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ACTAS DE HORTICULTURA Nº 60
Acortamiento del ciclo generacional en pimiento mediante el cultivo de
embriones inmaduros
J. P. Manzur, A. Rodríguez-Burruezo, F. Nuez
Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana, Universitat Politècnica de València,
Camino de vera, sn, CP 46022 Valencia, España.
Palabras claves: Capsicum annuum L., programas de mejora, cultivo in vitro,
embriones cigóticos.
Resumen
Aunque el cultivo in vitro de embriones inmaduros ha estado enfocado
fundamentalmente al rescate de embriones interespecíficos para sortear barreras
de incompatibilidad postcigóticas (aborto), existe otra aplicación, menos estudiada
en hortícolas, consistente en acortar el ciclo generacional y, en consecuencia,
reducir la duración de los programas de mejora. El objetivo del presente estudio
consistió en estimar el avance que aporta el cultivo in vitro de embriones
inmaduros en pimiento (Capsicum annuum). Para ello, se autofecundaron flores de
pimiento “California wonder” en el otoño-invierno 2010/11. Una parte de los
frutos se cosechó 40 días tras la polinización, extrayendo embriones inmaduros, en
estadíos torpedo y cotiledonar, cultivándolos en un medio artificial. Tras emitir las
raíces y alcanzar un tamaño suficiente se trasplantaron a maceta. En paralelo, el
resto de frutos se dejó en la planta hasta alcanzar la madurez fisiológica, necesaria
para asegurar una buena germinación, extrayendo las semillas y sembrándolas,
siguiendo el protocolo habitual. Para ambos bloques de plantas se registró la fecha
de floración, como medida objetiva del inicio de la siguiente generación, logrando
un avance superior a 60 días en el ciclo generacional mediante el cultivo in vitro de
embriones. Estos resultados confirman que esta técnica sería de gran utilidad para
acortar programas de mejora en pimiento, alcanzando hasta una generación más
al año.
INTRODUCCIÓN
El cultivo de pimientos, chiles y ajíes (Capsicum spp.) está extendido
prácticamente en todo el mundo. Esta solanácea cuenta a nivel mundial con 1,9 millones
de hectáreas cultivadas y una producción cercana a 30 millones de toneladas, ocupando
el séptimo puesto entre las hortalizas (FAO, 2009). Este hecho, junto a su diversidad de
usos (como hortícola y especia), lo sitúan como uno de los productos vegetales
hortícolas de mayor importancia económica. Además su importancia se encuentra en
continuo crecimiento, pues la superficie destinada a su cultivo se incrementa año tras
año.
El cultivo de embriones de plantas se utilizó por primera vez hace más de un
siglo por Hanning (1904), consiguiendo aislar y cultivar embriones maduros de dos
crucíferas (Cochleira y Raphanus) en un medio estéril con sales minerales e hidratos de
carbono. Desde entonces, las aplicaciones dadas a esta técnica han sido diversas. La más
utilizada y estudiada ha sido el rescate de embriones interespecíficos, que permite
transferir genes entre especies e incluso géneros, cuya cruzabilidad se ve afectada por la
incompatibilidad postcigótica del aborto embrionario (Laibach, 1929). Sin embargo, el
cultivo de embriones posee otras aplicaciones de interés agrícola entre las que destacan:
i) superar latencia en semillas, ii) germinar semillas de especies estériles, iii) facilitar la
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micropropagación clonal y transformación genética y iv) acelerar programas de mejora,
al acortar el ciclo generacional de cultivo. En lo que se refiere a esta última aplicación,
la técnica ha sido exitosa en diversos cultivos. En Rosa, que requiere un año para la
floración, utilizando esta técnica se han alcanzado hasta dos ciclos anuales (Asen,
1948). En girasol, cuya semilla requiere más de la mitad del ciclo generacional (120150 días) para madurar, se ha conseguido hasta 4 generaciones por año (Alissa et al.,
1986). En Vigna y guisante, que de modo convencional sólo se logran dos generaciones,
ha sido posible conseguir cuatro y seis generaciones al año, respectivamente (Ochatt et
al., 2002).
En el caso del pimiento, sus frutos requieren alcanzar la madurez fisiológica para
disponer de semillas viables y, en muchos casos, este período se puede extender varios
meses. Así, dentro de un programa convencional de mejora en pimiento, el ciclo
generacional (desde la siembra a la extracción de semilla madura) requiere 6-7 meses en
temporada otoño-invierno. Por ello, el cultivo de embriones inmaduros in vitro en
Capsicum se presenta como una herramienta potencial, que podría evitar la espera de la
maduración del fruto. Ello reduciría el tiempo generacional y aceleraría el programa de
mejora, reduciendo los costos para las empresas productoras de semillas, las cuales
suelen contar con una unidad de cultivo in vitro con los dispositivos y herramientas
necesarios para aplicar esta técnica. Este estudio tiene como objetivo valorar la utilidad
del cultivo in vitro de embriones inmaduros de pimiento para este fin. Para ello, se
cuantificó y comparó el tiempo necesario para completar una generación, en temporada
otoño-invierno, entre el método convencional de la siembra de semillas proveniente de
frutos maduros frente a la siembra in vitro de embriones procedentes de frutos
inmaduros.
MATERIAL Y MÉTODOS
El material vegetal utilizado en este estudio fue una accesión de pimiento
perteneciente al tipo varietal California Wonder de fruto rojo (C. annuum) conservado
en el Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana (COMAV).
La siembra se realizó en julio de 2010 y el transplante, cuando las plantas presentaban
4-5 hojas verdaderas, en septiembre de 2010 en invernaderos de la Universidad
Politécnica de Valencia (UPV, Campus de Vera). Iniciada la emisión de botones florales
(noviembre 2010), éstos se embolsaron en los días previos a la antesis para asegurar la
autofecundación. Los frutos cuajados (diciembre 2010) fueron divididos en dos bloques.
En el primero (bloque I o control), se siguió el procedimiento habitual. Para ello, se
dejaron madurar completamente tres frutos para extraer y secar sus semillas (4-5 días),
sembrándolas (45 en total, 15 por fruto) en una cámara de crecimiento (25 ºC, humedad
relativa del 70% y fotoperíodo 16/8 h) y, posteriormente, transferirlas al invernadero,
para registrar el momento en que cada planta de esta nueva generación presentase tres
flores, considerado el inicio de una nueva generación/ciclo. En el segundo (bloque II),
otros tres frutos se cosecharon inmaduros a los 40-45 días tras polinización (DTP),
momento óptimo para disponer de abundantes embriones inmaduros avanzados (torpedo
y cotiledonar) y cuya buena germinación en medio estéril ha sido constatada
previamente (Manzur et al., 2010). El medio utilizado para cultivar los embriones
contenía sales minerales MS con vitaminas (4,4 g.L-1), sacarosa (80 g.L-1), agar (7 g.L-1)
y pH 5,7. Las condiciones de cultivo en cámara fueron 30 días a 25 ºC, humedad
relativa del 70% y fotoperíodo 16/8 h. luz/oscuridad. Posteriormente, las plántulas se
transfirieron a sustrato y se les dio un periodo de aclimatación de siete días. Finalmente
se trasplantaron a macetas y se pusieron en las mismas condiciones que el bloque I,
esperando registrar la fecha de aparición de tres flores. Para este bloque se empleó un
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diseño experimental en embriones inmaduros similar al del bloque I (total de 45,
siembra de 15 embriones/fruto).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La cosecha del bloque I se realizó, en promedio, a los 120 DTP (marzo de 2011),
mientras que la del bloque II a los 44 DTP (diciembre de 2010). Esta diferencia de días
se mantuvo prácticamente constante durante toda la segunda generación. La
germinación en ambos casos requirió alrededor de 15 días. Las plántulas alcanzaron el
desarrollo óptimo para traspaso a maceta (4-5 hojas verdaderas) a los 160 y 100 DTP
para los bloque I y II, respectivamente (Figura 1). La floración de las tres plantas
(segunda generación) provenientes de semillas de los tres frutos (primera generación)
no tuvo grandes diferencias dentro del bloque (datos no mostrados), sin embargo entre
los bloques existió una clara diferencia. El bloque convencional (bloque I) tardó en
promedio 195 DTP en completar el ciclo, mientras que el bloque utilizando cultivo de
embrión sólo tardó 130 DTP (Figuras 1 y 2). En ambos bloques se observa que desde la
siembra a la germinación y desde el traspaso a maceta a la floración, el desarrollo de las
plantas se comporta de modo similar (pendientes similares), sin embargo desde la
germinación al traspaso a maceta el bloque II requirió unos días más para alcanzar las 45 hojas verdaderas. Esto podría deberse a que el embrión germinado in vitro está
inmaduro, por lo que requiere más tiempo en igualar su desarrollo con la planta
proveniente de semilla madura (Figura 1). Así, el desarrollo de las plantas provenientes
del cultivo de embrión no tuvo grandes diferencias con las plantas obtenidas del modo
convencional.
Los 66 días de diferencias logrados mediante el cultivo in vitro de embriones
permite reducir una generación de pimiento de 6,5 a 4,5 meses en temporada otoñoinvierno. Dado que en el ciclo primavera-verano el desarrollo vegetal es más rápido, la
utilización de esta técnica permitirá a los mejoradores alcanzar 3 generaciones al año.
Además, aunque en muchos vegetales emplear esta técnica conlleva la obtención de
individuos débiles, incapaces de completar su desarrollo (germinación precoz), en el
caso del pimiento todas las plantas presentaron una morfología y fertilidad normales
(Figura 2).
Otra ventaja de esta técnica fue una mayor tasa de germinación frente al método
convencional. Así en el bloque I el porcentaje de germinación medio fue del 33%,
mientras que en el bloque II alcanzó un 72% (datos no mostrados). Esto se debe,
probablemente, a que el embrión del bloque I se desarrolló en el fruto durante los meses
de invierno, por lo que las bajas temperaturas podrían haber afectado su viabilidad. Este
estudio demuestra que el cultivo de embriones en pimiento permite acortar el ciclo
generacional, acelerando los programas de mejora para las empresas productoras de
semillas al obtener un mayor número de ciclos por año.
Referencias
Alissa, A., Jonard, R., Serieys, H. et Vincourt, P. 1986. La culture d'embryons isolés in
vitro dans un programme d'amelioration du tournesol. CR Acad Sci Paris 302:161-164.
Asen, S. 1948. Embryo culture of rose seeds. Am. Rose Annual 33:151-153.
FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations). 2009. Base de datos
estadísticos. http://faostat.fao.org. Fecha de consulta: 17 de agosto de 2011.
Hannig, E. 1904. Zur physiologie pflanzlicher embryonen. I. Ueber die cultur von
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Laibach, F. 1929. Ectogenesis in plants. Jour. Hered. 20:201-208.
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Manzur, J.P., Herraiz, J., Rodríguez-Burruezo, A., and Nuez, F. 2010. Evaluation of
response to in vitro embryo rescue in Capsicum spp. Proceedings of the XIV TH
EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum & Eggplant. Valencia,
30 aug -1 sept. p. 397-402.
Ochatt, S. J., Sangwan, R. S., Marget, P., Assoumou Ndong Y., and Rancillac M. 2002.
New approaches towards the shortening of generation cycles for faster breeding of
protein legumes. Plant Breed. 121:436-440.
Fig. 1. Parámetros evaluados medidos en días tras polinización (DTP; las barras señalan
el error típico) comparando los dos bloques en estudio.
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Fig. 2. Esquema comparativo del ciclo generacional convencional (195 DTP) y del
modificado mediante el cultivo de embriones inmaduros (130 DTP).
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