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PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE RECUENTO DE
COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli EN
ALIMENTOS – INDICADOR DE COLOR (SimPlate)
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PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli EN ALIMENTOS – INDICADOR DE COLOR (SimPlate)
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ELABORÓ
REFERENTE DE LABORATORIO
REPRESENTANTE DE CALIDAD
DIRECTOR (S) TECNICO (S)
REVISÓ
SECRETARIO DE SALUD
APROBÓ
REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN
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COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli EN
ALIMENTOS – INDICADOR DE COLOR (SimPlate)
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1. OBJETIVO
Describir la Técnica de Indicador de Color Metodología SimPlate® recuento para
microorganismos Coliformes Totales y Escherichia coli para el análisis microbiológico de
las muestras de Alimentos de Consumo Humano.
2. ALCANCE
El procedimiento permite la identificación de Coliformes totales y Escherichia coli en
Alimentos de Consumo Humano, aplica a todas las muestras para análisis microbiológico
que son recepcionadas y analizados en Laboratorio de Salud Pública.
3. DEFINICIONES
 Coliformes: Son un grupo de Géneros Bacterianos que tienen ciertas características
bioquímicas en común: 1. Ser aerobias o anaerobias facultativas; 2. Bacilos gran
negativos; 3. No ser esporógenas; 4. Fermentar la glucosa a 35º±1°C en 48 horas,
produciendo ácido láctico y gas. Adicionalmente tienen importancia relevante
como indicadores de contaminación del agua y los alimentos.
Se encuentran comúnmente en las plantas, el suelo, los animales y los humanos. La
presencia de bacterias Coliformes en el suministro de agua es un indicio de que el
suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos
en descomposición.
 Escherichia coli (E. coli): Bacteria cuyo hábitat natural son los intestinos de la mayor
parte de los mamíferos sanos. Es el principal organismo anaerobio facultativo del sistema
digestivo. El aislamiento de esta bacteria en el agua da alto grado de certeza de
contaminación de origen fecal, alrededor del 99%.
 Sistema SimPlate: Detección binaria Technology™ combina los medios de
comunicación de propiedad y un dispositivo de recubrimiento patentado para
proporcionar resultados cuantitativos rápidos y precisos para los principales grupos de
organismos indicadores Sustratos definidos incorporados en los medios de
comunicación se utilizan para la detección de múltiples reacciones enzimáticas y redox
asociados a los organismos diana que resulta en cambios cromogénicos o
fluorescentes a los medios de comunicación, proporcionando fácil de leer los
resultados.
 Coliformes Totales y E.coli: Coli Complete es un método patentado de disco sustrato
de soporte que contiene tanto XGAL y la taza. Está diseñado para detectar
simultáneamente Coliformes totales y E. coli en productos alimenticios. La enzima
beta-galactosidasa producida por coliformes reacciona con el sustrato cromogénico
XGAL para producir un tinte azul insoluble visualmente detectable. La enzima beta-
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glucuronidasa que se encuentra en E. coli reacciona con el sustrato MUG para producir
una reacción fluorescente azul bajo luz UV de onda larga.
 ATCC = American Type Culture Collection. Rockville, EU. Es un material biológico de
referencia certificado. La colección certifica que se suministra una determinada cepa,
que es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas
morfológicas, bioquímicas y moleculares.
4. RESPONSABLES
Será responsabilidad del profesional asignado a la sección del Análisis Microbiológico de
Alimentos, del Laboratorio Departamental de Salud Publica del Meta cumplir con los
lineamientos establecidos en este documento, sin hacer ningún cambio que no esté
debidamente documentado y autorizado y se ejecutara según cronograma de análisis de
muestras.
5. GENERALIDADES
Grupo Coliforme Total: Toda bacteria que posea la enzima β–D Galactosidasa; la cual
tiene la propiedad de abrir el sustrato cromogénico, resultando en la liberación del
cromógeno. Escherichea coli es definida como toda bacteria que da respuesta positiva al
grupo Coliforme Total y además posee la enzima β Glucoronidasa, la cual tiene la
propiedad de abrir el sustrato fluorogénico, resultando en la liberación del fluorógeno.
Los microorganismos Coliformes son Gram negativos pertenecientes a la familia
enterobacteriácea, se utilizan como indicadores de contaminación, pues se encuentran
ampliamente difundidos en la naturaleza, agua y suelo. También son habitantes normales
del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente. Su presencia en alimentos
es signo de mala calidad higiénica en el proceso, falta de higiene de los manipuladores,
recontaminación después del proceso y aún de contaminación fecal.
6. REFERENCIAS

AOAC Official Method 2005:03 – Indicador de Color
7. DESARROLLO
7.1
FUNDAMENTO
7.1.1 SimPlate® CEc – Coliformes Totales / Escherichia coli
El método se utiliza para la detección y cuantificación de las poblaciones de coliformes
totales y E. coli. Se basa en la Defined Tecnología Substrato patentado (DST) que equivale la
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presencia de coliformes totales y E. coli a la presencia de B- galactosidasa y la actividad Bglucoronidasa, respectivamente. El medio se inocula con una muestra preparada, se dispensó en
un dispositivo SimPlate, y se incubó durante 24-28H. El recuento de coliformes totales y E. coli se
determina contando los pocillos con cambio de color y en referencia a la tabla de conversión
SimPlate. Pozos de colores indican el Presente de coliformes totales, y los pozos de colores que
presentan fluorescencia indican la presencia de E. coli. El dispositivo Simplate se envasa por
separado.
En su formulación solo se encuentran presente dos únicas fuentes de carbono CPRG y
MUG, lo que permite que solo los microorganismos enzimáticamente equipados para
hacer el metabolismo de estos azucares, tengan oportunidad de desarrollarse y entonces
evidenciar una señal positiva.
E. coli utilizan ß-glucuronidasa para metabolizar el MUG y crear fluorescencia.
7.1.2 SimPlate
Se basa en el empleo de una placa de plástico circular con 84 pocillos. La siembra se
realiza en el centro de un reservorio en el que se dispensa 1 ml de la muestra de alimento
convenientemente diluida y 9 ml del medio líquido rehidratado proporcionado por el
fabricante. La mezcla (alimento/medio) se distribuye homogéneamente en los pocillos
mediante movimientos circulares de la placa. Después de 24 horas de incubación a
35±1°C, la placa se sitúa bajo una fuente de luz ultravioleta.
7.2 MATERIALES
Tener en cuenta los materiales e insumos para la preparación de la muestra se realizara
conforme al P-SA—83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de
muestras de alimentos para consumo humano.
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7.2.1 Equipos y Material


Incubadora a 35±1°C
Lámpara de Luz Ultravioleta 365 nm
7.2.2 Reactivos
 Agua destilada estéril
 Reactivo SimPlate Coliformes Totales /E. coli CEc color indicado Simple
 Platos de SimPlate
7.2.3 Cepas de Referencia
 Cepas ATCC Escherichia coli 25922 o 11775
 Cepas ATCC Klebsiella neumoniae 31488 - (Coliformes Totales)
 Cepas ATCC Pseudomonas aeruginosa 10145 0 27853 - (No coliformes)
7.3
PROCEDIMIENTO
7.3.1 Controles y/o curvas de calibración
Llene tres viales con 10 ml de agua estéril, e inocule con un asa estéril los siguientes
controles microbiológicos:
Frasco 1: Control positivo: Cepa ATCC Escherichia coli
Frasco 2: Control negativo: Cepa ATCC Pseudomonas aeruginosa
Frasco 3: Control para Coliformes Totales: Cepa ATCC Klebsiella pneumoniae
7.3.2 Condiciones Ambientales y manejo de equipos
El acondicionamiento y manejo de equipos se realiza según hoja de vida (F-SA-18) de los
mismos.
7.3.3 Condiciones Generales
Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-SA-83
Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para
consumo humano.
7.4
Descripción del Método
Este procedimiento tiene como fundamento inocular diluciones decimales de la muestra
en SimPlate* CEc - Indicador de Color para la Detección de Coliformes Totales y
Escherichia coli en muestras de Alimentos para Consumo Humano.
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 Re suspender el vial que contiene el reactivo con 9 ml de agua estéril desionizada
Nota: NO cuente esta reconstitución como una dilución.
 Preparar la muestra en condiciones asépticas, pesando 10g de muestra y adicionar
90ml de Agua peptonada al 0,1% de diluyente, (dilución1:10) Homogenizar
(stomacher) durante 30 segundos y las diluciones de los homogenizados tal como se
ha recomendado.
 Transferir por duplicado, alícuotas de 1ml. De cada una de las diluciones consecutivas
en vial resuspendido de SimPlate CEc.
 Tapar y agitar el recipiente, asegurarse de que el reactivo se disuelva completamente.
 Mezclar por 15 a 20 segundos en el vortex y verificar la completa disolución del
reactivo.
 Transferir del contenido del vial (muestra + reactivo) a una plato de SimPlate de la
siguiente manera:
Se vierte la mezcla en el centro de la placa.
Incline ligeramente el plato de SimPlate para ayudar a distribuir el líquido en los pozos.
Si es necesario puede realizar golpes suaves a la placa sobre una superficie dura para
eliminar cualquier burbuja de aire que pueda haber quedado atrapados en los pozos.
Verter el exceso de medio sujetando la tapa contra la placa a cada lado de la cavidad
hacia la esponja.
Observe el color de fondo de los pozos. Se define como el color de la mezcla de muestra /
medio en el interior de los pocillos.
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No invierta el plato SimPlate.
Llevar los Platos SimPlate CEc a incubación a 35± 1ªC por 24 a 28 horas.
7.4.1 Lectura
 Coliformes Totales:
El cambio de color producido por microorganismos varía de color naranja claro al rojo
oscuro. Contar el número de pozos que muestran colores
 Escherichia coli:
Realizar la lectura contando el numero de pozos que presentan color naranja claro al rojo
oscuro y Fluorescencia al exponer los platos de SimPlate a una lámpara UV (366 nm) 1530 cm por encima del dispositivo SimPlate. Esto se realiza dentro de la cabina para
lectura de UV.
7.4.2 Cálculos
Para determinar la población por placa, lleve a cabo los siguientes cálculos:
 Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilución y contar el número de
pozos positivos por separado para Coliformes Totales y Escherichia coli.
NOTA:
 Si no hay pocillos positivos y la esponja es positivo la población es 1.
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 Si no hay pozos positivos y la esponja es negativo de la población es < 1
 Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución.
 Utilice la Tabla de Conversión SimPlate para determinar el número total de
microorganismos por placa (por separado para los Coliformes Totales y Escherichia
coli).
 Reportar asi:
Recuento de Coliformes Totales o Escherichia coli = X UFC góml
(X = Numero hallado en la Tabla)
7.4.3 Obtención Resultados
Con la interpretación de cálculos, los resultados según correspondan se registran en:


Resultados Microbiológicos de Alimentos F-SA-75.
Los resultados del control del método se registran en Control de calidad análisis
microbiológico F-SA-101
8.
VERIFICACIONES
8.1 Aseguramiento de Calidad Resultados
 Para demostrar la capacidad del laboratorio de detectar Coliformes Totales y E.coli
con el método sustrato definido, realizar los siguientes controles con materiales de
Referencia y analizarlos en las mismas condiciones que la muestra
 Para cada cepa bacteriana (Empleada como control), tome una colonia con una asa
de siembra desechable estéril se inocula directamente al vial que contiene el reactivo
y se procesa como una muestra (actividad 7.5).
8.2
CONTROL DE CALIDAD INTERNO
8.2.1 Control Coliformes Totales
 Control Negativo: Servir 10ml de agua destilada estéril más el Reactivo Simplate CEc
servir en los platos e incubar
 Control Positivo: Servir 10ml de agua destilada estéril más el Reactivo Simplate CEc,
inocular en el vial la Cepa Klebsiella pneumoniae ATCC 31488, servirlo en platos de
SimPlate e incubar.
NOTA: Este control es también Valido como Control Negativo para Escherichia coli
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Control Escherichia coli
Control Positivo: Servir 10ml de agua destilada estéril más el Reactivo Simplate CEc,
inocular en el vial la Cepa Escherichia coli ATCC 25922, servirlo en platos de SimPlate
e incubar
 Control Negativo Coliformes: Servir 10ml de agua destilada estéril más el Reactivo
Simplate CEc, inocular en el vial la Cepa Pseudomona aeruginosa, servirlo en platos de
SimPlate e incubar.
MATERIAL DE REFERENCIA
E. coli
ATCC 25922
RESULTADO PREVISTO
PARAMETRO EVALUADO
Pozos que presentan color
naranja claro al rojo oscuro y
Fluorescencia
Negativo
Klebsiella
pneumoniae
ATCC 31488
Color naranja claro al rojo
oscuro.
No Coliformes
Pseudomona
aeuriginosa
ATCC 10145 o
Incoloro
ATCC 27853
Sin Fluorescencia
Control Negativo del reactivo
Incoloro
Agua Estéril
No Aplica
Sin Fluorescencia
Registrar en los formatos






F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos
F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas
F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos
F-SA-34 Control Interno de Equipos
F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos.
F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico
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Criterio de Aceptación o Rechazo
CRITERIO
Control Negativo
Control Positivo
Coliformes totales
Cepa
ATCC
31438
Klebsiella pneumoniae
Control Positivo
Cepa Escherichia coli
ATCC 25922
Control
Coliformes
LECTURA
ACCION PARA
INCUMPLIMIENTO
DE CRITERIOS
RANGO DE ACEPTACION
No debe presentar cambio de
color ni Fluorescencia en
ningún pozo
Verificar el Crecimiento en el
control Positivo el cambio de
color en los pozos pasando de
amarillo a color naranja claro al
rojo oscuro y SIN presentar
fluorescencia al exponerse a la
luz UV
Verificar el Crecimiento en el
control Positivo el cambio de
color en los pozos pasando de
amarillo a color naranja claro al
rojo oscuro y CON presencia de
fluorescencia al exponerse a la
luz UV
Coliformes Totales =
0 microorganismos
Escherichia coli =
0 microorganismso
Repetir Análisis
Verificar.
Coliforfes Totales =
>738 UFC
Repetir siembra de
cepas ATCC y repetir
el Análisis
Repetir siembra de
cepas ATCC y repetir
el Análisis
Escherichia coli =
>738 UFC
Negativo
No debe presentar cambio de
color ni Fluorescencia en
ningún pozo
Coliforfes Totales =
0 microorganismso
Escherichia coli =
0 microorganismso
Reactivos vigentes
Vigencia del reactivo dentro de
la fecha
Reactivo Vigente a
utilización
Temperaturas de
Incubadoras
Temperatura ajusta a
35± 1ªC por 24 a 28 horas
Temperatura
35± 1ªC por 24 a 28 horas
Mantenimiento de
equipos
Calibración,
verificación
mantenimiento vigente
Control de
Esterilización de
Material
Verificar
la
fecha
de
esterilización
de
Material,
verificar el cumplimiento de los
controles de esterilización.
Cepa ATCC
Pseudomona
aeruginosa
ATCC 10145 ò
ATCC 27853
y
Repetir siembra de
cepas ATCC y repetir
el Análisis
la fecha de
Calibración,
verificación
mantenimiento vigente
y
Fecha
de
esterilización
Material.
Controles
esterilización.
de
de
Descartar Reactivos y
adquirir y procesar
con
reactivos
en
fechas vigentes
Ajustar control de
Temperatura y tomar
nuevamente
hasta
obtener temperatura
deseada.
Solicitar y ejecutar los
mantenimientos
o
verificaciones
pendientes
para
realizar análisis con
equipos idóneos
Descartar el Material
y realizar el proceso
con material que
cumpla
con
los
controles
de
esterilización.
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9. REGISTROS
Registro
F-SA-18 Hoja
de Vida de
Equipos
F-SA-34
Control Interno
de Equipos.
F-SA-46
Control De
Temperatura,
Limpieza y
Desinfección
de Equipos
F-SA-64
Identificación
de Sustancias
Químicas
F-SA-75
Resultados
Microbiológico
s de Alimentos
Responsable
Como
conservarlo
Donde conservarlo
Tiempo de
conservación
Disposición final
Físico
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla de retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla de retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla de retención
documental
Físico
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla de retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla de retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla de retención
documental
Físico
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla de retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla de retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla de retención
documental
Físico
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla de retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla de retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla de retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla
de
retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla
de
retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla
de
retención
documental
Profesional
Universitario o
Profesional del
Laboratorio
Auxiliar de
Laboratorio,
Profesional
Universitario o
Profesional del
Laboratorio
Auxiliar de
Laboratorio,
Profesional
Universitario o
Profesional del
Laboratorio
Auxiliar de
Laboratorio,
Profesional
Universitario o
Profesional del
Laboratorio
Profesional
Universitario o
Profesional del
Laboratorio
Físico
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Registro
F-SA-101
Control
de
calidad
análisis
microbiológico
10.
10.1
Como
conservarlo
Responsable
Profesional
Laboratorio
del
Físico
ANEXOS
Tabla SimPlate
P-SA-79
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Donde conservarlo
Tiempo de
conservación
Disposición final
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla
de
retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla
de
retención
documental
Según F-MC-04 Listado
Maestro de documentos,
Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o
tabla
de
retención
documental
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10.2
N.
3
4
5
6
7
8
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ANEXO 2
RESPONSABLE
1
2
P-SA-79
ACTIVIDAD
INICIO
ANALISTA
ANALISTA
ANALISTA
ANALISTA
ANALISTA
ANALISTA
ANALISTA
Verificar la identificación y
numeración de las muestras
que ingresan con cada Acta de
toma de Muestra.
Realizar el registro de la
muestra que ingresa en el
Libro
Análisis
Resultados
Microbiológicos de Alimentos
Marcar los platos SimPlate
con el número de la muestra a
analizar
Adicionar
9ml
de
agua
destilada
estéril al Vial
mezclar para disolver el medio
FLUJOGRAMA
INICIO
Verificar identificación y
numeración
de
las
muestras
Registrar
en
Libro
Resultados Microbiológicos
de Alimentos.
Registro de
Resultados Análisis
Microbiológico de
Alimentos
Marcar los platos SimPlate
con el número de la
muestra a analizar
Adicionar 9ml de agua
destilada estéril al Vial
mezclar para disolver el
medio
Trasferir 1ml de la muestra a
analizar
Transferir 1ml de Muestra
a analizar
.
Mezclar por 15 a 20 segundos
en vortex hasta verificar la
completa
disolución
del
reactivo
Mezclar por 15 a 20
segundos en vortex hasta
verificar la completa
disolución del reactivo
Retirar la tapa de la placa
Simplate y vaciar la solución
medio/muestra en el centro de
la placa.
Tapar la placa
Distribuir la muestra en todos
los pocillos, verificando que no
quede aire, vaciar el exceso
de medio en la esponja blanca
del plato, verifique que todos
los pozos están llenos antes
de eliminar el exceso de
medio.
REGISTRO
Retirar la tapa de la placa
Simplate y vaciar la
solución medio/muestra
en el centro de la placa
Cerrar la placa. Distribuir
la muestra en todos los
pocillos, vaciar el exceso
de medio en la esponja
blanca del plato, verifique
que todos los pozos
están llenos antes de
eliminar el exceso de
medio
Registro de
Control de uso
cabina de Flujo
Laminar
Registro Control
de Limpieza y
desinfección de
equipos
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N.
RESPONSABLE
9
ANALISTA
10
11
ACTIVIDAD
FLUJOGRAMA
Llevar la placa Simplate a
incubación a 35°C ± 1°C por
24 a 28 horas.
ANALISTA
Realizar
la
lectura
de
Recuento de Coliformes
Totales / E. coli por separado,
dado por el numero de pozos
con cambio de color del liquido
en los pocillos respecto al
color base:
ANALISTA
Para
determinar
la
concentración
por
plato,
ejecute los siguientes cálculos
(1) Cuente el número de
pocillos positivos en el plato
(2) Utilice la tabla de
conversión
de
Simplate,
anexo No 1, para determinar
el
número
total
de
microrganismos por plato
12
ANALISTA
13
ANALISTA
Registre el dato obtenido en el
libro de Análisis Microbiológico
de Alimentos y en el Sistema
Integral de Información en
Salud modulo Laboratorio
P-SA-79
Llevar la placa SimPlate
a incubación a 35°C ±
1°C por 24 a 28 horas
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REGISTRO
Registro Control
de Temperaturas
de Incubadoras
Realizar
Lectura
de
Coliformes Totales / E.
coli por separado
Realizar la lectura
(1) Cuente el número de
pocillos positivos en el
plato
(2) Utilice la tabla de
conversión de SimPlate,
Anexo 1, para determinar
el número total de
microrganismos por plato
Registre el dato obtenido
en el libro de Análisis
Microbiológico de
Alimentos en el Sistema
Integral de información
de Salud modulo
Laboratorio
Registro de
Resultados
Microbiológico de
Alimentos
Sistema Integral de
Información en Salud
modulo Laboratorio
FIN
FIN
11. HISTORIAL
VERSIÓN
1
VIGENCIA
24/06/2016
IDENTIFICACIÓN DE LOS
CAMBIOS
Versión inicial