.03%. Para controlar mejor la concentración del anticuerpo de elabora la mezcla con el anticuerpo y PBT 0.03% para todos los cortes. Se incuba a temperatura ambiente durante una hora y moviendo suavemente el tejido. Lavado del tejido. Pasado el tiempo se realiza nuevamente tres lavados de 10 minutos cada uno con PB 0.1M y el ultimo con PBT 0.01%. 11 Incubación del complejo AB. Se debe preparar el complejo avidina-biotina, se utiliza se utiliza 4.5 µl del componente A y 4.5µl del componente B en 991µl de PBT 0.03%, se vuelve a lavar tres veces los tejidos con PB 0.01M diez minutos cada uno. Activación de la reacción. Se realiza una reacción de diaminobenzidina utilizando una alícuota de 1ml para cada 50ml de agua más diez gotas de peróxido de hidrogeno. Lavado del tejido. Se lava el tejido tres veces. El tejido procesado será analizado con un microscopio óptico. Se tomarán microfotografías de cada una de las secciones obtenidas utilizando una cámara digital acoplada al microscopio. El número y distribución de las neuronas inmunomarcadas será determinado mediante cámara lúcida (Torterolo, 2002). El número de neuronas inmunomarcadas obtenidas de las hembras que tuvieron acceso a la cópula será comparado con el número de neuronas inmunomarcadas del grupo de ratas que no lo tuvieron. Diferencia en la actividad de las neuronas productoras de orexinas de acuerdo al grado de estimulación que la hembra recibe durante la cópula. Se formarán cinco grupos de hembras (n=10) y cinco grupos de machos (n=15). Entrenamiento de la conducta sexual Para las pruebas de entrenamiento sexual de los machos se utilizarán hembras adultas ovariectomizadas. La inducción de la receptividad sexual de las hembras será mediante la administración exógena de hormonas esteroides diluidas en aceite de maíz. Se les inyectará subcutáneamente benzoato de estradiol y progesterona 48 y 4 horas antes de las pruebas de conducta respectivamente. 12 Cada prueba iniciará con la colocación de un macho en el interior de un cilindro de acrílico transparente de 50cm de ancho X 50cm de alto. Al macho se le darán cinco minutos de habituación, luego se colocará una hembra receptiva y en ese momento se iniciará el registro de todos los parámetros de la conducta sexual masculina (Manzo et al. 2010) La interacción sexual de los machos inexpertos del grupo uno con las hembras receptivas se realizará cada tercer día durante dos semanas, tiempo en la que los machos aprenden la ejecución de la conducta sexual en cuatro pruebas. La interacción sexual de los machos inexpertos del grupo dos con las hembras receptivas se realizará cada tercer día durante una semana y media, es decir los machos del grupo dos solo tendrán tres pruebas de entrenamiento, tiempo insuficiente en la que los machos aprenden la ejecución de la conducta sexual. La interacción sexual de los machos inexpertos del grupo tres con las hembras receptivas se realizará cada tercer día durante una semana. Primer grupo (n=10) una vez pasado el tiempo de habituación las hembras identificadas en etapa de estro serán separadas y colocadas en una caja con un macho sexualmente experto. Se les permitirá el despliegue de conducta sexual, hasta la primera eyaculación del macho. Una vez que el macho eyacule la hembra será retirada y después de 90 minutos la hembra será anestesiada con pentobarbital sódico (100 mg/kg) y perfundida con fosfato buffer salino (PBS) 1M, Ph 7.4 y 4% de paraformaldehído en PBS. En seguida, el cerebro será extraído, fijado y se mantendrá en una solución crioprotectora compuesta por 20% de sacarosa más PBS durante 3 días. 13 Posteriormente se realizarán cortes histológicos a 40µm de espesor del cerebro hasta identificar el área tegmental ventral e hipotálamo lateral siguiendo el atlas de Paxinos y Watson, (1998). Se aplicará la técnica de doble inmunohistoquímica para ce-fos y orexina-A como ya ha sido descrito. Segundo grupo (n=10) una vez pasado el tiempo de habituación las hembras identificadas en etapa de estro serán separadas y colocadas en una caja de cópula con un macho sexualmente inexperto que haya tenido una semana y media de entrenamiento sexual, se les permitirá el despliegue de conducta sexual, una vez que la hembra haya recibido 10 intromiciones será retirada y después de 90 minutos será anestesiada y perfundida, el cerebro será extraído, se realizarán cortes de 40 micras hasta identificar el área tegmental ventral e hipotálamo lateral, los cortes obtenidos serán procesados por la técnica de doble inmunohistoquimica para c-fos y orexiana-A como ya ha sido descrito. Tercer grupo (n=10) una vez pasado el tiempo de habituación las hembras identificadas en etapa de estro serán separadas y colocadas cada una en una caja con un macho sexualmente inexperto que solo haya tenido una semana de entrenamiento sexual, se les permitirá el despliegue de conducta sexual, una vez que la hembra haya recibido de 10 a 15 montas será retirada y después de 90 minutos será anestesiada y perfundida, el cerebro será extraído, se realizarán cortes de 40 micras hasta identificar el área tegmental ventral e hipotálamo lateral, los cortes obtenidos serán procesados por la técnica de doble inmunohistoquímica para c-fos y orexiana-A como ya ha sido descrito. 14 Cuarto grupo de hembras (n=10) una vez pasado el tiempo de habituación las hembras identificadas en estro serán separadas y colocadas con un macho sexualmente experto, se les permitirá el despliegue de conducta sexual mediante el método de cópula regulada por la hembra o “pacing” durante treinta minutos, una vez pasados los treinta minutos la hembra será retirada y después de 90 minutos será anestesiada y perfundida, el cerebro será extraído, se realizarán cortes de 40 micras hasta identificar el área del hipotálamo lateral y el área tegmental ventral, los cortes obtenidos serán procesados por la técnica de doble inmunohistoquímica para c-fos y orexiana-A como ya ha sido descrito. Quinto grupo de hembras (n=10) se les permitirá el despliegue de conducta sexual, ahora la cópula será regulada por el macho, para la cual se utilizará un grupo de machos sexualmente expertos (n=15), un redondel de acrílico transparente de 50cm de ancho X 50cm de alto con aserrín en el piso sin ninguna abertura por donde pueda escapar la hembra, los animales serán colocados dentro del mismo redondel y se dejará que desplieguen conducta sexual durante media hora una vez pasado este tiempo la hembra será retirada y después de 90 minutos será anestesiada, perfundida, se extraerá el cerebro y se procederá a realizar la técnica de doble inmunohistoquímica del área tegmental ventral e hipotálamo lateral como ya ha sido descrito. El número de neuronas inmunomarcadas será comparado entre grupos con una ANOVA con el fin de verificar si la diferencia de estimulación que recibe la hembra durante la cópula tiene efecto en la activación de las neuronas productoras de orexinas en el área tegmental ventral y en el hipotálamo lateral. 15 LITERATURA CITADA ARIAS-CARRIÓN O (2009) Sistema hipocretinérgico y narcolepsia. Rev Méd Chile 137: 1209-1216. BEIRAS-FERNÁNDEZ A, R GALLEGO, M BLANCO,T GARCÍA-CABALLERO, C DIÉGUEZ & A BEIRAS (2004) Merkel cells, a new localization of prepro-orexin and orexin receptors. J Anat: 117–122. CAMPBELL E, KL GROVE & MS SMITH. (2003) Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons Coexpress Orexin 1 Receptor Immunoreactivity and Receive Direct Contacts by Orexin Fibers. Neuroendocrinology 4: 1542-1548. CORONA R & R PAREDES (2011) Nuevas neuronas para el olfato y la reproducción. Revista digital Universitaria 12: 1-10. EDWARDS, CMB, S. ABUSNANA, D. SUNTER, KG MURPHY, MA. GHATEI, & SR. BLOOM. (1999). The effect of the orexins on food intake: comparison with neuropeptide Y, melanin-concentrating hormone and galanin. Journal of Endocrinology 160:7–12. GARCÍA-HORSMAN P & RG PAREDES (2004) ¿Es la cópula siempre placentera para la hembra? En: Temas Selectos de Neurociencias III editor: Javier Velázquez Moctezuma UNAM 117-123pp. GONZÁLEZ-FLORES O, M CERBÓN & I CAMACHO-ARROLLO. (2004) Participación del Proteosoma 26S en la regulación de los receptores a hormonas sexuales y su relevancia en la conducta sexual femenina en roedores. En: Temas Selectos de Neurociencias III editor: Javier Velázquez Moctezuma UNAM 293-301pp. HEINONEN M V, AK PURHONEN, KA MÄKELA & KH HERZIG (2008) Functions of orexins in peripheral tissues. Acta Physiol 192: 471-485. KARTERIS E, J CHEN & HS RANDEVA (2004) Expression of human prepro-orexin and signaling characteristics of orexin receptors in the male reproductive system. J Clin Endocrinol Metab 89: 1957–1962. KORCZYNSKI W, M CEREGRZYN, R MATYJEK, I KATO, A KUWAHARA, J WOLINSKI & R ZABIELSKI (2006) Central and local (enteric) action of orexins. Journal of Physiology and Pharmacology 6: 17-42. MANZO J, M MIQUEL, M PÉREZ- POUCHOULÉN, GA CORIA-ÁVILA, LI GARCÍA, R TOLEDO, & ME HERNÁNDEZ. (2010). Aprendizaje motor y receptores a canabinoides en la corteza del cerebelo. Neurobiología 1: 2-9. MURILLO-RODRÍGUEZ E & ARIAS-CARRIÓN O (2007) Hipocretinas, péptidos relacionados con la narcolepsia. Gac Méd Méx 143:421-425. MUSCHAMP JW, JM DOMINGUEZ, SM SATO, S ROH-YU, & EM HULL (2007) A Role for Hypocretin (Orexin) in Male Sexual Behavior. Journal of Neuroscience 27(11):2837-2845. PACHECO P, G CORIA & M MARTINEZ-GÓMEZ (2002) Actividad Neural VaginoCervico-Uterina de la Rata Durante la Cópula. En: Neuroetología: la década del cerebro y la conducta animal, Editor: Jorge Manzo Denes. Universidad Veracruzana 482pp. PAXINOS G & CH WATSON (1998) The rat brain in: stereotaxic coordinates. Fourth Edition. PTASZYNSKA & MOLINA. (2007). Compendium de reproducción animal. Novena edición. Intervet. Paraguay. 422pp. RAMÍREZ L. (2006). El ciclo estral y menstrual. Mundo Pecuario. 2: 30-31. 16 SHIRASAKA T, M TAKASAKI & H KANNAN (2003) Cardiovascular effects of leptin and orexins. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol 284:639-651. SAKURAI, T, A. AMEMIYA, M. ISHII, I. MATSUZAKI, R.M CHEMELLI & H. TANAKA. (1998). Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding. Behavior. Cell 92: 573–585. SILVEYRA P, VA LUX-LANTOS & C LIBERTUN (2007). Both orexin receptors are expressed in rat ovaries and fluctuate with the estrous cycle. Effects of orexin receptor antagonists on gonadotropins and ovulation. Am J Physiol Endocrinol Metab 293: 977–985. SU J, L ZHIHAI, W ZHANG, H NING & J PING. (2008). Distribution of orexine B and its relationship with GnRH in the pig hypothalamus. Research in Veterinary Science 85:3 15-323. 17