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Prevalencia de los genes mcr-1 y mcr-2 de Resistencia a Colistina Mediada por Plásmidos en cepas procedentes de los Programas Nacionales de Control de Salmonella (PNCS) en aves en España, 2010 a 2015. De Frutos, C 1; Rocha, A 2; Buitrago, MD 2; Serrano, T 2; de Caso, M 2; Chico, I 2; Sánchez, M 1; Agüero, M 1 1 Laboratorio Central de Veterinaria. Ministerio de Agricultura y Pesca, Alimentación y Medio Ambiente , 2 TRAGSATEC Tecnologías y Servicios Agrarios, S. A. INTRODUCCIÓN Durante décadas la colistina ha sido ampliamente utilizada en medicina veterinaria frente a infecciones causadas por Enterobacteriaceae en animales de abasto en Europa. Hasta 2015 el mecanismo de resistencia a colistina conocido únicamente implicaba mutaciones cromosómicas, por lo que su diseminación se esperaba limitada a la transmisión vertical. Sin embargo en este año fue descubierto en China el gen mcr-1 [1], un nuevo mecanismo de resistencia a colistina mediada por plásmidos que permite una transferencia mucho más eficiente de esta resistencia. Desde entonces se ha documentado la presencia global de este gen en Enterobacteriaceae de humanos, animales de abasto y alimentos. A la preocupación originada por el descubrimiento de este gen se suma la identificación en 2016 de un segundo gen mcr-2 en Bélgica [2]. El objetivo de este trabajo es evaluar la prevalencia de estos dos genes de resistencia en las cepas de Salmonella procedentes de las poblaciones avícolas incluidas en los PNCS de 2010 a 2015. MATERIALES Y MÉTODOS En el marco de la legislación europea para la vigilancia de la resistencia de las bacterias zoonóticas y comensales a los antibióticos [3], el LCV llevó a cabo la investigación de la resistencia a antimicrobianos en un total de 2266 cepas de Salmonella aisladas en el contexto de los PNCS y seleccionadas a partir de distintas unidades epidemiológicas de gallinas ponedoras, pollos de carne y pavos de engorde durante los años 2010 a 2015. Para cada una de estas cepas se investigó la resistencia frente a un panel de 14 antibióticos entre los que se incluía la colistina. Para ello se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de acuerdo a la norma ISO 20776-1:2006, empleando el método de microdilución en caldo semiautomatizado (Sensititre, Trek Diagnostics System Ltd). El rango de concentración de colistina testado fue de 2 a 4 mg/l (2010-2013) y de 1 a 16 mg/l (2014-2015) y, de acuerdo a los puntos de corte epidemiológicos definidos por EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing), se consideraron resistentes a colistina las cepas con una CMI mayor a 2mg/l. En esta colección de cepas de Salmonella resistentes a colistina se estudió la presencia de los genes mcr-1 y mcr-2 mediante PCR convencional, de acuerdo al protocolo del Laboratorio Europeo de Referencia para resistencias a antimicrobianos [4] y Xavier et al. [2] respectivamente. Ambas PCRs fueron optimizadas con el Kit Mix Go Taq de PROMEGA, realizándose las reacciones en las siguientes condiciones: 200 µM de cada dNTP; 2.0mM MgCL2; 0.4µM de cada cebador; muestra (ADN) 3 µl; volumen reacción 25 µl. Tras la PCR, los productos amplificados se sometieron a electroforesis en geles de agarosa teñidos con SYBR Safe, Fig.1 y 2, y se confirmó la identidad de los fragmentos de tamaño compatible mediante secuenciación. AÑO APTITUD SEROVAR 2014 2014 2014 2014 2013 2011 2011 2011 2011 2010 Broilers Pavos Pavos Pavos Pavos Pavos Pavos Pavos Ponedoras Ponedoras S. Typhimurium S.Derby S.Derby S.Derby S.Derby S.London S.London S.London S.Enteritidis S.London CMI mg/l Colistina 8 4 4 4 8 8 8 8 4 8 GEN IDENTIFICADO mcr-1 mcr-1 mcr-1 mcr-1 mcr-1 mcr-1 mcr-1 mcr-1 mcr-2 mcr-1 PERFIL RESISTENCIA Col, Tmp,Cip,Tet;Nal,Chl,Amp Col, Tmp,Cip,Tet,Chl,Amp Col, Tmp,Cip,Tet,Amp Col, Tmp,Cip,Tet,Amp Col,Tet,Amp Col,Chl,Amp Col, Tmp,Cip,Tet,Chl,Amp Col,Chl,Amp Col Col,Chl,Amp Tabla 1. Cepas positivas a mcr-1 y mcr-2. Fig.3 Distribución de cepas resistentes a colistina en cada una de las poblaciones estudiadas. Fig.4 Distribución de mcr-1 y mcr-2 en el total de cepas resistentes a colistina. 4 3 mcr-1 2 mcr-2 1 0 2010 2011 2012 2013 2014 2015 Fig.5 Distribución de mcr-1 y mcr-2 en el periodo estudiado. RESULTADOS Durante el periodo de estudio se identificaron un total de 81 cepas de Salmonella resistentes a colistina (CMI >2mg/l). Fig.3 Nueve de estas cepas resultaron positivas al gen mcr-1 y una al gen mcr-2, lo que arroja una prevalencia global para ambos genes del 0,4% (0,4% mcr-1) (0,04% mcr-2), siendo la población de pavos de engorde la que presentó una mayor prevalencia. Fig.4 Estas 10 cepas positivas se analizaron de nuevo frente a colistina en concentraciones de 1 a 16 mg/l obteniéndose valores de CMI entre 4 y 8 mg/l. Las cepas positivas, muestreadas en los años 2010 (n=1), 2011 (n=4), 2013 (n=1) y 2014 (n=4), Fig.5, pertenecían a cuatro serovares diferentes de S. enterica subsp. enterica y procedían de las tres poblaciones estudiadas con origen en tres Comunidades Autónomas. Mientras que, de entre los 14 antibióticos analizados, la cepa que resultó positiva a mcr-2 sólo presentó resistencia a colistina, todos los aislados en los que se identificó el gen mcr1 presentaron un perfil de multirresistencia teniendo en cuenta puntos de corte epidemiológicos (resistentes a al menos tres antibióticos de familias diferentes). Tabla 1. DISCUSIÓN Fig.1. Fig. 2. Fig. 1. Gel agarosa. Muestra el amplicón PCR gen mcr-1(309nt) (M) marcador de peso molecular (100pb-1000Pb); (CA+) control positivo de amplificación; (1-9) aislado salmonella positivo a gen mcr-1; (CE-) control de extracción negativo; (CA-) control negativo de amplificación. Fig. 2. Gel agarosa. Muestra el amplicón PCR gen mcr-2 (526nt) (M) marcador de peso molecular (100pb-1000Pb; (CA+) control positivo de amplificación; (1) aislado salmonella positivo a gen mcr-2 ; (CE-) control de extracción negativo (CA-) control negativo de amplificación. REFERENCIAS Los hallazgos de este trabajo muestran la presencia de los genes mcr-1 y mcr-2 en nuestra avicultura al menos desde 2010. Hasta donde conocemos, es la primera vez que se identifica el gen mcr-2 en cepas de procedencia animal en España. En cuanto a mcr-1, su detección en distintos serovares de Salmonella está en consonancia con la diseminación horizontal de este gen. Aunque la multirresistencia observada en los aislados con mcr-1 podría contribuir a la selección de estas cepas debido a la presión ejercida por el posible empleo de otros antibióticos en las poblaciones estudiadas, la prevalencia obtenida ha sido baja para ambos genes y por otra parte los datos no indican una diseminación progresiva de los mismos. La relevancia de la colistina, considerada actualmente como un antibiótico de último recurso en medicina humana, hace esencial continuar con la vigilancia de esta resistencia en nuestra avicultura. 1. Liu YY, Wang Y, Walsh TR, Yi LX, Zhang R, Spencer J, Doi Y, Tian G, Dong B, Huang X, Yu LF, Gu D, Ren H, Chen X, Lv L, He D, Zhou H, Liang Z, Liu JH, Shen J. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study. Lancet Infect Dis. 2015 Nov 18. pii: S1473-3099(15)00424-7. doi: 10.1016/S1473-3099(15)00424-7. [Epub ahead of print] 2. Eurosurveillance, Volume 21, Issue 27, 07 July 2016. Rapid communication. IDENTIFICATION OF A NOVEL PLASMID-MEDIATED COLISTIN-RESISTANCE GENE, MCR-2, INESCHERICHIA COLI, BELGIUM, JUNE 2016.BB Xavier, C Lammens, R Ruhal, S KumarSingh, P Butaye, H Goossens, S Malhotra-Kumar (Xavier et al., 2016) 3. 2013/652/UE. Decisión de Ejecución de la Comisión, de 12 de noviembre de 2013, sobre el seguimiento y la notificación de la resistencia de las bacterias zoonóticas y comensales a los antibióticos [notificada con el número C(2013) 7145] 4. LABORATORY PROTOCOL mcr-1. PCR for plasmid-mediated colistin resistance gene mcr-1 (Protocol optimized at Statens Serum Institut, Copenhagen, Denmark). December 2015 Version 1 Lina Cavaco, Rene Hendriksen
