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ESTUDIO DE MICROORGANISMOS ENDÓFITOS EN PLANTAS DE
Rhizophora mangle EN DOS ECOSISTEMAS DE MANGLAR DEL CARIBE
COLOMBIANO
ELIZABETH PAOLA JIMÉNEZ BASTIDAS
SHAYRA PATRICIA VÉLEZ CARVAJAL
UNIVERSIDAD LIBRE DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA
BARRANQUILLA
2008
1
ESTUDIO DE MICROORGANISMOS ENDÓFITOS EN PLANTAS DE
Rhizophora mangle EN DOS ECOSISTEMAS DE MANGLAR DEL CARIBE
COLOMBIANO
ELIZABETH PAOLA JIMÉNEZ BASTIDAS
SHAYRA PATRICIA VÉLEZ CARVAJAL
Asesores
M.Sc. ANA MEDINA BUELVAS
M.Sc. NELSON VALERO VALERO
Esp. ARACELY GARCIA DE BALLÉN
UNIVERSIDAD LIBRE DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA
BARRANQUILLA
2008
2
CONTENIDO
Pág.
1.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
6
2.
JUSTIFICACIÓN
9
3.
OBJETIVOS
12
3.1
OBJETIVO GENERAL
12
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
12
4.
MARCO TEÓRICO
13
4.1.
ECOSISTEMA DE MANGLAR
13
4.1.1. Generalidades
13
4.1.2. Importancia y Función Ecológica
13
4.1.3. Importancia Económica
ANÁLISIS DE LOS ECOSISTEMAS DE MANGLAR EN
4.2.
COLOMBIA
4.3.
CARACTERÌSTICAS DE LAS PLANTAS DE MANGLE
14
4.4.
Rhizophora mangle (Mangle Rojo)
15
18
19
4.4.1. Características Morfológicas
19
4.4.2
Estrategias de Adaptación
21
4.5.
MICROBIOLOGÍA DEL MANGLAR
24
4.6.
MICROORGANISMOS ENDÓFITOS
28
4.6.1. Generalidades
28
4.6.2. Relaciones Simbióticas de los Hongos Endófitos.
31
4.6.3. Mecanismo De Transmisión de Los Hongos Endófitos.
32
4.6.4. Efectos Fisiológicos de los Hongos en el Hospedero.
32
5.
MARCO ESPACIAL
34
6.
MARCO TEMPORAL
35
3
7.
DISEÑO METODOLÓGICO
36
7.1.
TIPO DE INVESTIGACIÓN
36
8.
METODOLOGÍA
37
8.1
ÁREA O ZONA DE ESTUDIO
37
8.1.1. Bahía de Chengue
37
8.1.2. Cuenca Hidrográfica de la Ciénaga de Mallorquín
37
8.2.
METODOLOGÍA DEL MUESTREO
38
8.3.
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
39
8.3.1. Prelavado (Bacon, 2002).
39
8.3.2.
Proceso de Esterilización Superficial para Muestras destinadas
para el Aislamiento de Hongos Endófitos (Bacon, 2002)
39
8.3.3.
Proceso de Esterilización Superficial para Muestras destinadas
para el Aislamiento de Bacterias Endófitas (Bacon, 2002)
40
8.4.
PROTOCOLO DE AISLAMIENTO
41
8.4.1. Aislamiento e Identificación De Hongos Endófitos.
Aislamiento e Identificación De Bacterias Endófitas Aerobias y
8.4.2.
Anaerobias.
41
8.4.3. Aislamiento e Identificación Bacterias Endófitas Diazótrofas.
43
9.
PRESUPUESTO
46
10.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
47
11.
BIBLIOGRAFÍA
48
ANEXOS
4
42
LISTA DE IMÁGENES
Pág.
Imagen 1.
Corteza de Rhizophora mangle
20
Imagen 2.
Flores de Rhizophora mangle
20
Imagen 3.
Hojas de Rhizophora mangle
20
Imagen 4.
Raíces de Rhizophora mangle
22
Imagen 5.
Propágulos de Rhizophora mangle
23
5
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los manglares cubren el 60-75% de las costas tropicales y subtropicales del
mundo, de las cuales han desaparecido un 25% (FAO 2003), causando graves
impactos ambientales, sociales y en las economías de las comunidades locales
usuarias de estos ecosistemas. En América Latina ocupan aproximadamente
4.000.000 de ha, en las costas del Pacífico y del Atlántico; en Colombia cubren
aproximadamente 379.954 ha entre ambas costas, de las cuales 292.726 se
encuentran en el litoral Pacífico y 87.908 en el Caribe.
En los dos litorales se han realizado actividades que han ocasionado impactos
negativos sobre estos ecosistemas tales como: construcción de obras civiles
-carreteras, muelles y algunas obras inadecuadas en la producción de camarones,
expansión de las fronteras urbanas, agrícolas e industriales, contaminación por
hidrocarburos y plásticos, tala indiscriminada del bosque de mangle y
construcciones
turísticas. Lo anterior, ha generado efectos o consecuencias
negativas como la alteración y deterioro de las funciones ecológicas del manglar refugio, alimentación y anidación de diversas especies amenazadas de
mamíferos, reptiles, anfibios y
aves; estabilización de playas, control de la
erosión, evotranspiración, detoxificadores, amortiguadores de inundaciones y
atenuadores del calentamiento global- (Sánchez-Páez, et.al.,2000b).
Por tal motivo hoy en día la situación de los ecosistemas de manglar en Colombia
y en especial en el Caribe colombiano es crítica. Se calcula que unas 40.000
hectáreas han sido alteradas y deterioradas, de las cuales se han perdido por
completo aproximadamente 1.220 km2 en treinta años, equivalentes a 40,8 km 2
por año, de los cuales la mayor pérdida se ha registrado en la región Caribe, 1.898
6
km2 estimados en 1984, en consecuente en la región actualmente solamente
permanecen 863 km2, por efecto de diversos impactos como explotación forestal
intensiva, conversión a otros usos y contaminación entre otros (Ocampo-Aguirre,
1997).
En el Departamento del Atlántico, los manglares están sometidos a altos niveles
de contaminación y eutrofización; ejemplo de ello es La Ciénaga de Mallorquín
afectada por descargas de desechos químicos e industriales de Barranquilla y de
la acumulación de productos contaminantes y alta carga de sedimentos
provenientes del río Magdalena. Igualmente pueden mencionarse como tensores
de los manglares en el área, los procesos de aterramiento derivadas de las
actividades operativas de Cementos del Caribe, del Barrio las Flores y la
desviación de los cauces de varios caños. En las Ciénagas de Balboa y del Rincón
se presentan también vertimientos de aguas residuales y de productos químicos
que afectan el recurso pesca y a los ecosistemas de manglares en general
(IDEAM).
Ante esta problemática se han venido desarrollando programas de reforestación,
sin embargo la sobrevivencia de plántulas de mangle durante los procesos
naturales es baja (Holguín et al., 1999), En los últimos años se ha documentado el
importante papel de las comunidades microbianas asociadas a los ecosistemas de
Manglar. Estudios previos relacionados con el efecto promotor del crecimiento
vegetal por especies microbianas asociadas a la rizósfera
como coadyuvantes en programas de reforestación,
revelan su potencial
la aplicación de
biofertilizantes en estas plántulas podría contribuir a promover su crecimiento,
supliendo las deficiencias nutricionales y liberando fitohormonas que pueden ser
de gran utilidad para promover el desarrollo temprano y establecimiento de estas
plantas (Bashan, 2002).
7
En diferentes especies
se ha visto el importante papel de microorganismos
endófitos para la nutrición y el desarrollo de plantas como caña de azúcar, café,
mango, entre otras. Hasta el momento no se han adelantado estudios sobre
microorganismos endófitos en plantas de mangle, por cual se propone aislar y
caracterizar dichos microorganismos en plantas de Rhizophora mangle, situadas
en ecosistemas de manglar con diferentes condiciones medioambientales
-Ciénaga de Mallorquín y en la Bahía de Chengue-, teniendo en cuenta que estos
microorganismos podrían estimular el crecimiento vegetal de dichas plantas,
contribuyendo de este modo en los programas de reforestación, garantizando un
crecimiento mucho más efectivo.
Por consiguiente surge la siguiente inquietud: ¿Existen Microorganismos Endófitos
en plántulas de la especie Rhizophora mangle?
8
2. JUSTIFICACIÓN
Con este trabajo se iniciarán en la Universidad Libre
Seccional Barranquilla
proyectos de investigación relacionados con microbiología marina, siendo esta la
única universidad colombiana con un programa de microbiología que tiene
directamente un área de influencia sobre el patrimonio marítimo nacional,
pudiendo desarrollar bioprospección de recursos del litoral en Colombia como
estrategia de apropiación de la diversidad microbiana.
La innovación de esta investigación esta planteada teniendo en cuenta que a
nivel mundial no se han identificado microorganismos endófitos promotores de
crecimiento en plántulas de mangle, referenciándose hasta el momento endófitos
en café, caña de azúcar (Valero, 2000), arroz (Verma, 2001) y otros pastos,
donde estos microorganismos han resultado ser bastante promisorios como
estrategia de biofertilización, esto se debe a que se encuentran mejor protegidos
a las condiciones adversas del medio en relación a los rizosféricos y tienen un
contacto directo con la planta brindando beneficios a su hospedero – excreción de
fitohormonas y protección contra patógenos-, por este motivo es muy probable que
este fenómeno también se presente en plántulas de mangle (Muñoz-Rojas, 2000).
Teniendo en cuenta que en los ecosistemas de manglar las relaciones ecológicas
entre plantas y microorganismos son muy importantes, el hecho de contar con un
microorganismo endófito que promueva el crecimiento vegetal sería una ventaja
para el establecimiento de estas plántulas y muy conveniente para la producción
de biofertilizantes, que puedan suplir la deficiencia de nitrógeno que se presenta
en dichos ecosistemas (Holguín et al., 1992), y protegerlas de la tensión
ambiental; además los endófitos podrían ser utilizados en otros cultivos de interés
9
comercial (Galindo, 2006) o ser aplicados en suelos y ambientes donde otros
microorganismos no se adaptarían fácilmente.
En diferentes estudios realizados en países como México, USA, Brasil, entre otros,
se ha demostrado que el uso e introducción de bacterias promotoras de
crecimiento vegetal (BPCV) puede aumentar el desarrollo de plántulas de mangle
e incluso crear manglares artificiales en tierras húmedas. Se han realizado
inóculos para manglar con cianobacterias como M. chthonoplastes y BPCV como
Azospirillum sp. (Bashan y Holguín, 2002). Además, otros estudios revelan una
densa población de Azospirillum brasilense y A. halopraeferans colonizando las
raíces de A. germinans a cuatro días de la inoculación (Puente et al., 1999).
La aplicación de biofertilizantes puede contribuir a promover el crecimiento de
plántulas de mangle ya que en condiciones naturales su sobrevivencia es baja;
esto ha dado lugar a desarrollar programas de reforestación de ecosistemas de
manglar (Holguín et al., 1999). Para dichos programas en Colombia se han
utilizado principalmente plántulas de Rhizophora mangle, teniendo en cuenta que
esta especie tiene las tasas más altas de supervivencia y crecimiento frente a
otros géneros como Avicennia germinans y Laguncularia racemosa (Elster, 2000).
El aislamiento de microorganismos endófitos a partir de plantas de Rhizophora
mangle provenientes de ecosistemas con diferentes
ambientales
-salinidad-
nos
permitirían
proponer
condiciones medio
nuevos
productos
con
microorganismos capaces de adaptarse a manglares con parámetros medio
ambientales diversos; con el fin de comprobar lo anterior se seleccionaron para
este estudio la Ciénaga de Mallorquín que es un sistema estuarino y la Bahía de
Chengue la cual solo se ve influenciada por corrientes de agua marina.
La finalidad de esta investigación es proyectar la importancia de estos
microorganismos en el estimulo del crecimiento vegetal y su aporte nutricional,
promoviendo de este modo prácticas de bioprospección, encaminadas al estudio
10
de nuestra promisoria diversidad en un ecosistema como el manglar, donde los
estudios de ecología microbiana son escasos pero con alta potencialidad,
siguiendo lineamientos propuestos por el Plan Nacional de Bioprospección
Continental y Marina del Ministerio del Medio Ambiente (Melgarejo et al, 2003), ya
que si no se desarrollan nuevas tecnología de usos sostenibles que se puedan
utilizarse para la renovación de dichos ecosistemas pueden desaparecer,
afectando el equilibrio ecológico y la economía de las regiones aledañas.
11
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Estudiar microorganismos endófitos en plantas de Rhizophora mangle en dos
ecosistemas de manglar del Caribe Colombiano.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Desarrollar una metodología para el aislamiento de microorganismos endófitos
cultivables a partir de plantas de mangle.
 Identificar microorganismos endófitos presentes en diferentes órganos de
plantas de Rhizophora mangle.
 Comparar la diversidad de los grupos microbianos aislados de los dos
ecosistemas.
12
4. MARCO TEÓRICO
4.1. ECOSISTEMA DE MANGLAR
4.1.1. Generalidades.
Su nombre deriva de los árboles que los forman, los
mangles, el vocablo mangle de donde se deriva mangrove (en alemán, francés e
inglés) es originalmente guaraní y significa árbol retorcido. El manglar es un tipo
de ecosistema, formado por árboles que ocupan la zona intermareal de las costas
de latitudes tropicales, son biotopos tropicales y subtropicales anfibios, localizados
en la zona intermareal, de costas protegidas o poco expuestas, que reciben
periódicamente agua dulce por escorrentía y que resiste salinidades hasta de 40
mil ó 50 mil ppm (Prahl, 1990).
4.1.2. Importancia Y Función Ecológica. Los ecosistemas de manglar se
caracterizan por su alta producción y actividad en el lavado del suelo, generando
materia vegetal compuesta principalmente de hojas y madera en descomposición,
transformándose luego en detrito que puede ser transportado hacia el mar según
el flujo hídrico de la zona y posteriormente los organismos detritívoros lo
aprovechan y transfieren energía a los sistemas marinos a través de la cadena
trófica por esta razón se consideran eslabones de gran importancia en la cadena.
Entre otras funciones ecológicas tenemos que: son excelentes detoxificadores y
amortiguadores de inundaciones. (Sánchez-Páez, et.al.,2000b), desarrollan un
papel como evotranspiradores, actúan como sumideros naturales de CO 2, fuente
de materia orgánica e inorgánica, sirven de refugio, así como de sitios de
alimentación y anidación de diversas especies de mamíferos, aves, reptiles,
invertebrados y anfibios, muchos de estos son de gran importancia comercial.
13
Los manglares constituyen uno de los ecosistemas más frágiles, y por este motivo
su protección es prioritaria, garantizando, mediante su gestión integral, la
continuidad
de
la
utilización
de
los
recursos
forestales,
biológicos
e
hidrobiológicos. Adicionalmente, son formadores de suelos, protegen los litorales
de la erosión costera, dan sombrío en las playas y le ganan terreno al mar y
fijación de contaminantes en los sedimentos, el efecto de filtro de los bosques de
mangles protegen también los vitales arrecifes de coral y pastizales marinos del
daño por erosión, estrellas de mar y caracoles
4.1.3. Importancia Económica. En muchas partes del mundo, los mangles son
usados directamente en actividades comerciales de gran impacto, como la
producción de madera para construcción, leña, carbón, tanino, y muchos otros. En
algunos sitios, las frutas de los mangles son consumidas por humanos, y las hojas
son utilizadas en gran variedad de cocimientos, pociones, y como alimentación
para el ganado (Morton 1965). Debido a su ubicación, los manglares son
frecuentemente utilizados como sitios para establecer operaciones comerciales de
acuacultura y en México el 100% de la producción de camarones depende de la
existencia del manglar. Además el fruto de una de las especies de mangle
(Rhizophora mangle) se extrae jugo fermentado para producir una bebida
embriagante.
Cabe mencionar que el valor estético, de esparcimiento y turístico de los
manglares no se debe subestimar, ya que cerca de ellos es que ocurre el
fenómeno de las bahías o lagunas bioluminicentes. Estos sitios son muy
importantes para la navegación recreativa, la observación de vida silvestre, y el
simple esparcimiento.
14
4.2. ANÁLISIS DE LOS ECOSISTEMAS DE MANGLAR EN COLOMBIA
En Colombia los manglares ocupan una superficie aproximada de 380.634 ha de
las cuales 292.726 se encuentran en el litoral Pacífico y 87.908 en el Caribe. Los
aspectos relativos a la definición de estos ecosistemas, su importancia, así como
su estado y los principales tensores e impactos que los afectan, fueron
presentados en Informes del Estado de los Ambientes Marinos y Costeros en
Colombia correspondientes a los años 2001, 2002 y 2003. Debido a la ausencia
de cambios significativos en los temas citados, éstos se omiten en el informe
llevado a cabo en el año 2004 y solamente se incluyeron los avances realizados
por las CAR e Institutos de Investigación en los ecosistemas de manglares y de
guandales durante el 2004 (INVEMAR, 2004).
En el Caribe y Pacífico colombiano han incidido numerosas acciones antrópicas
que han generado deterioro y destrucción de los manglares entre las que se
encuentran la expansión turística, construcciones civiles y asentamientos urbanos,
drenajes y canalizaciones, construcción y operación de fincas camaroneras,
extracción intensiva de recursos maderables, expansión de áreas agrícolas y
ganaderas, y la disposición inadecuada de residuos industriales y domésticos.
Estos factores han generado la degradación de miles de hectáreas de manglar
con la consecuente disminución en la biodiversidad y recursos pesqueros,
formación de playones salinos y la sedimentación de los cuerpos de agua
(Sánchez-Páez et al., 1997; Sánchez-Páez et al., 2000).
Pese al creciente deterioro que presentan los ecosistemas de manglar, en la
actualidad continúan los esfuerzos por parte del Ministerio de Ambiente (MAVDT),
las CAR costeras, Universidades, Institutos de Investigación, empresas privadas,
las ONG y la participación de las comunidades locales e indígenas, para obtener
mayor conocimiento sobre estos ecosistemas costeros. Se han realizado estudios
sobre coberturas, atributos estructurales y funcionales, seguimiento para evaluar
15
posibles
impactos
por
obras
civiles,
así
como
también
acciones
interinstitucionales para su conservación, recuperación y uso racional a través de
la formulación y ejecución de los planes de manejo.
Desde enero de 2002 y hasta junio de 2004 se ejecutó el proyecto “Manejo
Sostenible y Restauración de los Manglares por Comunidades Locales del Caribe
de Colombia” que contó con el apoyo del Ministerio de Ambiente Vivienda y
Desarrollo Territorial, la Corporación Nacional de Investigación y Fomento Forestal
(CONIF), la Organización Internacional de Maderas Tropicales (OIMT), las
Corporaciones Autónomas Regionales convocadas (CORPOURABÁ, CVS,
CARSUCRE, CARDIQUE, INVEMAR y CORPAMAG) y la participación activa de
las comunidades locales. El Proyecto permitió dar respuesta a los planteamientos
de las comunidades locales (que dependen de estos ecosistemas), de las
entidades ambientales y del país, para desarrollar las acciones encaminadas al
manejo sostenible de los ecosistemas de manglar y a la restauración de las áreas
degradadas, y de esta forma contribuir al desarrollo de un sistema productivo y
sostenible desde los puntos de vista social, ecológico y económico (SánchezPáez et al., 2004). Como actividades relevantes se destacan la restauración de
450 ha de manglares deteriorados, para lo cual se restablecieron las condiciones
de flujos hídricos, se produjeron las plantas en viveros comunitarios y se
efectuaron las siembras. Además, se continuó con el estudio de la dinámica de
crecimiento de los mangles en las parcelas permanentes de crecimiento, se
capacitó a las comunidades locales en prácticas adecuadas de manejo de estos
bosque, se elaboró un plan de manejo integral de los manglares de la zona de uso
sostenible de la Bahía de Cispatá en colaboración con la CVS y las comunidades
locales, el cual comenzó a ejecutarse. Finalmente, se elaboró un plan de manejo
para los manglares de la Ciénaga de la Caimanera en Sucre con el apoyo de
CARSUCRE.
16
En el marco del Programa CARICOMP (Caribbean Coastal Marine Productivity
Program), el INVEMAR realiza anualmente el monitoreo de arrecifes coralinos,
pastos marinos y manglares en la Bahía de Chengue (Caribe colombiano). La
información obtenida durante el 2004 en las parcelas permanentes del bosque de
manglar indica que los atributos estructurales presentaron cambios poco
significativos. Se detectó un descenso en el promedio de la densidad de árboles,
debido a la muerte de algunos individuos en las parcelas evaluadas. Este hecho
ya se había registrado anteriormente y se atribuyó al impacto causado por las
termitas (Rodríguez-Ramírez y Garzón-Ferreira, 2003). En consecuencia, la
pérdida de estos árboles redujo el valor de otros atributos estructurales como el
área basal y la biomasa, sin embargo aparentemente no tuvo incidencia en la
productividad parcial del bosque, evaluada a través de la medición de la caída de
hojarasca, pues los valores obtenidos en octubre y noviembre de 2004 (3.2 y 4.6 2
g/m /día respectivamente), se hallan dentro del intervalo de variación registrado
entre 1995 y 2003. La continuidad del monitoreo permitirá evaluar si los cambios
observados indican algún proceso de deterioro en el manglar de Chengue
(INVEMAR, 2004).
Por otra parte en la Ciénaga de Mallorquín las plantas de mangle han sido
sometidas a una fuerte presión antrópica como la tala, debido a asentamientos
humanos subnormales especialmente en el margen oriental de la laguna y en la
desembocadura del arroyo León hacia la zona noroccidental de la ciénaga, a la
inadecuada
disposición
de
aguas
residuales,
al
aporte
de
sedimentos
provenientes del río Magdalena y en menor proporción de la cuenca del arroyo
Grande, debido a estos factores el ecosistema se encuentra en un alto grado de
deterioro ambiental. Como resultado en la zona, donde se concentra la mayor
extensión de manglares en el departamento, se han generado condiciones
extremas, como son largos periodos de sequía, alta evaporación, escaso
intercambio de agua dulce y marina, y altas concentraciones de salinidad, hasta el
punto que R. mangle, ha desaparecido casi en su totalidad, siendo reemplazado
17
por el mangle salado -A. germinans y L. racemosa- en la mayoría del área de la
ciénaga. En muchos sectores ya se evidencia la presencia de especies
colonizadoras como el trupillo, el aromo y algunas bromeleáceas, propias de
ambientes desérticos (Hidroestudios S.A.-ConCEP Ltda., 2003).
4.3. CARACTERÍSTICAS DE LAS PLANTAS DE MANGLE
Los Mangles son árboles o arbustos leñosos, que viven entre la zona de nivel de
mar media y la línea de las mareas altas de primavera en costas más o menos
estables donde forman comunidades conocidas como manglares (Hogarth, 1999).
Los mangles verdaderos tienen varias adaptaciones que los ayuda a prosperar en
esta zona que delimita la tierra y el mar incluyendo adaptaciones para anclaje en
sedimentos suaves, raíces respiratorias, mecanismos especializados para la
dispersión, y mecanismos especializados para lidiar con concentraciones
excesivas de sal. Los mangles son las únicas plantas verdaderamente vivíparas,
en las cuales las semillas se mantienen fijadas a la planta madre y germinan
formando un embrión ("propágulo") antes de caer del árbol.
Por lo general, los mangles se pueden caracterizar por los siguientes rasgos:
• Adaptaciones morfológicas, como raíces especializadas, que los adaptan a
su ambiente.
• Habilidad de excluir o filtrar sales.
• Las semillas germinan estando aún conectadas a la planta madre.
• Restringidos en distribución al ambiente de los manglares.
• Aislamiento taxonómico (no tienen parientes cercanos por lo menos al nivel
genérico).
18
Los mangles prosperan en costas protegidas con sedimentos finos donde la
temperatura promedio del mes más frío es mayor que 20°C. Muchos factores
influyen en el desarrollo de los manglares incluyendo componentes edáficos (de
los suelos), hidrográficos, químicos, geológicos, estocásticos (del azar), y
biológicos (Tomlinson 1986).
Se encuentra una amplia variedad de plantas de mangle, aproximadamente unas
54 especies pertenecientes a 20 géneros, encuadrados en 16 familias.
4.4. Rhizophora mangle (Mangle Rojo)
Pertenece a la familia
Rhizophoraceae, la cual cuenta con alrededor de 120
especies distribuidas en 16 géneros, siendo el género Rhizophora el mejor
conocido, dominando las partes más anegadas de los ecosistemas manglar.
4.4.1 Características Morfológicas. Los árboles de Rhizophora mangle son de 4
a 10 metros de alto, su forma es de árbol o arbusto perennifolio, halófilo, en el
tronco
se
encuentran
apoyadas
numerosas
raíces
aéreas
simples
o
dicotómicamente ramificadas con numerosas lenticelas, la corteza es de color
olivo pálido con manchas grises, sin embargo en el interior es de color rojizo, su
textura es de lisa a levemente rugosa con apariencia fibrosa. Las hojas son
simples, opuestas, pecioladas, de hoja redondeada, elípticas a oblongas, estas se
aglomeran en las puntas de las ramas, su color es verde oscuro en el haz y
amarillentas en el envés. Las flores son pequeñas, de 2.5 cm de diámetro con
cuatro sépalos lanceados, gruesos y coriáceos. La flor tiene cuatro pétalos
blancos amarillentos. Tiene de dos a cuatro flores por tallo o pedúnculo. Los frutos
se presentan en forma de baya de color pardo, coriácea, dura, piriforme, farinosa.
El desarrollo de las semillas se lleva a cabo en el interior del fruto por “viviparidad”,
19
los propágulos son frecuentemente curvos, de color verde a pardo en la parte
inferior y presentan numerosas lenticelas y por ultimo sus raíces son fúlcreas,
ramificadas, curvas y arqueadas.
Imagen 1. Corteza de Rhizophora
mangle
Imagen 3. Hojas de Rhizophora mangle
Imagen 2. Flores de Rhizophora mangle
20
4.4.2. Estrategias De Adaptación. Las zonas costeras en las cuales se localizan
los ecosistemas de manglar son consideradas sistemas muy dinámicos, motivo
por el cual las plantas allí situadas están sometidas a una serie de variables que
se encuentran en interacción constante, entre estas se pueden mencionar las
corrientes marinas, las mareas, los vientos, la
precipitación, el caudal y la
sedimentación de los ríos, entre otros. Con el fin de tolerar todas estas
condiciones a las cuales se encuentran expuestas, las plantas han desarrollado
ciertas estrategias de adaptación fisiológicas y anatómicas como
una marcada
tolerancia a las altas concentraciones de sal, adaptaciones para ocupar suelos
inestables, adaptaciones para intercambiar gases en sustratos
anaeróbicos y
embriones capaces de flotar que se dispersan transportados por el agua (Prahl,
1990).
 Tolerancia al agua salada
Todos los mangles excluyen alguna porción de sal cuando se absorbe el agua a
través de las raíces, otra parte se concentra al interior en el tejido de la planta,
variando las cantidades acumuladas de acuerdo a
cada especie. El mangle rojo
(Rhizophora mangle) deja entrar el agua con cantidades bajas de sal a través de
membranas situadas en las raíces, realizando filtraciones, ello se logra
manteniendo diferencias de presión negativas en el interior del tejido a través de
un proceso físico (Prahl, 1989).
 Desarrollo en suelos inestables
Rhizophora mangle es la especie que mejor está adaptada a esta situación por
poseer raíces en forma de zancos, lo que le permite estabilizarse sobre planos
lodosos, es común verlo a orillas de ciénagas, esteros o caños siempre
procurando aumentar su área radicular para
poder desarrollarse y colonizar
nuevos espacios; es el sistema radicular más conocido, ya que se distingue
una maraña de raíces difícil de sobrepasar.
21
por
Imagen 4. Raíces de Rhizophora mangle
 Intercambio de gases en sustratos anaeróbicos
Para superar la falta de oxígeno (anoxia) en el suelo las especies de árboles han
tomado distintos caminos evolutivos, en el caso de Rhizophora mangle posee en
sus raíces orificios llamados lenticelas, aberturas hidrófobas permeables al aire y
no al agua, los cuales se abren y se cierran de acuerdo al nivel de inundación
presente (Prahl, 1990).
 Embriones Capaces de flotar
Cuando se trata el tema de la reproducción es importante destacar que a
diferencia de las plantas terrestres típicas, Rhizophora mangle ha logrado que las
semillas antes de abandonar al árbol que la
produjo, realicen sobre éste el
proceso de germinación (vivíparismo), es decir, cuando las semillas son
despedidas inmediatamente después de encontrar condiciones de lechos
adecuados, las plántulas inician su crecimiento sin incurrir en azarosos procesos
germinativos, como si lo hacen las plantas de tierra firme, esta semilla es llamada
hipocótilo. La dificultad surge cuando en el medio existen sustancias nocivas, ya
22
que pueden ser destruidas fácilmente por no poseer estructuras externas que las
protejan como si ocurre con las plantas terrestres.
La capacidad de flotar es otro aspecto a destacar en los embriones ya que pueden
viajar por varios meses hasta colonizar nuevos lechos, esta condición les permite
dispersarse a grandes distancias sobre flujos de agua por acción del oleaje, las
mareas, inundación por desborde de los ríos y la precipitación.
Por otra parte estudios realizados demuestran que al momento de reforestar con
propágulos de esta especie de mangle, dichos embriones tienen las tasas mas
bajas de mortalidad en relación a los provenientes de las especies de Avicennia
germinans y Laguncularia racemosa (Elster, 2000), por este motivo Rhizophora
mangle es la especie de mangle más usada en la actualidad en programas de
reforestación.
Imagen 5. Propágulos de
Rhizophora mangle
23
4.5.
MICROBIOLOGÍA DEL MANGLAR
En la actualidad es bien conocido que aunque los ecosistemas de manglar son
ricos en materia orgánica, en general, son deficientes en nutrientes, especialmente
nitrógeno y fósforo (Sengupta y Chaudhuri, 1991; Holguín et al., 1992). No
obstante los manglares son altamente productivos, lo cual puede ser explicado por
un sistema de reciclaje de nutrientes en el que aquellos que son escasos son
retenidos y los nuevos son regenerados por descomposición de las hojas del
bosque (Alongi et al., 1993; Holguín et al., 1999).
En la transformación de nutrientes dentro del manglar se propone una relación
cíclica entre microorganismos – nutrientes – plantas como el principal mecanismo
de reciclaje y conservación de nutrientes. La alta productividad y diversidad de la
comunidad de microorganismos en los ecosistemas de manglar transforman
continuamente la necromasa en fuentes de nitrógeno, fósforo y otros elementos
que pueden ser utilizados por las plantas. Los exudados rizosféricos del manglar
son fuente de alimentación para los microorganismos en el ecosistema y generan
una gran red alimentaria (Holguín et al., 2001).
Los exudados rizosféricos del manglar promueven la actividad microbiana en
sedimentos, que sostienen los ecosistemas (Holguín et al., 1999). Mecanismos de
promoción del crecimiento están dados por la fijación biológica de nitrógeno y la
solubilización de fosfato, entre otros. La fijación biológica de N en el manglar es
considerable, con tasas que en algunos casos pueden proveer hasta un 40-60%
de los requerimientos de los mangles (Zuberer y Silver, 1978). Se han detectado
los procesos asociados a las hojas y raíces en descomposición, a la corteza de
árboles, a la rizósfera, sedimentos y raíces aéreas (Zuberer y Silver 1978). La
fijación de nitrógeno mediada por bacterias asociadas al sustrato, así como por
cianobacterias colonizadoras de raíces aéreas, cubre los requerimientos de los
24
manglares y desempeñan un importante papel en el mantenimiento y desarrollo
del ecosistema (Holguín, 1999).
Algunas de las más importantes
bacterias fijadoras de nitrógeno (BFN),
identificadas hasta ahora en ecosistemas terrestres, pertenecen a los géneros
Azospirillum, Azotobacter, Acetobacter, Rhizobium, Clostridium y Klebsiella. De
sedimentos
y rizósfera
de
Rhizophora
mangle,
Avicennia
germinans
y
Laguncularia racemosa han sido aisladas varias cepas de diazótrofos asociativos
como Vibrio campbelli, Listonella anguillarum, V. aestuarianus y Phyllobacterium
sp. (Holguín et al., 1992).
En la superficie de los neumatóforos de A. germinans se ha encontrado una gran
variedad de cianobacterias cuya distribución de colonización está dada por
diferentes afinidades de oxígeno. Las cianobacterias filamentosas como Lyngbya
sp y Oscillatoria sp colonizan la parte inferior de los neumatóforos. La porción
central es colonizada por Microcoleus sp y la parte superior por Aphanothece sp
(Toledo et al., 1995).
Se ha encontrado que la fijación biológica de N2 disminuye significativamente
durante el proceso de purificación de la cepa, debido a una necesaria interacción
de diferentes grupos bacterianos para mediar el proceso. La asociación con
Staphylococus sp (bacteria no fijadora de N) con la bacteria diazotrófica L.
anguillarum incrementó su tasa de fijación (Holguín et al., 1992).
La inoculación de A. germinans con la cianobacteria diazótrofa Microcoleus
chthonoplaste ha incrementado la actividad de fijación de N y su concentración
total. Esta asociación soporta el uso de M. chthonoplaste como inoculante para la
reforestación y rehabilitación de manglares parcial o totalmente destruidos
(Holguín et al., 2001).
25
En cuanto al proceso de solubilización de fosfatos, las fuentes de fósforo
provienen de la descomposición de residuos de plantas y animales que llegan al
mar, fosfatos de roca y otros insolubles de la roca nativa del subsuelo del mar e
inorgánicos insolubles de Na, K, Ca y Mg. La abundancia de cationes en aguas
marinas provoca la precipitación del fósforo del agua intersticial del manglar, que
se deposita en sedimentos e imposibilita su absorción por parte de las plantas. Los
fosfatos insolubles están sujetos a la acción de los microorganismos de una
manera directa. Los ácidos orgánicos e inorgánicos que producen los
microorganismos interactúan con los fosfatos insolubles, dando lugar a
compuestos solubles y asimilables por las plantas.
En la rizósfera existe una gran proporción de microorganismos solubilizadores de
fosfatos; los exudados radicales y detritos vegetales proveen el sustrato
energético para soportar la intensa actividad microbiológica característica de este
microhábitat y la energía necesaria para llevar a cabo la solubilización de fosfatos.
Holguín (1999) reporta el aislamiento de diferentes bacterias solubilizadoras de
fósforo a partir de A. germinans como Bacillus amyloliquefaciens, B. licheniformis,
Enterobacter aerogenes, E. taylorae, E. asbururiae y Kluyvera cryocrescens y dos
especies de bacterias solubilizadoras de fosfatos (BSP) en raíces de mangle
blanco Chryseomonas luteola y Pseudomonas stutzeri.
El inóculo con la mezcla de Phyllobacterium sp (diazótrofo) y Bacillus licheniformis
aislados de la rizósfera de mangle aumentó la fijación de N por parte de
Phyllobacterium sp de 160 mmol/colonia a 470mmol/colonia. La coinoculación de
plántulas de mangle con estas dos bacterias incrementó la incorporación de N en
las hojas, de 1,700 a 3,200  N15 (Holguín et al., 2001).
La inoculación con varias bacterias de la rizósfera de manglar a semillas de
Salicornia bigelovii (planta halófita de pantanos salados del norte de América)
26
aumentó su crecimiento de un 44-102 % en peso seco, en un 500% sus
contenidos de N y proteínas, y en un 94 % el contenido de ácidos grasos. Estas
bacterias incluyen a Vibrio aestuarianus (diazótrofo) con la bacteria solubilizadora
de fosfato (BSF) V. proteolycus y a Phylobacterium myrsinacearum (diazótrofo)
con BSF B. licheniformis (Bashan et al., 2000).
Dentro de las estrategias estudiadas para mejorar la propagación y crecimiento del
mangle, Kathiresan y Ravikumar (1995) concluyeron que el acodo aéreo y los
tratamientos hormonales con ácido indol acético y ácido indolbutírico pueden ser
aplicados en la propagación vegetativa del mangle. Sin embargo, la aplicación de
estas fitohormonas es costosa y en vez de la apicación directa, podría suplirse
indirectamente por la aplicación de microorganismos que las pueden producir por
metabolismo secundario.
En Colombia, una de las estrategias que se han estudiado para la reforestación de
manglares ha sido la aplicación exógena de poliaminas estimulando el crecimiento
vegetal y disminuyendo la fase de crecimiento lento en plántulas de R. mangle. La
aplicación de putrescina y espermina activó el crecimiento de las plántulas de
mangle e indujo cambios favorables en diferentes parámetros de desarrollo
(Mendoza, 2000), sin embargo los resultados no son contundentes y esta
estrategia también resulta costosa.
González et al. (1995) utilizaron el acodo aéreo como técnica para la repoblación
con mangle rojo logrando supervivencias del 64.4% y enraizamiento 80.2% de los
casos. No obstante la supervivencia de las plántulas fue nula al cabo de 40 días
de efectuado el transplante.
Otros estudios llevados a cabo en el país se han basado en la aplicación de
microorganismos aislados de rizósfera de manglar, con actividad fijadora de
nitrógeno (Aquaspirillum vinelandii) y solubilizadora de fosfatos (Penicillium sp.)
27
comprobada previamente in Vitro (Vanegas et al), sobre el crecimiento de
plántulas de mangle (A. germinans y R. mangle) y patilla (Citrullus vulgaris), en
dicho estudio se observó que la utilización de estas cepas causan un efecto
positivo de estimulación de crecimiento en las plantas tratadas con dichos
inoculantes, motivo por el cual los autores relacionan los resultados obtenidos con
el potencial biotecnológico de los inoculantes en procesos de restauración,
reforestación y uso como biofertilizantes (Vanegas y Galindo, 2006)
Por otra parte el proyecto manglares del Ministerio del Medio Ambiente de
Colombia obtuvo resultados satisfactorios con una tasa de supervivencia de
plántulas mayor del 70%, pero con un crecimiento lento (Ulloa et al.,1998) que, en
condiciones poco favorables (sedimentos inestables, la salinidad y las corrientes
marinas), contribuyen a una baja tasa de recuperación de manglares (McKee,
1993).
A pesar de todo lo anterior la diversidad y gran actividad microbiana y faunística,
aún inexploradas, que transforman y reciclan los nutrientes en el manglar se
conocen muy poco (Holguín et al., 2001).
4.6. MICROORGANISMOS ENDÓFITOS
4.6.1. Generalidades. La palabra endófito se deriva del griego endon, que
significa dentro y phyte que significa planta (Chanway, 1996). De Barry fue el
primero en utilizar este término, en el año 1866, al referirse a hongos viviendo
dentro de los tejidos de una planta (Petrini, 1986). A través de los años, diferentes
autores han propuesto definiciones más complejas, coincidiendo en que la
naturaleza endófita permite colonizar tejidos internos de plantas sin producir
signos visibles de enfermedad, aunque algunas veces pueden presentar un grado
de patogenicidad leve.
28
En cuanto a los hongos endófitos, en 1986, Carroll los describió como
endosimbiontes y excluyó los hongos patógenos y asociaciones micorrizas. Petrini
(1991) expandió esta definición e incluyó a los organismos con fases epifitas y
patógenos latentes que viven asintomáticamente, por algún tiempo, dentro de los
tejidos internos de la planta.
A pesar de lo anterior en la actualidad el término endófito se refiere a los hongos y
bacterias que durante todo o parte de su ciclo de vida viven sin causar daño en el
interior de células o tejidos de plantas superiores (Wilson, 1995); esto excluye las
asociaciones micorrícicas e incluye hongos con fases latentes antes del periodo
de infección y hongos que son patógenos conocidos pero que no expresan
síntomas en el tejido.
Los microorganismos endófitos suelen vivir en los espacios intercelulares y,
algunas veces, intracelularmente en hojas, tallos y flores, absorbiendo nutrientes
de la planta. En algunos casos, estos confieren beneficios a la planta que pueden
resultar mutuos: utilizan los nutrientes que sintetiza la planta y ésta se beneficia de
los metabolitos bioactivos que ellos producen, actividad que promete adelantos en
el área biotecnológica y en sistemas agrícolas. En gramíneas se ha demostrado
que brindan resistencia a herbívoros mediante la producción de metabolitos
secundarios que resultan tóxicos o reducen la palatabilidad para los organismos
que las consumen (insectos, mamíferos).
La diversidad y número de microorganismos en la rizósfera es muy grande, lo cual
ocasiona que en este ambiente exista una fuerte competencia por los nutrientes y
en consecuencia que su disponibilidad sea limitada. Sobre esta base se ha
considerado que los microorganismos endófitos podrían tener algunas ventajas
competitivas sobre los rizosféricos, ya que la disponibilidad de nutrientes es mayor
en el interior de las plantas y el número de microorganismos endófitos es menor
que el de los rizosféricos (James, 2000). Por otro lado, los microorganismos
29
endófitos se encuentran mejor protegidas que los rizosféricos de las condiciones
adversas que se presentan en el medio ambiente (Reinhold, 1998). Considerando
que los microorganismos endófitos se ubican en contacto íntimo con las plantas,
ellas podrían brindar beneficios más directos a su hospedero en comparación con
los rizosféricos. Por ejemplo, podrían excretar fitohormonas en el interior de las
plantas y/o protegerlas contra la acción de los fitopatógenos. La protección podría
ser a través de efectos antagónicos, debido a la producción de substancias que
inhiben el crecimiento de los patógenos (Muthukumarasamy, 2000) o bien, por el
desencadenamiento de una respuesta de defensa de la planta en contra de
patógenos inducida por el endófito, en forma similar a la que se observa con
algunas rizobacterias (Pieterse, 1999). Por otro lado, se ha sugerido que el interior
de las plantas es un ambiente propicio para que se lleve a cabo la fijación
biológica de nitrógeno (FBN), ya que este ambiente es bajo en oxígeno y
relativamente alto en fuentes de carbono, por lo que las bacterias diazótrofas
endófitas podrían fijar el nitrógeno y liberarlo directamente en el interior de las
plantas contribuyendo con una parte de los requerimientos nitrogenados de la
planta hospedera (Boddey, 1995).
Para el caso particular de los hongos endófitos, se dice que algunos de estos
también producen sustancias con propiedades insecticidas, antibacteriales,
antifúngicas y tóxicas a mamíferos (Siegel y Schardl, 1991). Estos compuestos se
pueden desarrollar como modelos investigativos, fuentes de nuevos metabolitos
para medicamentos y usos industriales, agentes de control biológico y
manipulación genética con fines biotecnológicos (Clay, 1989; Siegel y Schardl,
1991; Stone et al., 2000).
En plantas no gramíneas, aunque los hongos endófitos no se han relacionado con
un incremento en la resistencia a la herbivoría, en ocasiones pueden reducir la
incidencia y proteger a las plantas de infecciones causadas por microorganismos
patógenos; aunque muchos de ellos producen diversos metabolitos secundarios
30
bioactivos, sin embargo aún no se ha esclarecido su función exacta dentro de las
plantas.
Sridhar y Raviraja (1995) indican que el endofitismo podría ser una adaptación en
respuesta a la competencia por sustrato. Por otro lado, se sugiere que los hongos,
luego de vivir como endófitos, pueden actuar como saprófitos al iniciar los
procesos de senescencia en una planta (Petrini, 1991). Estudios como el de
Rodrigues (1996) confirman esta hipótesis debido a que la mayoría de los hongos
aislados como endófitos ya han sido reportados como saprófitos o patógenos de
otras especies de plantas. De igual manera, Schulz et al. (1998) corroboraron la
capacidad patogénica de hongos aislados inicialmente como endófitos.
Según investigaciones llevadas a cabo, todas las plantas de la tierra pueden ser
hospederos de al menos un hongo endófito (Petrini, 1986; Rodrigues, 1996) e
inclusive los endófitos han sido aislados de plantas acuáticas (Stone et al., 2000).
El mayor énfasis se le ha dado a plantas de las familias Coniferaceae, Ericaceae y
Gramineae en zonas templadas; pero también se han aislado endófitos de plantas
no vasculares y helechos (Dreyfuss y Petrini, 1984; Petrini, 1986). Sin embargo en
los últimos años se ha comenzado a estudiar la diversidad de hongos endófitos en
un amplio grupo de plantas en zonas tropicales.
4.6.2. Relaciones Simbióticas de los Hongos Endófitos. Los hongos endófitos
forman con sus hospederos relaciones simbióticas complejas, y en la actualidad
existe un gran número de interrogantes acerca del funcionamiento de esta
simbiosis. En primera instancia se desea saber qué beneficio recibe cada uno de
los participantes por estar involucrado en esta relación simbiótica.
En los trópicos no hay ningún ejemplo comprobado de mutualismo entre endófitos
y sus hospederos, pero se cree que sí hay casos. Existe un grupo de hongos
31
endófitos en pastos de las zonas templadas que les proveen protección contra
herbivoría y depredación de semillas mediante producción de toxinas. A cambio
reciben alimento, un lugar donde vivir y, en algunos casos, dispersión a través de
la semilla de su hospedero (Johnson et al., 1985; Clay, 1988; Knoch et al., 1993).
4.6.3. Mecanismo De Transmisión de los Hongos Endófitos. Petrini (1991)
propuso tres mecanismos que explican la llegada de hongos endófitos al tejido
vegetal:

Llegada e incorporación de esporas aerotransportadas.

Transmisión por semillas.

Esporas inoculadas por insectos directamente en las plantas.
El primer mecanismo, también conocido como transmisión horizontal, ocurre en la
mayoría de los casos, predominando en plantas leñosas donde el hongo
usualmente se dispersa mediante esporas (Carroll, 1990). La transmisión por
semillas ha sido ampliamente estudiada en gramíneas, donde los hongos se
transmiten entre generaciones a través de las semillas de la planta hospedera
(Carroll, 1986).
4.6.4. Efectos Fisiológicos de los Hongos en el Hospedero. Los hongos son
microorganismos con gran capacidad de influir el destino y la disponibilidad de los
nutrientes en un ecosistema (Lodge y Cantrell, 1995), por lo que es viable pensar
que su presencia tenga repercusiones fisiológicas en el hospedero. Por ejemplo,
las especies de endófitos pueden afectar diferencialmente la tasa de uso de
fotosintatos, ya que las especies varían en sus requerimientos y preferencias
nutritivas. Esto podría afectar al hospedero, al inducir agotamiento de ciertos
32
productos y/o acumulación de otros, de acuerdo con la presencia y/o dominancia
de ciertos endófitos.
Estudios indican que los hongos endófitos no afectan la tasa fotosintética de sus
hospederos naturales en el estadío de plántula (Gamboa-Gaitán et al., 2005b),
aunque recientemente se reporta el efecto negativo de los endófitos en plantas
tropicales de interés comercial (Rodrigues-Costa et al., 2000). Una publicación en
cebada, reporta el aumento de la tolerancia al estrés salino y de la resistencia a
enfermedades por parte de la planta gracias a la presencia de un endófito de raíz
(Waller et al., 2005). De otra parte, los hongos endófitos también producen
metabolitos secundarios que pueden proteger la planta contra herbívoros (Clay et
al., 1985; Clay, 1988). Si el recambio espaciotemporal de especies endófitas
modifica la calidad y/o cantidad de tales metabolitos, entonces es posible que el
hospedero tenga fluctuaciones temporales en la sensibilidad a herbívoros. La
importancia de este aspecto es innegable, al menos para la planta.
Desafortunadamente, no se sabe si la producción de toxinas in vivo alcanza
cantidades fisiológicamente activas (Lodge et al., 1996), por lo que en este campo
hay más especulaciones que datos reales, especialmente para especies
tropicales. Un aspecto interesante pero poco explorado, es el de la interacción
fisiológica de los miembros de esta simbiosis, la cual debe ser muy intensa dada la
asociación celular cercana. El tema es de tan crucial importancia para la existencia
de esta simbiosis, que se ha postulado recientemente que el estado fisiológico de
la planta determina si la relación será de carácter mutualista o parasítico (Redman
et al., 2001).
33
5.
MARCO ESPACIAL
Las áreas de estudio tomadas para la investigación se encuentran localizadas
en La Bahía de Chengue ubicada dentro del Parque Nacional Natural Tayrona,
a unos 14 km al nororiente de la ciudad de Santa Marta (Depto. Magdalena) y la
Ciénaga de Mallorquín situada en las áreas de jurisdicción de los municipios de
Barranquilla
y
Puerto
Colombia
en
34
el
Departamento
del
Atlántico.
6.
MARCO TEMPORAL
La presente investigación se llevará a cabo a partir del mes de Agosto de 2008 y
se espera culminar en Mayo de 2009.
35
7.
DISEÑO METODOLÓGICO
7.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN
 Empírica: ya que el método utilizado incluye operaciones prácticas y
experimentales.
 Aplicada: debido a que el fin que persigue es práctico y los conocimientos
obtenidos serán aplicados para la toma de decisiones.
 No experimental: ya que no se controlan variables, solo serán estudiadas o
analizadas en su situación normal.
 De Laboratorio: teniendo en cuenta que será llevada a cabo en un ambiente
cerrado y controlado.
 Exploratoria: ya que ya que se busca dar una visión aproximada de un tema.
 Descriptiva: debido a que estudia sucesos del presente.
36
8. METODOLOGÍA
8.1. ÁREA O ZONA DE ESTUDIO
8.1.1. Bahía de Chengue. La Bahía de Chengue hace parte del Parque Natural
Tayrona, situado 14 km al noreste de la ciudad de Santa Marta en la Costa Caribe
de Colombia; esta bahía se encuentra localizada en las siguientes coordenadas
11°20'N y 74°08'W y cuenta con una extensión de 3,3 km2.
Presenta el bosque manglar en mejor estado y con mayor cobertura de todo el
parque Tayrona, principalmente alrededor de la laguna sur, domina al borde una
franja R. mangle y al interior o en zonas mas estables se presenta A. germinans.
Tiene una marcada influencia marina, la salinidad promedio es de 37.5
(máximo=43.0; mínimo=29.0) (Rodríguez-Ramírez y Garzón-Ferreira, 2003) y
varía según las épocas climáticas y la ubicación en el sistema. En la laguna
durante la época seca se ha registrado una estratificación salina, según la cual la
salinidad tiende a ser menor hacia la boca que en las zonas interiores (Boca=38;
interior=42), y en los meses lluviosos se invierte el gradiente, pero las diferencias
son menores entre la boca y el interior (Boca=33-34, interior=32-33) (Álvarez-León
et al., 1995).
8.1.2. Cuenca Hidrográfica de la Ciénaga de Mallorquín. La cuenca de la
Ciénaga de Mallorquín se localiza en las siguientes coordenadas 74º52’ longitud
Oeste y 11º05’ latitud Norte, presenta una superficie aproximada de 296.2 Km 2,
cuya área de influencia esta definida a partir del nacimiento del arroyo Grande a la
altura de Pital de Megua del municipio de Baranoa, extendiéndose hacia el norte
hasta desembocar en el margen sur occidental de la ciénaga de Mallorquín.
37
En el costado noroccidental se encuentra un bosque maduro dominado por la
especie A. germinans entre la cual se mezclan algunos árboles de C. erectus y L.
racemosa. La regeneración natural de L. racemosa es abundante y hay algunas
plántulas de R. mangle y A. germinans.
En el costado sur existe un bosque monoespecífico de A. germinans poco
desarrollado, en los claros formados por tala o por la caída de los árboles viejos,
se encuentran plántulas de R. mangle, sobre todo en las zonas anegadas por las
aguas negras que ingresan al bosque desde los caseríos y barrios vecinos.
En el costado oriental se observa un playón bordeado por un cinturón de manglar,
compuesto exclusivamente por A. germinans. En la orilla de la ciénaga se
encuentra un borde de R. mangle de aproximadamente 10 metros de ancho.
Después de la franja de R. mangle, se observa un cinturón de árboles jóvenes de
L. racemosa; seguido a esta franja el bosque esta compuesto por A. germinans,
L. racemosa y C. erectus; y hacia el final del bosque crece un cinturón de R.
mangle. La salinidad promedio del ecosistema es de 20,6 ppm.
8.2. METODOLOGÍA DE MUESTREO
Se seleccionarán órganos vegetativos a partir de plantas de Rhizophora mangle;
solo se tendrán en cuenta aquellas plantas que no presenten sintomatología de
enfermedades -sin manchas foliares, clorosis, zonas necróticas, marchitez o
heridas-.
Entre las muestras de los órganos vegetativos a tomar se encuentran:
- Hojas.
- Tallos jóvenes
38
- Raíces
- Frutos (propágulos)
Se realizará un muestreo aleatorio, en el cual se tomarán las muestras a partir de
10 plantas diferentes, de las cuales a cada una se le tomará dos submuestras de
cada
órgano -hojas, tallos, raíces, propágulos- para obtener un total de 20
muestras por órgano, las cuales serán agrupadas por subgrupo, y al azar se
seleccionarán 10, cuatro de estas destinadas para el aislamiento de hongos y las
seis restantes para el aislamiento de bacterias.
Luego de haber recolectado todas las muestras se procede a sellarlas en bolsas
de plástico estériles para evitar la contaminación con el ambiente y se llevan al
laboratorio para ser procesadas en un periodo no mayor a 24-48 horas después
del muestreo.
8. 3. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
8.3.1. Prelavado (Bacon, 2002). Todas las muestras serán lavadas con buffer
salino, en el caso de las bacterias este será ajustado a pH de 7.2 y para el caso de
los hongos a un pH de 5.6.
8.3.2. Proceso de Esterilización Superficial para Muestras destinadas para el
Aislamiento de Hongos Endófitos (Bacon, 2002).
 Esterilización Superficial para Raíces, Propágulos y Tallos
Todo el material será sometido a una solución de Hipoclorito de Sodio al 5.25%
suplementada con 0,01% de Tween 20 por un periodo de 15 minutos, en un
shaker orbital con agitación constante. Luego del tiempo transcurrido durante la
39
esterilización, el material es sometido a lavados sucesivos con agua destilada
estéril.
 Esterilización Superficial para Hojas
Para esterilizar la superficie de estos órganos, se llevará a cabo el procedimiento
descrito anteriormente variando el tiempo de exposición a la solución a tan solo 35 minutos, después de los cuales las muestras serán sometidas a lavados
sucesivos con agua destilada estéril.
8.3.3. Proceso de Esterilización Superficial para Muestras destinadas para el
Aislamiento de Bacterias Endófitas (Bacon, 2002).
Inicialmente se lleva a cabo un lavado de todo el material con agua destilada
estéril y luego se sumerge en un buffer salino (pH 7) por 10 minutos para equilibrar
la presión osmótica y prevenir la difusión pasiva de los agentes esterilizantes al
interior de los tejidos.
 Esterilización Superficial para Raíces, Propágulos y Tallos
El material es inmerso en una solución de cloramina-t por un periodo de 1 hora,
luego se sumerge en un buffer fosfato 0.05M (pH 7) durante 30 minutos,
finalmente se llevan a cabo lavados sucesivos con agua destilada estéril.
 Esterilización Superficial para Hojas
Para esterilizar este material, se emplea una solución de cloramina-t al 1% en la
cual este es sumergido por un periodo de 30 minutos o bien se emplea una
solución de hipoclorito de sodio al 5.25% por 5 minutos. Luego se lava el material
con agua destilada estéril dejándolo en contacto con esta por 3 minutos.
40
Para el secado de todo el material se deja pasar unos minutos bajo la cabina de
flujo laminar o se seca sobre papel estéril.
Con el fin de comprobar la efectividad de cada uno de los procesos de
esterilización, se tomarán algunas partes después de realizado este proceso (sin
tener ningún tipo de corte) y se imprimirá el tejido sobre los diferentes medios de
cultivo con los cuales se va a trabajar.
8.4. PROTOCOLO DE AISLAMIENTO
8.4.1. Aislamiento de Hongos Endófitos por El Método Directo.
 Siembra de Muestras
Ya habiendo esterilizado cada una de las partes, se procede a realizar cortes en
ellas, con el fin de que al momento de sembrar en cada uno de los medios, los
hongos que se encuentren en el interior de la estructura vegetal migren hacia el
exterior de esta y se evidencie su crecimiento en medio de cultivo. Ese
procedimiento se llevará a cabo de manera distinta para cada uno de los órganos:
o Hojas
Se dividen en distintas partes y mediante técnicas asépticas se cortan en
secciones pequeñas (1-2 cm) entre la nervadura central y el borde de la hoja,
con el uso de un bisturí estéril (Ganley, 2006).
o Ramas
Inicialmente se realizará un corte longitudinal y luego uno transversal, con el
fin de obtener fragmentos de no más de 1cm de longitud.
41
o Raíces y Propágulos
Son cortados en pequeñas rodajas de no más de 5mm de grueso.
Luego de haber practicado los cortes, las muestras se sembrarán en Agar
Sabouraud
suplementado
con
antibióticos
-Cloranfenicol
0,05
mg/ml
y
Estreptomicina 0,05 mg/ml- para evitar el crecimiento bacteriano, y se incuba a
temperatura ambiente por un periodo de 2-8 semanas.
 Purificación de las Colonias e Identificación
A partir de los crecimientos obtenidos en las cajas se procede a aislar cada uno de
los morfotipos, realizando una resiembra en Agar PDA, para su posterior
identificación
mediante
claves
taxonómicas
y
el
empleo
de
pruebas
convencionales.
Los aislamientos obtenidos se conservarán en condiciones apropiadas con el fin
de mantenerlas como cepas de referencia.
8.4.2. Aislamiento De Bacterias Endófitas Aerobias y Anaerobias.
 Método Directo
Se realizarán cortes en el material vegetal de la misma manera que para el
aislamiento de hongos y las muestras serán sembradas en cajas con Agar
Nutritivo suplementado con 0.20% de cicloheximida y se incuba a 37ºC por un
periodo de 7 días. Para el caso de las bacterias anaerobias al agar se le
adicionará
0.01% de clorhidrato de cisteína y se incubará en condiciones de
anaerobiosis.
42
 Método de Diluciones
Solo se realizará una dilución, para ello se tomará 1gr de cada una de las
submuestras y por separado se homogenizarán en licuadora con 9ml de agua
peptonada 0.01% suplementada con 0.20% de cicloheximida. Para el caso de
aquellas muestras que serán destinadas para el asilamiento de bacterias endófitas
anaerobias, al diluyente se le adicionará 0.01% de clorhidrato de cisteína.
Se sembrarán alícuotas de 0.1ml de cada muestra en cajas con agar nutritivo
suplementado con 0.20% de cicloheximida y se incubará a 37ºC por un periodo
de 7 días. Para el caso de las bacterias anaerobias al agar se le adicionará 0.01%
de clorhidrato de cisteína y se incuba en condiciones de anaerobiosis.
 Purificación de las Colonias e Identificación
Después de haber observado crecimiento de las colonias durante las primeras
semanas, se procederá a realizar un recuento de las colonias obtenidas para cada
tipo de muestra, luego se procede a aislarlas a cajas de Petri con Agar Nutritivo,
para su posterior identificación mediante el empleo de pruebas bioquímicas
indicadas en Koneman (1987) para observar utilización de sustratos y con paneles
de detección rápida de microorganismos (API 20E, BBL Crystal). Los aislamientos
obtenidos se conservarán en condiciones apropiadas con el fin de mantenerlas
como cepas de referencia.
8.4.3. Aislamiento e Identificación de Bacterias Diazótrofas Endófitas.
 Siembra de Muestras
Se sembrarán alícuotas de 0.1ml de las diluciones realizadas para el aislamiento
de bacterias endófitas aerobias y anaerobias, en tubos con medio NFB semisólido
y se incuba en aerobiosis a una temperatura de 37ºC por un periodo de 7 días o
43
hasta observar en el medio de cultivo una película superficial o subsuperficial de
color amarillo a blanco (Döbereiner, 1994).
 Repique en el Mismo Medio.
Para el caso de aquellos tubos que hayan presentado formación de la película
característica, serán repicados en el mismo medio con la finalidad de agotar en lo
posible el nitrógeno que se pudiera agregar con la muestra al ser sembrada.
 Prueba de Reducción del Acetileno
Con el fin de confirmar la presencia de organismos diazótrofos con actividad
fijadora de nitrógeno se lleva a cabo el método indicado por Lozano (1998) para la
comprobación de la actividad nitrogenasa de forma indirecta a través de la
reducción del acetileno a etileno, utilizando cromatografía de gas en medios
sembrados con aquellas bacterias que presentaron crecimiento con formación de
película característica. El ensayo será realizado en un Cromatógrafo Gases
SHIMADZU GC-2014 con una columna Porapak N 80/100 (Porapak T.).
 Aislamiento de Colonias
A partir de réplicas de los tubos con actividad nitrogenasa positiva se hace una
siembra en estriado en el mismo medio de cultivo selectivo pero sólido el cual es
suplementado con extracto de levadura que promueve el crecimiento; según
Dobereiner (1980) en este paso debido a las condiciones de incubación aeróbica
los microorganismos microaerofílicos no pueden fijar su propio nitrógeno por lo
tanto una fuente de nitrógeno combinado (extracto de levadura) asegura la
supervivencia de microorganismos que en condiciones de aerobiosis no tienen
mecanismos adecuados de protección de la nitrogenasa.
44
Se identifican los diferentes tipos de colonias y se pasan nuevamente al medio de
cultivo semisólido con el fin de conocer cuales son los responsables de la
formación de la película característica, las cuales se seleccionarán para su
purificación.
 Purificación de Colonias e Identificación
Se lleva a cabo un aislamiento de cada una de las colonias obtenidas en Agar
papa (AP), para su posterior identificación mediante el empleo de pruebas
bioquímicas indicadas en Koneman (1987) para observar utilización de sustratos y
con paneles de detección rápida de microorganismos (API 20E, BBL Crystal). Los
aislamientos obtenidos se conservarán en condiciones apropiadas con el fin de
mantenerlas como cepas de referencia.
45
9. PRESUPUESTO
Descripción
Valor en Pesos
Personal
5.760.000
Equipos de Uso propio (cuantificación-10%)
10.000.000
Salidas de Campo
2.000.000
Materiales y Suministros
6.710.000
Servicios Técnicos y Mantenimiento
1.000.000
Bibliografía
500.000
TOTAL
25.970.000
46
10. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Meses
Actividades
1
2
Muestreo en campo
Aislamiento de Hongos Endófitos
Identificación de Hongos Endófitos
Aislamiento de Bacterias Endófitas
Identificación de Bacterias Endófitas
Aislamiento de Bacterias Endófitas
Diazótrofas
Identificación de Bacterias Endófitas
Diazótrofas
Estandarización de la actividad de la
nitrogenasa (Cromatografía de gases).
Evaluación de la actividad nitrogenasa
Análisis de datos
Conservación y mantenimiento de cepas
Entrega de informes
47
3
4
5
6
7
8
9
10
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58
ANEXOS
ANEXO 1
Localización y distribución de las formaciones de manglar de la Bahía de Chengue.
59
ANEXO 2
Localización de la cuenca Hidrológica de Mallorquín con la red
hídrica. Fuente: CI (2005).
60