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Universidad de Colima Doctorado en Ciencias; Área: Biotecnología Presencia de hongos micorrízicos arbusculares y contribución de Glomus intraradices en la absorción y translocación de cinc y cobre en girasol (Helianthus annuus L.) crecido en un suelo contaminado con residuos de mina Tesis Que para obtener el grado de Doctor en Ciencias; Área: Biotecnología Presenta Rosario Pineda Hernández Asesores Dr. Sergio Aguilar Dra. Lucía Yolanda Varela Fregoso Coasesores Dra. María del Rocío Flores Bello Dr. Javier Farías Larios Dr. José Gerardo López Aguirre Tecomán, Colima., Noviembre de 2004 AGRADECIMIENTOS A mi padre Dios, en el poderoso nombre de Jesucristo te doy gracias por sostenerme en mis momentos de desalientos, por ser mi fortaleza, mi guía y mi luz en el camino hacia mi meta y por lograrla con éxito. A la Dirección General de Educación en Ciencia y Tecnología del Mar, por la confianza depositada al otórgame la beca comisión para la realización de este estudio, especialmente al Biólogo Manuel López Yañes por su valioso apoyo en todos los trámites de la beca. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por proporcionarme apoyo econónico con una beca, que sin duda, sin ella, no hubiera sido posible la realización de este proyecto. A los directores del CET-MAR # 12, MVZ Martín Palomera Todd, y M. en C. Ramón Ramos Crespo por el consecuente e invaluable apoyo manifestado durante el periodo de la realización de este estudio. A todos mis compañeros que laboran en el CET- MAR # 12 por todo el apoyo. A la Universidad de Colima y autoridades que laboran en la Facultad de Ciencia Biológicas Agropecuarias (FCBA) Campus Tecomán, por haberme permitido interactuar con todos los investigadores que participan el posgrado y desarrollar el proyecto de investigación. A la Dra. Ma. del Rocío Flores Bello y el Dr. Sergio Aguilar Espinosa por ser quienes me iniciaron en ese mundo maravilloso de los hongos micorrízicos, por su asesoría en las múltiples actividades de campo y de laboratorio, sus constantes asesorías, sus acertadas sugerencias y por su apoyo moral, durante la realización de este proyecto. A la Dra. Lucía Varela Fregoso por haber formado parte de mi comité tutorial (como directora adjunta) por compartir su amplia experiencia y conocimientos relacionados con los hongos, por su tiempo dedicado en la elaboración de este documento y sobre todo por su amistad. Al Consejo Académico asignado al Programa donde realicé mis estudios de postgrados: Dr. Sergio Aguilar Espinosa, Dra. Ma. del Rocío Flores Bello, Dr. Javier Farías Larios y Dr. José Gerardo López Aguirre, por sus acertados observaciones e indicaciones que de manera sustancial contribuyeron al enriquecimiento de este trabajo. A las Dra. Marilu López Lavín, M. en C. Edelmira Galindo Velasco y al Dr. Oscar Rebolledo Domínguez, por el apoyo brindado en esos momentos de angustia y desaliento. Al M. en C. César Andrés Angel Sahagún por su valiosa asesoría en el análisis estadístico e interpretación de los datos generados de la evaluación de todos los bioensayos. Finalmente expreso mi reconocimiento a quienes de alguna forma contribuyeron en el logro de la culminación de este proyecto. Entre ellas me refiero a las siguientes personalidades: Dr. David Crowley del Department of Environmental Science of University of California en Riverside. Dra. Corinne Leyval del Centre de Pédologie Biologique de Université de Nancy. Dra. Ma. del Pilar Ortega Larrocea del Instituto de Geología de la Universidad Nacional Autonoma de México. Dr. Abdul Khan del College of Science, Technology and Environment, University of Western Sydney,Campbelltown Campus, Locked Bag 1797. Penrith South NSW 1797 Australia. Dr. José Miguel Barea Navarro de la Unidad Experimental del Zaidin en Granada España DEDICATORIAS A mis padres: Sara y Rafael †gracias por traerme a este maravilloso camino de la vida, papá se que estas con Dios muy contento porque alcance mi sueño. A mis amados hijos Zyanya y Mixtli Amados hijitos quiero decirles que son lo más valioso que Dios me ha dado, les agradezco infinitamente toda su comprensión en esas largas de ausencia y por su valiosa ayuda en la culminación mi trabajo. A mi esposo Ing. Ramón Campos Mosqueda Por todo su amor, paciencia y apoyo en todo el camino de este proyecto A mis hermanos Connie, Teresa, Roma, Rafael, Primo, Bernardo y Rudy. TODO LO PUEDO EN CRISTO QUE ME FORTALECE (Filipenses 4: 13) ÍNDICE Página ÍNDICE DE CUADROS ÍNDICE DE FIGURAS ABREVIATURAS RESUMEN ABSTRACT 1. INTRODUCCIÓN 2. ANTECEDENTES 2.1 Metales pesados 2.1.1 Metales pesados en el ambiente 2.1.2 Efecto de los metales pesados en suelos 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 Estrategias de remediación de suelos por métodos físicos y químicos 2.2.1 Extracción 2.2.2 Sellado 2.2.3 Incineración 2.2.4 Tratamiento químico 2.2.5 Tratamiento electroquímico Remediación de suelos por métodos biológicos 2.3.1. Biorremediación 2.3.2. Fitorremediación 2.3.3. Plantas hiperacumuladoras 2.3.4. Categorías de fitorremediación Contribución de los microorganismos en la remediación de suelos 2.4.1. Interacción de microorganismos con los metales pesados en la remediación de suelos Hongos micorrízicos 2.5.1. Generalidades de los hongos micorrízicos 2.5.2. Clasificación de los diferentes hongos micorrízicos Contribución de los HMA como mecanismo de recuperación de suelos contaminados por metales pesados 2.6.1. Interacción de los HMA y los metales pesados 2.6.2. Función de los HMA en la fitorremediación de suelos contaminados con metales pesados 2.6.3. Contribución de los HMA en la absorción y translocación de los metales pesados por las plantas hiperacumuladoras VII VIII IX X XI 1 6 6 6 11 21 23 23 24 25 26 27 27 28 32 40 42 42 47 47 49 52 52 54 61 Página 2.7 Importancia del cultivo de girasol (Helianthus annuus L.) 2.7.1. Origen 2.7.2. Características botánicas 2.7.3. Requerimientos edafoclimaticos 2.7.4. Particularidades del cultivo 2.7.5. Características del girasol como planta acumuladora para ser escogida en este estudio 3 MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Muestreo 3.1.1. Localización y descripción de los sitios de muestreo 3.1.2. Muestreo de suelos 3.1.3. Muestreo de raíces 3.2 Análisis físico y químicos del suelo colectado 3.2.1. Textura del suelo 3.2.2. pH del suelo 3.2.3. Conductividad eléctrica 3.2.4. Materia orgánica 3.3 Determinación de la concentración de metales pesados en suelo 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 colectado Hongos micorrízicos arbusculares y colonización de las plantas 3.4.1. Cuantificación de esporas Determinación del porcentaje de colonización micorrízica 3.4.2. arbuscular Selección del suelo de estudio Propagación de los hongos micorrízicos arbusculares nativos 3.6.1. Cultivos trampa 3.6.2. Diversidad morfológica de HMA presentes en el suelo de estudio Contribución de Glomus intraradices en la absorción y translocación de cinc y cobre 3.7.1. Desinfección de la semilla del girasol 3.7.2. Germinación de la semilla del girasol 3.7.3. Transplante 3.7.4. Inoculación 3.7.5. Duración del experimento 3.7.6 . Preparación y análisis de muestras Variables evaluadas Análisis estadístico 64 64 65 66 67 68 70 70 70 73 74 74 74 75 75 75 76 76 76 77 78 78 78 79 80 80 81 81 83 84 84 85 85 Página 4 RESULTADOS 4.1 Análisis físicos y químicos de suelo 4.2 Concentración de metales pesados en los suelos muestreados 4.3 Cuantificación de esporas y determinación de la colonización micorrízica arbuscular 4.4 Diversidad morfológica de HMA presentes en el suelo de estudio 4.5 Contribución de G. intraradices en la absorción y translocación del Cu y Zn por plantas de girasol inoculada y no inoculadas 4.6 Número de esporas y colonización micorrízica al finalizar el experimento 5 DISCUSIÓN 5.1 Análisis físicos y químicos de suelo 5.2 Concentración de metales pesados en los suelos muestreados 5.3 Cuantificación de esporas y determinación de la colonización micorrízica arbuscular 5.4 Diversidad morfológica de HMA presentes en el suelo de estudio 5.5 Contribución de G. intraradices en la absorción y translocación del Cu y Zn por plantas de girasol inoculadas y no inoculadas 5,6 Número de esporas y colonización micorrízica al finalizar el experimento 6 CONCLUSIONES 7 LITERATURA CITADA 86 86 88 89 93 97 98 100 100 102 104 106 107 111 112 114 ÍNDICE DE CUADROS Página Cuadro 1. Intervalos de límites normales y máximos permisibles de metales pesados en suelo 19 Cuadro 2. Clasificación de contaminación y polución de suelos contaminados 20 Cuadro 3. Clasificación actual de los hongos formadores de micorriza arbuscular 52 Cuadro 4. Sitios muestreados 73 Cuadro 5. Características físicas y químicas de los suelos muestreados 86 Cuadro 6. Concentración de metales pesados de los diferentes sitios muestreados 88 Cuadro 7. Valores de la colonización micorrízica y el número de esporas de los sitos muestreados 89 Cuadro 8. Absorción y translocación del Zn y Cu en plantas de girasol inoculadas y no inoculadas, a los 40, 55 y 70 días de crecimiento 98 ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Ruta de incorporación de contaminantes del suelo a la cadena alimenticia 7 Figura 2. Esquema mostrando la contaminación del suelo por metales pesados 21 Figura 3. Categorías de fitorestauración de suelos contaminados 40 Figura 4 Esquema representativo de la asociación simbiótica entre HMA-planta-metales pesados en suelos contaminados 47 Figura 5 Estructuras morfológicas de la micorríza arbuscular 50 Figura 6. Fenología de la planta de girasol 68 Figura 7. Mapa de la rivera del Río Marabasco, donde se indica la ruta de los sitios muestreados 71 Figura 8. Panorámica de los diferentes sitios muestreados: Laguna de Oxidación, Ávila Camacho, El Charco y El Centinela 72 Figura 9. Cultivo trampa utilizada en la propagación de los HMA nativos de suelo con mayor concentración de Cu y Zn 79 Figura 10. Etapas de crecimiento de la planta de girasol: creciendo en maceta con suelos 82 Figura 11. Planta de girasol creciendo en maceta con suelos después del segundo muestreo a los 60 días de crecimiento 83 Figura 12. Espora globosa apreciándose hifa sustentora bulbosa extraída de Ávila Camacho 90 Figura 13. Conjunto de esporas extraídas del sitio muestreado no cultivado 91 Figura 14. Espora apreciándose la hifa en forma de embudo obtenida de la zona no cultivada El Centinela, Jalisco, México 91 Figura 15. Hifas y vesículas de las raíces extraídas del suelo muestreado Centinela no cultivado 92 Figura 16. Micelio externo y esporas extraído del suelo muestreado Centinela no cultivad0 92 Figura 17 Arbusculos del sitio muestreado extraídas del sitio muestreado Charco no cultivado 93 Figura 18.Espora globosa y espora subglobosa con hifa de sostén extraída del suelo muestreado Centinela no cultivado 95 Figura 19.Espora rota mostrando doble pared extraída del suelo muestreado Centinela no cultivado 95 Figura 20.Espora apreciándose hifa en forma de embudo extraída del suelo muestreado Centinela no cultivado 96 Figura 21.Espora apreciándose hifa en forma de embudo, con pared gruesa extraída del suelo muestreado Centinela no cultivado 96 ABREVIATURAS Cd Cadmio Cr Cromo Cu Cobre HCl Ácido clorhídrico HNO3 Ácido nítrico H2 O2 Agua oxigenada HMA Hongos micorrízicos arbusculares FAA Formol-alcohol-ácido g Gramo Kg Kilogramo Km Kilómetro KOH Hidróxido de potasio MO Materia orgánica Pb Plomo pH Potencial de hidrógeno PVLG Alcohol polivinilico lacto-glicerol Zn Cinc RESUMEN En el presente estudio se llevo a cabó un experimento en maceta con plantas de girasol (Helianthus annus.L), inoculadas y no inoculadas con Glomus intraradices, para determinar la contribución de los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) en la absorción y la translocación de Zn y de Cu, así mismo se determinó la presencia de HMA en suelos irrigados con agua del río Marabasco, contaminada con metales pesados por filtraciones a su cauce procedentes de la laguna de jales en donde se depositan residuos de mina. Se muestrearon suelos de cuatro sitios seleccionados al azar a lo largo de un gradiente de 74 Km de longitud entre la laguna de oxidación situada en el municipio de Minatitlán, Colima y la zona agrícola del municipio de Cihuatlán, Jalisco. Se escogió el suelo con mayor concentración de Zn y Cu y con presencia de HMA nativos, los cuales fueron propagados para su identificación. Posteriormente este suelo fue esterilizado y en él se sembraron plantas de girasol inoculadas y no inoculadas con Glomus intraradices. Al finalizar el experimento se cuantificó la concentración de Cu y Zn en la raíz y en la parte aérea de las plantas de girasol inoculadas y no inoculadas. De acuerdo con los resultados, se encontró una diferencia significativa entre los dos tratamientos y se determinó que G. intraradices contribuye de manera positiva en la absorción de esos metales por la raíz y redujo su paso hacia la parte aérea de la planta. El metal que se absorbió en mayor cantidad fue el Cu y disminuyó su translocación hacia la parte aérea de las plantas de girasol inoculadas. De la propagación de los HMA nativos se identificó Glomus mosseae como la especie más representativa. Palabras clave: Hongos micorrízicos arbusculares, Glomus, metales pesados, fitoextracción, recuperación de suelos. ABSTRACT In the present study a pot experiment was conducted with plants of sunflower (Helianthus annus L.), inoculated and not inoculated with Glomus intraradices, to determine the contribution of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in absorption and translocation of Zn and Cu; also the presence of AMF in soils irrigated with water of the Marabasco river, contaminated with heavy metals by filtrations to its channel coming from the jales dam of a mine wastes, was determined. Soils from four sites randomized throughout a gradient of 74 km in length, between the lagoon of oxidation located in the municipality of Minatitlán, Colima and the agricultural zone of the municipality of Cihuatlán, Jalisco were sampled. The soil with greater concentration of Zn and Cu and with presence of native AMF, was chosen and native AMF were propagated for identification. Afterwards the soil was sterilized and plants of sunflower inoculated and not inoculated with Glomus intraradices were seeded in it. When finalizing the experiment the concentration of Cu and Zn in the root and the aerial part of the inoculated and not inoculated plants of sunflower was quantified. According with the results, a significant difference between both treatments was found, and it was observed that G. intraradices contributed in a positive way in the absorption of these metals by the root and reduced the passing towards the aerial part of the plant. The metal that was absorbed in greater amount in the root was Cu, diminishing its translocation towards the aerial part of the inoculated sunflower plant. The propagation of the native populations of AMF, Glomus mosseae was identified as the most representative species. Keywords: arbuscular mycorrhizal fungi, Glomus, heavy metals, phytoextraction, soil amendment 1. INTRODUCCIÓN Uno de los problemas más señalados por la sociedad a nivel mundial que ocupa un lugar prominente en los programas sociales y políticos es la de destacar la progresiva degradación de los recursos naturales causada por la gran diversidad de contaminantes tóxicos orgánicos e inorgánicos, tanto en la atmósfera, agua, suelo y subsuelo, procedentes de diversas actividades naturales y antropogénicas, generando un irremediable deterioro en el ambiente (Jensen et al., 2000; Khan et al., 1997; Adriano, 1992; McNeill y Waring., 1992; Adriano, 1986). Entre los contaminantes inorgánicos más nocivos para los seres vivos están los metales pesados derivados principalmente de actividades mineras (Khan et al., 1997; Chen et al.,1993; Alloway, 1990) que dan lugar a la pérdida irreversible de los recursos naturales por no son biodegradables. Es necesario reducir los niveles de contaminación, minimizar los elevados costos de restauración de suelos y cuerpos de agua contaminados, lo que representa un enorme reto para la humanidad (McEldowney et al., 1993). Con base en lo anterior existe la necesidad de desarrollar nuevas alternativas que permitan recuperar los suelos altamente contaminados por metales pesados (Chaney et al., 2001; Comis, 1996; Cunninghan y Lee, 1995; Chaney, 1983). Actualmente existen estudios tendientes a resolver la contaminación originada por metales pesados en suelos, mediante estrategias basadas en el uso de plantas que tienen la propiedad de acumular metales pesados; proceso denominado “fitorremediación” que consiste en la remoción, transferencia, estabilización y/o degradación y neutralización de compuestos orgánicos, 1 inorgánicos y radioactivos que resultan tóxicos en suelos y agua. Esta definición incluye cualquier proceso biológico, químico o físico, inducido por las plantas, que ayude en la absorción, degradación y metabolización de los contaminantes, ya sea por las plantas mismas o por los microorganismos que se desarrollan en la rizósfera (Kabatas-Pendias y Pendias, 2000; González, 1999; Kumar et al., 1995; Salt et al., 1995; Anderson y Coats, 1994; Baker et al., 1994; Raskin et al., 1994; Adriano, 1990). Las limitantes que dichas plantas pueden encontrar en la recuperación de suelos contaminados es la dificultad para establecerse y prosperar en situaciones adversas por la contaminación; así como también su lento crecimiento y poco volumen radicular, por lo que la importancia y beneficios de la simbiosis con los hongos micorrízicos en este sentido es ampliamente reconocida (Khan et al., 2000; Leyval et al., 1997; Pawloswska, 1996; Weissenhorn et al., 1995; Weissenhorn et al.,1993). La capacidad de ciertos microorganismos de degradar contaminantes orgánicos como hidrocarburos originó el término “biorremediación”, aplicado genéricamente a un grupo de técnicas que utilizan procesos biológicos para la remediación de suelos y aguas, que representan una de las técnicas más efectivas y de bajo costo en la recuperación de suelos y aguas contaminadas (Besthelin et al., 1995; Lovley et al., 1995). Los procesos biológicos involucran bacterias, hongos, algas, enzimas, así como plantas superiores incluyendo árboles. Además de metabolizar y degradar compuestos orgánicos, los microorganismos son capaces de absorber compuestos inorgánicos tóxicos, inmovilizándolos, y pueden inhibir y/o catalizar diversas reacciones, ampliándose por lo tanto su campo de aplicación 2 (Meagher, 2000; Salt et al., 1999; Chaudhry et al., 1998; Raskin et al., 1997; Berthelin et al.,1995; Brown et al., 1995; Chaney, 1983). Los hongos micorrízicos arbusculares son microorganismos que habitan el suelo y establecen una simbiosis de tipo mutualista con las raíces de una gran cantidad de plantas (Turnau, 2002; Dodd, 2000; Barea et al., 1997; Turnau, 1993). Con respecto a la importancia de la micorriza en la fitorremediación de suelos contaminados con metales pesados, se ha comprobado que esta simbiosis tienen un efecto benéfico, ya que inmoviliza los metales en la raíz reduciendo su translocación a la parte aérea de la planta y en consecuencia, el flujo de metales a la cadena trófica (Pawlowska et al.,2000; Del Val et al., 1999; Pawlowska et al.,1996; Barea et al., 1995; Leyval et al.,1995). En el estado de Colima, concretamente en la región agrícola que colinda con el valle de Cihuatlán, Jal., existen cultivos irrigados con afluentes del Río Marabasco que de acuerdo con el resultado de análisis sobre la concentración de metales pesados realizados en sus aguas presentan el contenidos de estos. Como consecuencia de esto, en la región agrícola los lugareños denunciaron un pobre desarrollo de las plantas que ahí se cultivan. Este suceso puede ser científicamente explicable tomando en cuenta que la literatura reporta que en los afluentes de las industrias mineras existen concentraciones de metales pesados más allá de las permisibles para un buen desarrollo de los cultivos. Estas altas concentraciones causan fitotoxicidad interfiriendo con el desarrollo vegetal (Lasat, 2002; 3 Berti et al., 1995; Chaudhry et al., 1997a; Baker y Brooks, 1989). Una de las limitantes de utilizar plantas para remediar suelos contaminados es la pobre masa radicular y entre las poblaciones de microorganismos rizósfericos del suelo que contribuyen a aumentarla son los hongos micorrízicos arbusculares. Por lo que el lograr maximizar la colonización radicular por HMA en ambientes adversos como son los suelos contaminados con metales pesados es ahora de gran interés (Khan et al., 2000; Chaudry et al.,1997b). Con base en estos antecedentes en el presente trabajo, el interés de utilizar un modelo hasta ahora no experimentado, que es la utilización de plantas de girasol asociadas con hongos micorrízicos nativos para tratar de contrarrestar los efectos tóxicos de los metales pesados Zn y Cu, presentes en suelos contaminados con filtraciones de residuos de minas. Para abordar este problema se planteó el siguiente cuestionamiento: ¿La presencia de HMA y la asociación de Glomus intraradices con girasol (Helianthus annuus L.) crecido en un suelo contaminado con residuos de mina, aumentará la absorción y la translocación de metales pesados? Para dar respuesta a la pregunta anterior, se estableció la siguiente hipótesis: La presencia de HMA y la contribución de Glomus intraradices en girasol (Helianthus annuus L.) crecido en un suelo contaminado con residuos de mina, aumenta la absorción y translocación de metales pesados. 4 Objetivo general Evaluar la presencia de los hongos micorrízicos arbusculares y la contribución del Glomus intraradices en girasol (Helianthus annuus L.) crecido en un suelo contaminado con residuos de mina. Objetivos particulares Determinar las características físicas y químicas; así como la concentración de metales pesados en suelos contaminados con residuos de mina. Determinar el número de esporas de HMA en el suelo de los sitios muestreados y la colonización micorrízica presente en la planta más representativas de cada sitio. Identificar a nivel de especie, la población de HMA nativos más representativa del suelo seleccionado. Evaluar la contribución de Glomus intraradices en la absorción y translocación de cinc y cobre en la biomasa aérea y radicular de plantas de girasol inoculadas y no inoculadas. 5 2. ANTECEDENTES 2.1 Metales pesados 2.1.1. Metales pesados en el ambiente Los metales pesados, son convencionalmente definidos como elementos con propiedades metálicas (conductibilidad, ductilidad, etc), número atómico mayor de 20, y cuya densidad es mayor a los 5 g / cm3. Se consideran metales pesados el cadmio, cromo, mercurio, zinc, cobre, plata y arsénico. Estos elementos constituyen un grupo de gran importancia, ya que, pese a que son esenciales para las células, en altas concentraciones pueden resultar tóxicos para los seres vivos, como humanos, organismos del suelo, plantas y animales (Spain et al., 2003; Liao et al., 2003). En las últimas décadas con el acelerado desarrollo industrial y crecimiento de las poblaciones, han generado serios problemas de contaminación por metales pesados, provocando un incremento de su concentración en el ambiente y su migración a suelos no contaminados, que deterioran su calidad del suelo, del aire y del agua. La exposición a estos metales en los humanos, causa una amplia gama de enfermedades entre las que destacan: enfermedad de Minamata, Itai-Itai, cáncer, anemia, daños hepáticos, renales, pulmonares y en vías respiratorias (Hasler, 1998; Adriano, 1986). . Las principales fuentes de metales pesados son actividades naturales, como desgastes de cerros, volcanes, que constituyen una fuente relevante de los metales pesados en el suelo, así como también actividades antropogénicas como la industria minera que está catalogada 6 como una de las actividades industriales más generadora de metales pesados. Además de refinerías, aguas residuales, procesos nucleares y de la manufactura de una gran variedad productos como de baterías, componentes eléctricos, aleaciones de metales, plaguicidas y fertilizantes (Roane et al.,1996; Alloway, 1990; Chaney, 1994; Chaney, 1993). En la atmósfera, los metales originados por las fuentes de emisión como la combustión de nafta con plomo, se encuentran como material suspendido en el aire que respiramos. Por otro lado, las aguas residuales no tratadas y las provenientes de minas y fábricas, contaminan a los ríos y las aguas subterráneas, y los desechos que contienen metales tóxicos simplemente abandonados en el ambiente contaminando el suelo y se acumulan en las plantas y los tejidos orgánicos (Liesko et al., 1999; Chen et al., 1992) (Fig. 1). Figura. 1. Ruta de incorporación de contaminantes del suelo a la cadena alimenticia (Martín, 2000). 7 Debido que los metales pesados no son química ni biológicamente degradables y una vez emitidos pueden permanecer en el ambiente durante cientos de años. Además, su concentración en los seres vivos aumenta a medida que son ingeridos por otros, por lo que la ingesta de plantas o animales contaminados puede provocar síntomas de intoxicación (Chaney et al., 2001; Licsko et al., 1999; McEldowney et al., 1993). De acuerdo con Cabrera, (1999); Tunnell et al., (1996); Alloway, (1990); Sopper, (1988) la actividad minera genera el desprendimiento de sustancias tóxicas, algunas de ellas asociadas con la roca, otras utilizadas para la separación de los minerales que se extraen y son difundidos en el ambiente las cuales se bioacumulan en el organismo humano ocasionando envenenamiento y una amplia variedad de enfermedades al trabajador así como también a los habitantes de las comunidades próximas a una mina y en concentraciones elevadas ocasionan la muerte. Por ejemplo los polvos de plomo provocan alteraciones al sistema nervioso central, desestabilizando el carácter, irritabilidad, insomnio, afecta las células reproductivas derivándose de esto malformaciones congénitas, abortos, partos prematuros, insuficiencias renales. En las familias mineras los niños son principalmente afectados, ocasionándoles pérdidas de la capacidad de aprendizaje, y lento crecimiento. El plomo se acumula en los huesos impidiendo la producción de la sangre. El cadmio por su semejanza química con el cinc provoca síntomas similares y su principal vía de acceso es la digestiva, debido al consumo de alimentos y agua contaminada. Otra vía 8 es la respiratoria por inhalación de aire contaminado, la intoxicación crónica causa severos daños renales, debido a que este elemento se acumula en los riñones, disminuye la actividad pulmonar causando cáncer pulmonar. Se han registrado, además, alteraciones genéticas como malformaciones cerebrales y craneofaciales y complicaciones en el embarazo y parto. El mercurio es un metal sumamente tóxico que puede permanecer en el ambiente circundante a las minas durante cien años, es conocido como un tóxico celular porque afecta la acción enzimática evitando así la catálisis deseada, o eliminando la función de la enzima. Aproximadamente el 80% es absorbido por los pulmones, riñón, cerebro, hígado, glóbulos rojos de la sangre y la leche materna. El cinc está situado en el 26º lugar de la lista de los elementos más comunes. Desde el punto de vista ecológico, se califica al cinc de la misma manera que al aluminio, plomo, cadmio, mercurio, talio, etc. Participa con un 0.0058% en la formación de la corteza terrestre. Su uso más difundido es el de aleación para piezas de fundición, como protección superficial (galvanizado o cincado) de chapas y alambres de hierro y bienes de uso en general (canaletas de desagüe, cubos (baldes), abrevaderos, materiales para techado, etc.). El cobre es un elemento químico de símbolo Cu, con número atómico 29; uno de los metales de transición e importante metal no ferroso. Su utilidad se debe a la combinación de sus propiedades químicas, físicas y mecánicas, así como a sus propiedades eléctricas y su abundancia. El cobre fue uno de los primeros metales usados por los humanos. 9 El cobre metálico se encuentra en mezclas (llamadas aleaciones) con otros metales tales como latón y bronce, se encuentra como parte de otros compuestos formando sales. Las sales de cobre ocurren naturalmente, pero también son manufacturadas, la más común es el sulfato de cobre. La mayoría de sus compuestos son de color azul-verde, son usados comúnmente en la agricultura para tratar enfermedades de las plantas, como el moho, para tratar agua, y como preservativos para alimentos, cueros y telas. De acuerdo con Kabata- Pendias y Pendias (2000) el cobre puede entrar al ambiente desde minas y de otros metales y desde fábricas que manufacturan o usan cobre metálico o compuestos de cobre, a través de aguas residuales domésticas, la combustión de materiales combustibles fósiles y desechos, la producción de madera, la producción de abonos de fosfato, y de fuentes naturales (por ejemplo, por polvo del suelo esparcido por el viento, volcanes, vegetación en descomposición, incendios forestales y del rocío de agua de mar). El cobre en el suelo se adhiere firmemente a materia orgánica y a minerales, se disuelve en agua se une rápidamente a partículas suspendidas en el agua, generalmente no entra al agua subterránea. El cobre que es transportado por partículas emitidas por fundiciones y plantas que procesan minerales regresa al suelo por la gravedad o por la lluvia o nieve. El cobre no se degrada en el ambiente y por eso se puede acumular en plantas y animales cuando se encuentra en suelos. En suelos ricos en cobre sólo un número pequeño de plantas pueden vivir. Por esta razón no hay diversidad de plantas cerca de las fábricas o minas de cobre, debido a su efecto sobre las plantas, por lo que es una seria amenaza para la cadena alimenticia. El cobre puede seriamente influir en el proceso de ciertas suelos agrícolas, dependiendo de la acidez del suelo y la presencia de materia orgánica, puede interrumpir la 10 actividad en el suelo, su influencia negativa en la actividad de microorganismos y lombrices de tierra. Cuando el suelo está contaminado con cobre, los animales pueden absorber concentraciones que dañan su salud. Principalmente las ovejas sufren un gran efecto por envenenamiento con cobre, debido a que los efectos se manifiestan a bajas concentraciones. La acumulación de cobre en el hígado lleva a un daño progresivo de este órgano cuya expresión más severa es la cirrosis hepática. El depósito de cobre en el sistema nervioso central produce un daño neurológico, que en algunos aspectos se parece a la enfermedad de Parkinson, y que puede acompañarse de manifestaciones psiquiátricas. Al nivel de la córnea la acumulación de cobre se aprecia como un anillo parduzco pericórneal (anillo de KayserFleisher). El daño a los tejidos se puede disminuir sometiendo en forma temprana a los pacientes a una dieta con bajo contenido de cobre, junto con una terapia con compuestos que disminuyan su absorción (el más usado es el cinc) y medicamentos que favorezcan la eliminación del exceso utilizando agentes quelantes como el EDTA. 2.1.2. Efecto de los metales pesados en los suelos Los metales pesados son elementos químicos, presentes en todo tipo de suelo y sus niveles de abundancia se reporta en porcentajes y partes por millón. Cuando el nivel de su contenido en el suelo es por abajo de los límites permitidos como se muestra en el cuadro 1. Presenta un efecto inocuo en la vegetación y en las poblaciones microbianas, además también desempeña un papel biológico en diversas funciones de las células, lo que les ha 11 permitido estar agrupados bajo el nombre general de “micro-elementos”. Cuando el suelo tiene un nivel alto dentro de los límites permitidos de estos elementos, el término que se usa es el de metal pesado, provocando contaminación de suelos, en este caso se afecta a largo plazo a las plantas y a los microorganismos. Cuando el contenido de metales pesados en el suelo alcanzan niveles que rebasan los máximos permitidos causando efectos inmediatos como inhibición del crecimiento normal y el desarrollo de las plantas, y causa un disturbio funcional en otros componentes del ambiente así como la disminución de las poblaciones microbianas del suelo, el término que se usa o se emplea es “polución de suelos” (Martín, 2000; Kabata-Pendias, 1995). En el suelo, los metales pesados están presentes como iones libres, compuestos metálicos solubles, compuestos insolubles como óxidos, carbonatos e hidróxidos. Su acción directa sobre los seres vivos ocurre a través del bloqueo de las actividades biológicas, es decir, la inactivación enzimática por la formación de enlaces entre el metal y los grupos -SH (sulfhidrilos) de las proteínas, causando daños irreversibles en los diferentes organismos. Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre un ser vivo, éstos deben encontrarse disponibles para ser captados por éste, es decir que el metal debe estar biodisponible. El concepto de biodisponibilidad se encuentra íntimamente relacionado con las condiciones fisicoquímicas del ambiente, que determinan la especiación y por lo tanto la concentración de metal libre y lábil. Por ello es fundamental al determinar el grado de contaminación por metales pesados de un ambiente, conocer su biodisponibilidad, es decir, la concentración de metal libre presente en la muestra (Lloyd y Lovley, 2000). 12 Aproximadamente en un 10% de los metales se encuentran como contenido nativo pertenecientes a materiales de algunos suelos, pero más del 90% llegan al suelo por deposiciones atmosféricas secas y húmedas y como resultado de algunas prácticas agronómicas (Adriano, 1986). Algunos de estos metales como Cr, Cu, Co y Mo, son elementos traza esenciales para animales, microorganismos y plantas, mientras otros no lo son como Pb, Cd, Zn; sin embargo en altas concentraciones todos ellos son considerados tóxicos. Su biodisponibilidad y toxicidad a microorganismos incluyendo hongos micorrízicos, plantas y animales son influidos por diversos factores particularmente pH, temperatura, potencial redox, capacidad de intercambio catiónico de la fase sólida y competencia entre iones (Leyval et al., 1994; Schmit y Sticher, 1991). La contaminación en suelos por metales pesados ocurre cuando estos son irrigados con aguas procedentes de desechos de minas, aguas residuales contaminadas de parques industriales y municipales, filtraciones de presas de jales (Zier et al., 1999; Wang et al., 1992). Estos contaminantes pueden alcanzar niveles de concentración que provocan efectos negativos en las propiedades físicas, químicas y biológicas como: reducción del contenido de materia orgánica, disminución de nutrimentos, variación del pH generando suelos ácidos, amplias fluctuaciones en la temperatura, efectos adversos en el número, diversidad y actividad en los microorganismos de la rizósfera. También dificultan el crecimiento de una cubierta vegetal protectora favoreciendo la aridez, erosión del suelo, y la dispersión de los contaminantes hacia zonas y acuíferos adyacentes y como consecuencia aumenta la vulnerabilidad de la planta al ataque por insectos, plagas y enfermedades, afectando su desarrollo (Zhang et al., 2000; Cabrera et al., 1999). 13 El pH es un factor esencial, para que la mayoría de los metales tiendan a estar más disponibles en un pH ácido, excepto As, Mo, Se y Cr, los cuales tienden a estar más disponibles a pH alcalino es una variable importante para definir la movilidad del catión, debido a que en medios con pH moderadamente alto se produce la precipitación como hidróxidos. En medios muy alcalinos, pueden nuevamente pasar a la solución como hidroxicomplejos. La adsorción de los metales pesados está fuertemente condicionada por el pH del suelo y por tanto, también su biodisponibilidad de sus compuestos (Alloway, 1993). La textura favorece la entrada e infiltración de la contaminación de metales pesados en el suelo, por ejemplo la arcilla tiende a adsorber a los metales pesados, que quedan retenidos en sus posiciones de cambio, por el contrario los suelos arenosos carecen de capacidad de fijación de los metales pesados, los cuales pasan rápidamente al subsuelo y pueden contaminar los niveles freáticos. La materia orgánica, reacciona con los metales formando complejos de cambio y quelatos. Los metales, una vez que forman quelatos o complejos, pueden migran con mayor facilidad a lo largo del perfil del suelo. La materia orgánica puede adsorber tan fuertemente a algunos metales, como es el Cu, que pueden quedar en forma no disponible por las plantas, motivo por el cual, algunas plantas crecidas en suelos ricos en materia orgánica, presentan carencia de elementos como el Cu., Pb y el Zn, eso no significa que los suelos no estén contaminados ya que las poblaciones microbianas se reducen notablemente. 14 La complejación por la materia orgánica del suelo es una de los procesos que gobiernan la solubilidad y la bioasimilación de metales pesados. La toxicidad de los metales pesados se potencia en gran medida por su fuerte tendencia a formar complejos organometálicos, lo que facilita su solubilidad, disponibilidad y dispersión. La estabilidad de muchos de estos complejos frente a la degradación por los organismos del suelo es una causa muy importante de la persistencia de la toxicidad. Pero también la presencia de abundantes quelatos puede reducir la concentración de otros iones tóxicos en la solución del suelo (Adriano, 1986; Alloway, 1990; Jackson y Alloway, 1993; Licsko et al., 1999). Los metales pueden acumularse en tejidos vivos (bioacumularse) y luego ser transmitidos de una especie animal a otra a través de la cadena alimenticia. Por ejemplo, un árbol puede alimentarse de aguas subterráneas contaminadas con metales, acumular algunos de estos metales en sus hojas, y luego hay pájaros que se alimentan de estas hojas y que pueden verse afectados por la toxicidad de este metal (Cobb et al., 2000; Cabrera et al., 1987). La toxicidad de los metales en la plantas pueden causar reducción en las raíces, quemaduras en las hojas, deficiencia en los nutrimentos e incrementa su vulnerabilidad al ataque de enfermedades e insectos (Angle et al., 1997; Kumar et al., 1995; Roane et al., 1994). La utilización del lodo de aguas residuales en las regiones agrícolas aumenta la concentración de metales pesados en suelo. Los estudios sugieren que las cosechas de leguminosas, que dependen de la fijación simbiótica del N2, puedan ser sensibles a los efectos tóxicos de los metales pesados presentes en dichos lodos. Así, se ha observado la reducción en la nodulación, tamaño de la planta y actividad de la nitrogenasa en las plantas 15 del trébol blanco crecidas en un suelo altamente contaminado con Cd, Pb, y Zn (Rother et al., 1993). Otros estudios han demostrado los efectos tóxicos de metales pesados en la nodulación y actividad de la nitrogenasa (Vigue et al.,1991). Dado que el arsénico es relativamente soluble en los ácidos y sales de arsénico el mayor factor por controlar en la toxicidad del arsénico es su biodisponibilidad en el suelo y en la planta; el arsénico soluble en agua es más fitotóxico que otras formas estrechamente relacionadas (Sharpley, 1994). Los ácidos y sales de arsénico han sido usados en la elaboración de plaguicidas durante muchos años, sin embargo esta práctica actualmente ha dejado de utilizarse en el mundo. La química y disponibilidad del cadmio en plantas de suelos agrícolas han sido estudiados, un extenso parámetro de índices de la actividad biológica en suelos como la actividad enzimática, fijación de nitrógeno y desnitrificación son ampliamente investigados (Chaney et al., 2000), comparado con otros metales, el cadmio, es más movible en suelos en relación a la lixiviación y disponibilidad en las plantas. Pero el cadmio es menos absorbido por el suelo que el cobre, el níquel y el cinc, afortunadamente se encuentra presente en más bajas concentraciones en fertilizantes, estiércol y biosólidos que otros metales (Vigue et al., 1991). Según Chaney et al., (2000) entre los factores más importantes encontrados que influyen en absorción del cadmio por las plantas son las propiedades del suelo como materia orgánica, pH, proporción Cd:Zn, niveles de hidruros de fierro, óxidos de manganeso, el nitrógeno 16 aplicado, niveles de cadmio en fertilizantes con fosfatos. El cinc provee protección contra la transferencia del cadmio hacia la cadena alimenticia, por medio de su potencial para la fitotoxicidad e inhibición de la absorción y translocación del cadmio en las plantas. Debido a que el cinc y el cadmio son acumulados por las plantas en la proporción que se presentan con elevadas concentraciones de cinc y cadmio, la máxima concentración foliar de cadmio es limitada por la fitotoxicidad del cinc. Aunque el cinc limita la máxima concentración de cadmio en las plantas y protege la cadena alimenticia, la proporción Cd:Zn acerca de 0.010, solo el arroz y el tabaco son capaces de transferir altos niveles de cadmio del suelo en forma biodisponible por ejemplo cuando se fuma el tabaco se puede transferir cadmio hacia los pulmones (Chaney et al., 2000). El Cd y el Zn pueden llegar a las plantas y de ahí pasar al resto de la cadena trófica. Son elementos bastante móviles. La contaminación por cadmio sin contaminación por cinc o cobre es rara, el cadmio es incapaz de alcanzar los niveles fitotóxicos en suelos agrícolas antes de que lo haga el cinc, reportándose concentraciones de metales en las plantas fuera de los límites permisibles. De una manera u otra, la salud animal y humana son amenazadas con las concentraciones de cadmio y cinc (Chaney et al., 2001; Chaney, 1993). Se han realizado numerosas revisiones de literatura con respecto a la fitotoxicidad provocada por metales. Steinborn (1999) estudió la fitotoxicidad por arsénico y encontró que diferentes concentraciones de este elemento reducen la producción vegetal. Por ejemplo < 25 mg/kg de arsénico en el suelo reducen la producción de frijol en un 14%; mientras que en otro estudio se encontró que 414 mg/kg de As la redujo en un 30%. 17 El cobre, níquel y cinc pueden ser tomados del suelo por las plantas a niveles potencialmente tóxicos. Existen varios reportes acerca de la toxicidad de estos elementos: (Chaney et al., 1997; Chaney, 1990) expresó una ligera evidencia de toxicidad por Cu o Zn en pruebas de campo con aplicaciones por arriba de 213 mg Cu/ha y 1610 mg Zn/ha. Por su parte Bertí y Huang (1995) reportaron toxicidad severa de Zn y Ni en maíz, sorgo y frijol por acumulación de metal de 2100 mg Ni/ha y 11300 mg Zn /ha. El maíz es altamente sensible a los metales pesados y la producción puede verse reducida hasta en un 50%. En la agricultura debe prestarse atención a la contaminación por cinc con los lodos de clarificación que se distribuyen sobre terrenos a cultivar, si es necesario, debe desistirse de la explotación agrícola, ya que las plantas pueden acumularlo y llevar de esta manera la contaminación al ser humano a través de la cadena alimentaría, lo que significa un riesgo para su salud (Chaney, 1994), se puede detectar su acumulación en los suelos hasta un radio de varios kilómetros de distancia de las plantas metalúrgicas, la acumulación en las plantas produce necrosis y clorosis e inhibe el crecimiento. Con el propósito de interpretar el nivel de los metales pesados en el suelo, solo han sido considerados los valores iniciales de su contenido: valores analíticamente determinados tanto en suelos normales no afectados por el impacto antropogénico como en suelos afectados. Los valores que representan los límites máximos permitidos de concentración de metales pesados en suelos fueron establecidos, principalmente aplicable al crecimiento y desarrollo de plantas. Los lÍmites máximos permitidos fueron establecidos en Alemania, de acuerdo con los resultados obtenidos de laboratorio, invernadero y experimentos de campo 18 (Cuadro 1). De acuerdo con Kloke (1980) y Chumbley (1991) los límites máximos permitidos siguen siendo utilizadas en muchos países, como Holanda, Austria, Canada, Japón y Estados Unidos de América. Cuadro 1. Intervalos del contenidos de los límites normal y máximo permitidos de los metales pesados en los suelos (Kloke 1980). Intervalo de contenido normal Límites máximos permitidos Elementos p.p.m. químicos Cadmio 0.1 - 1.0 3.0 Cobalto 1 - 10 50 Cromo 2 - 50 100 Cobre 1 - 20 100 Níquel 2- 5 50 Plomo 0.1 - 20 100 3 - 50 300 Cinc En Polonia se ha evaluado la contaminación estableciendo un índice de contaminación/ polución (c / p) que se obtiene dividiendo la concentración de metal en el suelo y el límite permitido, dando como resultado cinco clases de polución en suelos: 1) Ligera 2) Moderada, 3) Considerable, 4) Muy contaminados y 5) Extremadamente contaminados, (cuadro 2). La clase 3, suelos considerablemente contaminados, presentará riesgo de 19 contaminación en cultivos. La clase 4 corresponde a suelos que no deben usarse para la producción de plantas utilizadas en alimentación, sobre todo si se trata de suelos ácidos y de textura ligera. La clase 5 debería excluirse de cualquier uso agrícola y proceder, dentro de lo posible, a su limpieza (Raskin et al., 1994; Kabata - Pendias, 1995). Cuadro 2. Clasificación de contaminación y polución (c/p) de suelos (Kabata - Pendias 1995). Índice c/p 0.1 0.10 – 0.25 0.26 – 0.50 0.51 – 0.75 0.76 – 1.00 1.1 – 2.0 2.1 – 4.0 4.1 - 8.0 8.1 – 16.0 16.0 Significado Contaminación muy leve Contaminación leve Contaminación moderada Contaminación severa Contaminación muy severa Polución leve Polución moderada Polución severa Polución muy severa Polución excesiva . Los metales pesados incorporados al suelo pueden seguir cuatro diferentes vías: pueden quedar retenidos en el suelo, ya sea disueltos en la solución del suelo o bien fijados por procesos de adsorción, complejación y precipitación pueden ser absorbidos por las plantas y así incorporarse a las cadenas tróficas pueden pasar a la atmósfera por volatilización pueden movilizarse a las aguas superficiales o subterráneas (Fig. 2 ). 20 Figura 2. Esquema mostrando la contaminación por metales pesados en el suelo (Calvo de Anta, 1997). 2.2. Estrategias de remediación de suelos por métodos químicos y físicos La contaminación del suelo por metales pesados representa un grave problema a nivel mundial, debido a ello se han desarrollado tecnologías para reducir y/o enmendar el riesgo de la contaminación de agua y suelos contaminados con metales pesados. La contaminación de suelos por metales puede ser remediada por técnicas químicas, físicas y biológicas y son 21 agrupadas en dos categorías: a) in situ, este método remedia el suelo contaminado sin la remoción del mismo y b) técnicas ex situ, las cuales por el tratamiento los suelos contaminados requieren ser removidos del sitio. Las técnicas in situ tienen mayores ventajas que las de ex situ debido a su bajo costo y a su reducido impacto en el ecosistema (Chen et al., 1997). La remediación del suelo es necesaria para eliminar o disminuir los riesgos a los humanos y al ambiente de la toxicidad de los metales. Las enfermedades en el hombre son el resultado de la alta concentración de Cd , Se, Zn, Cu, Cr, y Pb en suelo (Chaney et al., 1999), el ganado y la fauna son dañados por estos metales (Raskin et al., 1994). La contaminación del suelo con Zn, Ni y Cu causada por desechos de minas y fundidoras es conocida la sensibilidad de las plantas (Chaney et al., 1999). Las estrategias físicas y químicas de remediación más utilizadas para eliminar y/o reducir los contaminantes del suelo son: extracción, sellado, incineración, excavación, tratamiento químico y tratamiento electroquímico. No obstante, muchas de estas tecnologías son costosas ya que su precio estimado de la recuperación de suelos en el mercado en Estados Unidos de América fue aproximadamente de1-2 millones en 1997 incrementándose a 15-25 millones en el 2000 y probablemente 70 – 100 millones en 2005 (Cunninghan, 1996; Glass, 2000; McGrath et al., 2001). Ciertas técnicas especializadas pueden exceder sus costos de 1000 dólares por tonelada, la excavación de contaminantes, tiene un costo promedio de 1000 000 dólares por acre y su 22 eficacia es moderada, destruyendo la estructura del suelo así como su fertilidad, o la más lamentable esparciendo la contaminación a sitios no contaminados (Adriano, 1996; Alloway, 1993; McGrath et al., 1997; Raskin, 1997; Chaney et al., 2001). El problema es más severo particularmente cuando grandes aéreas están contaminadas con radionucleótidos, como por ejemplo las áreas alrededor del reactor nuclear de Chernobyl. 2.2.1. Remediación de suelo por extracción La extracción entre las más conocidas son el “Soil Washing” ó lavado de suelos, se realiza habitualmente en depósito. Se basa en una separación o una reducción del volumen. El rendimiento depende de la solubilidad de los compuestos contaminantes en la solución de lavado que se utilice. Otra de las técnicas es conocida como “Soil Vacuum”. Se produce una extracción de los contaminantes y se utiliza para eliminar compuestos orgánicos volátiles y mercurio. Para potenciar la eficacia se puede utilizar además vapor de agua, una modificación es la técnica de “Soil Venting”, donde se combina el efecto de extracción con la inyección de aire. En este tipo de técnicas las características físicas y químicas del suelo pueden alterar la eficacia de la técnica (Burns et al., 1996). 2.2.2. Remediación de suelo por sellado La técnica del sellado trata al suelo con un agente que lo encapsula y lo aísla. El suelo es excavado, la zona se sella con un impermeabilizante y se redeposita el suelo. Para desarrollar las barreras de aislamiento se ha utilizado diversas sustancias, como el cemento, 23 cal, plásticos, arcilla, etc. El procedimiento tiene el inconveniente que se pueden producir grietas por las que los contaminantes pueden fugarse. Sometiendo al suelo a altas temperaturas (1600-2300°C) se consigue su vitrificación con lo que se llegan a fundir los materiales del suelo, produciendose una masa vítrea similar a la obsidiana. Durante el proceso hay que controlar la volatilización de numerosos compuestos. La propia filosofía de estas técnicas (persigue la eliminación del suelo) las hace sólo recomendable en situaciones extremas. En otras ocasiones se realiza el aislamiento directamente sobre los niveles de aguas freáticas y mediante bombeos exhaustivos se consigue deprimir los niveles freáticos para alejarlos del suelo y subsuelo contaminados (Huang et al., 1998). 2.2.3. Remediación de suelo por incineración La incineración es una técnica apropiada para el tratamiento de residuos principalmente para la fracción orgánica y combustible. Esta técnica reduce considerablemente el volumen y la peligrosidad de los residuos. Sin embargo, debe considerar el tratamiento de las emisiones atmosféricas, de los residuos líquidos; así como mismo la disposición apropiada de las cenizas y escorias que se generan en el proceso. La incineración de residuos no sólo se utiliza como una alternativa de tratamiento sino que también para el aprovechamiento del poder calorífico contenido en los residuos. Algunos procesos productivos, especialmente los de producción de cemento y de cal, presentan a nivel mundial una experiencia importante en coincineración de residuos como combustibles 24 alternativos, en forma complementaria al combustible tradicional. En nuestro país, algunas instalaciones ya realizan operaciones de coincineración de residuos y en el futuro se espera que otras empresas productoras de cemento, cal y de productos forestales comiencen a utilizar residuos como combustible, debido al menor costo que implica la utilización de estos compuestos en la generación de calor (Adriano, 1992). La incineración genera emisiones atmosféricas de contaminantes orgánicos e inorgánicos, en forma de gases y partículas presentando un riesgo a la salud de la población expuesta. Su dispersión puede darse a escala local y regional y su posterior deposición puede significar un riesgo al patrimonio ambiental o a otras actividades productivas. Dependiendo de los residuos utilizados, las emisiones a la atmósfera corresponderán a partículas totales en suspensión cuya composición química puede estar formada por metales pesados y sus compuestos u otras sustancias orgánicas e inorgánicas. Asimismo, las emisiones pueden corresponder a sustancias en forma de gases, entre ellos los compuestos clorados y fluorados (Cunningham et al., 1996). 2.2.4. Tratamiento químico De acuerdo con Adriano (1986) el tratamiento químico es un método útil para: hidrocarburos, aldehídos, ácidos orgánicos, fenoles, cianuros y plaguicidas organoclorados. Éste trata de depurar el suelo mediante la degradación de los contaminantes por reacciones 25 químicas. Frecuentemente se trata de reacciones de oxidación de los compuestos orgánicos. Como agente oxidante se emplea el oxígeno y el agua oxigenada. Este tratamiento se utiliza preferentemente in situ, inyectando el agente depurador a zonas profundas mediante barrenas huecas, o a veces, simplemente mediante un laboreo apropiado del terreno. Otro procedimiento químico es la descloración. Esta técnica se utilizó, en un principio, para la estabilización de productos del petróleo. En suelos se ha empleado para la descloración de PBC. Consiste en la inyección de CaO, Ca(OH)2 o NaOH. El suelo al reaccionar se calienta y al aumentar el pH hasta valores de 9 a 11 se produce la descloración de los PBC (Adriano, 1986). 2.2.5. Remediación de suelo por tratamientos electroquímicos El tratamiento electroquímico es un procedimiento a realizar in situ, el desplazamiento de los contaminantes se logra mediante la creación de campos eléctricos. Consiste en introducir, a suficiente profundidad electrodos en el suelo. Los contaminantes fluyen desde un electrodo a otro siguiendo las líneas del campo eléctrico. En el tratamiento de desechos peligrosos, la electrólisis se usa ampliamente para los metales como cadmio, cobre, oro, plomo, plata y cinc. La recuperación de metales por electrolisis por la electro-deposición directa, reduciendo particularmente metales. Un ejemplo específico es la remoción 26 electrolítica de cadmio y níquel en agua contaminada por desechos de baterías usando electrodos fibrosos de carbono (Abda y Oren, 1993). 2.3. Remediación de suelos por métodos biológicos 2.3.1. Biorremediación Los métodos tradicionales para la remediación de sitios contaminados se ha demostrado que además de ser costosos a menudo no son eficaces. La biorremediación aparece como una técnica alternativa efectiva y de bajo costo en el intento de mitigar y reducir la contaminación de compuestos orgánicos e inorgánicos, recurriendo a sistemas biológicos, tales como plantas, hongos, enzimas y bacterias que sustituyan a las actuales estrategias de enmienda de suelo y agua (Chaney et al., 1999; Garbisu y Alkorta, 1997; Rao et al., 1996). El biorremedio aprovecha la diversidad y versatilidades genéticas de los microorganismos para producir rupturas o cambios moleculares en los contaminantes generando compuestos de menor o ningún impacto ambiental (Khan, 2000; Saxena et al., 1999; Wenzel et al., 1999; Brown, 1998; Cunningham, 1996; Meeussen et al., 1994; Alloway, 1993; Adriano, 1992; Adriano, 1986). Estos cambios ocurren usualmente en la naturaleza, sin embargo su velocidad es baja, mediante una adecuada manipulación estos sistemas biológicos pueden ser optimizados para aumentar la velocidad de cambio o degradación y así usarlos en sitios con una elevada concentración de contaminantes de importancia ambiental en suelos, aguas y aire 27 (McGrath, 2001; Khan, 2000; De Oliveira y Narasimha, 1999). Una gran cantidad de contaminantes como plaguicidas, herbicidas, petróleo, gasolina y metales pesados pueden ser eliminados por biorremediación (Lasat, 2002; McGrath et al., 2001; Reed, 1992). Al incremento del uso de la biorremediación como una estrategia sostenible y económica, se le está prestando una particular atención, principalmente en Europa y Estados Unidos de América (Khan y Kuek et al., 2000 ). 2.3.2. Fitorremediación El concepto de usar plantas para limpiar suelos contaminados no es nuevo, desde hace 300 años las plantas fueron propuestas para el uso en el tratamiento de aguas residuales (Hartman,1975). En Rusia en los años 60´s se realizaron investigaciones utilizando plantas para recuperar suelos contaminados con radionucleótidos. Existen reportes sobre el empleo de plantas acuáticas en aguas contaminadas con plomo, cobre, cadmio, hierro y mercurio. La remediación de la acumulación de metales pesados en suelos utilizando plantas es también ampliamente reconocida (Ernst, 2000). La fitorremediación (el prefijo fito- significa planta) es una estrategia que se utiliza en la remediación de suelos contaminados (Chaney, 1997), es un proceso de descontaminación que involucra el empleo de plantas que pueden remover, transferir, estabilizar, descomponer y/o degradar contaminantes de suelo, sedimentos y agua, como solventes, plaguicidas, hidrocarburos poliaromáticos, metales pesados, explosivos, elementos 28 radiactivos, fertilizantes, para hacerlos más biodisponibles para la planta (McGrath et al., 2001; Macek et al., 2000; Mench et al.,1999; Raskin et al., 1994; Chen, et al.,1990). Esta técnica se encuentra todavía en su etapa inicial de investigación y de desarrollo, el número de pruebas de campo realizadas hasta la fecha es no obstante pequeña (Brown et al., 2003; Chen, 2000; Chaney et al., 1999), está surgiendo como un método terapéutico atractivo debido a su simplicidad el costo relativamente bajo. Además de la remoción de contaminantes, la limitación de ofrecimientos de técnicas de lixiviación del suelo, facilitando su mejora o el mantenimiento de estructura y propiedades, así como su fertilidad, hay también la posibilidad de bio-recuperación de ciertos contaminantes como por ejemplo metales pesados (Chaney et al., 2000; Watanabe, 1997). Aunque el conocimiento básico de que las plantas pueden ser usadas para remediación del ambiente ha sido desde décadas pasadas, solo recientemente ha sido reconocido completamente el valor de las plantas acumuladoras de metales en la recuperación de suelos contaminados (Salt et al., 1997). Después de una minuciosa investigación, la fitorremediación se esta convirtiendo en una tecnología alternativa de remediación de suelos contaminados realmente útil económica y efectiva (Watanawe, 1997). Esta nueva técnica de enmienda esta basada en prácticas agronómicas, es rápida y eficiente, y consiste en cultivar plantas en un lugar contaminado, después cosecharlas y estas plantas llenas de metales pesados, estás podrían venderse a compañías de energía eléctrica como fuente de biomasa para generar energía, la que a su vez podría generar una ganancia. Las cenizas resultantes de la incineración también se 29 podrían ser llevadas a una fundición para recobrar el metal y nuevamente crear un flujo de ingresos (Raskin et al., 1997; Salt et al., 1995; Crowley et al., 1991). Según Jentschke (2000), los árboles pueden realizar una acción de bombeo orgánico cuando sus raíces se extienden hacia la capa freática, formando una masa densa de raíces que absorbe una gran cantidad de agua. Los álamos, por ejemplo, absorben 113 litros de agua por día, y hay una variedad de álamo (Populus deltoides) que absorbe hasta 1325 litros por día. La acción de bombeo de las raíces disminuye la tendencia de los contaminantes superficiales al descender hacia el agua subterránea y el agua potable. En zonas agrícolas, los álamos plantados a lo largo de cursos de agua reducen el excedente de fertilizantes y herbicidas que contienen dichas aguas. Asimismo, los árboles plantados en vertederos como sustitutos orgánicos de la tradicional capa de arcilla o de plástico absorben agua de lluvia que, de lo contrario, se filtraría por el vertedero y llegaría al fondo en forma de "lixiviado" contaminado (Drake et al., 1999; El-Dermerdash et al., 1994). Esta novedosa tecnología, tiene muchas ventajas con respecto a los métodos convencionales de tratamientos de lugares contaminados; en primer lugar es una tecnología económica, de bajo costo, en segundo lugar posee un impacto regenerativo en lugares en donde se aplica y en tercer lugar su capacidad extractiva se mantiene debido al crecimiento vegetal. Además es capaz de ser modificada para aumentar su capacidad y selectividad extractiva, un caso bien conocido es la modificación genética de Arabodopsis thaliana para reducir ion mercurioso (Pawlowska et al., 2000; De Olivera, 1999; Salt et al., 1998; Kumar et al., 1995; Baker et al.,1994). 30 Los beneficios derivados de esta estrategia de fitoenmienda abarcan los sectores del ambiente, la salud, industria y energía. Las pruebas científicas han confirmado la validez de esta estrategia y se han emprendido gestiones para obtener financiamiento para los crecientes esfuerzos puestos en marcha en varios países (Chaney, 1997). Es importante reconocer que la fitorremediación ofrece ventajas adicionales a la limpieza de suelos y mantos freáticos al emplear alguno de los siguientes mecanismos: Incremento de la actividad y población microbiana en el subsuelo, que eleva la cantidad de carbón orgánico. Mejoras en la aeración del suelo por la liberación de oxígeno por las raíces. El retraso del movimiento e intercepción de compuestos orgánicos y algunos metales. Estimulación de las transformaciones de compuestos tóxicos a compuestos de menor toxicidad. Captación de hidrocarburos volátiles por las hojas, que sirven de “tapadera” a los lugares contaminados. Los suelos contaminados por metales son notoriamente difíciles de remediar, debido al alto costo, no saben que hacer con el suelo contaminado, por lo que la fitorremediación es una alternativa con un costo efectivo; varios análisis han demostrado que el costo de fitoextracción de metales es sólo una fracción de aquellos asociados con técnicas de ingeniería convencionales. Además, debido a que remedia el suelo in situ, la fitorremediación evita una ruptura dramática del terreno y preserva el ecosistema (Lasat, 2002). La fitorremediación no es un remedio para todos los suelos contaminados, antes de que esta tecnología pueda volverse técnicamente eficiente y costo-eficaz, hay algunas limitaciones que necesitan ser superadas como por ejemplo, sus mecanismos tanto moleculares, bioquímicos y fisiológicos son pocos conocidos e insuficientemente entendidos, sus 31 procesos como hiperacumuladoras, un gran número de plantas hiperacumuladoras todavía pueden descubrirse e identificarse (Freitas et al., 2004; Prasad y Freitas, 2003; Raskin et al., 1994). El proceso del fitorremediación es lento porque el índice de acumulación es directamente proporcional al de crecimiento de la planta, porque no hay planta con todas las características adecuadas con los criterios ideales de una hiperacumladora eficaz (crecimiento rápido y raíces extensas de biomasa alta, fáciles de cosechar, plantas acumuladoras de una amplia gama de metales tóxicos), por lo que es necesario introducir sistemas biológicos como la simbiosis entre hongos micorrízicos y las plantas para coadyuvar en la recuperación de suelos contaminados, o más aun modificarlas genéticamente para mejorarlas y sean empleadas satisfactoriamente como agentes en el proceso de fitorremediación (Clemens et al., 2002; Maagher et al., 2000; Lovley y Coates, 1997). 2.3.3. Plantas hiperacumuladoras de metales pesados Todas las plantas poseen un potencial para absorber una amplia variedad de metales del suelo pero la mayor parte de las plantas tienden solamente a absorber los que son esenciales para su supervivencia y desarrollo. Existe una notable excepción de esta regla de un pequeño grupo de plantas que pueden tolerar, absorber, y translocar altos niveles de ciertos metales, estas plantas reciben el nombre de hiperacumuladoras (Chen et al., 2001). 32 El concepto de "planta hiperacumuladora" fue establecido por R.R. Brooks y sus colaboradores en 1977, quienes fueron los pioneros en el estudio de plantas que pueden acumular metales. Una definición propone que si una planta contiene más de 0.1% de Ni, Co, Cu, Cr y Pb o 1% del Zn en sus hojas sobre una base del peso seco, ésta puede ser llamada una “hiperacumuladora”, independientemente de la concentración del metal en el suelo (Robinson et al., 2003; Chaney et al., 2000; Chaney et al., 1997; Peters y Shem, 1994; Baker y Brooks, 1989; Baker et al., 1988; Chaney, 1983; Brooks et al., 1979). Las primeras plantas hiperacumuladoras caracterizadas son miembros de las familias Brasssicaceae y Fabaceae. La idea de usar plantas para extraer metales de suelos contaminados fue reintroducida y desarrollada por Chaney (1983) y el primer ensayo en el campo de la fitoextración fue conducido en 1991. La especie Thlaspi caerulescens (carrespique) y Viola calaminaria son especies de plantas documentadas por acumular elevados niveles de metales en sus hojas (Baumann, 1985). De acuerdo con Salt et al., (1998), se establece que el botánico A. Baumann, trabajando en los límites entre Bélgica y Alemania observó las hojas de ciertas especies de plantas que crecían en suelos enriquecidos naturalmente con cinc y conteniendo altas concentraciones de este elemento. Las especies que particularmente registró fueron la violeta (Viola aclamaria ) y la mostaza (Thlaspi calaminare) recientemente clasificada como Thlaspi caerulescens. Las cuales contenían cerca de 1 y 1.7% de cinc en el peso seco de las hojas. Estas fueron comparadas con los niveles de cinc entre 0.001 y 0.02% del peso seco de hojas de otras plantas. 33 Los estudios realizados en Estados Unidos de América reportaron al selenio como un componente de la planta responsable de trastornos en ciertos animales en Dakota del Sur. Esta investigación indujo al descubrimiento de plantas capaces de acumular selenio arriba de 0.6% en la biomasa seca de los brotes. Una década mas tarde dos botánicos italianos, Minguzzi y Vergnano (1948) descubrieron plantas que acumulaban níquel, ellos observaron que las hojas secas de Alyssum bertolonii que crecían en suelos serpentinos ricos en níquel, cerca de Florencia Italia contenían alrededor de 1% de níquel, por arriba de 100 a 1000 veces más alto que otras plantas que crecían cercanas al sitio. El Dr. Rufus L. Chaney encabeza en los Estados Unidos de Norteamérica los estudios para evaluar plantas llamadas “hiperacumuladoras” que absorben grandes cantidades de metal de los suelos. En esas investigaciones se encontró una especie conocida como Thlaspi caerulencens, que acumula hasta 30 000 partes por millón (ppm) de zinc y hasta 6000 ppm de cadmio en sus hojas, sin reducir el rendimiento de la planta (Brown et al., 1995). También se ha demostrado la tolerancia al cadmio en el diente de león (Taraxacum officinale) (Kabir y Koide, 2000; Kuleff y Djingova, 1991). Otras especies como Chichorium intybus, Erigeron canadensis y Eupatorium capillifolium han sido investigadas como especies indicadoras de cadmio, cromo, níquel o vanadio, es decir como especies que indican la biodisponibilidad de estos metales contaminantes, por incorporarlos sin mostrar síntomas de toxicidad. El Amaranthus reflexus ha demostrado ser efectiva en absorber el amenazador cesio-137 radiactivo, también resulta muy prometedora como hiperacumulador de plomo, por su parte el helecho originario de Florida, Pteris vittata es capaz de absorber 34 el peligroso arsénico, lo más curioso es que el helecho crece mejor en suelos que contienen elevadas cantidades de arsénico que en los que carecen de él (Martín et al., 1996) El cadmio se puede acumular en girasol, Helianthus annuus (Davies et al., 2001; Simón, 1998). El girasol es una rizofiltradora potencial de cadmio, níquel, cobre, cinc, cromo y plomo; así como de radioisótopos (Brooks, 1998). Existen plantas que al mismo tiempo que son hiperacumuladoras de cobre, lo son del cobalto, entre ellas algunas especies de la familia Asteraceae (Brooks 1998). El girasol (Helianthus annuus L.) es la especie que absorbe los metales pesados en mayor cantidad en sus raíces que en sus brotes si se cosecha la biomasa entera de la planta, por lo que se considera una planta hiperacumuladora favorable en la fitoextracción de Cd, Zn, Pb y elementos radiactivos (Christie et al., 2004; Reeves, 2003; Davies, 2002; Cabrera et al., 1999; Kumar et al., 1995). Desde el punto de vista ecológico el papel de las plantas hiperacumuladoras no está aun completamente claro, pero se ha sugerido que éstas suministran protección contra el ataque de hongos patógenos e insectos. Las recientes evidencias han confirmado la función de protección de la acumuladora de níquel contra hongos y bacterias patógenos en Steptanthus polygaloides e insectos herbívoros en S. polygaloides y T. montanum (Li et al., 2003). El efecto contra los insectos herbívoros está bien demostrado en Thlaspi caerulescens, que es una planta hiperaculadora de cinc. Con esta extraordinaria habilidad las plantas hiperacumuladoras de metales pueden ser usadas en actividades de remediación en el ambiente, además que constituyen un importante recurso biológico en las futuras revegetaciones y fitorremediaciones de áreas 35 contaminados con metales pesados. Sin embargo las aplicaciones máximas todavía no se han logrado, una razón importante es la falta de conocimientos de los mecanismos moleculares y procesos biológicos involucrados que permiten tolerar, la adquisición, el transporte y acumulación de los metales en las planta, incluso que se puedan alimentar de los metales (Lovley, 1997). En las últimas décadas, la intensa búsqueda se ha conducido a investigar la biología de fitoextración de metal, pero a pesar de los sucesos significativos, la comprensión del mecanismo de las plantas que permiten la extracción del metal emergen lentamente. El suceso natural de especies de plantas capaces de acumular extraordinariamente altos niveles concentraciones hace de la investigación un proceso particularmente interesante. Como resultado, se están obteniendo los primeros avances para la comprensión de los mecanismos a nivel molecular por los cuales las plantas son capaces de tolerar los excesos y absorber metales pesados, que serían venenos peligrosos para otras especies, mientras que las hiperacumuladoras los incorporan como nutrientes (Huang et al., 1997) Hasta el momento, se ha descubierto que algunas moléculas facilitan el transporte de los metales pesados al interior de la planta a través de las raíces, por procesos de absorción en las vacuolas que aumentan su biodisponibilidad para las plantas, son conocidas como agentes quelantes como EDTA y DTPA (Chen et al., 2001; Khan et al., 2000; Turnau et al., 1998; Huang et al., 1997; Leyval et al.,1995), que son capaces de formar iones complejos con el metal facilitando en gran medida la absorción, estas sustancias pueden ser producidas por la propia planta y liberadas al suelo a través de las raíces. De acuerdo con 36 Leyval et al., (1997) la absorción de los metales pueden ser ayudadas por microorganismos como hongos micorrízicos. Los genes responsables de la hiperacumulación de los metales en los tejidos finos de la planta se han identificado y se han reproducido. El metabolismo del glutatión y de los ácidos orgánicos desempeñan un papel dominante en plantas en tolerancia de los metales. El glutatión es un componente de bacterias, plantas y animales. En el proceso de fitorremediación de metales en el ambiente, los ácidos orgánicos desempeñan un papel importante en tolerancia del metal (Hall, 2002) De acuerdo con Pilon-Smits et al., (2002) las estrategias genéticas en la producción de las plantas transgénicas y el papel que desempeñan los microorganismos contribuyen a la importancia en el proceso de fitorremediación, así como el desciframiento completo del genoma de Arabidopsis, además de los intensos estudios moleculares que se están llevando a cabo sobre Thlaspi, y el conocimientos de algunos genes implicados en las absorción y en la tolerancia a algunos metales específicos, resultan muy prometedores en la obtención de las primeras variedades de plantas transgénicas con capacidades hiperacumuladoras mejoradas (Zhu et al., 1999). A pesar de los subsecuentes reportes de investigaciones que afirman la identificación de plantas acumuladoras de elevados niveles de cobalto, cobre, manganeso y plomo están bien descritas (Baker y Brooks, 1989). Sin embargo la existencia de plantas hiperacumuladoras de metales como níquel, cinc y selenio son cuestionadas continuamente y requieren futuras investigaciones (Salt, 1998). 37 En fitorremediación se necesitan plantas de rápido crecimiento con una alta capacidad de incorporación de metales y una rápida ganancia de biomasa, para que puedan interferir en la biodisponibilidad de metales tóxicos en suelos y las limitaciones de las plantas hiperacumuladoras son pequeña biomasa radicular, su restringida selectividad de los elementos, el minúsculo conocimiento acerca de la agronomía, la genética y las enfermedades de éstas plantas. En su gran mayoría las plantas que acumulan metales son especies silvestres pequeñas en tamaño y tienen las tasas de crecimiento lento como ejemplo se tiene a Thlaspi caerulescens, que es una planta no micotrófica y de lento crecimiento son características que limitan el porcentaje de la fitoextracción. (Baker y Walker, 1997). Otras plantas acumuladoras con abundante biomasa son micotróficas tales como girasol y sauce, por lo que ahora reciben mayor atención que asociadas con HMA son tolerantes a metales y pueden por lo tanto ser consideradas para descontaminar suelos levemente contaminados. La asociación de las plantas con hongos micorrízicos representa una serie de importantes ventajas entre las que destacan protección contra ataque de parásitos y enfermedades, mayor área de extensión de las raíces facilitando la absorción de nutrimentos así como también contaminantes inorgánicos y orgánicos (Leyval et al., 2001; Ernst, 2000). Actualmente las plantas hiperacumuladoras identificadas son 397, este número puede ser cambiado en el futuro, ya que más plantas que crecen en suelos ricos en metales son investigadas, en la mayoría de los casos, no se trata de especies raras, sino de cultivos comunes que se han ensayado con éxito como posibles especies fitorremediadoras en el futuro como son la alfalfa, la mostaza, el tomate, la calabaza, el esparto, el sauce y el 38 bambú. Las principales familias a las que pertenecen las plantas hiperaculadoras se mencionan a continuación: Asteraceae, Aceraceae, Poaceae, Brassicaceae, Betulaceae, Convolvulaceae, Cyperaceae, Fabaceae, Malvaceae y Oleaceae. (De Oliveira y Vara, 1999) El gran interés despertado por las plantas hiperacumuladoras, especialmente para destoxificar un ambiente contaminado, obliga también a resolver otros problemas relativos a otras disciplinas, hace hincapié en ello y destaca que, cuando se potencie la investigación conjunta de diversos campos como botánica, fisiología vegetal, agronomía, química y genética, probablemente se inicie un brillante futuro para la fitorremediación. El entorno de las plantas hiperacumuladoras revela la necesidad de impulsar mayores conocimientos multidisciplinarios que aumenten la rentabilidad y eficacia de dichas plantas: sus aplicaciones son interesantes en muchas áreas, y particularmente importantes en la protección del ambiente (Lasat, 2002). Los recientes investigaciones sobre la glomalina que es una glucoproteína que se encuentra en las hifas de los hongos micorrízicos (Wright y Upadhayaya, 1996), han contribuido de manera considerable en la recuperación de suelos contaminados por metales pesados, ya que acuerdo con (González-Chávez et al., 2002) la glomalina puede atrapar elementos potencialmente tóxicos. El glutation es un antioxidante constituido por aminoácidos cisteina, glicina y ácido glutámico que fijan los metales pesados, los ácidos orgánicos forman los complejos con los metales, un proceso de la desintoxicación del metal por lo que la glomalina, el glutatión y los ácidos orgánicos desempeñan un papel dominante en tolerancia del metal por las plantas. Las estrategias genéticas y las plantas transgénicas, las 39 pruebas en la producción y el campo microbiológico traerán la importancia del campo de recuperación de suelos contaminados (Hall, 2002). 2.3.4. Categorías de la fitorremediación La fitorremediación de acuerdo con Salt et al., (1998) generalmente se divide en las siguientes áreas: Fitoextracción, fitovolatilización, rizofiltración fitodegradación, y fitoestabilización que se describen a continuación (Fig. 3). Fig. 3. Categorías de fitorremediación de suelos contaminados (Lasat, 2002). La fitoextracción, conocida también como fitoacumulación, es la captación de metales contaminantes por las raíces de las plantas y su acumulación en tallos y hojas. Algunas plantas absorben cantidades extraordinarias de metales en comparación con otras. Se 40 selecciona una de estas plantas o varias de este tipo y se plantan en un sitio según los metales presentes y las características del lugar. Después de un tiempo, cuando las plantas han crecido, se cortan y se incineran o se deja que se transformen en abono vegetal para reciclar los metales. Este procedimiento se puede repetir la cantidad de veces que sea necesario para reducir la concentración de contaminantes en el suelo a límites aceptables. Si se incineran las plantas, las cenizas deben colocarse en un vertedero para desechos peligrosos, pero la cantidad de ceniza será sólo alrededor del 10% del volumen de los desechos que habría que eliminar si se excavara el suelo contaminado para tratarlo (Robinson et al.,2002; Khan et al., 2001; Chaney et al., 1997). La fitovolatilización se produce a medida que los árboles y otras plantas en crecimiento absorben agua junto con contaminantes orgánicos. Algunos de los contaminantes pueden llegar hasta las hojas y evaporarse en la atmósfera. Los álamos, por ejemplo, evaporan el 90% de los contaminantes que absorben (Raskin et al., 1997) La rizofiltración es una técnica prometedora para abordar el problema de la contaminación del agua con metales. La rizofiltración es similar a la fitoextracción, pero las plantas que se usan para la limpieza se cultivan en invernaderos con las raíces en agua, en lugar de suelo. Cuando las plantas tienen un sistema radical bien desarrollado, se recoge agua contaminada de un vertedero, se transporta hasta el lugar donde están las plantas y las plantas se colocan en esta agua, las raíces absorben el agua junto con los contaminantes. A medida que las raíces se saturan de contaminantes, se cortan y se eliminan. Además de extraer metales del agua, la rizofiltración puede ser útil para descargas industriales, escorrentía de tierras 41 agrícolas, drenaje de minas de ácidos y contaminantes radiactivos. Las plantas de girasol fueron utilizadas con éxito en la extracción de contaminantes radiactivos del agua de una laguna en una prueba realizada en Chernobyl Ucrania (Duschenkov et al., 1995). La fitoestabilización es un proceso mediante el cual se reduce la movilidad de los contaminantes y previene la migración de metales a aguas subterráneas o al aire, también reduce su biodisponibilidad hacia la cadena alimenticia. Esta técnica también se utiliza para reforestar sitios disturbados que carecen de vegetación debido a las altas concentraciones de contaminantes, las plantas tolerantes a los metales se utilizan para restaurar la vegetación y de esa manera disminuir la migración potencial de la contaminación con la erosión del viento y de la lixiviación de contaminantes del suelo a aguas subterráneas. En algunos casos de fitoestabilización, los metales pueden ser transformados a menos biodisponibles y por consiguiente a formas menos tóxicas (Reeves, 2003; Berti y Cunningham, 2000). 2.4. Contribución de los microorganismos en la remediación de suelos 2.4.1. Interacción de microorganismos con los metales pesados en la remediación El suelo provee un hábitat para una gran variedad de organismos desde microbios hasta especies superiores como plantas. Las propiedades biológicas del suelo incluyen la actividad y diversidad de microorganismos del suelo. Las bacterias son los organismos más pequeños y numerosos en el suelo con más de 400 géneros y un estimado de 104 especies. En un gramo de peso seco de suelo rizosférico existe una gran cantidad de 42 microorganismos de aproximadamente de 108 para bacterias, 106 actinomicetos, y 105 para otros hongos (Karthikeyan et al.,2003). La biomasa de microorganismos puede exceder 500 mg de carbón por kilogramo de suelo sin embargo, los microorganismos solo comprenden menos del 3% del carbono orgánico del suelo y ocupan sólo 0.001% del volumen total (Zhang et al.,1997). La densidad de las poblaciones microbianas varía significativamente verticalmente y horizontalmente en el suelo. La dispersión de la biomasa microbiana dentro de una muestra de suelo está relacionada con diversos factores como la distancia de la superficie del suelo debido a la difusión de oxígeno, la locación y disponibilidad de materiales orgánicos como fuentes potenciales de comida (Lovley, 2000). El término “rizósfera” fue introducido por primera vez en 1904 para descubrir la interacción específica entre la bacteria y las raíces de las leguminosas. El términos se ha refinado desde entonces para referirse a la región bajo la influencia inmediata de las raíces de plantas donde haya una abundante población microbiana (Karthikeyan et al.,2003). Dentro de la amplia diversidad microbiana, existen microorganismos resistentes y microorganismos tolerantes a metales. Los resistentes se caracterizan por poseer mecanismos de destoxificación codificados genéticamente, inducidos por la presencia del metal. En cambio, los tolerantes son indiferentes a la presencia o ausencia de metal. Tanto los microorganismos resistentes como tolerantes son de particular interés como captores de 43 metales en sitios contaminados, debido a que ambos pueden extraer los contaminantes. La resistencia o tolerancia experimentada por microorganismos es posible gracias a la acción de diferentes mecanismos. Estos fenómenos son: biosorción, bioacumulación, biomineralización, biotransformación y quimiosorción mediada por microorganismos (Lovley, 2000). Por lo anterior los microorganismos pueden ser considerados como reactores bioquímicos que conducen el proceso de biodegradación de contaminantes del suelo, esta idea es una extensión lógica de varios estudios que demuestran que numerosos procesos bioquímicos se llevan a cabo con la ayuda de microorganismos (Lovley, 2000). Se conoce muy poco acerca de la enorme diversidad de las poblaciones microbianas del suelo, sus propiedades, su comportamiento en el entorno del suelo, los microorganismos que habitan en la rizósfera interactúan con las raíces de las plantas formando útiles asociaciones simbióticas que hacen posible la supervivencia de las plantas bajo condiciones de estrés como deficiencia de nutrimentos, alta concentración de metales pesados, sequedad del suelo, afectan la asociación de las raíces de las plantas por los hongos micorrízicos y Rhizobium (Khan, 1997). Algunos metales pesados son esenciales para el ser humano porque suministran cofactores básicos para diversas funciones de proteínas y enzimas, pero en altas concentraciones los metales pesados pueden actuar en forma nociva bloqueando los grupos funcionales 44 esenciales desplazando los iones modificando la conformación activa de las moléculas biológicas, por otra parte los metales pesados son tóxicos tanto para organismos superiores como para microorganismos. El efecto de los metales pesados a las comunidades microbianas han despertado la atención en la recuperación de suelos contaminados (Simonton et al., 2000). Los microorganismos como hongos y bacterias consumen y digieren sustancias orgánicas, de las cuales se alimentan y obtienen energía. Algunos microorganismos pueden digerir sustancias orgánicas tales como combustibles o solventes, que son peligrosas para los seres humanos, y descomponerlas en productos inocuos mediante un proceso llamado biodegradación. Las sustancias naturales liberadas por las raíces de las plantas (azúcar, alcohol y ácidos) contienen carbono orgánico, del cual se alimentan los microorganismos del suelo, y los nutrimentos adicionales intensifican su actividad. Además, las plantas aflojan el suelo y transportan agua al lugar, facilitando así la biodegradación (Karthikeyan et al.,2003). De acuerdo con Guider et al., (1999); Garbisu y Alkorta, (1997) los metales pesados que se encuentran depositados en los suelos no son degradados biológicamente ni ocurren cambios en su estructura molecular, pero si son transformados de un estado de oxidación a otro. Como consecuencia de la alteración del estado de oxidación, los metales pueden convertirse en: más solubles en agua y pueden ser removidos por lixiviación, inherentemente menos tóxicos, menos solubles en agua de tal manera que se precipitan y se convierten en menos 45 biodisponibles y finalmente pueden ser volatizados, esto sucede cuando se cambia el estado de oxidación de los metales pesados. Los microorganismos del suelo desempeñan un papel importante en la movilización e inmovilización de cationes metálicos, siendo cada vez más aparente la reducción de los metales pesados por los microorganismos, además pueden ser manipulados para ayudar en la remediación de los sitios contaminados por metales pesados. Los microorganismos pueden recuperar suelos contaminados con metales pesados por transformación de valencia, precipitación extracelular química o volatilización (Lovley, 1993). Los factores fisicoquímicos como pH, superficie o radio de acción, temperatura, salinidad, materia orgánica, disponibilidad de oxígeno, afectan el hábitat microbiano. Es fundamental el rol de los microorganismos en los ciclos biogeoquímicos de los metales y su utilización en los procesos de biorremediación de desechos sólidos y líquidos es esencial para el cuidado del medio ambiente (Karthikeyan et al., 2003; Nies, 1999). En la interacción suelo-planta destacan los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) esta simbiosis mutualística (Fig. 4) ejerce gran influencia en la nutrición y tolerancia de las plantas a estrés bióticos y abióticos (Siquiera y Saggin, 1995). Los HMA son los microorganismos del suelo más comunes y constituyen un importante componente funcional del sistema suelo-planta suceso presente en casi todos los hábitats y climas (Barea et al., 1997), incluyendo suelos disturbados. Sin embargo los suelos degradados 46 pueden sufrir cambios en la diversidad y abundancia en las poblaciones de los HMA. En este contexto, cuando las poblaciones de microorganismos degradativos como los hongos micorrízicos arbusculares son inoculados en sitios contaminados, estos deben poseer enzimas que ayudan a transformar el estado de oxidación de los metales, haciéndolos menos tóxicos (Leyval et al., 2000; Loth, 1996). Plantas Metales pesados en acumuladoras suelos . HMA Fig. 4. Esquema representativo de la asociación simbiótica entre planta-HMA-metales pesados en suelos contaminados fuente (Leyval et al., 1997). 2.5. Hongos micorrízicos 2.5.1. Generalidades de los HMA La simbiosis micorrízica se refiere a la asociación o simbiosis entre plantas y hongos como “un estado de interdependencia fisiológica equilibrada de dos o más organismos en el que no se estimulan permanentemente los mecanismos de reacción defensiva”, la relación hongo-suelo es la simbiosis del suelo más común y las respuestas principales ante la presencia de la inoculación es en suelos deficientes en nutrientes o en humedad. La 47 simbiosis micorrízica incrementa la efectividad en la absorción de nutrientes mejorando el crecimiento o aumento en la biomasa en las plantas (Abbott y Robson, 1992). Los hongos micorrízicos son microorganismos que han permanecido asociados a las raíces de las plantas desde que éstas existen en el mundo, el término micorriza fue utilizado por primera vez por el científico alemán Albert Frank en 1885, del griego: “mykes” (hongo) y “rhiza” (raíces) (Harrinson, 1997). Cincuenta años antes de Frank, estas asociaciones ya eran consideradas, de naturaleza parasítica, hasta que en 1987 se pudo demostrar que la colonización de las raíces era más bien simbiótica en lugar de parasitaria (Hayman, 1987). Las estructuras producidas por los hongos (HMA) dentro de la raíz del hospedero incluyen: un sistema de hifas contiguo, a través del punto de penetración inicial, con la red de hifas que se extiende en el interior del suelo, arbúsculos pequeños, intracelulares, cuya función es la transferencia de nutrimentos entre los simbiontes; y alargadas vesículas intercalares o terminales cuya función parece ser de almacén orgánico del endofito (Carlin y Brown, 1982). La fisiología de las micorrizas arbusculares es compleja y acompañada de su formación, se puede explicar en las siguientes etapas: Activación de los propágulos que son básicamente esporas, fragmentos de raíces colonizadas e hifas, la penetración e iniciación de la colonización se realiza cuando las hifas hacen contacto con un punto en la superficie de la raíz, la posibilidad de que ésta penetre e inicie la colonización depende de diversos factores como: el hongo debe ser capaz de formar un haustorio y penetrar inmediatamente, quizá 48 necesite crecer un poco sobre la superficie de la raíz, tal vez el número de propágulos para iniciar la colonización deba ser pequeño, o bien, quizá deba haber un número máximo de invasiones, etc. (Smith et al., 1997; Barea, 1995). Se ha demostrado que la infección inicia con una serie de unidades infectivas discretas, extendiéndose cada una hasta 5 mm hacia los lados del punto de entrada. estas unidades se unen para formar la colonización continua. En otros reportes se ha observado una extensión de hasta 10 mm desde el punto de entrada, independientemente del patrón seguido, los hongos pueden ocupar más de la mitad de la raíz en 3 y 4 semanas después de la entrada (Carlin y Brown, 1982). Aunque la absorción del fósforo parece ser uno de los principales efectos que facilita la inoculación, existen otros nutrimentos, minerales y metales pesados que pueden estar disponibles a través de la asociación planta-hongo, así como la translocación del agua. La producción de hormonas y otros cambios celulares son también incluidos como parte de la respuesta de la planta ante la colonización (Cox y Tinker, 1976). 2.5.2. Clasificación de los diferentes tipos de hongos micorrízicos Las plantas inoculadas son más resistentes al estrés ambiental que las plantas no inoculadas. Aunque en general se reconocen dos tipos de micorrizas: las endotróficas (endomicorrizas) y las ectotróficas (ectomicorrizas), se menciona la existencia de un tercer 49 grupo, las ecto-endomicorrizas considerado como un grupo intermedio entre las otras dos asociaciones que es frecuente en los viveros (Quilambo, 2003). De las endomicorrizas, el 90% de las especies vegetales existentes sobre la corteza terrestre, forman este tipo de asociación. La característica de esta asociación es la penetración intracelular en las células corticales y epidérmicas de la raíz para formar arbúsculos y vesículas que aseguran una gran superficie de contacto entre ambos asociados. El abundante micelio, que se ramifica a través de la raíz y se extiende hacia fuera del suelo, formando una maraña (Fig.5). Carecen de manto fúngico externo visible (Morton y Benny, 1990). Figura 5. Representación de la estructura morfológica de la micorriza vesículo arbuscular (Barea y Azcon, 1997). De acuerdo con Scnnerini y Bonfante-Fasolo (1982) las endomicorrizas se subdividen en: Micorriza de ericoides de la familia Ericaceae. Se desarrollan principalmente en tierras árticas en clima boreal, sus principales características son: sin manto de hifas, sin red de 50 Hartig, hifas retorcidas en las células radicales, hongos asociados Ascomycetes (Basidiomycetes). Las micorrizas de orquídeas se desarrollan principalmente en tierras calientes con pH ácido y en suelo pantanoso. Con estructuras características: sin manto de hifas, sin red de Hartig, hifas en las células radicales, posiblemente haustorio no ramificado micelio hialino, hongos asociados Ascomycetes (Basidiomycetes). La micorriza arbuscular, la más extendida sobre el planeta, tanto por el número de hospederos, como por su distribución geográfica. Ocurren en el 96% de las plantas vasculares, desde el punto de vista como biofertilizante. Morton y Benny (1990) definen dos estructuras que son características de las micorrizas arbusculares: Las vesículas que son grandes hifas infladas, en forma globosa usualmente llenas de lípidos, los cuales son necesarias durante la etapa de crecimiento y sirven como órganos de energía y almacenamiento, o como estructuras reproductivas. Los arbúsculos son minúsculas dicotómicas, muy finas intracelulares los cuales invaginan la membrana plasmática, sirviendo como sitio de intercambio nutrimental entre el hongo y el hospedero, presentan una vida media de 9 a15 días, al cabo de los cuales se colapsan o son digeridos por la célula hospedera. Forman abundante micelio que ramifica a través de la raíces y se extienden hacia fuera. Los hongos micorrízicos arbusculares pertenecen a la clase Glomeromycetes (Cuadro 3). 51 Cuadro 3. Clasificación actual de los hongos formadores de micorriza arbuscular (Oehl,F., y Sieverding, 2004) Subdivisión: Glomeromycota Clase: Glomeromycetes ORDEN FAMILIA GÉNERO Glomerales Glomeraceae fam. ined. Gigasporaceae Acaulosporaceae Gerdemanniaceae Diversisporaceae fam. ined. Paraglomeraceae Geosiphonaceae Archaeosporaceae Glomus (Glomus Group A or B) incertae sedis (Glomus Group A or B) Gigaspora & Scutellospora Acaulospora & Entrophospora Pacispora (=Gerdemannia) incertae sedis (Glomus Group C) Diversisporales Paraglomerales Archaeosporales Paraglomus Geosiphon Archaeospora 2.6. Contribución de los HMA como mecanismo de recuperación de suelos contaminados por metales pesados 2.6.1 Interacción de los HMA en la contaminación con metales pesados De acuerdo con Atimanav (2004) la simbiosis micorrízica se presenta en todos los hábitats incluyendo en suelos contaminados ya sean estos, producidos o derivados de actividades mineras y de acuerdo con con experimentos realizados por Leyval et al., (1997) pueden mejorar la revegetación de suelos con desechos de minas u otros sitios degradados. Las especies de hongos que son aislados de áreas contaminadas las cuales son enriquecidos naturalmente por metales pesados o de viejos sitios de desechos industriales mineros son más resistentes a los metales pesados que los HMA reproducidos de sitios no contaminados 52 por lo que constituyen un componente funcional importante en la interacción suelo-plantahongo en la recuperación de suelos degradados por metales pesados. Los HMA son importantes en la recuperación de suelos contaminados debido a que juegan un papel vital en la tolerancia (Del Val et al., 1999) y en la acumulación (Zhu et al., 2001; Joner et al., 1997) de metales por las plantas. El micelio externo de los HMA explora un amplio volumen de suelo al esparcirse más allá de la zona de exploración de las raíces (Malcova et al., 2003; Khan et al., 2000) proporcionando de este modo acceso a un mayor volumen de metales pesados presentes en la rizósfera. Una alta cantidad de metales pesados también pueden almacenarse en las estructuras micorrízadas de raíces y en las esporas, por ejemplo concentraciones de más de 1200 mg / kg de cinc han sido reportados en tejido de Glomus mosseae y sobre 600 mg / kg en G versiforme (Chen et al., 2003; Leyval et al., 1996; Dehn y Shuepp, 1989). Otro aspecto importante de esta simbiosis es que los HMA pueden incrementar el establecimiento y el crecimiento de plantas sin importar los altos niveles de metales pesados (Weissenhorn et al., 1993; Enkhtuya et al., 2002) en el suelo. Además de una mejor obtención de nutrimentos del suelo, disponibilidad de agua y propiedades de agregación de suelo (Rilling et al., 2002; Kabir et al., 2000) aspectos asociados con la simbiosis, los HMA son significativos en los mejoramientos ecológicos de la rizósfera (Medina et al., 2003; Azcón-Aguilar et al., 2003). 53 De acuerdo con numerosas investigaciones se ha observado que la simbiosis de los HMA con las plantas acumuladoras puedan proteger a ésta de los efectos de las altas concentraciones de los metales pesados y se ha reportado la disminución de la toxicidad de cinc y cadmio en suelos contaminados (Tao et al., 1997; Weissenhorn et al., 1995). Varios mecanismos biológicos y físicos han sido propuestos para explicar la contribución de los HMA a la tolerancia al metal de las plantas hospederas. La inmovilización del metal en la biomasa de los hongos es uno de los mecanismos involucrados (Li et al., 2000). 2.6.2. Función de la simbiosis micorrízica en la recuperación de suelos contaminados con metales pesados Ante la necesidad de reforestar o la posibilidad de usar plantas en un proceso de descontaminación del suelo (Backer et al., 1994), mediante el empleo de tecnologías emergentes conocidas como “remediación verde” o fitorremediación (Salt et al.,1995), las interacciones entre micorrizas y metales pesados se ha tornado de gran importancia en la restauración de ecosistemas. La interacción entre los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) y los minerales, particularmente los metales pesados, ha sido el objetivo de una variedad de recientes estudios debido a un efecto benéfico de la micorriza sobre la tolerancia de las plantas contra la toxicidad de dichos metales pesados (Leyval et al., 2002) Es bien conocido que los HMA pueden ser afectados por la toxicidad de los metales en la disminución de su número de esporas en el suelo; así como en la colonización de las raíces de las plantas, pero se ha observado que en muchos casos éstas plantas acumuladoras son 54 micotróficas y se han detectado colonización en sus raíces y esporas en el suelo rizósferico aunque en un número muy reducido comparado con otras plantas que crecen en suelos no contaminados (Khan et al., 2002; Harrier, 2001; Leyval et al., 2001; Leyval et al., 1997; Weissenhorn et al., 1995; Haselwandter et al., 1994). En los últimos años el interés de la investigación se ha centrado en la diversidad y tolerancia de los HMA a los metales pesados en los suelos contaminados, tratando de entender sus mecanismos de adaptación y tolerancia de HMA a metales pesados en suelos, debido a que esto podría facilitar el manejo de estos microorganismos de suelo, para programas de restauración / Biorremediación. Autores como Jeffries et al., (2003); Del Val et al., (1999) mostraron que la diversidad los hongos micorrízicos asociada con plantas de maíz en un experimento de campo a largo plazo, no defirió entre tres parcelas que habían recibido diferentes niveles de lodos de cañería que contenían metales pesados. Sin embargo, el número de esporas de cada especie fue menor en el suelo con la concentración más alta de metales pesados. Usando el mismo experimento de campo a largo plazo y la misma variedad de planta, pero suelos más ácidos; Weissenhorn (1996) encontró una reducción del número, pero además de diversidad de esporas de HMA en el suelo que recibía la cantidad más alta de lodo. En un suelo altamente contaminado en el norte de Francia donde solo plantas adaptadas podían crecer, fueron recogidas raíces de Arrhenaterum elatius a lo largo de una pendiente de concentración de metales pesados. Hasta tres especies diferentes de Glomus fueron identificadas dentro de las raíces de Arrhenaterum, las cuales defirieron a lo largo de la 55 pendiente de metales (Leyval et al., Datos no publicados). La contribución de estos HMA a la tolerancia de las plantas a metales pesados o la acumulación de metales pesados por las plantas no ha sido establecida. Cuatro especies de Glomus fueron encontradas además en la rizósfera de otra planta tolerante al metal, Viola calaminaria, creciendo en un suelo altamente contaminado con metales pesados (21 y 41 mg kg-1 Zn y Cd, respectivamente) (Tonin et al., 2001). Éstas especies de Glomus incrementaron la concentración de Cd y Zn en las raíces de trébol, pero no en los retoños, y no afectó el crecimiento en las plantas. Por el contrario, una especies de Glomus aislada de la rizósfera de Viola calaminaria incrementó el crecimiento de maíz y alfalfa en suelos contaminados por metales pesados y redujo la concentración de Zn en raíces y retoños (Hildenbrandt et al., 1999; Kaldorf et al., 1999). Se han reportado plantas micorrizadas que crecen en los sitios contaminados por metales pesados (Chaudhry et al.,1998; Shetty et al., 1995; Weissenhorn et al.,1995; Pawlowska et al., 1996; Chaudhry et al., 1980); indicando que estos hongos han desarrollado una tolerancia a los metales pesados y que pueden desempeñar un papel en la fitorremediación del sitio. También se ha observado que la asociación entre los HMA con raíces de las plantas incrementan la absorción, translocación, metabolización y acumulación de algunos elementos traza como Cu (Gildon y Tinker, 1983), Pb (Díaz et al., 1996), Cd (Guo et al., 1996; Joner et al.,1997), Ni (Killham et al.,1983), Zn (Lambert et al., 1979; Davies et al., 1987; (Galli et al., 1994), Zn y Ni (Jamal 2002), otros metales como Hg y Cr (Galli et al., 1994) y Co (Killham y Firestone, 1995). 56 Killham y Firestone (1995) determinaron la influencia de la colonización de Glomus fasciculatum en la absorción metales pesados y crecimiento de pasto perenne (Ehrharta calycina) en un suelo areno arcilloso con metales pesados como: Cu, Ni, Pb, Zn, Fe y Co, que fueron aplicados simulando lluvia ácida con pH 3.0, 4.0 y 5.6. Los porcentajes de las deposiciones fueron similares a los efluentes de fundidoras. La concentración de los metales pesados en los brotes de las plantas micorrizadas fue mayor que en las plantas testigo expuestas a la lluvia ácida simulada. Cuando Gildon y Tinker (1983) analizaron el efecto de metales pesados en la extensión y desarrollo de la colonización de cebolla por Glomus mosseae, ellos encontraron que la intensidad de la colonización se reducía progresivamente cuando se incrementaba la adición de Cu o Zn. Los dos metales tuvieron sorpresivamente efectos similares. Sin embargo las plantas de trébol que crecieron en áreas fuertemente contaminadas con metales pesados mostraron niveles de colonización de alrededor del 30%, mientras que en niveles con menos concentración de contaminación con metales pesados se ha manifestado una alta colonización en la raíces de cebolla en experimentos en maceta. De acuerdo con el porcentaje de raíz colonizada, Glomus mosseae aislado de un suelo contaminado fue más tolerante con el Zn y Cd que Glomus mosseae aislado de suelo no contaminado. Concluyendo que el peso seco de brotes y la concentración de fósforo fueron significativamente aumentados por los hongos tolerantes a los metales en comparación a la cepa no tolerante. Dueck et al., (1986) examinaron el efecto de G. fasciculatum en dos pastos (Festuca rubra y Calamagrostis epipejos) en dunas costeras con presencia de cinc, ellos encontraron que la 57 colonización de HMA puede reducir el efecto negativo del Zn en el crecimiento de la planta. Así también ambos el Zn y los HMA influyen en el crecimiento de la planta, mientras que el Zn inhibe el crecimiento, los HMA estimulan el desarrollo radicular y de los brotes, especialmente en el caso de F. rubra. Con respecto al crecimiento de las raíces, ambas especies mostraron una interacción significativa entre el efecto de Zn y HMA. Posteriormente Leyval et al., (1991) y Weissenhorn et al., (1993) confirmaron los resultados de Gildon y Tinker (1983). En suelos contaminados por deposiciones atmosféricas de fundidoras encontraron HMA más tolerantes al Cd que una cepa de G. mosseae aislada de suelo no contaminado. Esta tolerancia de Cd fue observada en el número de esporas (Weissenhorn et al., 1993) y en el porcentaje de colonización micorrízica. De acuerdo con Weissenhorn et al., (1996), la prolongada exposición de los metales pesados puede desarrollar tolerancia en los HMA, pero el mecanismo es poco conocido, por consiguiente es posible mejorar la capacidad de las plantas en la recuperación de suelos, inoculándolas con HMA. Griffioen et al., (1994) reportaron altos niveles de colonización micorrízica en Agrostis capillaris creciendo en suelos contaminados por Zn y Cd colindantes a una refinería de Zn. En contraste, en el área alrededor de una vieja mina de cobre encontraron una correlación negativa entre la colonización de A. capillaris por HMA y el contenido total de cobre en el suelo. Desafortunadamente no analizaron sus resultados sobre la relación entre la biodisponibilidad de los elementos y las propiedades físicas y químicas de los diferentes suelos. Noyd et al., (1996) señalaron que la colonización de los HMA de las plantas 58 nativas en una pradera contaminada con hierro, se incrementaron lo cual ayudó a establecer a una comunidad sostenible de hierba nativa que significaría considerables logros en la recuperación del sitio. Varios autores han reportado la extracción de esporas de HMA tales como Glomus y Gigaspora asociadas a la mayoría de las plantas que crecían en ambientes contaminados con metales pesados. Christie (2004) y Raman et al., (1993) identificaron a Glomus y Gigaspora spp. en micorrizósferas de catorce especies de plantas que colonizaban un desecho de mina de magnesita en la India. Mientras que Weissenhorn y Leyval et al., (1994) aislaron solo a Glomus mosseae; Dueck et al., (1986) aislaron Glomus fasciculatum de los suelos contaminados por metales pesados. Pawlowska et al., (1996) examinaron grandes cantidades ricos en Cd, Pb y Zn en Polonia y recuperaron esporas de Glomus aggregatum, G. fasciculatum y Entrophospora spp. de las micorrizósferas de las plantas que crecían en los suelos. Galli et al., (1994) dichos autores sugirieron que las micorrizas pueden desempeñar un papel crucial en la protección de la planta contra los metales pesados. La eficacia de la protección, sin embargo, difiere entre los distintos aislados de hongos micorrízicos y los diferentes metales pesados. Joner y Leyval (1997) señalaron que las hifas extra- radicales de los HMA Glomus mosseae pueden transportar el Cd del suelo a las plantas de trébol creciendo en macetas seccionadas. Los autores no señalaron ninguna restricción en el crecimiento de las hifas en suelos con altos niveles de Cd extraíble. 59 La captación de metales por la simbiosis micorrizíca obedece a varios factores tales como las propiedades físicas y químicas del suelo (Wang y Chao, 1992), particularmente su nivel de fertilidad (Lambert et al., 1979; Thompson, 1990), su pH (El-Kherbawy et al.,1989; Killham y Firestone, 1983), la planta hospedera (Griffioen y Emst, 1989; Kucey y Janzen, 1987), el tipo de hongos involucrados (Gildon y Tinker, 1981) y, sobre todo, la concentración de los metales en los suelos. Bajo condiciones de deficiencia, la mayoría de los estudios señalan un aumento en la captación de metal por las plantas micorrizadas. En este contexto, se ha observado un aumento en la concentración de Zn en las hojas, causada por HMA, en suelos con altas concentraciones de este elemento (Christie, 2004; Thompson, 1990; Faber et al., 1990). La acumulación de cadmio, plomo y cinc, en cultivos irrigados con desechos de la industria minera y eléctrica; las muestras del suelo superficial analizadas mostraron que las raíces de zanahoria son afectadas ya que sus hojas contenían altas concentraciones de metales pesados, ya que estos son absorbidos por las plantas llegando a los frutos y transfiriéndose a la cadena alimenticia. Por lo que es necesario la recuperación de suelos contaminados utilizando la simbiosis entre plantas acumuladoras con los hongos micorrízicos por lo que el maximizar una colonización radicular en plantas que crecen en ambientes adversos, como son los suelos contaminados con metales pesados es ahora de gran interés, porque se considera que las micorrízas arbusculares son clave en estrategias destinadas a frenar la contaminación de suelos, la erosión y desertificación, basadas en la revegetación con especies arbustivas autóctonas (Kugonic y Graman, 1999; Kothari et al., 1990). 60 2.6.3. Contribución de los HMA en la absorción y translocación de los metales pesados por plantas hiperacumuladoras Cuando los suelos contienen altas cantidades potencialmente tóxicas de metales pesados, la simbiosis micorrízica induce bajas concentraciones de estos metales en la parte aérea de la planta y por consiguiente un efecto benéfico en su crecimiento. Díaz y Honrubia (1995) detectaron un aumento en la acumulación de plomo en las plantas micorrizadas, utilizando poblaciones de hongos nativos, ellos observaron una disminución en la concentración de plomo en la parte foliar de A. cytisoides micorrizadas creciendo en suelos con altas concentraciones de plomo y cadmio. (Chen, 2000 y Weissenhorn et al., 1995) también informaron una reducción en la concentración de plomo en plantas micorrizadas. Los efectos provocados por los HMA en las plantas colonizadas en la absorción y traslocación de metales son poco conocidos; pero la absorción de metales pesados depende de la especie de la planta, de la concentración del metal, del medio de crecimiento y posiblemente de la especie de hongo, pudiendo aumentar o disminuir la absorción de ciertos metales (Heggo et al., 1990). Con respecto al significado de las micorrizas en fitorremediación de suelos contaminados con metales pesados, se ha comprobado que las plantas micorrizadas tienen un efecto benéfico, basado en la capacidad que confiere a la planta para inmovilizar metales en la raíz reduciendo así su translocación a la parte aérea y, en consecuencia, el flujo de metales a la cadena trófica (Del Val et al., 1999). En este contexto, dos aspectos principales deben 61 considerarse: el primero trata de los efectos de los metales pesados sobre los hongos micorrízicos y su simbionte, el segundo se refiere al efecto provocado en los hongos en la absorción del suelo para la planta y transferencia a los brotes y la tolerancia de las plantas un exceso de metales pesados en el suelo (Nogueira, 1996; Leyva et al., 1997). Los reportes de las altas concentraciones de metales muestran variaciones en la acumulación de metal y la translocación dentro de la planta dependiendo del hongo, de la planta hospedera, densidad de la raíz, características del suelo, metales y su disponibilidad (Joner y Leyval, 2001; Leyval et al., 1997; El-Kerbawy et al., 1989). Las micorrizas arbusculares pueden subsistir en suelos altamente contaminados con metales pesados, sin embargo la colonización a menudo es reducida en esas condiciones. Varios metales pesados son fungitóxicos, reduciendo la germinación de las esporas, el crecimiento micelial y consecuentemente la colonización micorrízica (Jamal, 2002). Los HMA aislados de suelos contaminados son más tolerantes a metales pesados y pueden disminuir la concentración en retoños y raíces, o disminuir la traslocación de raíces a retoños (Joner y Leyval, 1997; Diaz et al., 1996). Lo último puede ser debido a la alta capacidad de absorción de metal de estos hongos, lo cual podría “filtrar” iones de metal durante la absorción (Joner et al., 2000). En otro estudio realizado por Weissenhorn et al., (1994), la colonización radicular de maíz en suelo contaminado aumentó la masa vegetal y redujo la absorción de Cd, Zn y Cu en la parte aérea y raíces. 62 Los HMA pueden disminuir los efectos adversos de la fitotoxicidad inducida por el exceso de metales que no solo revisten importancia ecológica y, más recientemente, tecnológica; considerando la necesidad de rehabilitar áreas contaminadas con metales pesados dispersas por todo el mundo (Leyval et al., 1997). Se ha prestado poca atención al papel de la MA en ambientes que contienen un elevado y potencialmente nivel tóxico de elementos minerales, si bien la inoculación con hongos micorrízicos reduce la concentración de cinc y cadmio en las hojas de la planta que crecen en suelos con alta concentración de estos metales (Heggo et al., 1990) mencionan que la toxicidad del Zn para las raíces de Betula pendula puede ser reducida por la colonización con hongos micorrízicos y la influencia en el mejoramiento fue positivamente asociada con la compatibilidad entre la filtración del hongo y la planta. Un mejoramiento similar se ha observado en Betula papyrifela asociada con varios simbiontes micorrízicos expuestos a cobre y a níquel. Autores como Joner y Hutchinson, (1986), Gildon y Tinker, (1989) demostrarón que las micorrízas arbusculares pueden también afectar la incorporación de metales pesados por las plantas y que los hongos arbusculares son tolerantes a las altas concentraciones en el suelo. Numerosos estudios han mostrado ahora que bajo condiciones moderadas de contaminación de cinc, las plantas hospederas de los HMA se encontraba colonizada. Los trabajos realizados por Griffionen et al., (1994) en una parcela próxima a una refinería de cinc, contaminada con cinc y cadmio, la especie de Agrostis capilaris utilizada en programas de 63 rehabilitación de suelos contaminados con metales pesados se encontraba colonizada, debiendo por lo tanto beneficiarse de la simbiosis. La colonización con los hongos nativos tolerantes a los metales ha mostrado que puede proteger a las plantas contra los efectos tóxicos de concentraciones excesivas de metales pesados. Los hongos MA mejoraron la incorporación de Zn en el melocotón en los suelos deficientes en California en maíz (Zea mays L.) y trigo (Triticum aestivum L.) en algunos suelos deficientes en la India (Christie et al., 2004). Una reciente contribución de los HMA en la ecología de los suelos, se relaciona con el descubrimiento de la glicoproteína llamada glomalina. Wright y Upadhyaya (1998) mostraron que la abundante concentración (comúnmente varios mg/kg) de proteína en el suelo, esta altamente correlacionada con los agregados. 2.7. Importancia del cultivo del girasol 2.7.1. Origen El origen del girasol se remonta a 3000 años a.c. en el norte de México y oeste de Estados Unidos de América, ya que fue cultivado por las tribus indígenas de Nuevo México y Arizona, fue uno de los principales productos agrícolas empleados en la alimentación de muchas comunidades americanas antes del descubrimiento. La semilla de girasol fue introducida en España por los colonizadores y después se extendió al resto de Europa, pero 64 fue durante el siglo XIX cuando comenzó la explotación industrial de su aceite destinado a la alimentación. 2.7.2. Características botánicas Perteneciente a la familia de las Asteraceae cuyo nombre científico es Helianthus annuus. Es una planta anual, con un desarrollo vigoroso en todos sus órganos, dentro de esta especie existen numerosos tipos o subespecies cultivadas como plantas ornamentales, oleaginosas y forrajeras, cada una de las partes de la planta se describen a continuación. Raíz: esta formada por una raíz pivotante y un sistema de raíces secundarias de las que nacen las terciarias que exploran el suelo en sentido vertical y horizontal, normalmente la longitud de la raíz principal sobrepasa la altura del tallo. Tallo: es de consistencia semileñosa y maciza en su interior, siendo cilíndrico y con diámetro variable entre 2 y 6 cm y a una altura hasta el capítulo entre 40 cm y 2 m. La superficie exterior del tallo es rugosa, asurcada y vellosa, excepto en su base (Alba y Llanos, 1990). Hojas: son alternas, grandes, trinervadas, largamente pecioladas acuminadas, dentadas y de áspera vellosidad tanto en el haz como el envés. El número varia entre 12 y 49, de acuerdo con las condiciones de cultivo y la variedad, el color también es variable y va de verde oscuro a verde amarillento. 65 Inflorescencia: el receptáculo floral o capítulo puede tener forma plana, cóncava o convexa, el capítulo es solitario y rotatorio y esta rodeado por brácteas involúcrales. Las flores del exterior del capítulo (pétalos amarillos) son estériles, están dispuestos radialmente y su función es atraer a los insectos polinizadores. Las flores del interior están formadas por un ovario inferior, dos sépalos, una corola en forma de tubo compuesta por cinco pétalos y cinco antenas unidas a la base del tubo de la corola. Fruto: es un aquenio de tamaño comprendido entre 3 y 20 mm de largo y 2 y 13 mm de ancho. El pericarpio es fibroso y duro, quedando pegado a la semilla, la membrana seminal crece en el endospermo y forma una película fina que recubre al embrión y asegura la adherencia entre el pericarpio y la semilla (Alba y Llanos, 1990). 2.7.3. Requerimientos edafoclimáticos Suelo: es un cultivo poco exigente en el tipo de suelo, aunque prefiere los arcillo-arenosos y ricos en materia orgánica, es muy poco tolerante a la salinidad y contenido de aceite disminuye cuando ésta aumenta en el suelo. En suelos neutros o alcalinos la producción de girasol no se ve afectada, además es una de las plantas con mayor capacidad para utilizar residuos químicos (Alba y Llanos, 1990). Temperatura: es un factor muy importante en el desarrollo del girasol, adaptándose muy bien a un amplio margen de temperatura que van desde 25-35C a 13-17 C. Fotoperiodo y luz: las diferencias en cuanto a la aparición de hojas, fecha de floración y a la duración de las fases de crecimiento y desarrollo son atribuidas al fotoperiodo. Durante la 66 fase reproductiva el fotoperiodo deja de tener influencia y comienza a tener importancia la intensidad y la calidad de la luz, por tanto un sombreo en plantas jóvenes produce un alargamiento del tallo y reduce la superficie foliar (Alba y Llanos, 1990).. 2.7.4. Particularidades del cultivo La época de la siembra es variable y depende de las características climatológicas de cada región. El conocimiento de la forma que tiene la planta de crecer y desarrollarse sus órganos, desde la germinación de la semilla hasta la maduración de sus semillas, permite una correcta utilización de los medios de producción, y una interpretación acertada de la forma de reaccionar de la planta frente a la influencia del medio ambiente y a las prácticas agrícolas utilizadas para su producción (Carter, 1987). La semillas de girasol, presentan un hábito de crecimiento (Fig. 6) como se explica a continuación: la germinación de la semilla es aproximadamente de 10 a 20 días, entre los 15 y 25 días se produce el enraizamiento de la planta, el período de crecimiento más activo de la planta es alrededor de 40 y 50 días, aparecen de cinco pares de hojas al principio de floración en el cual se presenta la máxima absorción de elementos minerales del suelo. La floración puede durar de 10 a 12, días comienza con la apertura de las primeras flores liguladas y finalmente la maduración puede durar entre 35 y 50 días. Esta fase comienza con el final de la floración y llega hasta el estado de madurez fisiológica (Alba y Llanos, 1990) (Fig. 6). 67 Fig. 6. Fenología de la planta del girasol, tomada de (Alba y Llanos, 1990). 2.7.5. Características del girasol como planta fitorremediadora El girasol fue escogido para este estudio por las siguiente razones: Facilidad de manejo en su cultivo Se adapta fácilmente a un amplio intervalo en la variación de temperatura. La época de la siembra es variable y depende de las características climatológicas de cada región. Es una planta hiperacumuladora de una variedad de metales pesados como: Cr (III), Cr (IV), (Davies et al., 2001), de As, Bi, Cd, Cu, Mn, Pb, Sb, TI y 68 Zn (Christie et al.,2004; Cabrera et al., 1999), también metales radioactivos como uranio (De Oliveira 1999; De Oliveira et al., 2003) Es una planta micotrófica (Davies et al., 2001; Cabrera et al., 1999; Chandrashekara et al., 1995) Puede remediar tanto suelos como aguas contaminadas. Como se mencionó anteriormente una de las limitaciones de la utilización de plantas para recuperar suelos contaminados es su lento crecimiento y su poca biomasa radicular (Raskin, 1995; Chaudhry et al., 1998) pero de acuerdo con Xiong, (1997) y Davies (2001) las Asteraceae toleran altos niveles de algunos metales en comparación con otros grupos taxonómicos y se les ha propuesto como especies fitoremediadoras. El girasol es reportado con una alta biomasa radicular y capacidad de acumular metales, no obstante una baja tolerancia al cromo comparado con otras plantas acumuladoras (Shahanden y Hossner, 2000). Es una planta micotrófica ya que el género Glomus puede colonizar al girasol (Chandrashekara et al., 1995; Davies et al., 2001). Los HMA ayudan a desarrollar el volumen y extensión radicular aumentando el área de descontaminación de suelos con metales pesados. Sin embargo el estudio de la interacción de los HMA y el girasol con los suelos contaminados puede proveer información del papel ecológico de los HMA en los suelos contaminados por metales pesados especialmente cinc y cobre y su participación en la tolerancia de estos metales. 69 3. MATERIALES Y MÉTODOS El trabajo experimental se realizó en las instalaciones de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima, Campus Tecomán, localizada en el Km. 40 de la autopista Colima-Manzanillo a 1854’ LN y 10352’ LW. 3.1. Muestreo de suelos 3.1.1. Localización y descripción de los sitios de muestreo En este trabajo se estudiaron cuatro suelos seleccionados completamente al azar, a lo largo de un gradiente de 74 Km de longitud, entre la laguna de oxidación situada en el municipio de Minatitlán, Colima con una altura de 740 msnm y la zona agrícola del municipio de Cihuatlán, Jalisco, que cuenta con una altura de 13 msnm. En la laguna de oxidación o de jales son depositados los desechos que resultan de la extracción de hierro del consorcio minero Peña Colorada ”Benito Juárez”, ubicado en el municipio de Minatitlán, Colima a una altura de 850 msnm. Contiguo a la presa de jales transita el caudal del Río Marabasco también llamado Cihuatlán, Chacala o Paticajo, el cual recibe filtraciones de la laguna de oxidación por lo que sus aguas contienen metales como: plomo, hierro, cinc, cobre, cromo y cadmio (Meyer et al., 1999), su cauce recorre la pendiente hasta llegar a la zona agrícola del municipio de Cihuatlán del estado de Jalisco. En el transcurso del río, los habitantes aledaños utilizan sus aguas para riego y consumo para ganado bovino y aves. La ubicación de los sitios seleccionados se muestran en la (Fig. 7). 70 1 2 4 3 Fig. 7 Mapa de la rivera del Río Marabasco, señalando los sitios muestreados. 1.- Laguna de Oxidación, 2.- Ávila Camacho, 3.- El Charco y 4.- El Centinela. El sitio 1 se localizasitúa en la laguna de oxidación del Consorcio Minero “Peña Colorada Benito Juárez”, en la cual se vierten los residuos del proceso de extracción de hierro. En esta área, el tule y el diente de león son las plantas representativas. El sitio 2, se encuentra ubicado en la parte media entre la laguna de oxidación y el valle de Cihuatlán, y corresponde con el lugar conocido como Manuel Ávila Camacho perteneciente al municipio de Minatitlán. En esta zona crecen plantas silvestres y las más representativas son conocidas comúnmente como diente de león y tule. El sitio 3 se encuentra en la región llamada “El Charco”, de donde se tomaron muestras de una área con cultivo de plátanos y chile jalapeño y una zona no cultivada con presencia de plantas silvestres. El sitio 4 llamado “El Centinela de Arriba” del municipio de Cihuatlán, 71 Jalisco en donde se colectó un suelo cultivado con plátano y limón; así como un suelo no cultivado con presencia de plantas silvestres (Fig. 8; Cuadro 4). . A C) B D) E) F) Figura 8. Panorámica de los diferentes sitios muestreados: A) y B) Laguna de Oxidación, C) Ávila Camacho, D) El Centinela no cultivado, E) El Centinela Cultivado y F) El Charco no Cultivado. 72 Cuadro 4. Sitios de colecta del suelo para el estudio. Sitios Laguna Municipio Estatus Número de muestras de Minatitlán No cultivada 5 Manuel Ávila Minatitlán No cultivada 5 El Charco Cihuatlán Plátano 5 El Charco Cihuatlán No cultivada 5 El Centinela Cihuatlán Plátano 5 El Centinela Cihuatlán No cultivada 5 oxidación 3.1.2 Muestro de suelos El muestreo de suelo se llevó a cabo bajo una metodología completamente al azar, en un transecto de 74 Km de longitud, empleando el método de muestreo en zig-zag, sugerido por Sieverding (1991), colectando el suelo rizósferico de las plantas dominantes a una profundidad de 0 a 25 cm. De cada sitio se tomaron cinco submuestras las cuales se mezclaron para formar una muestra compuesta de aproximadamente un 1 kg. Las muestras obtenidas se secaron al ambiente bajo sombra, posteriormente se tamizaron en malla de 4 mm de apertura y se guardaron a 5º C en bolsas de polietileno debidamente selladas y etiquetadas, hasta su análisis físico y químico; así como la determinación de la 73 concentración de metales pesados y determinar el porcentaje de colonización micorrízica en las raíces de las plantas dominantes, en los sitios de colecta. 3.1.3. Muestreo de raíces Las raíces se tomaron entre 0-25 cm de profundidad fueron colectadas de las plantas dominantes de cada uno de los sitios muestreados. Cinco muestras de raíces fueron tomadas de puntos al azar. Las raíces fueron cuidadosamente extraídas del suelo y colocadas en bolsas de plástico debidamente etiquetadas, posteriormente fueron llevadas al laboratorio, una vez ahí se colocaron en frascos con formol-alcohol-ácido acético (FAA) hasta su procesamiento. 3.2. Análisis físicos y químicos de suelos Las características físicas y químicas que se determinaron fueron: Textura, conductividad eléctrica, potencial de hidrógeno (pH) y el contenido de materia orgánica. Los cuales se realizaron de la siguiente manera. 3.2.1. Textura del suelo La textura se determinó por el método del hidrómetro de Bouyoucos (Day, 1963). Se tomó una muestra de 100 g de suelo, se le agregaron 5 ml de solución dispersante (hexametafosfato de sodio). Después se pasó esta suspensión a una batidora y luego se pasó 74 a una probeta de 250 ml. Inmediatamente se realizó la primera lectura de densidad, la cual corresponde a la densidad de la suspensión de arcilla más limo. Se dejó en reposo y se realizó la segunda lectura que corresponde a la arcilla. Se hicieron los cálculos correspondientes y se determinó la textura utilizando el triángulo de las texturas. 3.2.2. pH del suelo El pH del suelo se determinó por el método propuesto por Rayment y Higginson (1992), se pesaron 10 g de suelo el cual fue mezclado con 20 ml de agua destilada, la suspensión suelo-agua se agitó por una hora a 25 C, se dejó reposar por 15 min, la medición fue tomada empleando un electrodo de vidrio (McLean, 1982). 3.2.3. Conductividad eléctrica del suelo La conductividad eléctrica del suelo fue determinada para medir la salinidad del suelo. Se tomó una relación suelo agua (1:1) utilizando 100 g de suelo al cual se agregaron 100 ml de agua destilada, la suspensión suelo-agua se agitó por una hora a 25 C, se dejó reposar por 15 min. La lectura fue tomada con la ayuda de un conductímetro calibrado. 3.2.4. Materia orgánica El contenido de materia orgánica fue determinado por el método de oxidación del carbono de la materia orgánica por la combinación del dicromato de potasio y el ácido sulfúrico 75 (Walkley-Black, 1976). Se tomaron 10 g de suelo muestreado, se trata con 5 ml de dicromato de potasio 1N y con el doble de ácido sulfúrico concentrado. Después de media hora de reposo se añaden 100 ml de agua, 5 ml de ácido fosfórico y 6 gotas de fenilamina, para titular con solución sulfato ferroso. 3.3. Determinación de la concentración de metales pesados Se examinó el contenido de los siguientes elementos: plomo, cadmio, arsénico, cinc, cromo, cobre y hierro. Se empleó el método de extracción con reflujo con agua regia (HCL: HNO3 2:1 v/v) (Berrow y Stein, 1983), y posteriormente fueron determinados por espectrofotometría por absorción atómica (Schlichting et al., 1995). Estos análisis se realizaron en el Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa (LATEX). 3.4. Hongos micorrízicos arbusculares y colonización en plantas silvstres 3.4.1.Cuantificación de esporas Las esporas fueron extraídas en 100 g de suelo, empleando el método de tamizado en húmedo y decantación de acuerdo con Gerdemann y Nicolson, (1963), continuando con la centrifugación en una solución de sacarosa al 50% (Walker et al., 1992). Las esporas así obtenidas se observaron en el microscopio estereoscópico para realizar el conteo, contándose solamente esporas turgentes y brillantes. 76 Para reportar el número de esporas en suelo seco se determinó el contenido de humedad de cada suelo. El peso seco se obtuvo después de pesar el suelo húmedo y secarlo a 60 C, hasta peso constante volver a pesar hasta obtener el peso seco por la diferencia de pesos y finalmente reportar el número de esporas en 100 g de suelo seco (Anderson e Ingram, 1993). 3.4.2. Determinación de la colonización micorrízica Las raíces fueron lavadas con agua para eliminar el FAA y cortadas en fragmentos de aproximadamente 1 cm de longitud. Una vez lavadas se procesaron de acuerdo con la técnica de Phillips y Hayman (1970) modificada por Kormanik et al., (1978). Las raíces se colocaron en una solución de hidróxido de potasio (KOH) al 10% hasta cubrirlas y se metieron en autoclave, posteriormente se enjuagaron por los menos tres veces con agua destilada para retirar el KOH y se enjuagó 3 veces con agua corriente. A continuación las raíces se sumergieron en ácido clorhídrico (HCl) al 1% y finalmente se agregó la solución colorante fucsina ácida al 0.05 % y se llevaron a una temperatura de 121º C por 10 min. Para determinar la colonización micorrízica arbuscular de las raíces, se utilizó el método sistemático del portaobjeto (McGonigle et al. 1990). Esta evaluación se realizó con un microscopio compuesto Olympus modelo 1x70-MO81. Los valores se expresaron en porcentaje de colonización micorrízica. Los segmentos de raíces, fueron seleccionados al azar a partir de las muestras teñidas y se colocaron en láminas portaobjetos, con la ayuda de un microscopio compuesto Olympus modelo 1x70-MO81 con un aumento de 40 X, se pudo observar la presencia de estructuras 77 fúngicas. Se hicieron tres repeticiones para cada sitio. La longitud de la colonización cortical fue estimada en milímetros (valor promedio) y expresada como el porcentaje de raíces colonizadas. 3.5. Selección del suelo de estudio Para la selección del suelo a utilizar en el experimento final, se eligio el que presentó el mayor contenido de metales pesados y además en el que se constató la mayor presencia de estructuras morfológicas de hongos micorrízicos arbusculares en las plantas silvestres. 3.6. Propagación de HMA nativos de suelos contaminados 3.6.1. Cultivo trampa Para la identificación de los HMA se propagaron utilizando como cultivo trampa una mezcla de sorgo (Sorghum vulgare. L) y pasto de guinea (Panicum maximum). Para este ensayo se usó el suelo con mayor concentración de metales pesados y con presencia de hongos micorrízicos arbusculares. El suelo se mezcló con arena en una proporción 2:1. Se colocó en macetas de 350 g y se sembraron con una mezcla de semillas de pasto bahía (Paspalum notatum) y alfalfa (Medicagato sativa). Las macetas se colocaron en bolsas “sun bags” de acuerdo con la técnica de Walker (2001) y se mantuvieron en condiciones semicontroladas de invernadero con una temperatura promedio de 22 C en el día y de 15 C por la noche, con una humedad relativa (H.R.) del 60-80% y con un intervalo de 78 oscuridad y luz de 10/12. Después de 16–18 semanas de crecimiento se suspendió el riego para estimular la producción de esporas. Una vez secas las plantas se cortó la parte aérea y el suelo se guardó en bolsas de plástico en un lugar seco y fresco hasta su procesamiento (Fig. 9). Fig. 9. Cultivo trampa utilizado en la propagación de HMA nativos del suelo con mayor concentración de Cu y Zn. 3.6.2. Diversidad morfológica de HMA nativos presentes en el suelo de estudio Para la identificación de las esporas se extrajeron del suelo siguiendo la técnica de tamizado húmedo y decantación (Gerdemann y Nicolson, 1963) seguida de centrifugación en gradiente de sacarosa (Walker, 1997). Las esporas se colocaron en una caja de Petri y fueron observadas bajo el microscopio estereoscópio Olympus SZ40. Se separaron de acuerdo con sus características morfológicas principalmente color, tamaño, forma, presencia de hifas de sostén como sugieren Walker (1983) y Schenck et al., (1990). 79 Posteriormente se seleccionaron los morfotipos más representativos, se realizaron preparaciones permanentes colocando esporas intactas usando alcohol polivínilico lactoglicerol (Morton et al., 1993). Se observaron en el microscopio para su identificación. En la identificación se utilizarondo los criterios taxonómicos de Schenck y Perez (1990). 3.7. Contribución de Glomus intraradices en la absorción de cinc y cobre El diseño experimental consistió en una distribución completamente al azar con dos tratamientos: inoculación con hongos micorrízicos y sin inoculación, con diez repeticiones. Este estudio se efectúo bajo condiciones de invernadero, utilizando como planta hiperacumuladora el girasol (Helianthus annuus L.). El hongo usado en este experimento fue Glomus intraradices procedente de un suelo no contaminado de Campeche que fue propagado como se describe en la sección 3.6.1. 3.7.1. Desinfección de la semilla Las semillas de girasol (Helianthus annuus L.) se desinfectaron en su superficie, por inmersión en alcohol al 70% por un minuto, a continuación se sumergieron en hipoclorito de sodio al 10% por quince minutos, posteriormente la semilla se enjuagó ocho veces con agua destilada estéril (Talukdar y Germida, 1994; Duncan y Howard, 2000; Zhu et al., 2000). 80 3.7.2. Germinación de la semilla de girasol Una vez esterilizadas las semillas, se sembraron utilizando como sustrato polvillo de coco se colocó en charolas de germinación de 48.5 x 35 x 13.5 cm de polietileno de alta densidad y con perforaciones de 3/8 de pulgadas en la base para drenaje y aireación. Las semillas se mantuvieron húmedas utilizando agua destilada estéril y permanecieron en condiciones semicontroladas de invernadero hasta que las plántulas presentaron el primer par de hojas verdaderas, aproximadamente a los 15 días después de la siembra, posteriormente se procedió al transplante. 3.7. 3. Transplante de girasol Se seleccionaron plántulas con características semejantes en tamaño, color, diámetro del tallo y número de hojas, se transplantaron a macetas de plástico 1.5 kg de capacidad previamente desinfectadas. El sustrato de crecimiento que se utilizó en las macetas fue el suelo seleccionado. Dicho suelo fue esterilizado mediante vapor con anterioridad a la siembra. En cada maceta se trasplantaron tres plántulas lo que representó una unidad experimental, éstas fueron colocadas en condiciones semicontroladas de invernadero (Fig. 10 y 11). 81 b) a) c) Fig. 10. Diversas etapas de la planta de girasol: creciendo en maceta con suelos a)germinación b) nascencia c) después del primer muestreo a los 40 días de crecimiento. 82 Fig.11. Planta de girasol: creciendo en maceta con suelos después del segundo muestreo a los 60 días de crecimiento. 3.7.4. Inoculación micorrízica Al momento del transplante, las plántulas se inocularon con 1.5 g de inóculo, el cual consistía de una mezcla suelo/ raíz de Glomus intraradices. El inóculo fue puesto en una capa 5 cm debajo de la superficie del suelo. Las macetas se mantuvieron en condiciones de invernadero por ocho semanas, las plantas fueron regadas con agua corriente según se necesitó y no se aplico fertilizante, ni solución nutritiva. La superficie de las macetas fue cubierta con discos de papel aluminio para reducir la transpiración del suelo y eliminar la contaminación. 83 3.7.5 Duración del experimento De acuerdo con Davies, (2001) el lapso de tiempo para completar el estudio con plantas de girasol es de aproximadamente 50 días, pero la duración del presente experimento fue de 70 días con el fin de registrar el comportamiento de la absorción del cinc y cobre por la planta posteriormente a su fase de mayor absorción de nutrimentos. Las fechas programadas fueron las siguientes: A los 25 días después del trasplante, contando con 40 días. de crecimiento, en este periodo la planta presenta una mayor absorción de nutrimentos. A los 55 días después de la siembra. A los 70 días después de la siembra. 3.7.6 Preparación y análisis de muestras Al término del experimento, las plantas fueron cuidadosamente extraídas de las macetas, separándose la parte aérea y radicular, se lavaron con agua corriente para eliminar los residuos de suelo, posteriormente se procesaron cada una de las partes de las plantas para determinar la concentración de los metales pesados. 84 3.8. Variables evaluadas Las variables evaluadas fueron: concentración de metales pesados en la parte aérea y en las raíces de las plantas inoculadas y no inoculadas, concentración de metales pesados en el suelo con la planta inoculada y no inoculada, colonización micorrízica y la población de esporas, al finalizar el experimento. 3.9. Análisis estadístico Se efectuó un análisis de varianza (ANOVA) para una distribución de los tratamientos completamente al azar con dos tratamientos, mediante el programa estadístico SAS (Statistical Analysis System) (SAS, 1990) y se utilizó la prueba de Tukey al 0.05 de probabilidad para la separación de los promedios y determinación del mejor tratamiento. 85 4. RESULTADOS 4.1. Análisis físicos y químicos de los suelos Los resultados obtenidos de los análisis físicos y químicos de los suelos colectados y estudiados se presentan en el Cuadro 5. Con respecto al pH, los valores se indican que los suelos varían dentro de un intervalo de 6.4 a 7.1. El de pH 6.4 es considerado como ligeramente ácido y los que presentan un pH de 7.0 y 7.1 son neutros, por lo que de acuerdo con Daub y Seese (1996) estos suelos se clasifican como ligeramente ácidos a neutros. Cuadro 5. Características químicas y físicas de los diferentes suelos muestreados. Los datos son promedio de 3 repeticiones. Sitio pH (H2 O) Laguna de oxidación. 6.4 Materia orgánica CE (mScm-1) 0.8 0.70 Textura Areno-limo-arcilloso (15 % arcilla 13% limo 72 %arena) Ávila Camacho 7.0 1.6 0.1 Arena (5 % arcilla 5 % limo 90% arena) El Charco con cultivo 7.1 2.8 0.8 Franco Arenoso (14% arcilla 12 % limo 74%arena) El Charco no cultivado 6.9 1.9 0.1 Arena (5 % arcilla 5 % limo 90% arena) El Centinela con cultivo 7.1 2.9 0.5 Areno limo arcilloso (15 % arcilla 13 % lino 72% arena) El Centinela no cultivado 6.9 2.1 0.2 Franco arenoso (14% arcilla 12% limo 74% arena) Nota: Análisis realizados en el laboratorio de la Facultad de Ciencia Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima, utilizando métodos estandarizados de suelo y las especificaciones del .PROYNOM-021-RECNAT-2000 (SEMARNAT,2000). Estos análisis fueron ratificados por el Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa, Ver. (LATEX). 86 El valor de pH, dentro del cual se encuentra el suelo de la Laguna de Oxidación (6.4) es considerado como ligeramente ácido. Mientras que en los otros suelos muestreados como El Charco y El Centinela no cultivados, El Charco y El Centinela cultivados a sí como también el suelo de Ávila Camacho presentan un pH neutro. Con respecto a los contenidos de materia orgánica, se estableció que en la Laguna de Oxidación, el suelo es muy pobre en materia orgánica (0.8); además con un pH ligeramente ácido; ambos factores intervienen en la solubilidad de los metales pesados. En los sitios muestreados de Ávila Camacho, El Charco y El Centinela no cultivado son moderadamente altos en materia orgánica, pero son ricos en esa propiedad química los suelos de El Charco y El Centinela cultivados, considerando que estos suelos son neutros se limite la movilidad y disponibilidad de metales pesados (Termminghof et al., 1997). La textura de suelo es otro factor importante que influye en la movilidad y disponibilidad de los metales pesados. De acuerdo con los resultados de los análisis realizados a los suelos colectados, se observa que la textura que presentan los suelos muestreados de Ávila Camacho y El Charco sin cultivar son arenosos, mientras en El Charco cultivado y El Centinela con cultivo son franco arenosos y los suelos de la Laguna de Oxidación y El Centinela cultivado son areno-limo-arcilloso. Recordando que la conductividad eléctrica de un suelo nos indica la salinidad del mismo y de acuerdo con los resultados obtenidos de los suelos muestreados, nos señalan que estos suelos no son salinos. 87 4.2. Concentración de metales pesados en los suelos muestreados. En el Cuadro 6 se muestran los resultados de la concentración de metales pesados de los sitios muestreados, que se obtuvieron en el laboratorio y además se exponen como referencia los límites máximos permitidos en los países Europeos, Estados Unidos de América y Canadá (Kloke, 1980). Cuadro 6. Concentración de metales pesados (ppm) en cada uno de los suelos colectados. Sitios Laguna de Muestreados oxidación Ávila ElCharco Camacho (cultivado) El Charco (sin cultivo) ElCentinela El Centinela ( cultivado) (sin cultivo) Plomo 100 L.M.P 22.9 12.90 15.21 14.78 17.23 20.01 Cromo 100L.M..P 4.47 49.06 42.00 39.87 27.27 25.10 Cadmio 3.0L.M..P 2.0 1.18 1.98 2.01 1.99 2.01 Cinc 300L.M..P 270.60 72.86 64.59 69.06 69.93 89.71 Cobre 100L.M..P 592.92 42.36 54.60 88.46 110.01 44.10 Fuente: Análisis realizados en el laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa (LATEX), utilizando métodos estandarizados de suelo y las especificaciones del PROY-NOM-021-RECNAT-2000. (SEMARNAT,2000). Límite máximo permitido (LMP). En el suelo de la laguna de oxidación se registraron las concentraciones más altas de Cu y de Zn, sin dejar de ser importante la presencia de Pb, Cd y C. Con respecto a los otros suelos muestreados, se observa también una considerable concentración de metales pesados, siendo el sitio El Charco con cultivo mostrando las concentraciones mas bajas 88 exceptuando el Pb y en El Centinela no cultivado se denota la mayor presencia de Cu y Zn por lo que este sitio fue seleccionado para el estudio de investigación. 4.3 Cuantificación de esporas y determinación de la colonización micorrízica de los sitios muestreados Los resultados obtenidos de la colonización micorrízica y el número de esporas en los sitios muestreados se exponen en el Cuadro 7. Cuadro 7. Colonización micorrízica expontána en los suelos de los sitios muestreados. Los datos son promedios de tres repeticiones. Sitios Colonización micorrízica (%) Número de esporas por 100 g suelo seco 1 0.45 00 Ávila Camacho 59.0 9.18 505 3.62 El Charco (con cultivo) 43.3 7.41 418 2.23 El Charco (no cultivado) 48.9 2.35 432 1.48 ElCentinela (con cultivo) 43.6 5.67 402 1.35 ElCentinela (no cultivado) 32.8 6.45 344 1.14 Laguna de oxidación Es importante hacer notar que en suelo de la laguna de oxidación, presentó una mayor concentración de metales pesados, no se registró la presencia de esporas y una colonización radicular pobre, que no es relevante. Con respecto a los demás suelos estudiados el de Ávila Camacho, como observa en el Cuadro 7 es el que muestra un mayor número de esporas (505esporas/ 100g de suelo seco), así como también de vesículas, estableciendose que en 89 los demás sitios estudiados con el aumento de la concentración de metales pesados en sus suelos se disminuye el porcentaje de colonización y el número de esporas de HMA. Una muestra de las esporas extraídas de los suelos colectados se presentan en la Fig. 12. Figura 12. Espora globosa que muestra la hifa sustentora bulbosa, extraída del suelo de Ávila Camacho. En los sitios restantes como El Charco y El Centinela con cultivo y sin cultivar, también se observó la presencia de esporas (Fig. 13 y 14). 90 Figura 13. Esporas extraídas del sitio El Centinela no cultivado en donde se aprecian hifas de sostén (Fotografía tomada a 10x ). Figura 14. Espora apreciándose la hifa en forma de embudo extraída del sitio El Centinela no cultivado (Fotografía tomada a 20x.). Las tinciones realizadas en las raíces de las plantas de los sitios muestreados, se observó la presencia de estructuras como hifas (Fig. 15), micelio (Fig. 16) y arbúsculos (Fig. 17). 91 D a) (b Figura 15. Estructuras de HMA en la raíces de plantas más representativas del sitio El Centinela no cultivado: a) hifas y b) vesícula. a) b) Figura 16. Ilustración que muestra a) micelio externo y b) esporas en el suelo colectado en Ávila Camacho. 92 Figura 17. Detalles de los arbúsculos del sitio El Charco (no cultivado). 4.4. Diversidad morfológica de HMA presentes en el suelo de estudio Las esporas de los HMA nativos extraídos del suelo con mayor contaminación de Zn y Cu fueron propagadas de donde se distinguieron cuatro diferentes morfotipos de HMA, identificándose solamente el más ampliamente representado y de acuerdo con las características morfológicas denotadas en el manual de Schenk y Pérez (1992) realizada por la Dra. Lucía Varela Fregoso, las esporas identificadas corresponden a Glomus mosseae. De acuerdo con el INVAM las características morfológicas que presenta Glomus mosseae se describen a continuación. Algunos cultivos en las macetas producen esporas en agregados de 2-8 rodeado por un estrecho perídio, el color del esporocarpo varía de caféamarillas a cafés. El perídio alrededor de estas esporas es de unos 10-38 µm de espesor, con robustas hifas (con paredes de 8-18 µm de ancho y unos 1.6-3.5 µm de espesor) 93 mezclado con muchas finas ramificaciones de hifa (2-5 µm de ancho, paredes de < 1 µm de espesor). El peridio no altera la estructura de la pared de la espora, y parece ser un carácter inestable (generalmente se pierde después de muchas sucesiones o cultivos sucesivos). En las esporas completas el color varia de naranja a café oscuro, siendo en su mayoría amarillos-café con forma globosa a subglobosa algo irregulares, la distribución de tamaño es de 100-260 µm con un promedio de 195 µm. Con respecto a la pared de la espora: estas poseen tres capas que la forman consecutivamente, pero con diferencias (secuencia baja, de izquierda a derecha). Las dos superficiales seguido mudan la piel, variando los grados de madurez, o indican las esporas mas viejas. La forma de la hifa varia de acampanada a una forma de embudo de ancho 16-32 µm como promedio 24 µm. En el suelo de estudio se encontraron esporas en su mayoría de un color amarillo claro a café oscuro de forma globosa a subglobosa, el tamaño fue de 100 a 260 m de diámetro en promedio 150 m (Fig. 15) y con paredes de 7.5 a 12.5 m (Figs. 18 y 19) con hifas sustentoras que presentan un septo recurveado con forma de embudo que es una característica particular de Glomus mosseae (Figs. 20 y 21). 94 a) b) Figura 18. a) Espora globosa b) Espora subglobosa con hifa de sostén. Esporas montadas en PVLG (Fotografías tomadas a 20x). Figura 19. Espora rota mostrando doble pared, montada en PVLG (Fotografía tomada a 40x). 95 Figura 20. Espora con hifa en forma de embudo, fijadas en alcohol polivinilico lactoglicerol (PVLG), (Fotografía tomada 20x) Figura 21. Espora montada en PVLG apreciándose una hifa en forma de embudo, con pared gruesa (Fotografía tomada a 40x). 96 4.5. Contribución de Glomus intraradices en la absorción y translocación del cinc y cobre por el girasol El suelo muestreado de El Centinela no cultivado fue elegido como sitio de estudio porque fue el que presentó una mayor concentración de cinc (89.71ppm) y cobre (110.01 ppm) además se observo la presencia de HMA nativos, pero debido a que su propagación no fue suficiente para ser empleado como inóculo; se tomo la decisión de usar a Glomus intraradices, para cuantificar su contribución en la absorción y translocación del cinc y cobre por las plantas de girasol inoculadas. Se calendarizaron tres muestreos de acuerdo con las etapas de crecimiento de esta planta con el fin de cuantificar la concentración de estos metales en la raíz y la parte aérea de la planta; estos muestreos se realizaron en las siguientes fechas. A los 40, a los 55 y 70 días después de la siembra se analizó la absorción de cobre y del cinc en la parte aérea y radicular en las plantas de girasol. Los resultados de la absorción y la translocación del cobre y cinc por las plantas de girasol inoculadas y no inoculadas se muestran en el Cuadro 8. 97 Cuadro 8. Contenido del cobre y cinc en plantas de girasol M y NM en ppm a los 40, 55 y 70 días de crecimiento, como los medios de diez replicas. Fechas Raíz Parte aérea Planta Completa ZnM CuM 66.6 ± 0.84b 75.0 ± 6.83a 38.6 ± 2.52b 46.0 ± 6.33a 105 ± 1.71b 121 ± 6.58a ZnNM Cu NM 43.0 ± 2.82b 57.0 ± 7.67a 25.5 ± 0.78b 37.0 ± 5.90a 68.5 ± 1.80b 94.0 ± 6.78a ZnM CuM 16.6 ± 0.57b 26.6 ± 0.73a 17.1 ±0.67a 11.6 ± 0.94b 33.7 ± 0.62a 36.2 ± 0.82a ZnNM Cu NM 16.8 ± 0.57b 22.4 ± 1.27a 16.1 ± 0.68a 11.1 ± 0.91b 32.9 ± 0.68a 33.5 ± 1.09a ZnM CuM 15.9 ± 0.70b 26.1 ± 1.17a 16.3 ± 0.91a 11.0 ± 1.22b 32.2 ± 0.80b 37.1 ± 1.95a ZnNM Cu NM 16.3 ± 1.06b 21.8 ± 2.48a 15.8 ± 1.38a 10.8 ± 1.28b 32.1 ± 1.22a 32.6 ± 1.88a 40 días 55 días 70 días Letras distintas presentan diferencia significativa (P<0.05; prueba-t) entre tratamientos (Zn y Cu Micorrizado a los 40 días; Zn y Cu no Micorrizado a los 40 días; Zn y Cu Micorrizado a los 55 días; Zn y Cu no Micorrizado a los 55 días; Zn y Cu Micorrizado a los 70 días; Zn y Cu no Micorrizado a los 70 días). De los resultados que se exponen en el Cuadro 8, se observa a los 40 días (primer muestreo) el análisis estadístico mostró diferencia significativa para la absorción y la translocación del cobre entre las plantas de girasol inoculadas (M) y no inoculadas (NM). En las raíces de las plantas inoculadas (M) se muestra que el Cu fue absorbido en mayor proporción con respecto al Zn. Con referencia a las plantas no inoculadas (NM) se observa que la absorción de los metales fue en menor cantidad. Si se compara la absorción de los 98 metales en las plantas completas con inóculo y sin inoculación se manifiesta las diferencias entre los tratamientos. Con respecto a la translocación, es notorio que tanto el Zn como el Cu permanecieron en mayor proporción en la parte radicular disminuyéndose así la translocación hacia la parte aérea de las plantas (M) y en menor cantidad de las plantas (NM). Con referencia a los resultados que se muestran a los 55 y 70 días, segundo y tercer muestreo, respectivamente; en la absorción de Cu por las plantas de girasol inoculadas (M) se observa que existen mínimas diferencias entre el segundo y tercer muestreo con 26.6 a 26.1 mg / kg; mostrándose diferencia significativa con el primer muestreo de 75 mg / kg. En la translocación también existen diferencias mínimas entre el segundo y tercer muestreo entre las plantas inoculadas y no inoculadas. Con respecto al Zn, no existió diferencia significativa entre el segundo y tercer muestreo, entre las planta inoculadas (M) y no inoculadas (NM). 4.6. Colonización micorrízica del suelo de estudio al término del experimento De acuerdo con la concentración de metales registrada en el suelo de estudio, se considera como levemente contaminado, por ese hecho la colonización micorrízica y el número de esporas en el suelo sustrato al finalizar el experimento fue la siguiente: Como promedio de tres repeticiones, la colonización micorrízica presentó (61.7 ± 2.56) y el número de esporas por 100 g de suelo seco se registró (472 ± 3.69). 99 5. DISCUSIÓN 5.1 Análisis físicos y químicos de los suelos colectados De acuerdo con Alloway (1995) el pH es un factor importante para determinar la solubilidad de los metales como el Cu y el Zn en el suelo; así como también su movilidad y disponibilidad para las plantas, específicamente a medida que disminuye el pH aumenta la solubilidad del Cu y Zn, así como también otros metales pesados. De esta manera, el suelo de la Laguna de Oxidación que presentó un pH ligeramente ácido, y de acuerdo con Weissenhorn et al., (1994) este suelo presenta una mayor movilidad y disponibilidad de metales pesados, convirtiendo un suelo con una mayor concentración de ellos. Con respecto a los otros suelos muestreados son considerados como neutros y de acuerdo con Alloway, (1993), Kabata-Pendias (2000) en este tipo de suelos la concentración movilidad de los metales pesados es menor, lo que se refleja en la movilidad de estos elementos en sus suelos que son menores que en la laguna de oxidación. Un aspecto relevante de la materia orgánica es su atracción por los metales pesados cuando éstos se encuentran en disolución, tiene propiedades secuestradoras ya que contiene una gran cantidad de cargas negativas y a menudo forma complejos orgánicos solubles, que pueden polimerizarse sobre los complejos moleculares del humus. De esta forma, la materia orgánica del suelo a menudo actúa como almacén de estos elementos, si bien puede transferirlos a la vegetación o a la fase acuosa si se produce su descomposición en medio ácido u oxidante. Debido a la capacidad de la materia orgánica para formar complejos estables con los iones metálicos, la relación entre la materia orgánica del suelo y los 100 metales pesados es muy importante, especialmente en suelos neutros y tendientes a alcalinos, donde su afinidad es aún mayor. De acuerdo con Alloway, (1995) una de las asociaciones materia orgánica-metal pesado más estrecha se da con el cobre, lo que redunda en una fuerte disminución de su potencial tóxico. Un suelo con alto porcentaje de materia orgánica y un pH neutro son factores básicos que representan una alta capacidad amortiguadora en la disponibilidad de los metales pesados por las plantas. De lo anterior se destaca que el sito de la Laguna de Oxidación, es pobre en materia orgánica y su pH tiende a ácido por lo que la movilidad de los metales pesados es elevada como se refleja en los resultados, mientras que en los suelos restantes, muestran contenidos de materia orgánica normal y un pH neutro por lo que de acuerdo con Alloway (1995) y Kabata-Pendias (2000) son suelos que amortiguan la disponibilidad de los metales pesados lo que se refleja en los resultados en donde la concentración de ellos es menor que en la laguna de oxidación motivo por el cual muestran una menor toxicidad debido a la menor solubilidad de los metales. De acuerdo con Kabata-Pendias (2000), la entrada e infiltración de los metales pesados en el suelo está regulado por la textura de los suelos. En los resultados se observa que solamente dos suelos arenosos carecen de la capacidad para fijar los metales pesados en el suelo, lo cual pasa rápidamente al subsuelos y contaminan los mantos freáticos, en cambio con respecto a los otros suelos colectados, presentan en su textura una mayor cantidad de limo y arcilla por lo que tienden a fijar los metales pesados. 101 Los resultados de los análisis físicos y químicos realizados a los suelos colectados en este estudio, muestran concordancia con los resultados de los experimentos realizados por líderes en la recuperación de suelos contaminados con metales tales como: Haselwandter et al.,(1994); Leyval et al., (1991); Turnau, (1998); Chaney et al., (1998); Jamal et al., (2002); Leyval et al., (2002) en donde señalan que los suelos en donde son depositados los residuos de minas presentan un pH ácido, con pobre contenido de materia orgánica. En nuestro estudio el suelo colectado de la laguna de oxidación, en donde son depositados los residuos de la mina “Benito Juárez” muestra un pH (6.4) ligeramente ácido y un pobre contenido (0.8) de materia orgánica. 5.2 Concentración de metales pesados en los suelos colectados Se compararon con los máximos permitidos del Cuadro 1, en donde se muestran la concentración normal y los límites permisibles de la concentración de metales pesados en suelos de los países europeos y norteamericanos, debido a que en México, según la SEMARNAT, actualmente está en elaboración la Norma Mexicana que establece los criterios para determinar los máximos permitidos, se espera que a principios del 2005 esté en consulta pública (comunicación vía correo electrónico), razón por la cual los resultados solamente se compararon con normas europeas y norteamericanas. En el suelo de la laguna de oxidación, el cadmio, cobre y cinc rebasan el límite permitido, mientras que el plomo y el cromo se encuentran dentro del contenido normal. Siendo el cobre el que rebasa el límite máximo permitido. 102 El suelo de Ávila Camacho muestra que los contenidos de cadmio, cinc, cobre, cadmio cinc rebasan el contenido del límite permitido, pero ningún metal se sobrepasan de los límites máximos permitidos. Los suelos de los sitios de El Charco y El Centinela cultivados, así como El Charco no cultivado reportan que el plomo y el cromo se encuentran dentro de los límites del contenido permitido, pero el cadmio rebasa ligeramente este límite, en cambio el cobre y el cinc se encuentran excesivamente fuera de ese límite sin salirse de los límites máximos permitidos. Analizando los resultados del sitio El Centinela no cultivado, se observa que solamente el cromo se encuentra dentro del limite permitido, en cambio el cadmio, cinc, y plomo se encuentran extralimitados de este intervalo, se reporta solamente que el cobre se encuentra fuera del límite máximo permitido. Por lo que este suelo se presenta como el sitio con la mayor concentración en cinc, cobre y el cadmio en menor proporción, debido a que las propiedades física y químicas del Zn y Cd son muy semejantes y de acuerdo con Chaney et al., (2000) el Zn suministra protección contra la transferencia del Cd a la cadena alimenticia, motivo por el cual se tomó solamente el Cu y el Zn en la evaluación con Glomus intraradices en la absorción y translocación por las plantas de girasol. Recordando la relación inversa entre el pH, la movilidad y disponibilidad de metales pesados en el suelo, a mayor pH menor movilidad y disponibilidad y viceversa; en los suelos de los sitios muestreados que tienen un pH neutro se presenta una menor movilidad 103 y disponibilidad de metales pesados. Por lo anterior se deberá considerar ese factor en los resultados obtenidos de la concentración de metales pesados de los suelos muestreados, y debido a que presentan un pH neutro la concentración de metales pesados no es elevada. Comparando los resultados de los suelos muestreados que se presentan en el Cuadro 2 en donde se muestra la clasificación de contaminación y polución de los suelos colectados, se puede establecer que el suelo de la Laguna de Oxidación, con respecto al cobre presenta una severa polución, una leve polución en cinc, mientras que el plomo, cadmio y cromo se muestran levemente contaminados. En los suelos El Centinela y El Charco cultivados, El Charco no cultivado presentan una leve contaminación. No así el suelo El Centinela no cultivado con respecto al cobre y al cinc se muestra como un suelo con una leve polución. 5.3 Cuantificación de esporas y determinación de la colonización micorrízica Aun bajo condiciones de contaminación es importante hacer notar que aunque los suelos de los sitios muestreados contenían concentraciones de metales pesados se constato la existencia de esporas en el suelo y de vesículas en las raíces de las plantas endémicas En el suelo de la laguna de oxidación, no se encontraron esporas y el porcentaje de colonización en las raíces no fue significativa, estos resultados muestran una semejanza con los obtenidos por Leyval et al., (1991); Haselwandter et al., (1994); Weissenhorn et al., (1995); Turnau, (1998); Jamal et al., (2002); Leyval et al., (2002); Malcova et al., (2003), ellos reportaron que en suelos en donde son depositados residuos de minas son afectadas las poblaciones de HMA reduciendo el número de esporas en el suelo y la colonización en las 104 plantas endémicas del lugar, lo anterior también depende del nivel de contaminación. Como se observa en los resultados a medida que aumentan la concentración de los metales disminuyen la población de hongos micorrízicos. Los resultados sugieren que en el establecimientos de programas de fitorremeiación es necesario incluir la inoculación con HMA en las plantas hiperacumuladoras. Es interesante destacar que en este suelo se observó la presencia de plantas registradas como formadoras de micorriza como el diente de león y el tule, las cuales se han reportado como plantas hiperacumuladoras de metales pesados. El suelo de la laguna de oxidación es el que presenta, una severa polución, relacionando con la nula presencia de poblaciones de HMA y escasa materia orgánica y con un pH tendiendo a ácido que de acuerdo con la literatura aumenta la solubilidad de los metales pesados. Con respecto a los demás suelos del sitio El Centinela y El Charco cultivados, así como El Charco no cultivado presentan una colonización promedio del 39% y un número de esporas en 100 g de suelos seco son un promedio de aproximadamente de 400 esporas, de lo cual se puede decir que aunque exista una moderada contaminación en estos suelos es interesante decir que los HMA presentan una tolerancia a estos metales. El suelo de El Centinela no cultivado presenta con respecto a los sitios del Centinela y El Charco cultivados y El Charco no cultivado un menor número de esporas y porcentaje de colonización micorrízica, por lo que es significativo hacer notar que la concentración de los metales pesados en este suelo es mayor que en los sitos anteriormente mencionados con excepción al suelo de la laguna de oxidación por lo que, de acuerdo con Leyval et al., 105 (2002) y Malcova et al., (2003) también mostraron resultados similares a los obtenidos en este estudio con relación al porcentaje de colonización y el número de esporas en donde se coincide que cuando en el suelo aumenta la concentración de metales pesados entonces se disminuyen las poblaciones de los HMA nativos de estos suelos. Recordando que los sitios muestreados se encuentran ubicados a lo largo de una pendiente y es el sitio de la Laguna de Oxidación el que se ubica en la cima, siguiendo el sitio Ávila Camacho continuando con el sitio llamado El Charco y finalizando el Centinela, de acuerdo con ellos se detecta que a medida que disminuye la pendiente se aumenta la concentración de Zn y Cu y disminuye el porcentaje de colonización micorrízica y el número de esporas; tal como se menciona anteriormente el número de esporas de los suelos rizósfericos disminuyen de acuerdo con el aumento de la concentración de metales pesados de esos suelos. Sin embargo, aunque los suelos muestreados, con excepción del suelo de la Laguna de Oxidación, presentan una leve contaminación, pueden afectar la largo plazo al crecimiento de las plantas, el crecimiento de las poblaciones microbianas, y el paso los metales hacia la cadena alimenticia. 5.4. Diversidad morfológica de HMA en el suelo de estudio En los mirfotipos de esporas de los HMA propagados en cultivo trampa y de acuerdo con las observaciones de las preparaciones en PVLG en el microscopio estereoscopio no se 106 encontró una diversidad de especies, pero la más representativas pertenece al orden taxonómico de los Glomales, de acuerdo con sus características morfologicas la identificación se trata de Glomus mosseae, que según autores como Gildon y Tinker (1983); Leyval et al., (1995); del Val et al., (1998); Jarausch-Wehrheim et al., (1999); Pawlowska et al., (2000), Christie et al., (2004), esta especie ha sido aislada de diversos suelos contaminados, donde ha mostrato mayor tolerancia al Zn, Cd y Cu, que las especies aisladas de suelos no contaminados y de acuerdo con la literatura es el que ha demostrado la mayor capacidad de tolerar la toxicidad de metales pesados como el Zn y Cu en las plantas. En el presente estudio, no fue posible utilizar esta especie de Glomus mosseae ya que su propagación no se logro contar con el inóculo necesario para inocular las plantas de girasol, hecho que se lamenta por lo anteriormente mencionado. Los principales factores que probablemente afectarón la reproducción de los HMA nativos pudieron ser los que se mencionan a continuación: la concentración de los metales pesados, el cultivo trampa que se utilizo en la propagaciónde los HMA y el tiempo de crecimiento del cultivo trampa. 5.5. Contribución de Glomus intraradices en la absorción y translocación del cinc y cobre. El primer muestreo realizado a los 40 días, como se mencionó anteriormente fué el periodo de máxima absorción por las plantas, y es interesante hacer notar, que los resultados establecen una marcada diferencia entre plantas inoculadas y las no inoculadas 107 con G. Intraradices; ya que en las primeras la absorción del cinc y cobre es considerablemente mayor que en las plantas sin inocular (Cuadro 8). También es importante apreciar que la mayor concentración de los metales pesados permaneció en las raíces disminuyendo así la translocacion hacia la parte aérea de las plantas inoculadas. Estos resultados no coinciden con los reportados con Leyval et al., (1995) y Christie et al., (2004) quienes señalan en sus resultados una reducida absorción de Cu y Zn por plantas de maíz inoculadas Esto puede atribuirse a que el suelo empleado en sus estudios, existió una elevada concentración de estos metales, excedia a los máximos permisibles. También puede adscribirse al decrecimiento de la colonización (ma) en la planta acumuladora debido a las elevadas concentraciones de metales pesados en suelos, esto ha sido reportado por Schuepp et al., (1989); Leyval et al., (1991); Christie et al., (2004). Los resultados obtenidos en este estudio, coinciden con lo señalan por Li, (2002) y Davies, (2001) quienes reportan diferencias significativas para la absorción de metales pesados entre las plantas acumuladoras inoculadas (M) y no inoculadas (NM). Por otra parte en nuestro estudio, la notable absorción de Cu y Zn en las plantas inoculadas, se deba a que el suelo fue considerado como levemente contaminado sugún Kabata Pendias, (1995), y se ha demostrado que los efectos primarios de los metales pesados se producen en las raíces, lo que se traduce en una menor elongación después de ser expuestas a estos metales (Lamber et al., 1998) también puede atribuirse al importante papel que desempeña la simbiosis micorrízica en la mejora de la disponibilidad de estos metales en el suelo de estudio. 108 El análisis de los resultados que se muestran en el Cuadro 8, con respecto a la absorción del Zn y el Cu, se denota que el cobre muestra una mayor presencia que el Zn en las raíces de las plantas inoculadas. Con respecto a la translocación del Cu y del Zn a la parte aérea de las plantas inoculadas se percibe una reducción en el transito de la raíz hacia la parte aérea. La comparación entre las plantas M y las plantas NM, establece que la mayor absorción de cinc y cobre por las raíces, así como también la disminución de la translocacion a la parte aérea ocurrió en las plantas inoculadas, estos resultados se atribuyen a la importante función que desempeñan los HMA en la tolerancia a los metales pesados en la recuperación de suelos contaminados, por otra parte, la glomalina que es una glucoproteína atrapa a los metales pesados, está puede ser la razón por la cual los contaminates permanecen la mayor parte en las raíces. Con respecto a los resultados de los dos muestreos restantes a los 55 y 70 días que se muestran en el Cuadro 8, coinciden con lo reportado por autores como Leyval et al.,(1995), quienes señalan concentraciones de metal significativamente más bajas; lo cual puede atribuirse a diversos factores que pudieron estar involucrados como son: el término del periodo de máxima absorción de la planta acumuladora, el aumento de la biomasa radicular y aérea de las plantas inoculadas. Probablemente en nuestro estudio, los resultados de los dos últimos muestreos la concentración del Cu y del Zn sea debido a que estos metales se almacenaron en el micelio específicamente en la glomalina siendo esta una glicoproteína la cual puede atrapar metales pesados. Estos resultados demuestran el delicado balance entre los efectos micorrízicos en el crecimiento de la planta y la adquisición de estos metales, tal como lo establecen autores como Leyval et al., (1997); Christie et al., (2004). La 109 comprensión de la absorción y de la translocación del cinc y del cobre por las plantas inoculadas es importante y se requiere resaltar diversos factores como la disponibilidad de estos metales en el suelo para ser absorbidos por la planta y los sitios de almacenamiento en los órganos de las plantas, su evolución durante el ciclo de crecimiento y su fisiología; como es sugerido por autores como Weissenhorn et al., (1995) y Zhu et al., (2001). Si se preguntara para que utilizar los HMA en nuestro modelo de estudiosi la planta de girasol ya por si sola puede absorber y disminuir el paso de estos metales hacia la parte aérea, la respuesta es que los HMA pueden proveer una capacidad adicional para retener metales en la raíz contribuyendo a optimizar la absorción y la translocación, además de conferir una protección a las plantas contra la toxicidad del Zn y Cu. Se ha demostrado que los efectos primarios de los metales pesados se producen en las raíces, lo que muestra una menor elongación después de ser expuestas a estos metales cuando éstos superan los límites permisibles, lo que origina el aspecto achaparrado de las plantas por lo que es esencial el inóculo de los HMA que contribuye a aumentar la biomasa radicular, extendiendo así su radio de acción en la absorción de metales pesados, además que protegen a la planta contra el estrés presentado por la toxicidad de los metales. Por lo que las plantas de girasol inoculadas presentan una tolerancia a estos metales y pueden ser consideradas para la recuperación de suelos contaminados para mejorar el crecimiento, viabilidad de las plantas y su resistencia a éstos metales. 110 5.6. Colonización micorrízica al término del experimento De acuerdo con los resultados obtenidos la colonización micorrízica presentó (61.7 ± 2.56) y el número de esporas por 100 g de suelo seco se registró (472 ± 3.69), indican que la colonización micorrízica muestra sensibilidad al cobre y al cinc, pero no se muestra afectada de manera drástica, ya que comparada con la colonización de un suelo no contaminado que dependiendo de factores abióticos es de aproximadamente del 80- 90% (Pawlowska et al.,2000) por lo que se deduce, que la colonización sigue ocurriendo incluso en estos niveles de contaminación, De acuerdo con Weissenhorn y Leyval (1996); Weissenhorn et al., (1994), dichos autores señalan que los HMA del género Glomus son tolerantes a metales pesados como Zn y Cu en suelos levemente contaminados. 111 6. CONCLUSIONES La concentración de metales determinada en los suelos colectados, se concluye que el suelo de la laguna de oxidación puede ser considerado como un suelo con severa polución; mientras que los restantes de acuerdo con los límites permitidos son clasificados como ligeramente contaminados. En los suelos de la laguna de oxidación no se confirmó la presencia de esporas y la colonización no fue significativa. En los suelos restantes colectados, si se registró una significante presencia de HMA, por lo que se concluye que son tolerantes a los metales pesados aunque en elevadas concentraciones su presencia es miníma. De acuerdo con las características morfológicas la identificación la población de HMA más representativas en el suelo de estudio El Centinela sin cultivo fue el Glomus intraradices, por lo que se concluye que una de las especies de HMA más tolerante a los metales pesados. Los resultados del estudio en maceta muestran que la hipótesis planteada debe ser aceptada; ya que estos indican que la inoculación de G. intraradices contribuye de manera positiva en la absorción y la translocación de Cu y de Zn en las plantas de girasolTambién demuestra que en las raíces hubo una mayor absorción de Cu que de Zn y se encontró en estas, una cantidad mas elevada que en la parte aérea, por lo que se concluye que sí contribuyó en la disminución de la translocación de estos metales hacia la parte foliar del girasol. 112 Con respecto a las plantas de girasol no inoculadas, por ser una especie catalogada como acumuladora de metales pesados, si se registró absorción y translocación de metales; aunque en menor grado que las plantas inoculadas con G intraradices. Esto indica que la planta tiene sus propios mecanismos de protección contra la toxicidad de los metales, tales como la acumulación en los plástidos de las células de las raíces o secuestración por proteínas inducibles de bajo peso molecular retenedoras de metales como fitoquelatinas y metalotioneinas. La función que desempeñan los HMA en la resistencia de las plantas en particular de las hiperacumuladoras, al estrés provocado por los metales y en la protección de la cadena alimenticia, no debe ser ignorada por lo que es necesario realizar mas investigación para una mejor comprensión de la participación de los HMA en suelos contaminados. Así como para elucidar su contribución en los procesos de absorción y translocación de los metales pesados, a través de las hifas, al sistema radicular y posteriormente a las hojas y demás orgános aéreos de las plantas. 113 7. LITERATURA CITADA Abbot, L. K. y Robson A.D. (1992). The role of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi in agriculture and the selection of fungi for inoculation. J. Agric. Res. 33, 389-408. Abda, M. y Oren, V.(1993). Removal of cadmium and associated contaminants from aqueous wastes by fibrous carbon electrodes. Water Res. 27, 1535-1544. Adriano, D. C. (1990). Bioengineering of Trace Metals. Advances in Trace Substances Research .Lewis, Boca Raton , Fl. 513. Adriano, D.C. (1992). Bioengineering of trace metals. Advances in Trace Substances Research Lewis Boca Raton 513. Alba, A. O. y Llanos, M. C., (1990). El cultivo del girasol. Ed. Agroguías Mundi-Prensa 41-55. Alloway, B.J. (1990). Soil processes and the behaviour of metals. In: Heavy Metals in Soils. 7-28. Allen, H.E. y Chen, P.H.(1993). Remediation of metal contaminated soil by EDTA incorporating electrochemical recovery of metal and EDTA. Environ. Prog. 12, 284293. Anderson TA y Coats JR.(1994). Bioremediation Through Rhizosphere Technology. ACS Symposium Series No. 563. American Chemical Society, Washington DC, USA. Angle, J.S., y J. R., Heckman, (1997). Effects of soil pH and sewage sluge on VA mycorrhizal infection of soybeans. Plant Soil 93, 437-441. Atimanav, G., y Alok, A. (2004). Prospects of arbuscular mycorrhizal fungi in phytoremediation of heavy metals contaminated soils. Current Science 86 (4), 528-534. Azcón-Aguilar, C., Palenzuela, J., Roldán, A., Bautista, S., Vallejo, R., y Barea, J.M. (2003). Analysis of the mycorrhizal potential in the rhizosphere of representative plant species from desertification-threatened Mediterranean shrublands. Appl. Soil Ecol. 22, 29-37. Baker, A.J.M., y Brooks, R.R., (1989). Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metallic elements- a review of their distribution, ecology and phytochemistry. Biorecovery 1, 81-126. 114 Baker, A.J.M., and Walker, P.L. (1997). Ecophysiology of Metal Uptake by Tolerant Plants. In Heavy Metal Tolerance in Plants: Evolutionary Aspects. 155-177. Baker, A.J.M., McGrath, S.P., Sidoli,. C.M.D.y Reeves, R.D. (1994). Resources, Conversation and Recycling, 11:41. Barea, J.M., y P. Jeffries. (1995). Arbuscular mycorrhizas in sustainable soil plants systems, p. 521-559. In: B. Hock and A Varma (ed). Mycorrhiza structure, function, molecular biology and biotechnology. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany. Barea, J.M., C. Azcón-Aguilar, y R. Azcón. (1997). Interactions between mycorrhizal fungi and rhizosphere microorganism within the context of sustainable soil-plant systems, p. 65-77. In: A.C. Gange and V.K. Brown (ed), Multitrophic interactions in terrestrial systems. Cambridge, United Kingdom. Baumann, A. (1985). Das Verhalten von Zinksatzen gegen Pflanzen ind im Boden. Landwirtsch. Vers-Statn 73, 97-106. Berti, W. R. y J.W., Huang, (1995). Phytoremediation of contaminated soil. Trends in Biotech. 13, 393 – 397. Besthelin, J., Munier-Lamy., Leyval, C. (1995). Effect of microorganisms on mobility of heavy metals in soils. In: Environmental Impact of Soil Component Interactions Volume 2. Edited by Huanag P.M. Boca Raton: CRC Press: 3-17. Black, C. A. (1983). Methods of Soil Analysis Soil Sci. Am., Inc Publ. Madison Wisc. U.S.A. Bradley R.; A. J. Burt y D. J. Read, (1990). The biology of mycorrhizae in the Eicaceae. VII. The role of mycorrhizal infection in heavy metal resistance New Physiologist 91, 1977-209. Burns, R. G., Rogers, S. y McGhee. (1996). Remediation of inorganic and organic in Industrial and Urban Contaminated Soil. Contaminants and the Soil Environment in the Australia-Pacific Region. 125-181. Brooks, R.R., Morrison R.S., Reeves, R.D., Dudley, T.R. y Akman, Y. (1979). Hyperaccumulation of nickel by Alyssum linneaeus (Cruciferae). In: Proc R Soc Lond B Biol Sci, 203, 387- 402. Brooks, R.R. (1998). Plants that hyperaccumulate heavy metal. CAB International. 380. 115 Brown, S.L., Chaney, R, L., Angle, J.S., Baker, A. J. M., (1995). Zinc and Cadmium Uptake by Hyperaccumulator Thlaspi caerulencens an Metal Tolerant Silene vulgaris Grown on Sludge-Amended Soil, Environ. Sci. and Technol. 29(6), 1581-1585. Brown, S.L., Chaney, R, L., Angle, J.S., y Baker, A. J. M., (1994). Phytoremediation Potential of Thlaspi caerulescens and Bladder campion for Zinc and CadmiumContaminated Soil. Journal of Environmental Quality 23, 1151-1157. Brown, S.L., Chaney, R, L., Hallfrisch, J.G., y Qi Xue (2003). Effect of biosolids processing on lead bioavailability in an urban soil. Environ Qual 32, 100-108. Cabrera, F., Clemente L., Díaz Barrientos, E. López R. y Murillo, J.M. (1999). Heavy metal pollution of soils affected by the Guadiamar toxic flood. Sci Total Environ 242 (1-3): 117-29. Cabrera, F., Murillo, J. M., López, R. (1999). Accumulation of heavy metals in sunflower and sorghum plants affected by the Guadiamar spill. The Science of the Total Environment, 242; 281-292. Cano Parrilla, M.A. Moreno García, A. M. y González Parra, J. (1997). Evaluación de la contaminación por metales pesados en suelos de cultivo. Ecología II: 83-89. Carling, D.E., y Brown, M. F. (1982). Anatomy and physiology of vesicular-arbuscular an nonmycorrhizal roots. Phytopathology 72 (8): 1108-1114. Carter, J. F.(1987). Sunflower Science and Technology. American Society of Agronomy. Crop Science Society of America. Agronomy Series. núm.19. Madison, Wisconsin, EE.UU. Chaney, R. L., Mallik M., Li Y. M., Brown S.L., y Brewer E. P. (1997). Phytoremediation of soil metals. Curr. Opin. Biotechnol 8: 279-84. Chaney, R. L. (1990). Plant Uptake of Inorganic Waste. In Land Treatment of Hazardous Wastes. 50-76. Chaney, R. L., Ryan, J.A., Li Y. M., y Brown S.L. (1999). Soil cadmium as a threat to human health. Pp. 219-256. In: M.J. McLaughlin and B.R. Singh (eds) Cadmium in Soils and Plants. Chaney, R. L., y Ryan, J.A., (1994). Risk Based Standards for Arsenic, Lead and Cadmium in Urban Soils. (ISBN 3-926959-63-0) Dechema, Frankfurt. 130 . 116 Chaney, R. L., (1993). Zinc phytotoxicity,. 135-150. In: A.D Robson (ed) Zinc in Soils and plants. Kluwer Academic Publ., Dordrecht. Chaney, R.L., Ryan J.A., Li Y. M., y Angle J.S. (2000). Transfer of cadmium through plants to the food chain pp. 76-86. In: J.K. Syers and M. Gochfeld (eds) Environmental Cadmium in the Food Chain. Chaney, R. L., Angle, S. J., y Baker, A. J.M. (2001). The phytomining of certain elements. Cooperative Research and Development Agreement Nº 58-3k95-7-570. Chandrashekaragrowth, C.P., Patil, V.C., y Screenivasa, M.N.(1995). VA-mycorrhiza mediated P effect on and yield of sunflower (Helianthus annus L.) at different P levels. Plant Soil. 176, 352-328. Chaudhry, T. M. Hayes, W. J., Khan, A. S., y Khoo, C. H. (1997). Metal Accumulator Plants from two Contaminated Sites of New South Wales Australia. 10-15. Chaudhry, T.M., Khan, A.G., Khoo, C. S., y Hayes W.J., (1997). Assessment of a metal contaminated abandoned mine near Lithgow, NSW., Australia. 9: 69-82. Chaudhry, T.M., Hayes, A.G., Khan, A.G., y Koo, C.S. (1998). Phytoremediation focusing on accumulator plants that remediate metal contaminated soil. Australasian J. Ecotoxicol. 56: 59-65. Chaudhry, T.M., Hill, L., Khan A.G., y Kuek C. (1980). Colonization of iron and zinccontaminated dumped filter cake waste by microbes, plants and associated mycorrhizae. In Remediation and Management of Degraded Land. Chen, Z.S. (1992). Metal contamination of flood soils, rice plants, and surface waters in Asia. In: Biogeochemistry of Trace Metals, Adriano. D.C. (ed) Lewis Publishers. 85108. Chen, J. Cunningham, S.D., y Huang, J.W. (1997). Phytoremediaton of Soil L and Water Contaminants. 89-97. Chen, B., Christie, P., y Li, L. (2001). A modified glass bead compartment cultivation system for studies on nutrient and trace metal uptake by arbuscular mycorrhiza. Chemosphere 42, 185-192. 117 Chen, B. D., Li, X. L., Tao, H. Q., Christie, P., y Wong, M. H. (2003). The role of arbuscular mycorrhiza in zinc uptake by red clover growing in calcareous soil spiked with various quantities of zinc. Chemosphere 50 (6), 839-846. Christie, P., Li, X., Chen, B.(2004). Arbuscular mycohrriza can depress translocation of zinc to shoots of host plants in soils moderately polluted with zinc. Plant and Soil, 261 (1-2), 209-217. Chumbley, G.G. (1991). Permissible levels of toxic metals in sewage sludge used in agriculture land, Agriculture Development and Advisor service. Report No. 10. Clemens, Stephan, Palmgren, Michael G., y Kramer, Ute. (2002). A long way ahead: underting and engineering plant metal accumulation. TRENDS in Plant Science 7 (7): 309-314. Cobb, G.P., Sands, K., Waters, M., Wilson. BG., y Dorward-King, E. (2000). Accumulation of heavy metals by vegetables grown in mine waste. Environmental Toxicology & Chemistry. 19 (3), 66-607. Comis, D. (1996). Green remediation. Journal of soil and Water Conservation. 51, 184-187. Cox, G., y Tinker, P., (1976). Translocation and transfer of nutrients in vesicular-arbuscular mycorrhizae. New Phytol. 77, 371-378. Cunningham, S. D., y Lee, C. R. (1995). Phytoremediation: Plant-Based Remediation of Contaminated Soils and Sediments. In: Skipper, H. D., & Turco, R. F. (Ed) Bioremediation: Science and Applications. (pp 145-147). Wisconsin: Soil Science Society of America., Inc., American Society of Agronomy, Inc., Crop Science Society of America, Inc. Cunningham, S. D., (1996). Promises and Prospects of Phytoremediation. Plant Physiol 110, 715-719. Daniels-Davis, C. (1996). Studies investigating the use of hyper accumulating plants in remediating heavy metal-contaminated soils. Unpublished M. S. Thesis, Jackson State University. 118 Davies, F.T. Jr., Jeffrey D. Puryear, R. J. Newton, J. N. Egilla, J. A., y Saraiva, G. (2001). Mycorrhizal fungi enhance accumulation and tolerance of chromium in sunflower (Helianthus annus L.). Plant Physiol. 158, 777-786. Davies, F.T. Jr. (1987). Mycorrhizal fungi, fertility and media effects on growth and nutrition of Rosa multiflora. Plant Soil. 104, 31-35. Dehn, B., y Schuepp H. (1989). Influence of VA mycorrhizae on the uptake and distribution of heavy metals In: plants. Agric. Ecosystem. Environ. 29, 79-83. Del Val, C., J.M. Barea, y C. Azcón-Aguilar. (1999). Diversity of arbuscular mycorrhizal fungus populations in heavy metals-contaminated soils. Appl. Environ. Microbiol. 65, 718-723. Del Val, C., Barea, J.M., y Azcón-Aguilar C. (1999). Assessing the tolerance to heavy metals of arbuscular mycorrhizal fungi isolated from sewage sludge-contaminated soils. Appl. Soil Ecol., 11, 261-269. De Oliveira, F., Maria,V. P., y Narasimha, F. (1999). Feasible biotechnological and bioremediation strategies for serpentine soils and mine spoils. Electronic Journal of Biotechnology 20-34. Denny, H.J., y Wilkins D.A. (1987). Zinc tolerance in Betula spp. Variation in response to zinc among ectomycorrhizal associates. New phyt, 106, 535-544. Drake, P. Baldo, F., Cuesta, J. A., García- González, D., Silva –García, A., Arias AM., Rodríguez, A., Sobrino, I., y Fernández-Delgado C. (1999). Initial effects of the toxic waste spill (Aznalcollar mine accident) on the aquatic macrofauna of the Guadalquivir Estuary. Science of the Total Environment. 242 (1-3), 271-280. Díaz, G., y Honrubia M. (1995). Effect of native and introduced arbuscular mycorrhizal fungi on growth and nutrient uptake of Lygeum spartum and Anthyllis cytisoides. Biol. Plant 37, 121:129. Díaz, G. Azcón –Aguilar, C. Honrubia, M. (1996). Influence of arbuscular mycorrhizae on heavy metals (Zn and Pb) uptake and growth of Lygeum spartum and Anthyllis cytisoides. Plant Soil 180, 241-249. 119 Dodd, J. C. (2000). The role of arbuscular mycorrhizal fungi in agro-and natural ecosystems. Outlook on Agriculture 29 (1): 55-62. Duek, T.A., Visser, P., Ernest, W.H.O., y Schat, H. (1986). Vesicular-arbuscular mycorrhizae decrease zinc toxicity to grasses growing in zinc-pollutes soil. Soil Biol. Biochem. 18, 331-333. Duschenkov, V., Kumar, N., Motto H., y Raskin, I. (1995). Rhizofiltration: The Use of Plants to Remove Heavy Metals from Aqueous Streams. Environmental Science and Technology 29, 1239-1245. Ebbs, S. D., y L. V. Kochian. (1998). Phytoextraction of zinc by oat (Avena sativa), barley (Hordeum vulgare), and Indian mustard (Brassica juncea). Environ. Sci. Tachnol. 32, 802-806. El-Demerdash, S., Dahdoh M.S.A., y Hassan F.A. (1994). Residual effects of sludge application on corn growth, nutrients and heavy metals uptake. Fertilizer and Environment, VII International symposium, C.I.E.C., IRNA-CSIC. Salamanca, Spain. El-Kherbawy, M, Angle J. S. Heggo A., y Chaney R. L. (1989). Soil pH, rhizobia, and vesicular- arbuscular mycorrhizae inoculation effects on growth and heavy metals uptake of alfalfa (Medicago sativa L.). Biol. Fertil. Soil 8, 61-65. Enkhtuya, B., Rydlová, J., y Vosátka, M. (2002). Effectitveness of indigenous and nonindigenous isolates of arbuscular mycorrhizal fungi in soils from degraded ecosystems and man-made habitats. Appl. Soil Ecol. 14, 201-211. Ernst, W.H.O. (2000). Evolution of metal hyperaccumulation and phytoremediation. New Phytol 146, 357-357. Faber, B. A., Zasoski, R. J. Burau, R. G., y Uriu, K. (1990). Zinc uptake by corn as effected by vesicular- vesicular mycorrhizae. Plant and Soil 129, 121-130. Freitas, H., Prasad, M.N.V., y Pratas, J. (2004). Heavy metals in the plant community of Sao Domingo an abandoned mine in SE Portugal: Possible applications in mine remediation. Environmental International, 30 (1), 65-72. 120 Garbisu, C., y Alkorta, I. (1997). Bioremediation: Principles and Future. J. Clean Technol., Environ. Toxicol. & Occup. Med., 6(4), 351-366. Galli, U., Schuepp, H., y Brunold, C. (1994). Heavy metal binding by mycorrhizal fungi. Physiol. Plantarum 92, 364-368. Gildon, A., y Tinker, P. B. (1981). A heavy metals- tolerant strain of a mycorrhizal fungus. Trans. Br. Mycol. Soc. 77, 648-649. Gildon, A., y Tinker, P. (1983). Interactions of vesicular-arbuscular mycorrhizal infection and heavy metals in plants II. The infection on uptake of cooper. New Phytol. 95, 263268. Gerdemann, J.W. y Nicolson, T.H. (1963). Spores of Mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Trans. Brit. Mycol. Soc. 46, 234-244. Gildon, A., y Tinker, P.B. (1989). Interactions of vesicular- arbuscular mycorrhizal infection and heavy metals in plants. I. The effect of heavy metals on the development of VA mycorrhizae. New Phytol. 94, 247-263. Gilmore, A. E. (1971). The influence of endotrophie mycorrhizae on the growth of peach seedlings. J. Am. Soc. Hort. Sci. 96, 35-38. Glass, D.J.(2000) Economic potential of phytoremediation. P. 15-31. In I. Raskin and B.D. Ensley (Ed) Phytoremediation of toxic metals .John Wiley & Sons, New York. González-Chávez, C,. D´Haen, J., Vangronsveld, J., y Dodd, J. C. (2002). Copper sortion and accumulation by the extraradical mycelium of different Glomus ssp. (arbuscular mycorrhizal fungi) isolated from the same polluted soil. Plant and Soil 240, 287-297. González, M. J., y Hernández, L. M. (1999). Heavy Metal pollution in water, sediments, and earthworms from the Ebro River, Spain. Bolletin of Environmental Contamination & Toxicology. 63(3), 305- 311. Griffioen, W. A J., y Ernst, E. H. O. (1994). The role of VA mycorrhizae in the heavy metals tolerance of Agrosti capillaris L. Agric. Ecosyst. Environ. 29, 173-177. 121 Guilder, K. E., Witter, E., y McGrath, S.P. (1999). Assessing risks of heavy metal toxicity in agricultural soils: Do microbes matters?. Human & Ecological Risk Assessment. 5(4), 683- 689. Guo, Y., George, E., y Marschner, H. (1996). Contribution of an arbuscular mycorrhizal fungus to the uptake of cadmium and nickel in bean and maize plants. Plant and Soil. 184, 195-205. Hall, J.L. (2002). Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance. Journal of Experimental Botany. Vol. 53 (366): 1-11. Ham, G.E., y Dowdy, P.B. (1980). Soybean growth and composition as influenced by soil amendments of sewage sludge and heavy metals: Field studies. Agron. J. 70, 326-330. Hasler, B. (1998). Analysis of environmental measures aimed at reducing nitrogen leaching at the farm level. Environ. Pollut. 102, 227-233. Haselwandter, K. Leyval, C., y Sanders, F. E. (1994). Impact of arbuscular mycorrhizal fungi on plant uptake of heavy metals and radionuclides from soil. In Impact of arbuscular Mycorrhizae on sustainable Agriculture and natural Ecosystems. Eds. S. Gianinazzi and H Schuepp. 179- 189. Birkhauser, Basel. Switzer-land. Hayman, D.S. (1987). VA mycorrhizas in field crop systems. In: Ecophysiology of VA Mycorrhizal Plants.(G.R. Safir, ed.). 171-192. CRC press, Boca Raton, Florida. Herrick, B. A. D., Wilson G. W. T., y Figge, D. A. H. (1994). The influence of mycorrhizal symbiosis and fertilizer amendments on establishment of vegetation in heavy metal mine spoil. Environ. Pollut. 86,171-179. Harrison, M. J. (1997). The arbuscular mycorrhizal symbiosis. Academic. Press Inc. England. ISBN 0-12-325560-0. Heggo, A., Angle, J.S., y Chaney, R. L. (1990). Effects of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi on heavy metals uptake by soybean. Soil Biol. Biochem. 22(6): 865-869. Hildebrant, U., Kaldorf, M., y Bothe, H. (1999). The zinc violet its colonization by arbuscular mycorrhizal fungi. J., Physiol., 154, 709-717. 122 Huang, J. W., y Cunningham, S. D. (1996). Lead phytoextraction: species variation in lead uptake and translocation. New Phytol. 134, 75-85. Huang, J. W., Chen, J. J., Berti, W. B., y Cuninghan, S. D. (1997). Phytoremediation of lead-contaminated soil: role of synthetic chelates in lead phytoextraction. Environ. Sci. Technol. 31, 800-805. INVAM (International Culture Collection of Arbuscular & Vesicular-Arbuscular Mycorrhizal Fungi) (2003). Obtenido en la Red Mundial el 30 de agosto 2004. http://invam.caf.wvu.edu/fugi/taxonomy/classification.htm. Jamal, A., Ayub, N., Usman, M, y Khan, A. G. (2002). Arbuscular mycorrhizal fungi enhance zinc and nickel uptake from contaminated soil by soyabean and lentil. International Journal of Phytoremed. 4 (39): 205-221. Jeffries, P., Gianinazzi, S., Perotto, S. Turnau, K., y Barea, J.M. (2003). The Contribution of arbuscular mycorrhizal fungi in sustainable maintenance of plant health and soil fertility. Biol Fert Solis 37, 1-6. Jensen, D.L., Holm, P. E., y Christensen, T. H. (2000). Soil and groundwater contamination with heavy metals at two scrap iron and metal recycling facilities. Waste Management & Research. 18 (1), 52- 63. Johns, G.G., McConchie, D.M. (1994). Irrigation of bananas with secondary treated sewage. I. Field evaluation of effect on plant nutrients and additional elements in leaf. Australian Journal of Agriculture Research (AUS). 45 (7): 1601- 1617. Joner, M.D. y Hutchinson, T.C. (1986). The effect of mycorrhizal infection on the responses of Betula papyriera to nickel and copper. New Phytol, 102, 429- 442. Joner, E. J., y Leyval, C. (1997). Uptake of Cd., by roots and hyphae of a Glomus mosseae/ Trifolium subterraneum mycorrhizae from soil amended with high and low concentration of cadmium. New. Phytol. 135, 353-360. Joner, E., Briones, R., y Leyval, C. (2000). Metal binding capacity of arbuscular mycorrhizal fungi, Plant and Soil. 226, 227-234. 123 Joner, E.J., y Leyval, C. (2001). Time-course of heavy metals uptake in maize, clover as affected by different micorrhiza inoculation regimes .Biology & Fertility of Soil. 33, 351-357. Kabata Pendias, A. (1995). Agricultural problems related to extensive trace metal contents of soil. In: Salomons, W. V. Forstener C.P. Mader (eds) Heavy metals, problems and solutions. 3-18 Springer-Verlag, Berlin, Germany: 412. Kabata Pendias, A. S., y Pendias, H. (2000). Trace elements in soils and plants. CRC Press, An. Arbor, Michigan 432. Kabir, Z, y Koide, R.T. (2000). The effect of dandelion or a cover crop on mycorrhiza inoculum potential, soil aggregation and yield of maize. Agric. Ecosyst. Environ. 22, 15-28. Kaldorf, M., Kuhn, A. J., Shroder, W. H., Hildebrandt, U., y Bothe, H. (1999). Selective element deposits in maize colonized by a heavy metal tolerance conferring arbuscular mycorrhizal fungi J. Plant Physiol. 154, 718-728. Karthikeyan, R., y Kulakow, P.A. (2003). Soil plant microbe interactions in phytoremediation. Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 78, 53-74. Khan, A.G., y Chaudhry, T.M., Hayes, W.J., Khoo, C. S., Hill, L., Fernández, R., y Gallardo, P. (1997). Growth responses of endomycorrhizal onions in unsterilized coal waste. New Phytologist, 87: 363-370. Khan, A.G. (2001). Relationships between chromium biomagnification, ratio, accumulation factor, and mycorrhizae in plants growing on tannery effluent-polluted soil. Environ. Int. 26, 417-423. Khan, AG., Kuek, C., Chaudhry, TM. Khoo, CS, Hayes, WJ. (2002). Role of plants, mycorrhizae and phytochelators in heavy metal contaminated land remediation. Chemosphere. 41(1-2): 197- 207. Killham, K., y Firestone M. K. (1995). Vesicular- arbuscular mycorrhizal mediation of grass response to acidic and heavy metals depositions. Plant and Soil 72: 39-48. 124 Kloke, A. (1980). Richwere´80, Orientierungsdaten fur tolerierbare Gesamtgehalte einiger Elemente in Kultorboden, Mitt VDLUFA, H. 2, 9-11. Kramer, U. (2000). Cadmium for all meals-plants with an unusual appetite. New Phytologist. 145, 1-5. Kormanik, P.P., Bryan, W.C., y Schults, R.C. (1978). Endomycorrhizal inoculation during transplanting improves growth of vegetatively propagated yellow poplar. Plant propagator 23, 4-5. Kothari, S. K., Marschner H., y Romheld V. (1990). Direct and indirect effects of VA mycorrhizal fungi and rhizosphere microorganisms on acquisition of mineral nutrients by maize (Zea mays L.) in a calcareous soil. Nerw Phytol. 116, 6637-645. Kucey, R. M.N., y Janzen, H. H. (1987). Effects of VAM and reduced nutrient availability on growth and phosphorus and micronutrient uptake of wheat and field beans under greenhouse conditions Plant and Soil. 104, 71-78. Kugonic, N. Grumman, H. ( 1999). The accumulation of cadmium, lead and zinc by different vegetables from Zasavje Slovenia. Phyton: Annales Botanicae. 39(3): 161165. Kuleff, I., Djingova, R. (1991). The dendelion (Taraxacum officinale) A monitor for environmental pollution? Water Air Soil Pollution 21, 77-85. Kumar, P.B.A.N., Dushenkov, V. Motto, H., y Raskin, I. (1995). Phytoextraction: The use of plants to remove heavy metals from soils. Environmental Science& Technology 29 (5): 1232 (7). Lambert, D.H., Baker, D. R.E., y Cole, H. (1979). The role of mycorrhizae in the interactions of phosphorus with zinc, copper and other elements. Soil. Sci. Soc. Am. J. 43, 976-980. Larue, J. H., McClellan, W. D. y Peacock, W. L. (1985). Mycorrhizal fungi and peach nursery nutrition. California Agriculture 29, 5-7. 125 Lasat, M.M., Baker, A.J. M., y Kochian, L.V. (1998). Physiological characterization of root Zn2 absorption and translocation to shoots in Zn hyperaccumulator and nonaccumulator species of Thlaspi. Plant Physiol. 112, 1715-1722. Lasat, M.M. (2002). Phytoextraction of toxic metals: A review of biological mechanisms. Journal of Environmental Quality. 31(1): 109-120. Leyval, C., Berthelin, J., Schontz, D., Weissenhorn, I., y Morel, J.L. (1991). Influence of endomycorrhizas on maize uptake of Pb, Cu, and Cd applied as mineral salts and sewage sludge. In: Farmer , J.G. (ed): Heavy Metals in the Environment, CEP Consultants LTD., pp 204-207. Leyval, C., Weissenhorn, I., Glashoff A., y Berthelin, J., (1994) Influence des metaux lourds sur la germination des spores de champignons endomycorrhizien a arbuscules dans les sols. Acta Botanica Gallica (in press) Leyval, C., Singh, B.R., y Janer, E.J., (1995). Occurrence and infectivity of arbuscular mycorrhizal fungi in some Norwegian soils influenced by heavy metals and soil properties. Water, Air Soil Pollut. 83, 203-216. Leyval, C., y Weissenborn, I. (1996). Tolerance to metals of arbuscular mycorrhizal fungi from heavy metals polluted soil. A summary of results. In mycorrhizae in integrand Systems. From Genes to Plant Development. Eds. C. Azcón- Aguilar and J..M. Barea Granada Spain. Leyval, C., Turnau, K., y Haselwandter, K. (1997). Effect of heavy metal pollution on mycorrhizal colonization and function: physiological, ecological and applied aspects. Mycorrhiza 7, 39-153. Leyval C., Joner E.J., del Val C., y Haselwandter K. (2000). Potential of arbuscular mycorrhizal fungi for bioremediation. Mycorrhizal Technology in Agricultura. Ed By S. Gianinazzi, H. Schuepp, J. M. Barea and K. Haselwandter. Leyval, C., Joner, E., Del Val, C., y Haselwandter. K. (2001). Potencial of arbuscular mycorrhiza for bioremediation. Mycorrhiza. 7 (2): 308-317. Li, X. L., y Christie, P. (2000). Changes in soil solution Zn and pH and uptake of Zn by arbuscular mycorrhizal red clover in Zn-contaminated soil. Chemosphere, 42, 201-207. 126 Li, X., Chen, B., Feng, G., y Christie, P.,(2002) Role of arbuscular mycorrhizal fungi in alleviation of Zn phytotocity and mineral nutrition of host plants. Symposium 42 (1649) 17th WCSS. Li, Yin-M., Chaney, R., Brewer, E. P., Angle, J.S., y Nelkin, J. (2003). Phytoextraction of nikel and cobalt by hyperaccumulator Alyssum species grown on nickel-contaminantes soils. Environ. Sci. Technol 73, 1463-1468. Liao, J. P., Lin, X. G., Cao, Z.H., Shi, Y. Q., Wong, M. H. (2003). Interactions between arbuscular mycorrhizae and heavy metals under sand culture experiment. Chemosphere 50 (6), 847-853. Licsko, I., Lois, l.,y Szebenyi, G. (1999). Tailings as a source of environmental pollution. Water Sic. Techno. 39 (10-11),: 333-336. Lloyd, J. R., y Lovley, D.R. (2001). Microbial detoxification of metals and radio nuclides, Current Opinion in Biotechnology 12, 248- 253. Loth, C. (1996). Abundance of arbuscular mycorrhizal fungi spores at different natives sites in dependence of sludge applications. Bodenkultur 47, 89-96. Lovley D.R.(1993). Dissimilatory metal reduction. Annu. Rev. Microbiol. 47, 263-290. Lovley, D.R.(1995). Bioremediation of organic and metal contaminants with dissimilatory metal reduction. J. Indust. Microbiol. 14, 85-93. Lovley, D. R., y J. D. Coates. (1997). Bioremediation of metal contamination. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 285-289. Lovley, D.R. (2000). Environmental Microbe-Metal interactions. American Society for Microbiology, Washington, D.C. Macek, T., Mackova M. Kas J. (2000). Exploitation of plants for the removal of organics in environmental remediation. Biotechnology Advances. 18(1), 23-34. MacDonald, J., Rittman, A., y Bruce E. (1993). Performance standards for in situ bioremediation. Environmental Science & Technology, 27: 1974-1979. 127 Malcova, R., Vosátka, M., y Gryndler, M. (2003). Effect of inoculation with Glomus intraradices on lead uptake by Zea mays L. and Agrostis capillaris L. Appl. Soli Ecol., 23, 55-67. Martin, H. W.,Young, T.R., Kaplan, D.I., Simon, L., y Adriano. D.C. (1996). Evaluation of three herbaceous index plant species for bioavailability of soil cadmium, chromium, nickel and vanadium. Plant Soil 182, 199-207. Martin, C.W. (2000). Heavy metals trends in floodplain sediments and valley fill. Catena 39, 53-68. McEldowney, S., Hardman, D.J. y Waite, S. (1993). Pollution, Ecology and Biotreatment, 48-58. McGrath, S.P., Shen, Z.G., y Zhao F.J. (1997). Heavy metal uptake and chemical changes in the rhizosphere of Thlaspi caerulescens and Thlaspi ochroleucum grown in contaminated soils. Plant Soil 188, 153-159. McGrath, S.P., Lombi, E., Zhao, F.J., y Dunham, S. J. (2001). Phytoremediation of heavy metal-Contaminated Soils: Natural Hyperaccumulation versus Chemically Enhanced Phytoextraction. Journal of Environmental Quality 30 (6): 1919-1926. McNeill, K.R. y Waring, S. (1992). Vitrification of Contaminated soils. In: J.F. Rees (ed): Contaminated Land Treatment Technologies. Society of Chemical Industry, Elsevier Applied Science, London. Meagher, R. B. (2000). Phytoremediation of toxic elemental and organic pollutants. Currente Oponion in Plant Biology 3:,153-162. Meeussen, J.C.L., Keizer, M.G., van Riemsdijk, W. H., y deHaan, F.A.M. (1994). Dissolution behavior of iron cyanide (Prussian blue) in contaminated siol. Jour. Environ Quail. 23, 785-792. Minguzzi, C., Vergnano O. (1948). II contento di nichel Nelly cenri di Alyssum bertlonii Desv. Tai della Societa Toscana di Science Naturali, Men Ser A 55, 49-77. Morton, J.B., y Benny, G.L. (1990). Revised classification of arbuscular mycorrhizal fungi (Zygomycetes): A new order, Glomales; tow new suborder, Glomineae and 128 Gigasporinae, and two new families, Acaulosporaceae and Gigasporaceae,with and emendation of Glomaceae: Mycotaxon 37, 471-491. Morton, J.B., S. P. Bentivenga, F.J., y Wheeler, W.W. (1993). Germ plasm in the International Collection of Arbuscular and Vesicular-arbuscular Mycorrhizal fungi (INVAM) and procedures for culture development, documentation and storage. Myccotaxon 48, 491-528. Morton, J.B. y Benny, G.L. (1990). Revised classification of arbuscular mycorrhizal fungi (Zygomycetes): A new order, Glomales; tow new suborder, Glomineae and Gigasporinae, and two new families, Acaulosporaceae and Gigasporaceae,with and emendation of Glomaceae: Mycotaxon 37, 471-491. Mosses, B. (1981). Vesicular Arbuscular Mycorrhizae Research for Tropical Agriculture University of Hawaii Press, Honolulu. Nies, D, H., (1999). Microbial heavy-metal resistance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 730-750. Noyd, R. K., Pfleger, F. L., y Norland, M. R. (1996). Field responses to added organic matter, arbuscular mycorrhizal fungi, and fertilizer in reclamation of torbonite iron ore tailing. Plant Soil 179, 89-97. Oehl, F. y Sieverding, E. (2004). Pacispora, a new vesicular arbuscular mycorrhizal fungal genus in the glomeromycetes. Journal of Applied Botany and Food QualityAngewandte Botanik, 78(1); 72-82. Oberle, S. L., y Burkart. M. R. (1994). Water resource implications of Midwest agroecosystems. J. Environ. Qual. 2, 4-8. Pawlowska, T.E., Blaszkowsi, J., y Ruhling, A. (1996). The mycorrhizal status of plants colonizing a calamine spoil mound in southern Poland. Mycorrhizae 6, 499-505. Pawlowska, T. E., Chaney, R.L., Chin, M. y Charvat, I. (2000). Effects of metal phytoextraction practices on the indigenous community of arbuscular mycorrhizal fungi at a metal contaminated landfill. Appl. Environ. Microbiol. 6, 2526-2530. 129 Peters, R. S. y Shem, I. (1994). Use of chelating agents for remediation of heavy metal contaminates soil. In Environmental Remediation Removing Organic and Metal Ion Pollutants. 12 (3): 89-97. Pilon-Smits, E., y Pilon, M. (2003). Phytoremediation of metals using transgenic plants. Critical Reviews in Plant Sciences, 21 (5), 439-456. Phillips, J.M., y Hayman, D.S. (1970). Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Trans. Br. Mycol. Soc. 55, 156-161. Prasad, M.N.V., y Freitas, H. (2003). Metal hyperaccumulation in plants-biodiversity prospecting for phytoremediation Technology Electronic Journal of Biotechnology 54 (11), 25-42. Quilambo, O. A.(2003). The vesicular-arbuscular mycorrhizal simbiosis. African Journal of Biotechnology 2 (12): 539-546. Raman, N., y Sambandan, S. (1998). Distribution of VAM fungi in tannery effluent polluted soils of Tamil Nadu, India. Bull. Environ. Contamin. Toxicol. 60, 142-150. Raman, N., Nagarajan, N., Gopinathan, S., y Sambandan, S. (1993). Mycorrhizal status of plants species colonizing a magnesite mine spoil in India. Biol. Fertil. Soil. 16, 76-78. Ramos, L., Fernández, M.A., González, M.J., y Hernández, L.M. (1990). Heavy metal pollution in water, sediments, and earthworms from the Ebro River, Spain. Bolletin of Environmental Contamination &Toxicology. 63 (3): 305-311. Rao, P.S.C., Davis, G,B, y Johnston, C.D. (1996). Technologies for enhanced remediation of contaminated soil and aquifers: an Overview, analysis and Case Studies: 189-210. Rascio, W. (1977). Metal accumulation by some plants growing on Zn mine deposits. Oikos 29, 250-253. Raskin, I. (1995). Phytoextraction- The use of plants to remove heavy metals from soil. Environmental Science Technology. 29, 1232- 1238. Raskin, I., Kumar, P.B.A.N., Dushenkov, S., y Salt, D.E. (1994). Bioconcentration of heavy metals by plants. Current Opinion in Biotechnology 5, 285-290. 130 Raskin, I., Smith, R.D., y Salt, D. E., (1997). Phytoremediation of metals: using plants to remove pollutants from the environment. Current Opinion in Biotechnology 8, 221-22. Rayment, G.E., y Higginson, F.R. (1992). Australian Laboratory Handbook of Soil and Water Chemical Method. Inkata Press, Sydney. Reed, D.T., Tasker, I. R., Cunnane, J.C., y Vandegrift, G. F (1992). Environmental restoration and separation science. In: Environmental Remediation 45-62. Reeves, R. (2003). Tropical hyperaccumulators of metals and their potential for phytoextraction. Plant and Soil 249, 57-65. Rillig, M. C., y Steinberg, P. D. (2002). Glomalin production by an arbuscular mycorrhizal fungus: a mechanism of habitat modification. Soil Biol. Biochen, 34, 1371-1374. Roane, T.M., Perpper, M. (1996). Microbial remediation of metals. In Craford, L., Ronolad & Cfawford, L., Don (Ed) Bioremediation Principles and Applications 312-340. Rother, J.A., Milbank, J.W., y Thorntonb, I. (1993). Nitrogen fixation by white clover (Trifolium repens) in glass land on soil contaminated with cadmium to lead and zinc. J. Soil. Sci. 34, 127- 136. Saad, R. N. (1990). Studies on legumes-mycorrhiza-rhizobia symbiotic system in newly reclaimed soil. Ph. D. thesis, Fac. Agric. Ain shams Univ. Salt, D.E., Blaylock, M., Kumar, PBAN., Viatcheslav, D., y Ensley, B. D. (1995). Phytoremediation: a novel strategy for the removal of toxic metals from the environment using plants. Bio-Technology 13, 468-74. Salt, D.E., Blaylock, M., Kumar, PBAN., Dushenkov, S. Ensley, B. D., Chet, I. Raskin, I. (1997). Phytoremediation: A novel strategy for the removal of toxic metals from environments using plants. Bio/ Tech, 13, 468-474. Salt, D.E., Smith, R.D., y Raskin, I. (1998). Phytoremediation. Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49,643-668. SAS. Institute (1990) SAS. User´s Guide: Statistics, 4th edn. SAS Inst., Cary, NC. Schenck, N. C., y Pérez, Y. (1990). Manual for the identification of mycorrhizal fungi (3th ed.). Gainsville (USA): Synergistic Publications. 286 p. 131 Schmitt, H. W., y Sticher, H. (1991). Heavy metals compounds in the soil. In: Marina, E. (ed): Metals and their Compounds in the Environment, VCH Verlagsgessellschaft Weinheim, Germany, pp. 312-331. Schlichting, E., H.P., Blume y Stahr, K. (1995). Bodenkundliches praktikun. Blackwell Wisseschafts-Verlang, Berlin, 295. Schuepp, H., Dehn, B., y Sticher, H., (1987). Interaktionen zwischen VA-Mycorrhizen und shuwermetallbelastungen. Agnew. Botanik, 61, 85-96. Scnnerini, S., y Bonfante-Fasolo, P. (1982). Comparative ultraestructural analysis of mycorrhizal association. Can. J. Bot. 61, 917-943. SEMARNAT (Secretaría de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca) (2000). Proyecto de Norma Oficial Mexica PROY-NOM-021-RECNAT-2000 que establece las especificaciones de fertilidad, salinidad y clasificación de suelos; Estudios, muestreo y análisis. Sharpley, A. S., y M. Meyer. (1994). Minimizing agricultural nonpointsource impacts. A symposium overview. J. Environ. Qual. 23, 1-3. Shahandeh, H., Hossner., L.R. (2000). Plant screening for chromium phytoremediation. International J. Phytoremediation. 2, 269-286. Shetty, K. G., Banks, M.K., y Hetrick, A. P. (1995). Effects of mycorrhizae and fertilizer amendments on zinc tolerance of plants. Environ. Pollut. 88, 307-341. Sieverding, E. (1991). Vesicular-Arbuscular Mycorrhiza Management in Tropical Agrosystems. Technical Cooperation, Eschborn, Germany, 57-70. Siqueira, J.O., y Moreira, E.M.S. (1997). Microbial populations and activities in highlyweathered acidic soils: Schaeffert, N.K. Gageria, C.A. Rosolem, and H. Cantarella (Eds).Proceedings of the 4th International Symposium on Plant-Soil Interactions at low pH pp 193-156, Brazil, Brazilian Soil Science Society. Simon, L., (1998). Cadmium accumulation and distribution in sunflower plant. J. plant Nutrition 21(2), 341- 352. 132 Simonton, S., Dimsha, M., Thomson, B., Barton, L., y Cathey, G. (2000). Long-Terms stability of metals inmobilized by microbial reduction. Environ. Engr. 121,(11): 798804. Smith, S.E., y Read, D. J. (1997). Mycorrhizal symbiosis ( 2 th ed.). San Diego (USA): Academic Press, London. 605 p. Spain, A. (2003). Implications of microbial heavy metals tolerance in the environment. Reviews in undergraduate research, 2,1-6. Sopper, W. E. (1988). Revegetation of a Contaminated Zinc Smelters Site. Landscape and Urban Planning 17, 241-250. Steinborn, M., y Breen, J. (1999). Heavy metals in soil and vegetation at Shallee mine, Silver mines, Co. Tipperary, Ireland. Biology & Environment Proceedings of the Royal Irish Academyc. Stuzt, J. C., y Morton, J.B. (1996). Successive pot cultures reveal high species richness of arbuscular endomycorrhizal fungi in arid ecosystems. Canadian Journal of Botany, 74, 1883-1889. Tao, H. Q. (1997). Effect of mycorrhiza on resistance of red clover to heavy metal Zn and Cd pollution. Chemosphere 42, 201-207..Temminghof, E.J.M., Plette, A.C.C., Seatmud, Zee, & Riemsdjk (1997). Speciation of heavy metals in soil in relation to availability and mobility, Recent Research Development In: Soil Science 1: 55-65. Thompson, C. (1995). Plants providing their worth in toxic metal cleanup. Science, 269, 302-303. Thompson, J. P. (1990). Soil sterilization methods to show VA mycorrhizae aid P and Zn nutrition of wheat in vertisols. Soil Biol. Biochem 22, 229-248. Tonin, C., Vandenkoornhuyse, P., Joner, E. J., Straczek, J., y Leyval, C. (2001). Assessment of arbuscular mycorrhizal fungi diversity in the rhizosphere of Viola calamamria and effect of the these fungi on heavy metals uptake by clover. Mycorrhiza, 10, 161-168. 133 Turnau, K., (1993). Mycorrhiza in toxic metal polluted sites. Wiadomosci Botaniczne 37, 43-59. Turnau, K. (1998). Heavy metals content and localization in mycorrhizal Euphorbia cyparissias fron zinc wastes in Southern Poland. Acta Soci. Bot. Poloniae 67, 105-113. Turnau, K, y Haselwandeter, K. (2002). Arbuscular mycorrhizal fungi: an essential component of soil microflora in ecosystem restoration. In: S. Gianinazi, H. Shuepp, J.M. Barea, K. Haselwander, (eds), Mycorrhizal Technology in Agricultura- from genes to bioproducts. Berlin: Birkhauser Verlag. 137-149. Turnnell, D.M., Dennis, R., y Roth, M. (1996) Soil-Washing Evaluation Program for Palmerton Zinc Site. Journal of Environmental Science Health A31, (6): 1459-1468. Vigue, G. T., Pepper, I. L.y Bendick, D. F. (1991). The effect of cadmium on nodulation and nitrogen fixation by dry beans. J. Environ Qual 10, 87-98. Walker, C., (1992). Systematic and taxonomy of the arbuscular endomycorrhizal fungi Glomales a possible way forward. Agronomy, 12: 887-897. Walker, C. (1997). Spore extraction by centrifugation-sugar flotation. Biological Research and Imaging Laboratory. Hampshire, UK. Wang, Y. P., y Chao, C.C. (1992). Effects of vesicular- arbuscular mycorrhizae and heavy metals on the growth of soybean and phosphate and heavy metal uptake by soybean in major soil groups of Taiwan. J. Agric. Assoc. China. New. Ser. 157, 6-20. Wang, Y. P., Wang, .M.K., y Liu, C. L. (1992). The relationships between heavy metals in soils, waters, and sediments: Case study in Chang-Hwa Industrial park. Project report of EPA-ROC. Watanabe, M.E. (1997). Phytoremediation on the brink of commercialisation. Environ, Sci. Technol. 31, 182-186. Weissenhorn, I., Leyval, C., y Berthelin, J. (1993). Cd-tolerant arbuscular mycorrhizal (AM) fungi from heavy metals polluted soils. Plant and Soil 157,274-256. 134 Weissenhorn, I., y Leyval, C. (1994). Roots colonization of maize by a Cd-sensitive and a Cd-tolerant Glomus mosseae and cadmium uptake in sand culture. Plant Soil 175, 233238. Weissenhorn, I., Leyval, C., y Berthelin, J. (1995). Bioavailability of heavy metals and abundance of arbuscular mycorrhiza in soil pollutes by atmospheric deposition from a smelter. Biol. Fertil. Soils. 19, 22-28. Weissenhorn, I., Leyval, C., Belgy, G., y Berthelin J. (1995). Arbuscular mycorrhizal contribution to heavy metal uptake by maize (Zea mays L.) in pot culture with contaminates soil. Mycorrhiza 5, 245-251. Weissenhorn, I., y Leyval, C. (1996). Spore germination of arbuscular mycorrhizal fungi in soils differing in heavy metals content and other parameters. Eur. J. Soil Biol. 32, 165172. Wright, S. F., Upadhyaya, A. (1996). Extraction of an abundant and unusual protein from soil and comparison with hyphal protein of arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Science 161, 575-586. Zier, N. Schiene, R. Koch H., y Fischer, K. (1999). Agricultural reclamation of disturbed soils in a lignite mining area using municipal and coal wastes: the humus situation at the beginning of reclamation. Plant and Soil. 213, (1-2): 241-250. Zhu, Y. G., Christie, P., y Laidlaw, A. S.(2001). Uptake od Zn by arbuscular mycorrhizal white clover from Zn-contaminated soil. Chemosphere 42, 193-199. Zhang, Q, Davis, L.C., y Erick, L.E. (2000). Heavy metal. In: Hazardous Substance Res. 2 (4):1 135