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Liberación controlada de interferón y Copaxone usando nanopartículas de SiO 2 y TiO2 por Sol-­‐Gel 5 EL CEREBRO E l sistema nervioso es un conjunto de estructuras que desempeñan funciones específicas que controlan y regulan los órganos, sistemas e interacciones del cuerpo humano. El cerebro es el elemento central del sistema nervioso pues es el encargado de enviar, recibir, interpretar y responder a estímulos ya sean internos o externos. En términos generales se puede decir que el cerebro, y el sistema nervioso, está formado por dos clases de tejido: sustancia gris y sustancia blanca. (Society for
Neuroscience, 2012) La sustancia gris es la más predominante, lleva a cabo las funciones primarias del pensamiento, percepción y cognitivas. Está compuesta de cuerpos celulares, que junto con los capilares le otorgan su característico color rosa grisáceo. En el cerebro se puede encontrar sustancia gris en la corteza cerebral, el cerebelo, así como en el hipotálamo, ganglios basales y el tallo cerebral. (Allen,
Bruss, & Damasio, 2004) En contraste, la sustancia blanca se encuentra en secciones interiores del cerebro y debe su coloración a su composición. Está formada por fibras nerviosas cubiertas por mielina cuya función es conducir las señales entre el cerebro Ilustración 5.1 El c erebro. y los diferentes órganos y sistemas. Aunque existe una menor cantidad de esta sustancia respecto a la gris, durante los últimos años ha cobrado interés debido a las enfermedades y daños que se presentan en ella. (Filley,
2005) El tejido cerebral, y en general el sistema nervioso central, requiere de protección contra compuestos u organismos que pudieran dañar el delicado equilibrio bioquímico que requiere para su funcionamiento. Además se necesita la regulación de solutos entre el sistema nervioso y la sangre. (Minagar & Alexander, 2003) En la siguiente sección se describe la estructura encargada de este proceso, la barrera hematoencefálica. 5.1
Barrera Hematoencefálica La barrera hematoencefálica es una monocapa de células endoteliales cerebrales, vasos sanguíneos y capilares unidos estrechamente que regulan el intercambio de solutos entre el sistema nervioso central y el sistema circulatorio. Dicho mecanismo de intercambio se basa en la presencia de conductos intra e intercelulares que seleccionan a las moléculas que la atraviesan o no de acuerdo a sus propiedades físico-­‐químicas. (Jouyban & Soltani, 2012) 17 Humberto Sánchez de Cima Carrillo A finales del siglo XIX, Paul Erlich y otros científicos hallaron evidencia de una separación entre el sistema nervioso central y el circulatorio cuando, al aplicar un tinte por vía intravenosa observaron que teñía todos los tejidos del cuerpo humano a excepción del cerebro y la médula espinal. Pero cuando se administraba en los Ilustración 5.2 Barrera hematoencefálica. ventrículos cerebrales sí se observaba una coloración. Fue en 1900 cuando Lewandowsky acuñó el término de barrera hematoencefálica. Él descubrió que la administración intravenosa de un neurotóxico no tenía efecto nocivo, mientras que al suministrarlo directamente en el cerebro sí. (Banks,
1999) La permeabilidad característica de la barrera hematoencefálica es sumamente restringida, de forma que sólo algunos gases (por ejemplo O2 o CO2), moléculas lipofílicas de entre 400 y 600 Da y otras moléculas orgánicas pueden cruzar la barrera a través de canales específicos y regulados. Únicamente el agua atraviesa sin restricción alguna. La propiedad de esta estructura pudo comprenderse mejor gracias a la microscopía electrónica que permitió identificar a las células endoteliales que la conformaban y sus características. Las características morfológicas y funcionales que distinguen a las células endoteliales que forman la barrera hematoencefálica son: la presencia de uniones estrechas entre ellas, la carencia de fenestraciones (discontinuidades en el citoplasma) y de vesículas de endocitosis intraendoteliales, un mayor número de mitocondrias y la presencia de láminas basales simples. (Pascual-Garvi, González-Llanos, Prieto-Arribas, Cerdán, &
18 Liberación controlada de interferón y Copaxone usando nanopartículas de SiO 2 y TiO2 por Sol-­‐Gel Roda, 2004) De forma similar a lo que ocurre en otras clases de células, la difusión a través de la barrera hematoencefálica ocurre vía difusión pasiva, endocitosis y transporte activo. El mecanismo que dirija el paso de un compuesto estará determinado por propiedades como lipofilicidad, tamaño, ionización y polaridad. Los sistemas de transporte son específicos hacia las sustancias que el cerebro requiere pero no puede sintetizar, como lo son amino ácidos esenciales, vitaminas, ácidos grasos libres, glucosa, minerales, ácidos nucleicos y electrolitos. También es necesario que el sistema de intercambio se encargue de eliminar sustancias tóxicas, por lo que se necesita un sistema de transporte de entrada y salida. (Banks, 1999) La difusión pasiva ocurre cuando un compuesto atraviesa la barrera hematoencefálica con facilidad. Para contrarrestar la tensión superficial se necesita aplicar cierto trabajo, sin embargo cuando las moléculas son pequeñas y neutras el trabajo aplicado es mínimo. Este mecanismo de difusión se divide a su vez en un proceso libre y en uno facilitado. En el primero los compuestos se mueven libremente entre las células o las atraviesan de acuerdo a un gradiente de concentración. El segundo ocurre cuando una molécula (amino ácidos, péptidos pequeños y glutatión, por mencionar algunas) se une a una proteína específica en la membrana celular, cambiando su conformación y abriéndose paso de una zona de alta concentración a una con baja. La difusión pasiva es característica de sustancias liposolubles. En la endocitosis, sustancias macromoleculares cruzan la barrera hematoencefálica usando vesículas celulares como transporte. La transferencia puede darse a través de la activación de receptores específicos a hormonas, factores de crecimiento, enzimas, proteínas plásmicas y moléculas esenciales similares. Igualmente puede llevarse a cabo con base en interacciones electrostáticas entre la membrana cargada negativamente y sustancias catiónicas como los péptidos. Los compuestos que no son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica por los mecanismos anteriores, emplean el transporte activo. Este tercer proceso depende de ciertas proteínas en la membrana celular conocidas como transportadores, que son aptos para acarrear un compuesto en contra del gradiente de concentración ya sea hacia el interior o exterior de la célula. (Jouyban & Soltani, 2012) Algunas de las sustancias que usan este mecanismo son la glucosa y los amino ácidos esenciales que no pueden ser sintetizados por el cerebro. Una clase especial de endocitosis es la diapedesis, y es el proceso por el cual algunas células pueden sobrepasar la barrera hematoencefálica. Este mecanismo implica la coordinación entre la invaginación de la célula endotelial y la podocitosis de la célula inmune. Esta última está mediada por la presencia de glicoproteínas. La combinación de estos dos fenómenos conlleva al paso del leucocito. Más adelante se describe a detalle este proceso, que es fundamental en la inducción del proceso desmielinizante característico de la esclerosis múltiple. (Banks, 1999) 19 Humberto Sánchez de Cima Carrillo La barrera hematoencefálica se encarga de mantener el entorno apropiado para que las neuronas funcionen correctamente. Sin embargo, esta protección representa un obstáculo para el tratamiento de enfermedades originadas en el sistema nervioso central, ya que el fármaco es incapaz de cruzar la barrera. (National Institutes of Health,
2010) Es por dicha situación que actualmente se estudian diferentes enfoques para distribuir efectivamente los medicamentos, siendo los más relevantes los enfoques invasivos, farmacológicos y fisiológicos. El enfoque invasivo ocupa técnicas que utilizan infusiones intracerebro-­‐ventriculares, liberación por convección y polímeros o microchips implantados en el sistema nervioso central. En la infusión intracerebro-­‐ventricular, el fármaco se libera cerca de los ventrículos y eventualmente se distribuye. Sin embargo, no es un método eficiente si el objetivo no está en las proximidades de los ventrículos (1-­‐2 mm). La liberación por convección, por otra parte, consiste en la inserción de un catéter a través del cual se bombea el fármaco. A diferencia del primer enfoque, se ha demostrado que se pueden liberar proteínas de alto peso molecular a hasta 2 cm del sitio de inyección después de 2 horas de infusión. Este es un método efectivo, pero requiere que la localización del catéter sea precisa. El uso de implantes es una alternativa eficiente en tratamientos a largo plazo. (Gabathuler, 2010) Ejemplo de esto es lo reportado por Fung, cuyos estudios en primates demostraron la presencia de altas concentraciones de fármaco (0.5–3.5 mM para carmustina, 0.2–1 mM para paclitaxel) a 3 mm del implante y concentraciones un poco menores (0.4 μM para carmustina, 0.6 μM para paclitaxel) a 5 cm, después de un mes. (Fung, et al., 1998) El enfoque farmacológico se centra en la modificación de las propiedades fisicoquímicas del fármaco mediante técnicas de química medicinal. Lo que se busca es adecuar la estructura molecular de forma que asemejen a la de las moléculas que se difunden libremente en términos de peso molecular, carga y lipofilicidad. Algunas de las transformaciones más comunes son la reducción del número de grupos polares y la adición de fragmentos lipídicos. Paralelamente, se ha estudiado la nanoencapsulación de fármacos en micelas poliméricas. En último lugar, el enfoque fisiológico toma ventaja de los receptores específicos de la membrana endotelial (a glucosa, insulina, hormona de crecimiento, entre otras). Los factores que se deben considerar son: la cinética de transporte de la molécula fisiológica, los requerimientos estructurales de unión del transportador, que el fármaco pueda unirse sin perder su actividad y que más allá de la unión, pueda haber un acarreo a través de la barrera hematoencefálica. (Gabathuler, 2010) Como se ha revisado hasta este punto, la barrera hematoencefálica es un elemento fundamental para el cerebro al actuar como un filtro de entrada y salida selectivo. Su principal función es proteger y regular el ambiente donde se encuentran las células del sistema nervioso. En la siguiente sección se describe a la neurona de forma general, su estructura, funcionamiento e importancia. 20 Liberación controlada de interferón y Copaxone usando nanopartículas de SiO 2 y TiO2 por Sol-­‐Gel 5.2
La Neurona Las neuronas son células especializadas para transmitir “mensajes” a través de un proceso electroquímico y aunque tienen una función en común, presentan diferentes formas y tamaños. Mientras que los cuerpos celulares de algunas miden alrededor de 1 µm, otros pueden llegar a medir hasta 100 µm. (Stufflebeam, 2008) Ilustración 5.3 La neurona. Las neuronas se dividen en tres categorías de acuerdo a la dirección en la que las señales se propagan. Las neuronas sensoras o aferentes comunican a los órganos sensoriales con el cerebro proporcionando los sentidos del tacto, vista, oído, gusto y olfato. Las neuronas motoras o eferentes controlan la actividad muscular y glandular, es decir, envían señales del cerebro hacia diferentes partes del cuerpo. La tercera clase incluye a las que se conocen como interneuronas y se encargan de la comunicación entre las dos clases de neuronas anteriores. (Hall, 1998) 5.2.1
Estructura de la neurona Las neuronas poseen cuatro regiones definidas: el cuerpo celular o soma, los axones, sus terminaciones y las dendritas. En la siguiente imagen se muestra el esquema de una neurona típica. Ilustración 5.4 Estructura de la neurona. El cuerpo celular o soma controla la actividad celular y actúa como el centro metabólico, sintetizando proteínas, neurotransmisores y otras moléculas necesarias. Los somas componen a lo que se conoce como sustancia gris. De forma similar a las células comunes, el cuerpo celular cuenta con núcleo, citoplasma, aparato de Golgi, mitocondrias, microtúbulos y lisosomas. (Matamala, 2011) Las dendritas son fibras que se extienden del cuerpo celular y actúan como receptores de las señales químicas provenientes de otras neuronas. Aumentan el área superficial de la neurona y por tanto, su capacidad de recepción. En contraste, los axones actúan como transmisores; pueden llegar a medir hasta 1 m de largo. Algunos están cubiertos por vainas de mielina, un material lipídico y aislante cuya función es acelerar las señales eléctricas. 21 Humberto Sánchez de Cima Carrillo En el extremo de los axones se encuentran las terminales presinápticas. Estas pequeñas ramificaciones se encuentran en proximidad con las dendritas de otra neurona. El sitio donde las terminales presinápticas terminan se conoce como sinapsis. Estos espacios interneuronales no son conexiones físicas como tampoco son estáticas. Una neurona promedio forma aproximadamente 1000 sinapsis, cada una surge en respuesta a cada nueva experiencia y son la base del aprendizaje. (National Institutes of Health, 2010) 5.2.2
Comunicación neuronal Para poder cumplir con la función general del sistema nervioso, las neuronas poseen capacidades de comunicación intra e intercelular. En primer lugar, para enviar información de una parte de la célula a otra se genera una señal del tipo eléctrica. Este proceso se conoce como mecanismo de conducción. En segundo lugar, para transmitir la información a otra neurona, dicha señal eléctrica se transforma en una química. En este caso se habla de un mecanismo de neurotransmisión. (Stufflebeam, 2008) 5.2.2.1
Mecanismo de conducción Cuando una neurona se estimula, un potencial de acción (la señal eléctrica) se genera en una región del axón cercana al cuerpo celular y viaja en dirección a las terminales presinápticas. Dicho potencial permite a la señal viajar rápidamente, pues dura menos de 2 ms. Al igual que otras Ilustración 5.5 Axón en reposo. células, la neurona presenta un potencial de membrana originado por una diferencia en la concentración de iones dentro y fuera de la estructura. En el ser humano, este potencial de membrana se encuentra entre -­‐40 mV y -­‐80 mV, en condiciones de reposo. Cuando el potencial está en reposo, la concentración de iones Na+ es menor en el interior de la neurona y la de iones K+ es mayor. (National Institutes of Health, 2010) Cuando un estímulo genera el intercambio de aniones Cl-­‐ y cationes K+ y Na+ a través de la membrana neuronal, el potencial se altera creando un cambio eléctrico o el potencial de acción. El potencial de acción resulta del cambio en la permeabilidad de la membrana y existen dos tipos. Cuando el interior de la neurona se vuelve más negativo se conoce como hiperpolarización. En el caso contrario se observa una despolarización. El canal de Na+-­‐K+ recupera el balance normal de los iones en la región afectada. Sin embargo, el cambio momentáneo produce una variación similar en la sección adyacente, misma que se 22 Ilustración 5.6 Potencial de Acción. Ilustración 5.7 Propagación del potencial. Liberación controlada de interferón y Copaxone usando nanopartículas de SiO 2 y TiO2 por Sol-­‐Gel va propagando hacia las terminales presinápticas. (Córdoba García, 2005) La generación de un potencial de acción es a lo que se le conoce como un fenómeno todo o nada. Es decir, los potenciales tienen igual amplitud y duración sin importar el estímulo, siempre y cuando rebase cierto umbral. Lo que permite a una neurona responder a un estímulo determinado se relaciona con el número y frecuencia de los potenciales de acción. (National Institutes of Health, 2010) 5.2.2.2
Mecanismo de neurotransmisión El mecanismo de neurotransmisión o de transmisión sináptica ocurre por el movimiento de señales químicas o eléctricas a través de una sinapsis. La sinapsis está compuesta por tres elementos primordiales. El primero es la superficie presináptica o las llamadas terminales axónicas donde se localizan unas vesículas que contienen neurotransmisores. En segundo lugar se encuentra el espacio sináptico, una zona de aproximadamente 200 Å de espesor que separa a las terminales axónicas de las dendritas receptoras. Este tercer elemento, la superficie postsináptica, cuenta con canales iónicos que permiten el paso de los neurotransmisores y con ellos la propagación del impulso. (Hall, 1998) Ejemplo de este mecanismo son las fibras musculares, donde los mioblastos se fusionan para que el potencial de acción viaje con mayor rapidez. Finalmente la sinapsis química es la que predomina. En ella un intermediario químico, un neurotransmisor, se libera a través de la membrana presináptica y es identificado por los receptores de la superficie postsináptica. (Harvard University) Al llegar a las terminales axónicas, el potencial de acción provoca la liberación de neurotransmisores específicos almacenados en las vesículas sinápticas. La despolarización abre los canales iónicos de Ca2+ permitiendo la entrada de este catión hacia el interior de la neurona. El Ca2+ se une a la membrana de las vesículas, lo que provoca su ruptura y la subsecuente liberación del neurotransmisor. Este compuesto se difunde a través del espacio sináptico y se fijan en los receptores de las dendritas de otra neurona. Los neurotransmisores activan la apertura de canales iónicos generando un potencial postsináptico y con él un nuevo impulso nervioso, la contracción muscular o la secreción de alguna sustancia. En términos generales se puede decir que los neurotransmisores pueden crear dos clases de potencial postsináptico, excitatorio (EPSP) o inhibitorio (IPSP). Si se produce una despolarización se habla de un EPSP, mientras que si se trata de una hiperpolarización corresponde a un IPSP. (Macalester College) Ilustración 5.8 Mecanismo de neurotransmisión. 23 Humberto Sánchez de Cima Carrillo El ion Ca2+ juega un papel importante en la comunicación intracelular que a su vez regula procesos fisiológicos. De forma general, las funciones del catión se deben a la diferencia en las concentraciones extracelulares y citoplasmáticas. Mientras que la primera está en el orden de mM, la segunda es de aproximadamente 100 nM. Dentro del líquido cefalorraquídeo lo encontramos en el rango de entre 2.0 y 3.0 meq/L (1.0 -­‐ 1.5 mmol/L). (Torres Morera, 2001) El ion calcio no sólo controla la liberación de neurotransmisores, como se indico anteriormente. Se ha reportado que el Ca2+ es mensajero en la proliferación de neuronas y células gliales. Después de la neurogénesis, las neuronas deben migrar hacia el sitio que les corresponde y es el ion calcio el que funge como señalizador. Además participa en la expresión de genes neuronales y en la plasticidad sináptica. (León Iza &
Zarain Herzberg, 2010) Desde la década de 1980 existe una hipótesis que propone que la decadencia en las funciones cognitivas en función del envejecimiento esta causada por una irregularidad en la homeostasis de Ca2+. El resultado sería un incremento en la concentración intracelular y por tanto la pérdida neuronal. Igualmente se ha vinculado una deficiencia de calcio con la transmisión de mensajes intraneuronales espontáneos. Aún no se conocen con precisión las funciones que desempeña este catión, es por esto que es un área latente de estudio e interés. (Toescu & Verkhratsky, 2007) 5.2.3
Importancia de la mielina Como se sabe, el sistema nervioso está formado por materia blanca y materia gris. En particular, la materia blanca se compone de axones mielinizados, células gliales y vasos sanguíneos, siendo la mielina el elemento más abundante. Las vainas de mielina forman cerca del 50% de la masa total y es la principal diferencia química entre la materia blanca y la gris. (Brockes, 1982) Como se mencionó anteriormente, la mielina es una membrana modificada que recubre espiralmente algunos axones. Además es parte de las células Schwann en el sistema nervioso periférico y de los oligodentrocitros en el sistema nervioso central. La vaina se presenta en forma de segmentos periódicos o internodos, donde cada uno se origina de una célula independiente (células Schwann u oligodendrocito). Las secciones del axón descubiertas son los nodos de Ranvier (Zarco, 2014) y son fundamentales en el funcionamiento de la neurona. Ilustración 5.9 Vaina de mielina de un perro adulto. Alrededor del 40% de la mielina in situ es agua. Sin embargo, la masa seca consta de entre 70 y 85% de lípidos y de 15 a 30% de proteínas. Con base en estudios de microscopía electrónica, la vaina de mielina se 24 Liberación controlada de interferón y Copaxone usando nanopartículas de SiO 2 y TiO2 por Sol-­‐Gel observa como un patrón de líneas oscuras y claras alternadas, proteínas y lípidos respectivamente. La imagen a la izquierda, por ejemplo, muestra una fibra mielinizada del sistema nervioso central, específicamente de la médula espinal, de un perro adulto. (Quarles & Morell, 2006) La vaina de mielina, juega un papel fundamental en el mecanismo de conducción, en particular los nodos de Ranvier (Zarco, 2014). Estos segmentos sin recubrir permiten que los canales de Na+ y K+ en el axón queden expuestos al espacio intersticial. La mielina actúa como aislante y es esta propiedad la que facilita el proceso de conducción. En las fibras sin esta estructura, el potencial de acción se propaga a través de secciones adyacentes a lo largo del axón. Esto no sucede en las fibras mielinizadas. En ellas la polarización se transmite hacia el siguiente nodo de Ranvier 1 mm (1 x 106 nm) más adelante, pues el imposible para la mielina polarizarse. Así es como el mecanismo de conducción se agiliza conservando energía. (Barkovich, 2000) Ilustración 5.10 Mecanismo de conducción sin mielina. Ilustración 5.11 Mecanismo de conducción con mielina. 25