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MODULACIÓN ESTROGÉNICA DEL SISTEMA KISSPEPTINA/GPR54 VÍA
GPR30 EN CÉLULAS GT1
Hernández Martínez C.(1); Martínez de la Escalera G.(2)
(1)
Fac. Ciencias Naturales / Lic. Biología
Universidad Autónoma de Querétaro
(2)
Instituto de Neurobiología (INB)
Universidad Nacional Autónoma de México.
Resumen.
Se analizó el mecanismo de acción del estradiol sobre neuronas GnRHérgicas en la
línea celular inmortalizada GT1-7. Mediante RT-PCR en tiempo real, se determinó el
efecto del 17β-estradiol sobre el nivel de expresión de GPR54, y se comparó la
magnitud del mismo con el efecto de dos agentes agonistas del receptor GPR30 como
son el 4-hidroxitamoxifeno y el G-1, observandose en ambos casos un aumento en los
niveles del ARNm de GPR54, lo cual indica que este sistema se regula vía GPR30.
Introducción.
La organización de la función reproductiva se lleva a cabo por señales neurales y
hormonales que inciden sobre las neuronas neurosecretoras de la hormona liberadora de
gonadotropinas o GnRH, las que comandan la función del eje. Entre los mecanismos
que controlan la secreción de las gonadotropinas destacan las asas de retroalimentación
positiva y negativa por parte del estradiol. Dada la ausencia o la cantidad limitada del
receptor a estrógenos (RE) (hoy denominado receptor a estrógenos α o REα) expresado
en neuronas GnRHérgicas (Shivers et al, 1983; Fox, et al., 1990; Herbison y Theodosis,
1992; Huang y Harlan, 1993; Lehman y Karsch, 1993), en un tiempo se consideró que
los efectos estrogénicos no podrían ocurrir de forma directa, y se sugirió que la
regulación de la liberación de la GnRH por estrógenos estaría mediada por mecanismos
de acción indirectos. Estos mecanismos indirectos podrían presentarse en diversas
combinaciones, dando como resultado efectos de retroalimentación tanto negativa como
positiva (Herbison y Pape, 2001). Con el descubrimiento de un segundo receptor a
estrógenos (hoy denominado β o REβ) (Kuiper et al., 1996), la biología de los
estrógenos en general fue reevaluada. Se encontró que este segundo receptor se expresa
y funciona en neuronas GnRHérgicas (Skynner e al., 1999; Herbison et al, 2001;
Hrabovszky et al., 2001). Esto sugirió que los esteroides gonadales podrían influir
directamente sobre las neuronas GnRHérgicas. Recientemente se descubrió un tercer
receptor a estrógenos, que a diferencia de los dos señalados anteriormente y que operan
a nivel nuclear ejerciendo acciones genómicas, este último es membranal y se encuentra
acoplado a proteínas G, y es denominado GPR30 (Hewitt, et al 2005). Este receptor
presenta una alta selectividad para estradiol en comparación con estrona y estriol
(Thomas et al., 2005). El descubrimiento de este nuevo receptor ha ayudado a explicar
algunos mecanismos rápidos de acción estrogénica.
En los últimos años se describió un nuevo sistema de neurotrasmisión aferente a las
neuronas GnRHérgicas, denominado sistema Kisspeptinas/KiSS-1R, que ha
revolucionado los conceptos de la regulación neuroendócrina de la reproducción. Las
Kisspeptinas son péptidos que actúan como reguladores de las neuronas secretoras de la
GnRH, participando en la pubertad y en el funcionamiento normal del eje reproductivo
(De Roux et al, 2003, Seminara et al., 2003, Seminara y Kaiser, 2005; Messager, 2005a;
Messager, 2005b; Tena-Sempere, 2005; Aparicio, 2005; Vogel, 2005; Popa et al, 2005;
Dungan et al., 2006). Actúan a través de un receptor acoplado a proteínas G, llamado
GPR54 o KiSS-1R (Stafford et al., 2002).
El estudio del sistema reproductor ha avanzado considerablemente mediante el
desarrollo de líneas celulares GnRHérgicas inmortalizadas, como es el caso de las
células GT1, las cuales presentan muchas de las características fisiológicas de las
neuronas GnRHérgicas in vivo (Martínez de la Escalera y Clapp, 2001). En estas células
se encontró la expresión funcional de ambos receptores estrogénicos nucleares, REα y
REβ (Poletti et al., 1994; Shen et al., 1998; Roy et al. 1999; Kallo, et al, 2001).
Recientemente Jacobi y col (2007) detectaron también la expresión del ARN mensajero
correspondiente al receptor GPR30. En células GT1 se ha estudiado la regulación
estrogénica de la liberación de la GnRH y se han reportado efectos estrogénicos a través
de mecanismos genómicos y no genómicos (Roy, et al 1999; Shen, et al, 1998; Navarro
et al., 2003). De tal forma que actualmente se considera la posibilidad de una regulación
del eje reproductivo por acción estrogénica directa sobre las neuronas GnRHérgicas, lo
cual complementaría a los mecanismos de acción indirecta que ya han sido
demostrados.
Con base en la información anterior, en el presente estudio se propuso analizar el papel
del receptor membranal GPR30 en la modulación estrogénica del sistema
Kisspeptina/GPR54. Particularmente se determinó si en el incremento de la expresión
de las moléculas KiSS-1 y KiSS-1R inducido por 17β-estradiol participa el GPR30,
para lo cual se utilizó el agonista específico para este receptor, el G-1 (Bologa et al.,
2006).
Metodología.
Se utilizo la línea celular GT1-7 en el pase 29, cultivadas con medio de cultivo Eagle
modificado por Dulbecco (D-MEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino y 5%
de penicilina/estreptomicina (GIBCO BRL), manteniéndose dentro de una incubadora a
37°C, con alta humedad y 5% de CO2 en aire atmosférico. El medio de cultivo se
cambió cada tercer día hasta obtener una confluencia celular entre el 80 y 90%. Durante
las 48 hrs previas al tratamiento, el medio de cultivo fue sustituido por un medio de
cultivo D-MEM libre de rojo de fenol (GIBCO BRL) y sin suplemento de suero fetal
bovino, con el objeto de evitar algún efecto esteroideo presente en el medio. El
tratamiento consistió en la exposición a 17-β-estradiol (Research Biochemicals
Incorporated) disuelto en etanol, a 4-hidroximatomifeno (SIGMA), o a G-1
(CALBIOCHEM), todos ellos en concentraciones de 1, 10 y 100 nM, por un periodo de
24hr. Se utilizó un grupo control y en todos los grupos las determinaciones se realizaron
por triplicado. Posterior a las 24 horas del tratamiento el medio fue retirado y las células
fueron congeladas a -80°C hasta su análisis.
Se extrajo el ARN total de cada una de las muestras utilizando el kit RNAqueous
(Ambion). El ARN extraído de las muestras fue sometido a retrotrascripción (RT) para
obtener una cadena complementaria de ADN (cDNA por sus siglas en inglés). Para
verificar la eficiencia de la RT, en cada muestra se amplificó por PCR convencional un
fragmento de 173 pb correspondiente al gen de β-actina, un gen de expresión
constitutiva. Posteriormente se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa o
PCR (por sus siglas en ingles), en la modalidad tiempo real, el cual es un método muy
sensible para la cuantificación de secuencias especificas de ácidos nucleicos.
Resultados y Discusión.
Como se observa en la figura 1, los resultados muestran que los tres tratamientos
indujeron un aumento en los niveles de expresión del GPR54, en comparación con los
niveles basales observados en el grupo control. El mayor aumento se observa en dosis
de 100 nM para los tres tratamientos, lo cual indicaría que esta podría ser la dosis
optima para la activación del receptor GPR30. Para el caso del tratamiento con
estradiol (barras rojas), se muestra claramente la tendencia de una curva dosis respuesta.
La respuesta al tratamiento con 4-OHT, también tiene un patrón claro entre la dosis y la
respuesta, pero las dosis menores como 1nM y 10nM produjeron una disminución en la
expresión de ARNm de GPR54. Este resultado puede deberse a la existencia de una
inhibición por parte del 4-OHT a dosis bajas o a una sobre estimación del grupo control.
En el caso del G-1, el agonista específico del receptor GPR30, las dosis mayores (10 y
100 nM) también muestran una relación dosis-respuesta, pero la menor (1 nM) no sigue
este patrón. La dosis mayor de G-1 (100nM) fue donde se observó el mayor nivel de
expresión del ARNm de GPR54. El análisis estadístico mostró diferencias significativas
entre dosis en los tres grupos tratados (P<0.05), así como con el grupo control (P<0.05).
El aumento de los niveles del ARNm de GPR54 demuestra que este sistema esta
modulado por estrógenos vía el receptor GPR30. Será necesario replicar este
experimento para poder concluir con toda certeza si el 4-OHT tiene un efecto dual
(inhibitorio a dosis pequeñas y facilitador a dosis mayores) o bien esta observación fue
producto de la variabilidad observada en el grupo control.
Fig.1. Efecto del 17β-estradiol así como también los agonistas del receptor GPR30 4-OHT y G1 sobre el incremento del ARNm de GPR54 en células GT1-7. En cada gráfica se muestran los
promedios del error estándar. Los cálculos fueron realizados utilizando el método para
determinación de expresión relativa por PCR en tiempo real denominado ΔΔCp.
Diversos grupos de investigación han demostrado que el sistema kisspeptina/GPR54
esta modulado por estrógenos, y nuestros resultados no solo confirman este concepto,
sino que lo extienden al proponer que al menos en parte esta modulación implica al
receptor membranal GPR30. Actualmente, se considera que el GPR54 es una molécula
muy importante en la regulación de la función reproductiva, desarrollando un papel
crucial en el proceso de la pubertad (Seminara et al., 2003). La kisspeptina se ha
considerado también un componente importante de la secreción de la GnRH, el
desarrollo de la pubertad y el mantenimiento de la función normal de la reproducción en
el adulto, todo ello inter-dependiente de esteroides sexuales. Por esta razón
consideramos que es importante hacer un análisis adicional midiendo y comparando los
niveles de expresión del ARNm de la propia Kisspeptina, para saber si esta juega un
papel autócrino en estas células.
Conclusiones.
El sistema Kispeptina/GPR54 esta modulado vía GPR30 en neuronas GnRHérgicas. Los
agonistas del receptor GPR30 (G1 y 4-OHT) tienen un efecto máximo en la dosis de
100 nM.
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