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PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 CODIGO FECHA DE EMISIÓN P-SA-78 27/05/2016 VERSIÓN PÁGINA 01 Página 1 de 12 PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 ELABORÓ REFERENTE DE LABORATORIO REPRESENTANTE DE CALIDAD DIRECTOR (S) TECNICO (S) REVISÓ SECRETARIO DE SALUD APROBÓ REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 CODIGO FECHA DE EMISIÓN VERSIÓN PÁGINA 1 P-SA-78 27/05/2016 01 Página 2 de 12 OBJETIVO Describir la Técnica de Aislamiento y recuento de Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva para detectar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) en análisis microbiológico en alimentos de consumo humano. 2 ALCANCE El procedimiento técnico de Aislamiento y recuento de Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva en Alimentos de consumo humano, aplica a todas las muestras para análisis microbiológico que son recepcionadas y analizados en Laboratorio de Salud Pública 3 DEFINICIONES Staphylococcus aureus: enterotoxigénico es un microorganismo que se encuentra frecuentemente en alimentos crudos o cocidos de origen animal, especialmente en aquellos que requieren manipulación directa para su preparación, como es el caso de los alimentos preparados no industriales. Unidades formadoras de colonias (UFC): Término que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa. Recuento en Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el método de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las características del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable formará una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente más diluidas de la muestra. 4. RESPONSABLES Será responsabilidad del profesional asignado a la sección del Análisis Microbiológico de Alimentos, del Laboratorio Departamental de Salud Pública del Meta cumplir con los lineamientos establecidos en este documento, sin hacer ningún cambio que no esté debidamente documentado y autorizado y se ejecutara según cronograma de análisis de muestras. 5. GENERALIDADES 5.1 Taxonomía y morfología PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 CODIGO FECHA DE EMISIÓN VERSIÓN PÁGINA P-SA-78 27/05/2016 01 Página 3 de 12 El género Staphylococcus, pertenece a phylum Firmicutes, clase III Bacilli, orden I 18 especies de Staphylococcus, han sido reportadas de importancia en alimentos, siendo S. aureus la más relevante y siendo ésta indicadora de contaminación por manipulación inadecuada. S aureus es una bacteria con morfología microscópica típica de cocos Gram positivos agrupados en racimos de tamaño entre 0,5 a 1,5 μm, no esporulada (asporógena) e inmóvil. Es organótrofa, catalasa positiva, con un contenido de G+C en la composición del ADN de 30 a 40% Por lo general, las cepas productoras de coagulasa son termonucleasa positiva. Es una bacteria ubicua y patógena que puede causar intoxicación alimentaria. 5.2 Fisiología Staphylococcus aureus es una bacteria mesófila aerobia facultativa capaz de crecer en amplios rangos de pH y aw. Es uno de los patógenos humanos asporógenos más resistente a condiciones ambientales adversas, logrando persistir a temperaturas de congelación y descongelación. Las concentraciones máximas de sal que permiten el crecimiento dependen de factores como: temperatura, pH, potencial redox, entre otros. (Ver tabla 6). 6. Tabla 6. Parámetros de crecimiento de S. aureus. Parámetros Crecimiento de S. aureus Óptimo Temperatura (°C) pH aw 0,90 - > 0,992 NaCl (%) Potencial redox (Eh) (mV) Atmósfera Rango 37 6-7 0,98 7 - 48 4 - 10 0,83 - > 0,991 0 > + 200 Aerobia 0 - 20 < - 200 - > + 200 Anaerobia REFERENCIAS Manual de técnicas de análisis para control de calidad microbiológico de alimentos para consumo humano. INVIMA 7. 7.1 DESARROLLO FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus, consiste en los siguientes pasos: Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo sólido, el cual inhibe el desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus, pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado. PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 CODIGO FECHA DE EMISIÓN VERSIÓN PÁGINA P-SA-78 27/05/2016 01 Página 4 de 12 Recuperación de la cepa, este paso permite restaurar las células dañadas de Staphylococcus aureus. Identificación bioquímica, en este punto se identifica el género y especie de Staphylococcus aureus enterotoxigénico. 7.1.1 Agar Base Baird Parker: Medio de alta especificidad diagnóstica, selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. El fundamento del medio de cultivo preparado y completo la peptona y el extracto de carne constituyen la fuente de carbono y nitrógeno, el extracto de levadura aporta vitaminas del complejo B, la glicina y el piruvato estimulan el crecimiento de los estafilococos. Este medio de cultivo es selectivo y diferencial debido al telurito de potasio y al cloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora acompañante. La yema de huevo permite demostrar la actividad lecitinásica. Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y originan colonias de color grisáceo-negro, y dan reacción sobre la yema de huevo produciendo alrededor de la colonia una zona opaca que a menudo tiene una zona clara más externa. Se pueden encontrar cepas no lipolíticas, que presentan igual características de colonias pero sin la zona opaca y clara. Se debe confirmar la presencia de S. aureus mediante pruebas bioquímicas. 7.2 MATERIALES Tener en cuenta los materiales e insumos para la preparación de la muestra se realizara conforme al P-SA—83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano. 7.2.1 Equipos Incubadora a 35°C ±1°C Asas estériles desechables o varillas de hockey Tubos Estériles 7.2.2 Medios de cultivo y reactivos PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 CODIGO FECHA DE EMISIÓN VERSIÓN PÁGINA P-SA-78 27/05/2016 01 Página 5 de 12 Agar Baird Parker Solución de Yema de huevo más Telurito Plasma de Conejo Caldo BHI 7.2.3 Cepas de Referencia Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 7.3 PROCEDIMIENTO 7.3.1 Controles y o curvas de calibración Control Positivo: A partir de una siembra de Staphylococcus aureus ATCC 25923 sembrado en Agar TSAYE, Agar Pate Count o Agar Nutritivo, se toma una porción de la colonia con la ayuda de un asa estéril y se siembra sobre el agar Baird Parker Invertir las placas e incubarlas a 35°C +/- 1°C durante 24 - 48 horas. Control Negativo: A partir de una siembra de Bacillus cereus ATCC 11778 sembrado en Agar TSAYE, Agar Pate Count o Agar Nutritivo, donde se toma una porción de la colonia con la ayuda de un asa estéril y se siembra sobre el agar Baird Parker Invertir las placas e incubarlas a 35°C +/- 1°C durante 24 - 48 horas. 7.3.2 Condiciones Ambientales y manejo de equipos Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano. 7.4 Preparación de la Muestra Dejar secar la superficie de la placa preparada con anterioridad, con la tapa hacia arriba dentro de la cabina de flujo laminar. Marcar la base de la caja de petri que contiene el medio de cultivo Baird Parker con los 4 últimos números del consecutivo asignado en el momento de la recepción de la muestra. De la siguiente manera: XXXX XXXX PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 CODIGO FECHA DE EMISIÓN 27/05/2016 VERSIÓN PÁGINA 7.5 P-SA-78 01 Página 6 de 12 Descripción del Método Este procedimiento tiene como fundamento inocular diluciones decimales de la muestra en agar Baird Parker, mediante método de extensión en superficie, e incubar a 35 ±1°C/ 24 – 48 horas. En condiciones asépticas, pesar 10g de muestra y depositarla en 90mL de Agua peptonada al 0,1% de diluyente, (dilución1:10) Homogenizar (stomacher) durante 30 segundos. Conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano. Sembrar en superficie y en duplicado 0,1 ml (100µl) de la dilución de la muestra a analizar en placas de agar Baird Parker y extender con varilla de hockey o asa redonda estéril desechable. Diseminar el inóculo con asa redonda desechables estéril o varillas de hockey estéril por toda la superficie del agar. Tapar las cajas y colocarlas invertidas en la incubar de 35°C ± 1°C / 24 - 48 horas. Observar las placas a las 24 horas y si la reacción no es clara dejar por 24 horas adicionales. 7.5.1 Lectura PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 CODIGO FECHA DE EMISIÓN P-SA-78 27/05/2016 VERSIÓN PÁGINA 01 Página 7 de 12 7.5.1.1 Macroscópica Medio de Cultivo Imagen Características Agar Baird Parked Merck Colonias negras con borde incoloro, convexas, rodeadas de una zona opaca, con una zona clara externa. Agar Baird Parked Oxoid Gris-negro brillante convexa diámetro de 1-1,5 mm (18 horas) hasta 3 mm (48 horas) estrecho margen entero blanca rodeada por zonas clara de 2-5mm 7.5.1.2 Microscopio Preparar una tinción de Gram y observar microscópicamente: cocos gram positivos dispuestos en racimos. 7.5.2 Confirmación Colonias de Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva Esta prueba bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa. La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus toxigénico en esta prueba es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva. 7.5.2.1 Recuperación de la Cepa Con ayuda del cuadro del Item 7.5.1.1, determinar el número de colonias a evaluar, tomando en cuenta el número de colonias típicas de S. aureus obtenidas en el agar Baird-Parker: Así mismo seleccionar las colonias para realizar la prueba cuantitativas coagulasa. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas, que son características de este microorganismo, utilizando asa desechable recta estéril, en caldo infusión cerebro corazón. Incubar a 35 ± 1° C durante 24 horas. PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 CODIGO FECHA DE EMISIÓN P-SA-78 27/05/2016 VERSIÓN PÁGINA 01 Página 8 de 12 Inocular e incubar en la misma forma, cepas tipo de S. aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922 respectivamente de las pruebas bioquímicas. 7.5.2.2 Prueba de la Presencia de la enzima coagulasa En un tubo de ensayo estéril adicionar 0.2ml de la suspensión del microorganismo que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón, adicionar 0.2 mL de plasma de conejo. Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen según las especificaciones del fabricante. Incubar en incubadora, entre 35º±1°C y observar durante 3 horas. En intervalos de 1 hora. 7.5.3 Cálculos Nota: el factor de dilución es 10 veces mayor, debido a que solamente se inoculó 0.1 ml de cada dilución, en lugar de 1ml. Para realizar el cálculo, aplicar la siguiente fórmula: Colonias positivas* N. de la dilución ____________________________________ Colonias examinadas Ejemplo: 10-2: 6 colonias Colonias examinadas: Colonias positivas: = 600 =3 600 x2 = 400ufc/g ó mL =2 3 7.5.4 Expresión de Resultados El resultado se expresa en ufc de Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva por gr o ml de producto analizado según corresponda Ausencia de colonias, expresar el resultado como: Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva <100ufc/g ó mL PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 CODIGO FECHA DE EMISIÓN VERSIÓN PÁGINA 8. P-SA-78 27/05/2016 01 Página 9 de 12 VERIFICACIONES 8.1 Aseguramiento de Calidad Resultados Para comprobar la capacidad del laboratorio de detectar Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva con el método técnico de Aislamiento y Recuento, realizar los siguientes controles con material de Referencia y analizados en las mismas condiciones que la muestra. Para cada cepa bacteriana (Empleada como control), tome una colonia con una asa de siembra estéril e inoculo en una caja del medio selectivo utilizado una muestra (actividad 7.5) Medio de Cultivo Control Imagen Control Positivo Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva ATCC 25923 Agar Baird Parker Control Negativo Escherichia coli ATCC 25922 Registrar en los formatos F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos F-SA-34 Control Interno de Equipos F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos. F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 CODIGO P-SA-78 FECHA DE EMISIÓN VERSIÓN PÁGINA 27/05/2016 01 Página 10 de 12 Criterio de Aceptación o Rechazo RANGO DE ACEPTACION CRECIMIENTO CRITERIO LECTURA Control Positivo Staphylococcus aureus ATCC 25923 Colonias negras con borde incoloro, convexas, rodeadas de una zona opaca, con una zona clara externa. Control Negativo Escherichia ATCC 25922 ACCION PARA INCUMPLIMIENTO DE CRITERIOS Repetir Análisis Verificar. Inhibido Repetir siembra de cepas ATCC y repetir el Análisis coli Verificar el Crecimiento en el Masivo Reactivos vigentes Temperaturas de Incubadoras Mantenimiento de equipos Control de Esterilización de Material control Positivo Vigencia del reactivo dentro de la fecha Temperatura ajusta a 35 +/- 1 ºC Calibración, verificación mantenimiento vigente y Verificar la fecha de esterilización de Material, verificar el cumplimiento de los controles de esterilización. Reactivo Vigente a fecha de utilización la Descartar Reactivos y adquirir y procesar con reactivos en fechas vigentes Temperatura 35 +/- 1 ºC Ajustar control de Temperatura y tomar nuevamente hasta obtener temperatura deseada. Calibración, verificación y mantenimiento vigente Solicitar y ejecutar los mantenimientos o verificaciones pendientes para realizar análisis con equipos idóneos Fecha de esterilización de Material. Controles de esterilización. Descartar el Material y realizar el proceso con material que cumpla con los controles de esterilización. Los resultados de los controles se registran en el Control De Calidad Análisis Microbiológico F-SA-101 PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 CODIGO P-SA-78 FECHA DE EMISIÓN VERSIÓN PÁGINA 27/05/2016 01 Página 11 de 12 9. REGISTROS Registro F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos F-SA-34 Control Interno de Equipos. F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas F-SA-75 Resultados Microbiológico s de Alimentos Responsable Como conservarlo Donde conservarlo Tiempo de conservación Disposición final Físico Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Físico Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Físico Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Físico Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Profesional Universitario o Profesional del Laboratorio Auxiliar de Laboratorio, Profesional Universitario o Profesional del Laboratorio Auxiliar de Laboratorio, Profesional Universitario o Profesional del Laboratorio Auxiliar de Laboratorio, Profesional Universitario o Profesional del Laboratorio Profesional Universitario o Profesional del Laboratorio Físico PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE Staphylococcus aureus Coagulosa Positiva EN MUESTRAS EN ALIMENTOS PARA CONSUMO HUMANO ISO 6888-1:1999 CODIGO FECHA DE EMISIÓN VERSIÓN PÁGINA Registro Responsable F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico 10. Profesional Laboratorio Como conservarlo del Físico P-SA-78 27/05/2016 01 Página 12 de 12 Donde conservarlo Tiempo de conservación Disposición final Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental HISTORIAL VERSIÓN VIGENCIA IDENTIFICACIÓN DE LOS CAMBIOS 1 27/05/2016 Versión inicial
