Download diagnostico y caracterización molecular de virus asociados al cultivo

DIAGNÓSTICO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS ASOCIADOS
AL CULTIVO DE LA PAPA EN COLOMBIA, CON ENFASIS EN EL VIRUS MOPTOP (PMTV, POMOVIRUS).
JOSÉ FERNANDO GIL RAMÍREZ
Tesis de Grado presentada para optar al Título de
Magíster en Ciencias - Biotecnología
DIRECTOR
MAURICIO ALEJANDRO MARÍN MONTOYA I.A., M.Sc., PhD.
ASESOR ESTADÍSTICO
JOSÉ MIGUEL COTES TORRES I.A., M.Sc., PhD
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MEDELLÍN
FACULTAD DE CIENCIAS
2010
1
CONTENIDO
RESUMEN
16
2. OBJETIVOS
23
2.1. Objetivo general
23
2.2. Objetivos específicos
23
3. MARCO TEÓRICO
24
3.1. Virus asociados al cultivo de la papa
24
3.2 Virus asociados al cultivo de la papa en Colombia
27
3.3. Generalidades de algunos virus asociados al cultivo de la papa
30
3.3.1. Familia Virgaviridae
30
Género Pomovirus
32
Potato mop-top virus (PMTV)
33
3.3.2. Familia Potyviridae
36
Género Potyvirus
37
Potato virus Y (PVY)
39
3.3.3. Familia Alphaflexiviridae
42
Género Potexvirus
43
Potato virus X (PVX)
44
3.3.4. Familia Betaflexiviridae
46
Género Carlavirus
47
Potato virus S (PVS)
48
3.3.5. Familia Luteoviridae
50
2
Género Polerovirus
50
Potato leafroll virus (PLRV)
52
3.3.6. Familia Closteroviridae
55
Género Crinivirus
56
Potato yellow vein virus (PYVV)
57
3.4. Métodos de diagnóstico en virología vegetal
60
3.4.1 Métodos Biológicos
61
Inoculación mecánica
63
Inoculación por vectores
63
Injertos
64
3.4.2. Métodos serológicos
64
ELISA (Enzyme-linked immuno-sorbent assay)
65
Otros métodos de inmunodiagnóstico
67
Microscopía electrónica
68
3.4.3. Métodos basados en el uso de ácidos nucleicos
69
Hibridización molecular
69
Técnicas basadas en PCR
71
PCR en tiempo real
72
4.1. Localización
74
4.2. Evaluación de niveles de incidencia viral en cultivos de papa
75
4.3. Detección del PMTV en cultivos afectados por S. subterranea
77
4.4. Definición de afinidades filogenéticas de virus asociados a cultivos de papa mediante
RT-PCR y secuenciación
78
4.5 Secuencias parciales de los genomas virales
82
4.6. Diagnóstico de los virus PVY y PMTV mediante RT-PCR en tiempo real
84
3
5. RESULTADOS
5.1. Evaluación de niveles de incidencia viral en cultivos de papa
Evaluación de incidencia de síntomas en cultivos de papa
89
89
89
5.2 Detección serológica de virus en muestras de papa sintomáticas
93
5.3 Niveles de incidencia de virus en cultivos de papa de 12 zonas productoras de
Colombia
94
5.4 Detección serológica de PMTV en cultivos de papa de Colombia
99
5.5. Definición de afinidades filogenéticas de virus asociados a cultivos de papa mediante
RT-PCR y secuenciación
102
5.5.1. Afinidades filogenéticas de aislamientos de PVY
106
5.5.2. Afinidades filogenéticas de aislamientos de PYVV
111
5.5.3. Afinidades filogenéticas de aislamientos PVS
115
5.5.4. Afinidades filogenéticas de aislamientos PLRV
120
5.5.5. Afinidades filogenéticas de aislamientos PVX
124
5.5.6. Afinidades filogenéticas de aislamientos PMTV
128
5.6. Secuencias parciales de los genomas virales
136
5.6.1. Secuencias parciales del genoma de PMTV
136
5.6.2. Secuencias parciales del genoma de PVY
148
5.6.3. Secuencias parciales del genoma de PVX
159
5.6.4. Secuencias parciales del genoma de PVS
166
5.6.5. Secuencias parciales del genoma de PLRV
169
5.6.6. Secuencias parciales del genoma de PYVV
171
5.7. Diagnóstico de los virus PVY y PMTV mediante RT-PCR en tiempo real
176
5.7.1. Pruebas de detección de PVY
176
5.7.2. Pruebas de detección de PMTV
179
4
6. DISCUSIÓN
185
CONCLUSIONES
200
AGRADECIMIENTOS
203
BIBLIOGRAFÍA
204
ANEXOS
227
5
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Procedencia de las muestras de papa utilizadas para la detección de virus.
74
Tabla 2. Cebadores específicos utilizados en la detección por RT-PCR de cada uno de los
virus bajo estudio.
80
Tabla 3. Cebadores específicos utilizados en la detección por RT-PCR de cada uno de los
virus bajo estudio.
83
Tabla 4. Cebadores específicos y sondas a utilizar en la detección por qRT-PCR de los
virus PVY y PMTV.
86
Tabla 5. Muestras empleadas para la detección del virus PVY.
86
Tabla 6. Muestras empleadas para la detección del virus PMTV.
87
Tabla 7. Detección mediante pruebas de ELISA de PMTV en raíces y tubérculos de plantas
de papa afectadas por S. subterranea.
100
Tabla 8. Detección mediante pruebas de ELISA de PMTV en raíces de plantas de Nicotiana
benthamiana cultivadas en sustratos infestados con S. subterranea.
101
Tabla 9. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVY.
103
Tabla 10. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PLRV.
104
Tabla 11. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVX.
105
Tabla 12. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVS.
105
Tabla 13. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PYVV.
106
Tabla 14. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP y TGB2 del virus
PMTV.
106
Tabla 15 Matriz de identidad para cepas del virus PVY de cultivos de papa de Colombia y
otros países del mundo.
108
6
Tabla 16 Matriz de identidad para cepas del virus PYVV de cultivos de papa de Colombia y
Perú.
112
Tabla 17. Matriz de identidad para cepas del virus PVS en cultivos de papa de Colombia y
el Mundo.
118
Tabla 18. Matriz de identidad para cepas del virus PLRV de Colombia y el Mundo
122
Tabla 19. Mariz de identidad para cepas del virus PVX de Colombia y el Mundo
126
Tabla 20. Matriz de identidad para cepas del virus PMTV (TGB) de Colombia y el Mundo.
130
Tabla 21. Matriz de identidad para cepas del virus PMTV (CP) de Colombia y el Mundo.
133
Tabla 22. Aislamientos de los virus en estudio y secuencias parciales de sus genomas. 136
Tabla 23. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del primer fragmento de la
región CP secuenciada para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo.
140
Tabla 24. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del segundo fragmento de la
región CP secuenciado para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo.
140
Tabla 25. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del fragmento secuenciado
de la región TGB para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo.
142
Tabla 26. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del primer fragmento de la
región CP secuenciado para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo. 144
Tabla 27. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del fragmento de la región
CPRT secuenciada para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo.
144
Tabla 28. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región TGB
secuenciada para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo.
145
Tabla 29. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región P1 secuenciada
para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
150
7
Tabla 30. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
151
Tabla 31. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo
151
Tabla 32. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
155
Tabla 33. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
156
Tabla 34. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región P1 secuenciada
para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
156
Tabla 35. Matriz de identidad de nucleótidos y aminoácidos de la región RdRp secuenciada
para la cepa Ceja de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo.
160
Tabla 36. Matriz de identidad de nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Ceja de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo.
161
Tabla 37. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 5‟NTR-RdRp
secuenciada para la cepa Carmen de PVX y su comparación con otros aislamientos del
mundo.
163
Tabla 38. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 3‟ RdRp
secuenciada para la cepa Carmen de PVX y su comparación con otros aislamientos del
mundo.
164
Tabla 39. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 3‟TGB3-CP3‟NTR secuenciada para la cepa ¨Carmen¨ de PVX y su comparación con otros
aislamientos del mundo.
164
Tabla 40. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para las cepas Carmen y Santuario de PVS y su comparación con otros aislamientos del
mundo.
167
8
Tabla 41. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP-3‟NTR
secuenciada para las cepas Carmen y Santurio de PVS y su comparación con otros
aislamientos del mundo.
167
Tabla 42. Matriz de identidad para nucleótidos y aminácidos de la región parcial de CP
secuenciada para las cepas Siguineque y Suras de PLRV y su comparación con otros
aislamientos del mundo.
169
Tabla 43. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región parcial del
extremo 5‟de CPm secuenciada en las cepas Obonuco y Saguarán con dos cepas de PYVV
del Perú.
172
Tabla 44. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región parcial del
extremo 3‟de CPm secuenciada en las cepas Obonuco y Saguarán con dos aislamientos de
PYVV del Perú.
172
Tabla 45. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para las cepas Obonuco y Saguarán y dos aislamientos de PYVV del Perú.
173
Tabla 46. Detección del virus PMTV en muestras de tejido de raíz de plantas de N.
benthamiana sembradas en turba inoculada con S. subterranea, empleando tres
metodologías (ELISA, RT-PCR, qRT-PCR).
180
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Diagrama representativo de los seis géneros que conforman la familia
Virgaviridae.
31
Figura 2. Representación del genoma de PMTV.
36
Figura 3. Organización del genoma de un potyvirus.
39
Figura 4. Representación del genoma de un Potexvirus.
44
Figura 5. Representación del genoma de los Carlavirus.
48
Figura 6. Representación del genoma de los Polerovirus.
52
Figura 7. Representación del genoma de un Crinivirus.
57
Figura 8. Representación esquemática de la organización del genoma del PYVV.
60
Figura 9. Promedio de cuatro síntomas visuales posiblemente asociados a enfermedades
virales en cultivos de papa ubicados en cuatro departamentos de Colombia.
89
Figura 10. Síntomas observados en campo sobre tejido foliar de plantas de papa en cuatro
departamentos de Colombia.
90
Figura 11. Promedio de observaciones de plantas con síntomas visuales presumiblemente
asociados a enfermedades virales en cultivos de papa para los departamentos de Antioquia,
Boyacá, Cundinamarca y Nariño.
91
Figura 12. Promedio de observaciones de plantas con síntomas visuales presumiblemente
asociados a enfermedades virales en cultivos de papa ubicados en 12 zonas de muestreo
dentro de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño.
93
Figura 13. Niveles de detección serológica de los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX con
respecto a los cuatro síntomas evaluados visualmente en la investigación (AV, EN, EF y
MR) en cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia.
94
10
Figura 14. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus
Potyvirus, PLRV, PVS y PVX en cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia.
96
Figura 15. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus
Potyvirus, PLRV, PVS y PVX en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia,
Boyacá, Cundinamarca y Nariño.
97
Figura 16. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus
Potyvirus, PLRV, PVS y PVX en cultivos de papa de 12 zonas productoras de los
departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño.
98
Figura 17. Plantas señuelo y fotos de microscopía de sus raíces infectadas con S.
subterranea.
102
Figura 18. Amplicones obtenidos con los cebadores PVY F y PVYR (480 pb) a partir de
tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia.
107
Figura 19. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para
aislamientos de PVY obtenidos de cultivos de papa de Colombia y otros países del mundo.
110
Figura 20. Amplicones obtenidos con los cebadores PYVVCPF y PYVVCPR (758 pb) a
partir de tejido foliar de plantas de papa de tres departamentos de Colombia.
111
Figura 21. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para
aislamientos de PYVV obtenidos de cultivos de papa de Colombia y Perú.
114
Figura 22. Amplicones obtenidos con los cebadores PVSCPF y PVSR (629 pb) a partir de
tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia.
116
Figura 23. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para
aislamientos de PVS obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo.
119
Figura 24. Amplicones obtenidos con los cebadores PLRVF y PLRVR (330 pb) a partir de
tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia.
120
11
Figura 25. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para
aislamientos de PLRV obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo.
123
Figura 26. Amplicones obtenidos con los cebadores PVXF y PVXR (562 pb) a partir de
tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia.
125
Figura 27. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para
aislamientos de PVX obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo.
127
Figura 28. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb) a partir
de tejido de raíz de N. benthamiana de dos departamentos de Colombia.
129
Figura 29. Árbol filogenético basado en secuencias parciales del TGB2 viral para
aislamientos de PMTV obtenidos cultivos de papa de Colombia y el Mundo.
131
Figura 30. Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (460 pb) a partir de
tejido de raíz de N. benthamiana de tres departamentos de Colombia.
132
Figura 31. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para
aislamientos de PMTV obtenidos cultivos de papa de Colombia y el Mundo.
135
Figura 32. Amplicón obtenido con los cebadores H360 y PMTV2017R (2000 pb) a partir
de tejido de raíz de N. benthamiana de dos departamentos de Colombia.
138
Figura 33. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 – 123end (1067 pb) y
PMTV759 – PMTV1552R (817 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrado
en suelo infestado con S. subterranea.
138
Figura 34. Amplicónes obtenidos con los cebadores Furo-Hel – 123end (2722 pb) y
PMTV1948F – 123end (448 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrado en
sustrato infestado con S. subterranea.
139
|Figura 35. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTV5 USA RNA3 y PMTV7 USA
RNA3 (647 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrada en suelo infestado
con S. subterranea.
139
12
Figura 36. Contextualización de las secuencias obtenidas para laa región CP de la cepa R25
de PMTV respecto a la secuencia de referencia NC 003724.
141
Figura 37. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región TGB de la cepa
R25de PMTV con respecto a la secuencia de referencia NC 003725.
143
Figura 38. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de la cepa
RValle de PMTV con respecto a la secuencia de referencia NC 003724.
146
Figura 39. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región TGB de la cepa
RValle de PMTV con respecto a la secuencia de referencia NC 003725.
147
Figura 40. Amplicones obtenidos a partir de tejido foliar de papa de dos cepas de PVY del
departamento de Antioquia, con los cebadores PVYc – PVYd (967 pb), PVYCPF –
PVYCPR (827 pb); PVYF – 3ntr (1061 pb); PVYF – 3ntrC (1061 pb)
148
Figura 41. Amplicones obtenidos con los cebadores PVYCPF – 3ntr (1219 pb), PVYCPF –
3ntrC (1219 pb), a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de
Antioquia.
149
Figura 42. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región P1 de PVY de la
cepa Ceja respecto a la secuencia de referencia AJ584851.1.
152
Figura 43. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la
cepa Ceja respecto a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867.
153
Figura 44. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la
cepa Ceja respecto a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867.
154
Figura 45. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la
cepa Carmen respecto a la secuencia de referencia AJ585342.
157
Figura 46. Contextualización de las secuencias obtenidas para las regiones CP y P1 de PVY
de la cepa Carmen respecto a las secuencias de referencia AY884983 y 166867.
158
13
Figura 47. Amplicones obtenidos con los cebadores PVX5476F-PVXR (749 pb), PVX1FPVX1651R (1651 pb), PVX3130-PVX4495 (1365 pb), PVX5476F-PVX6415R (939 pb), a
partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia.
159
Figura 48. Contextualización de las secuencias obtenidas para una región parcial de RdRp y
CP de la cepa Ceja de PVX, respecto a la secuencia de referencia EU021215.
162
Figura 49. Contextualización de las secuencias obtenidas para las regiones 5‟NTR-5‟ RdRp
parcial, 3‟RdRp parcial y TGB3 parcial-CP-3‟NTR de la cepa Carmen de PVX, respecto a
la secuencia de referencia EU021215.
165
Figura 50. Amplicones obtenidos con los cebadores PVSCPF-PVSCPR (1288 pb) carriles
12 a 20, a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia.
166
Figura 51. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP-3‟NTR de
cepas Carmen y Santuario de PVS, respecto a las secuencias de referencia AJ863510 y
AJ863509.
168
Figura 52. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región parcial CP de las
cepas de PLRV Siguineque y Suras, respecto a la secuencia de referencia AF453388.
170
Figura 53. Amplicones obtenidos con los cebadores CPm1-CPm2 (2025 pb), a partir de
tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Nariño.
171
Figura 54. Contextualización de las secuencias obtenidas para CPm parcial de las cepas de
PYVV Obonuco y Sagruarán, respecto a las secuencias de referencia NC_006063.1 y
AJ557129.1.
174
Figura 55. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de cepas de
PYVV Obonuco y Sagruarán, respecto a las secuencias de referencia NC_006063.1 y
AJ557129.1.
175
Figura 56. Amplicones obtenidos con los cebadores PVYF y PVYUnivR (227 pb) a partir
de tejido foliar de plantas de papa de dos departamentos de Colombia.
177
14
Figura 57. Gráfica de amplificación de qRT-PCR con los cebadores PVYUnivF,
PVYUnivR y la sonda PVYUniv a partir de tejido foliar de plantas de papa de dos
departamentos de Colombia.
178
Figura 58. Porcentajes de detección del virus PVY empleando ELISA, RT-PCR y qRTPCR en muestras de tejido foliar de papa de los departamentos de Antioquia y Nariño. 178
Figura 59. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTV759F y PMTV1552R (816 pb) a
partir de tejido de raíz de plantas de N. benthamiana cultivadas en suelos infestados con S.
subterranea de cuatro departamentos de Colombia
182
Figura 60. Gráfica de amplificación de qRT-PCR con los cebadores PMTV1948F,
PMTV2017R y la sonda PMTV1970 a partir de tejido de raíz de plantas de N. benthamiana
cultivadas en suelos infestados con S. subterranea de cuatro departamentos de Colombia
183
Figura 61. Porcentajes de detección del virus PMTV empleando ELISA, RT-PCR y qRTPCR en muestras de tejido de raíz de N. benthamiana cultivadas en suelos procedentes de
cuatro departamentos de Colombia.
184
15
RESUMEN
El cultivo de la papa representa uno de los renglones agrícolas de mayor importancia en
Colombia, alcanzando cerca de 162.000 ha y una producción que supera 2.721.396 ton.
Este cultivo es afectado por diversas plagas y enfermedades, entre las que se destacan las
polillas de los tubérculos, el tizón tardío y los problemas virales. Diferentes trabajos indican
que los problemas virales reducen los rendimientos y la calidad del tubérculo semilla en
cultivos de papa de todo el mundo, razón por la cual su manejo debe hacer parte
fundamental de los programas de manejo fitosanitario en este cultivo. Esta investigación se
planteó con el fin de evaluar la presencia y características genotípicas de los virus Potyvirus
(PVY), PVX, PLRV, PVS, PYVV y PMTV en los cultivos de papa de los departamentos de
Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño, determinándose además los niveles de
incidencia de cuatro de ellos (Potyvirus, PLRV, PVS y PVX) en diez regiones de dichos
departamentos. Adicionalmente, se evaluó la utilidad de la técnica de qRT-PCR para la
detección de los virus PVY y PMTV, seleccionados por su importancia económica y
carácter cuarentenario, respectivamente. Los resultados confirmaron la presencia de los seis
virus bajo estudio en los cultivos de papa de Colombia, siendo los Potyvirus y PVS los de
mayor incidencia con 72 y 40%, respectivamente, mientras que el PLRV y PVX se
encontraron en el 20 y 8% de las muestras evaluadas. Los análisis moleculares de los seis
virus analizados, permitieron inferir las afinidades filogenéticas de los genotipos virales,
encontrándose que los virus PLRV y PYVV presentan bajos niveles de variación y
diferenciación con respecto a cepas de referencia de otros lugares del mundo, mientras que
los virus PVY y PVS resultaron con niveles apreciables de variación. De gran interes
resultó el hecho que un alto número de cepas colombianas de PVY estuvieron asociadas
16
con la raza PVY-NTN, responsable de la enfermedad conocida como PTNRD. Los virus
PVX y PMTV presentaron un alto número de cepas con bajos niveles de variabilidad,
aunque algunos aislamientos compartieron bajos niveles de identidad con los genotipos de
referencia mundial. El uso de la técnica de qRT-PCR permitió detectar el virus PVY en el
100% de las muestras analizadas y el PMTV en el 45% de raíces de plantas de Nicotiana
benthamiana utilizadas como plantas señuelo para S. subterranea. Estas proporciones de
detección mediante qRT-PCR fueron superiores en 34% y 20% para PVY y PMTV con
respecto a la técnica de ELISA, y en 9% (PVY) y 17% (PMTV) cuando se comparó con
RT-PCR convencional. Se espera que la información generada en esta investigación sea
incorporada para el diseño de metodologías de diagnóstico viral que apoyen los programas
de certificación de tubérculo semilla y los programas de manejo integrado de enfermedades
virales en los cultivos de papa de Colombia.
17
1. INTRODUCCIÓN
El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L.) ocupa un lugar importante en la economía
mundial, debido a su uso como fuente de almidón para consumo fresco y para la industria
de alimentos, de concentrados para animales y de bebidas alcohólicas (Horton, 1992). En el
año 2007, la producción mundial de papa alcanzó 325,30 millones de ton con un
rendimiento promedio de 16,8 ton/ha, siendo la región Andina la de mayor crecimiento en
la producción del tubérculo, pasando de 30 millones de ton/año en el decenio de 1960 a
165,41 millones de ton para el 2007. En el año 2005 los países en desarrollo presentaron un
incremento en la producción del tubérculo, a tal punto que alcanzaron a superar la
producción de los países desarrollados. China, Rusia e India, son en su orden los mayores
productores del tubérculo en el mundo, con 72, 36 y 26 millones de ton de papa en el año
2007, respectivamente (FAO, 2008).
Para el mismo año, América Latina tuvo un área cosechada de papa de 963.766 ha, con un
rendimiento promedio de 16,3 ton/ha, un valor cercano al promedio mundial y similar al
Europeo, cuyo rendimiento fue de 17,4 ton/ha. Sin embargo, América Latina presenta una
reducción en el consumo de papa (20,7 kg/persona), lo que contrasta con los altos
consumos que se presentan en regiones como Europa, que alcanzan promedios de 87,8
kg/persona (FAO, 2008).
En Colombia, el cultivo de la papa genera una producción de 2.721.396 ton en
aproximadamente 162.000 ha cosechadas. El rendimiento promedio del cultivo para el
2006 fue de 16,8 ton/ha, valor similar al promedio de rendimiento mundial. La producción
nacional está distribuida en su orden en los departamentos de Cundinamarca, Boyacá,
Nariño y Antioquia con 398.926, 297.492, 266.112 y 119.854 ton, respectivamente.
18
Alrededor de 25.000 ton/año, son exportadas como papa fresca o refrigerada y el 7% del
total de dichas exportaciones, son representadas por productos procesados. Con respecto a
importaciones del tubérculo, para el año 2006 éstas ascendieron a 84.791 ton, con cerca del
62% correspondiente a papas procesadas, congeladas y féculas (MADR, 2006).
Los principales problemas en la producción de papa en Latinoamérica se pueden definir en
su orden en: problemas de comercialización y poscosecha (variación en precios, costos de
almacenamiento y demanda), las plagas y enfermedades y la reducida calidad del tubérculo
semilla. Esta última está estrechamente relacionada con el segundo aspecto y con la
capacidad técnico-científica de los países productores (Herrera y Scott, 1993). Los efectos
adversos de diferentes factores climáticos también limitan la producción de papa en gran
medida (MADR, 2006), especialmente bajo las condiciones actuales del cambio climático
global.
Desde tiempo atrás se han venido reportando los efectos que tienen los virus en el cultivo
de la papa y principalmente en su rendimiento. Aunque el promedio del rendimiento
nacional para el año 2006 es semejante al promedio mundial obtenido en el año 2007, no es
el óptimo, debido principalmente a la degeneración del tubérculo semilla ocasionado en
gran medida por los patógenos virales (Howard, 1978; Sánchez de Luque et al., 1991). Lo
anterior se evidencia mejor, si se compara el rendimiento promedio de 45 ton/ha en una
región como Inglaterra, donde se cuenta con un estricto sistema de certificación de semilla
(Defra, 2005). Datos similares se han registrado en Latinoamérica en la provincia de
Buenos Aires (Argentina), donde se han reportado rendimientos promedios de 30-50 ton/ha
(Cantos de Ruiz et al., 1989) y en la localidad de Colpac, Huancayo (Perú), donde se
obtuvieron registros de rendimiento que alcanzaron 74 ton/ha (Benza, 2008), cuando se
19
aplicaron medidas para reducir la presencia de virus en el tubérculo semilla y se realizaron
todas las prácticas agronómicas necesarias para el correcto manejo del cultivo.
En el mundo los principales virus que afectan la papa son: PLRV (Potato leafroll virus,
Polerovirus), PVY (Potato virus Y, Potyvirus), PVA (Potato virus A, Potyvirus) y PVX
(Potato virus X, Potexvirus) (Salazar, 1997a), sumándose a éstos PVS (Potato virus S,
Carlavirus) y PYVV (Potato yellow vein virus, Crinivirus) en Colombia (Salazar, 1997a;
Arciniegas, 2003). El efecto del PLRV en variedades susceptibles puede llegar a ocasionar
pérdidas de hasta el 90%, mientras que PVY y PYVV, pueden reducir los rendimientos
hasta en 80% y 60%, respectivamente. Sin embargo los estudios en virología han
demostrado que el efecto sobre la producción en papa es especialmente crítico cuando los
virus se presentan en conjunto; así por ejemplo, la infección simultánea de PVA y PVX
pueden llegar a destruir completamente el cultivo (Arciniegas, 2003; Zapata 2004). Debido
a estos graves efectos sobre la producción de papa, el Instituto Colombiano Agropecuario
(ICA), dirige un Programa Nacional de Certificación de Semilla de Papa cuyas tolerancias
mínimas para virus en cultivos destinados a semilla son los siguientes: para PLRV, PVY,
PVX y PVS no se permite presencia de virus en semilla Super Élite y Élite, 1% de
presencia de virus en semilla básica, 2% en semilla registrada y 5% en semilla certificada.
Para el caso de PYVV no se permite presencia de virus en semilla Super Élite, Élite y
Básica, 1% en semilla registrada y 1% en semilla certificada (Zapata, 2004). Sin embargo,
la utilización sucesiva de tubérculo semilla por parte de los agricultores conduce al
aumento de los niveles de incidencia y severidad de estos virus y de otros no incluidos en el
programa de certificación, generando reducciones importantes en la producción de este
cultivo en el país. Entre los virus no incluidos se destacan el PMTV (Potato mop-top virus,
20
Pomovirus), que según Salazar (2006), está distribuido en todos los Andes suramericanos,
desde Venezuela hasta Bolivia, pero no induce la sintomatología clásica reportada en la
zona templada y por tanto tiende a ser confundido con otros problemas virales o incluso
con problemas abióticos. Este virus fue recientemente detectado por Vélez (2007) en
cultivos de Zipaquirá y Subachoque, mediante RT-PCR con cebadores específicos y a partir
de un ensayo de inoculación en plantas de tabaco mediada por Spongospora subterranea
(Plasmodiophoridae), el agente causal de la sarna polvosa de la papa y que actúa como su
vector en el suelo.
Ya que el problema de la sarna polvosa de la papa causado por S. subterranea se ha
expandido dramáticamente en los últimos años en las principales regiones cultivadores del
tubérculo del país (Jaramillo y Botero, 2007), es posible que paralelamente la infección por
el virus Mop-top también se encuentre en franco aumento, razón por la cual se planteó la
presente investigación, con el objetivo principal de evaluar la presencia de PMTV en las
principales regiones cultivadoras de papa de los departamentos de Antioquia,
Cundinamarca, Boyacá y Nariño, determinado el nivel de variabilidad de las cepas
detectadas mediante análisis de secuencias de la región que codifica para la cápside viral y
implementando una prueba diagnóstico basada en RT-PCR en tiempo real que permita la
detección del PMTV. Dichas evaluaciones fueron acompañadas por el estudio de los
niveles de incidencia de los virus PVY, PVX, PLRV, PVS y PYVV mediante pruebas de
ELISA y análisis de secuencias diagnósticas para determinar su identidad y afinidades
filogenéticas con cepas de dichos virus cuyas secuencias están reportadas en las bases de
datos moleculares. De esta manera el desarrollo de esta investigación ha generado un
cuerpo actualizado de información sobre el estado de la sanidad viral de los cultivos de
21
papa en Colombia y sobre las características genéticas de sus agentes causales, bases para
el diseño de las estrategias de manejo de estas enfermedades en los cultivos de papa de
nuestro país.
22
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Detectar y caracterizar los principales virus que afectan la sanidad de los cultivos de papa de las
regiones productoras de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño, con
énfasis en el estudio del virus PMTV.
2.2. Objetivos específicos
Determinar los niveles de incidencia de los virus PVS, PVX, PLRV, PVY y PMTV
mediante pruebas de ELISA, en las principales regiones cultivadoras de papa de los
departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño.
Evaluar la presencia del virus PMTV en quistosoros de S. subterranea presentes en agallas de
raíces y/o tubérculos y muestras de suelos de lotes afectados por sarna polvosa mediante
pruebas de ELISA y RT-PCR.
Definir las afinidades filogenéticas entre las variantes de los virus PVS, PVX, PLRV, PVY,
PYVV y PMTV identificadas mediante RT-PCR convencional y secuenciación en cultivos de
papa de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño, y aquellas cuyas
secuencias se encuentran depositadas en las bases de datos moleculares.
Implementar una metodología basada en RT-PCR en tiempo real para el diagnóstico de los
virus PVY y PMTV, seleccionados para este análisis por su importancia económica y
condición cuarentenaria, respectivamente.
23
3. MARCO TEÓRICO
3.1. Virus asociados al cultivo de la papa
El cultivo de la papa es uno de los más afectados por los problemas virales en la agricultura
mundial, siendo reportados al menos 25 virus y viroides (Salazar, 1995; Salazar, 2006) que
se pueden agrupar con base en la dependencia de la papa para su supervivencia y
diseminación. Dentro del grupo de los dependientes se destacan: PVX, PVY, PVS, PVM
(Potato virus M, Carlavirus), PAMV (Potato aucuba mosaic virus, Potexvirus), PMTV,
PLRV, PVT (Potato virus T, Betaflexiviridae sin género asignado), APMV (Andean potato
mottle virus, Comovirus), PBRV (Potato black ringspot virus, Nepovirus), WPMV (Wild
potato mosaic virus, Potyvirus), PSTVd (Potato spindle tuber viroid, Pospiviroid) y APLV
(Andean potato latent virus, Tymovirus). En el segundo grupo, es decir, los que no
dependen de la papa para su supervivencia se encuentran: AMV (Alfalfa mosaic virus,
Alfamovirus), BCTV (Beet curly top virus, Curtovirus), CMV (Cucumber mosaic virus,
Cucumovirus), PYDV (Potato yellow dwarf virus, Nucleorhabdovirus), TRV (Tobacco
rattle virus, Tobravirus), TMV (Tobacco mosaic virus, Tobamovirus), TRSV (Tobacco
ringspot virus, Nepovirus), ToBRV (Tomato black ring virus, Nepovirus), ToSWV
(Tomato spotted wilt virus, Tospovirus) y TSV (Tobacco streak virus, Ilarvirus). Los virus
del primer grupo generalmente presentan un rango de hospederos más restringido o
moderado que los del segundo (Salazar, 1995), mientras que PLRV, PVY, PVA, PVX y
PVS, son considerados los de mayor importancia económica y con la más amplia
distribución mundial (Solomon-Blackburn y Barker, 2001).
Los problemas virales en el cultivo de la papa afectan la producción de tubérculos al
reducir el área fotosintética, la movilización de nutrientes y por tanto la acumulación de
24
carbohidratos para la formación adecuada de los tubérculos, lo cual está asociado
directamente a reducciones del rendimiento y además imposibilita al agricultor para obtener
tubérculo semilla a partir de su propio cultivo (Salazar, 1995). En sistemas agrícolas
tradicionales como los que predominan en las zonas alto-andinas de Suramérica, esta
situación es frecuente y conduce a la pérdida de vigor de la semilla, y a un efecto
acumulativo de diferentes virus que termina por reducir dramáticamente los rendimientos,
al cabo de varios ciclos de siembra-cosecha. En explotaciones tecnificadas, dicha situación
se remedia mediante el empleo de semilla certificada, la cual es monitoreada por los
organismos de sanidad de los estados. Así por ejemplo, en Colombia se permite hasta un
5% de presencia de virus para semilla certificada y de 0 a 1% para semilla básica
dependiendo de los virus (Zapata, 2004), mientras que en Inglaterra los límites permitidos
no superan el 0.01% de plantas con síntomas virales para semilla pre-básica; 4% para
semilla básica y 10% para semilla certificada (Defra, 2006). La siembra de semilla
certificada es sin duda un factor fundamental para el aumento de los rendimientos en este
cultivo.
La degeneración del tubérculo semilla se ha debido entre otras causas, a los virus que
inciden en el cultivo de la papa (Guerrero y Martínez, 1980; Santos Rojas, 1985) y dicha
incidencia se debe principalmente al desconocimiento de los patógenos virales que posee el
tubérculo semilla empleado para la siembra y a la dificultad para su detección prematura, lo
que hace más difícil controlar la diseminación de los virus y mantener rendimientos
óptimos en los cultivos (Howard, 1978; Salazar, 1982). La relación de los patógenos del
tubérculo semilla es bastante estrecha, encontrándose en ocasiones incidencias debidas a la
sucesiva propagación del mismo material hasta del 100% (Secor y Rivera-Varas, 2004).
25
Una ilustración de la degeneración del tubérculo semilla debida a la afección viral, es la
situación del rendimiento en Perú para la década de los 80, en la cual se reportaba una
producción promedio de 8 ton/ha (Salazar, 1986; FAO, 1987), que luego de un proceso de
implementación de programas de saneamiento de semilla y estudios sobre la influencia de
los virus y el tipo de partículas virales relacionadas con la degeneración de las variedades
locales (Ezeta y Scheidegger, 1985) logró aumentarse a 12,1 ton/ha a nivel nacional y a 17
ton/ha en la región costera del país (Nuñez, 2009). Lo anterior indica que la disminución en
el rendimiento productivo del cultivo de la papa puede llegar a niveles críticos en la región
Andina, llegándose a estimar hasta en un 50% (Guerrero y Martínez, 1980).
Además de los virus tradicionalmente encontrados en los cultivos de papa, frecuentemente
se reporta la aparición de nuevas especies o variantes virales y/o ocurre la re-emergencia de
otros virus que habían perdido importancia económica. Dichas situaciones están muy
asociadas a la globalización de los mercados, que facilitan el movimiento de productos de
origen agrícola entre continentes y países, en donde los virus pueden encontrar nuevas
variedades susceptibles y condiciones agroambientales o antropogénicas que favorezcan su
proceso infectivo y dispersión. Algunos ejemplos que ilustran estas situaciones incluyen la
emergencia de la raza PVY-NTN que causa necrosis de tubérculo y los virus codificados
como SB26/29 y SB41, que causan mosaicos severos y enanismos en cultivos de papa del
Perú, con reducciones en el rendimiento de hasta el 80% para SB26/29 (transmitido por el
Psyllidae, Russelliana solanicola) (Rojas et al., 1993; Tenorio, 2000; Salazar, 2006). De
otra parte el virus PMTV ha sido reportado en diferentes regiones del continente americano,
representa una gran preocupación para los productores en Norte América, donde fue
reportado en 1991-1992 (Xu et al., 2004; Johnson, 2009) y en Costa Rica se ha detectado
26
mediante serología en el 50% de las muestras evaluadas, principalmente en las zonas con
altitudes comprendidas entre 1800 y 2500 msnm (Vásquez et al., 2006). En Colombia
PMTV fue recientemente reportado en cultivos de papa de Cundinamarca y Boyacá (Vélez,
2007). Como anota Salazar (2006), esta variación en re-emergencia de algunos virus y la
aparición de otros nuevos, puede estar influenciada fuertemente por los cambios climáticos
que además de afectar la fisiología del cultivo, influyen sobre las poblaciones de los
vectores de los virus, razones por las que es necesario mantener una vigilacia fitosanitaria
permanente que conduzca a evitar su diseminación y efecto económico en la producción de
los cultivos.
3.2 Virus asociados al cultivo de la papa en Colombia.
En estudios realizados desde años atrás en el país, se ha evidenciado la presencia e
interacción de diversos virus afectando el cultivo de la papa. Tal es el caso de los virus
PVX, PVY y PLRV, para los cuales se reportaron pérdidas del orden del 61% en
rendimiento (Guerrero, 1978). Además de estos virus, en las últimas décadas ha cobrado
importancia el PYVV (Guzman et al., 2004a; Zapata, 2004), gracias a su eficiente
diseminación por parte de Trialeurodes vaporariorum, un insecto que es además
comúnmente encontrado en otros cultivos de la región Andina como frijol (Phaseolus
vulgaris), zanahoria (Daucus carota) y diversas plantas arvenses (especialmente solanáceas
silvestres y poáceas) (Salazar, 1997b). Más recientemente, se ha reportado en el país el
virus PMTV o Mop-top de la papa (Vélez, 2007); dicho virus puede causar pérdidas
estimadas de hasta 25% en rendimiento en la región templada, lo que sumándose al efecto
del daño ocasionado por su vector S. subterranea, pudiera ascender a valores de 50 - 80%
27
(Jones y Harrison, 1972; Guerrero, 1997; Guerrero, 2000). Según Salazar (2006), el PMTV
es uno de los virus que ha sido prevalente en el cultivo de la papa en los andes
sudamericanos, pero su efecto sobre el rendimiento del cultivo no se ha establecido
claramente en esta zona. La enfermedad inducida por PMTV presenta una amplia gama de
síntomas dependiendo de la variedad del cultivar, que incluyen amarillamiento foliar,
anillos necróticos y cuarteamiento de tubérculos y moteados tipo ¨Aucuba¨ (Salazar, 1995;
Sokmen et al., 1998; Xu et al., 2004). En Colombia, no es posible identificar con exactitud
la sintomatología que induce PMTV en los cultivos de papa, pudiéndose confundir con
desordenes fisiológicos o afecciones de otros patógenos, incluyendo algunas razas de PVY
y PVS.
Con respecto a la importancia económica de estos virus en Colombia, se han realizado
diferentes estudios tendientes a estimar los porcentajes de reducción atribuibles a los
principales virus que afectan el cultivo de papa. Así, para PYVV se estimó que bajo las
condiciones del centro experimental La Selva de CORPOICA (Rionegro, Antioquia), este
virus ocasiona una disminución del 28% en la variedad Diacol Capiro (Zapata, 2004). En
los casos de PVX, PVY y PLRV, estudios realizados en la variedad ICA-Puracé,
encontraron que las inoculaciones individuales de los virus PVX y PVY en plantas sanas no
ocasionaron una disminución significativa en el desarrollo y rendimiento del cultivo; sin
embargo, su inoculación conjunta, condujo a pérdidas del orden del 61%. Las inoculaciones
individuales de PLRV ocasionaron pérdidas de 47% respecto al testigo, mientras que el
asocio de PVY y PLRV redujo la producción en un 55%. Finalmente, cuando se inocularon
conjuntamente PVX-PVY y PVX-PLRV, estos valores fueron del 39% y 24%,
respectivamente (Guerrero y Martínez, 1980).
28
Por otra parte, en un estudio en el que se evaluaron la incidencia y los efectos en los
rendimientos de los virus PVX, PVS, PVY y PLRV en tres regiones altitudinales (páramo3200 msnm, media-2600 msnm y baja-2150 msnm) sobre las variedades Parda Pastusa,
ICA Puracé, Diacol Capiro e ICA Tequendama, a lo largo de tres años consecutivos
empleando los tubérculos semilla del mismo experimento, se encontró que la zona baja fue
la que presentó mayor incidencia viral, con valores de 68 y 87% para el primer y segundo
semestre del año y disminuciones en el rendimiento del 50 y 40%, respectivamente. La
zona media tuvo incidencias del 34 y 46% y disminución en el rendimiento del 14 y 30%.
En la zona del páramo, la incidencia fue tan sólo del 18% y no se presentó una disminución
evidente en la producción durante el primer semestre; sin embargo, para el segundo
semestre las incidencias fueron del 30% reduciéndose el rendimiento en un 3%. Los
resultados confirmaron la relación estrecha entre el incremento de las poblaciones de áfidos
y otros insectos vectores con la incidencia de los virus que afectan papa (Sánchez de Luque
et al., 1991).
Para Solanum phureja, en un estudio con 800 muestras de los municipios de Nariño y
Cundinamarca y que estimó la incidencia de virus mediante Inmuno-impresión, se
encontraron valores de 86%, 72%, 39% y 91%, para los virus PVS, PVY, PVX y PLRV,
respectivamente. Esta misma evaluación se realizó al material del banco de germoplasma
de la Colección Central Colombiana de S. phureja y en este caso los valores de incidencia
fueron de 20%, 19%, 5.7% y 6,6%, respectivamente (Guzman et al., 2004a).
29
3.3. Generalidades de algunos virus asociados al cultivo de la papa.
3.3.1. Familia Virgaviridae.
La familia taxonómica Virgaviridae fue recientemente descrita y agrupa virus cuya
partícula viral posee forma de bastón (Latín Virga). Incluye los géneros Furovirus (5
especies), Hordeivirus (4 especies), Pecluvirus (2 especies), Pomovirus (4 especies),
Tobamovirus (25 especies) y Tobravirus (3 especies) y un total de 43 especies descritas.
Las características del grupo son entre otras, proteínas de replicación de tipo alfa, genoma
de ARN de sentido positivo con un motivo de ARN de transferencia asociado a su extremo
3‟ terminal, forma de bastón de sus viriones y un canal central de 20 a 25 nm de diámetro.
Por último, las proteínas de cápside poseen tamaños que oscilan entre 19 a 24 kDa (Adams
et al., 2009; ICTV, 2010).
Los virus de esta familia se caracterizan también por poseer al menos una proteína de
movimiento “30K”, como es el caso de Furovirus, Tobamovirus y Tobravirus. Por su parte,
Hordeivirus, Pecluvirus y Pomovirus, tienen un grupo de tres proteínas relacionado con su
movimiento sistémico en la planta denominado “TGB” (Bloque triple de genes). Existen
algunas diferencias en la organización de sus genomas y el número de ARN que los
componen varía desde 1 a 3 dependiendo del género. Hordeivirus y Pomovirus poseen tres
ARN genómicos (ARNg), pero el primer grupo tiene su motivo de ARN polimerasa
dependiente de ARN (RdRp) en un ARN diferente al de los motivos Helicasa y Metiltransferasa, los cuales están juntos en los demás géneros de la familia. Tobamovirus es el
único género cuyos integrantes poseen un solo ARN como genoma y no es transmitido por
un patógeno del suelo; el resto de miembros de la familia poseen dos ARNg (Adams et al.,
2009).
30
Mediante el análisis filogenético de la RdRp de los virus de la familia con aquellos
agrupados como Benyvirus (viriones con forma de bastón), miembros de las familias
Closteroviridae y Bromoviridae, el género Idaeovirus y miembros del orden Tymovirales,
se encontró que los géneros que agrupa la familia Virgaviridie están fuertemente soportados
por la alta relación filogenética de sus secuencias y que los virus del género Benyvirus son
realmente distantes de la familia en cuestión (Adams et al., 2009). En la figura 1 se pueden
visualizar las diferencias en los genomas de los virus pertenecientes a la familia
Virgaviridae.
Figura 1. Diagrama representativo de los seis géneros que conforman la familia Virgaviridae. (M) Motivo
Metil-transferasa, (H) Motivo Helicasa, (R) Motivo RdRp, el Bloque triple de genes (TGB) esta representado
por los cuadros en tramas, (MP) Proteínas de movimento de la superfamília “30K”, (C) Proteína rica en
cisteína o “CRP”. Los triángulos representan sitios de supresión del codón de finalización. (t) representa
motivos de ARN de transferencia con los aminoácidos que acepta. Los corchetes representan ORF que no
están presentes en algunas razas. Tomado de Adams et al, (2009).
31
Género Pomovirus
El género Pomovirus deriva su nombre de la especie tipo Potato mop-top virus (PMTV). El
género está compuesto por tres especies además de PMTV: Beet soil-borne virus (BSBV),
Beet virus Q (BVQ) y Broad bean necrosis virus (BBNV). BSBV y BVQ son transmitidos
por Polymyxa betae (Meunier et al., 2003), mientras que BBNV es transmitido por P.
graminis y PMTV por S. subterranea (Deacon, 2010). Los virus de este género poseen
viriones con simetría helicoidal cuyas longitudes varían de 60 a 310 nm, dependiendo del
virus (Büchen-Osmond, 2010) y el ARN. PMTV posee 3 moléculas de ARN con tamaños
de 6,4 kb, 3 kb y 2,5 kb, con caperuzas hacia el extremo 5‟ y una estructura tipo ARNt
hacia el extremo 3‟. El coeficiente de sedimentación de las partículas formadas es de 230,
170 y 125S. El ARN 1 codifica para una proteína que tiene motivos de metiltransferasa y
helicasa (ORF 1) y una proteína generada por supresión del codón de finalización del ORF
1 con motivos de RdRp. Cerca del extremo 3´del ARN 2 se presenta una proteína asociada
a la transmisión por vector y generada a partir de la supresión del codón de terminación del
ORF que codifica para CP. Esta proteína parece ser la responsable de la pérdida de la
estructura helicoidal en los extremos del ARN durante el proceso de desensamblaje. El
ARN 3 codifica para cuatro polipéptidos de 51, 21, 13 y 8 kDa, respectivamente. Los
primeros tres presentan secuencias similares a proteínas de TGB de otros virus,
involucradas en el movimiento célula a célula. La función de la cuarta proteína, una
proteína rica en cisteína (CRP), parece ser la de actuar en el incremento de la virulencia; sin
embargo, no es indispensable para el proceso infectivo (Reavy et al., 1998; Savenkov et al.,
2003).
32
Las secuencias de los virus de este género comparten menos del 80% de identidad cuando
se comparan sus genomas completos y menos del 90% cuando se comparan las secuencias
de aminoácidos de la proteína de cápside. También difieren en su rango de hospederos,
especies vectores, morfología de los cuerpos de inclusión en tejidos, relaciones serológicas
y componentes del genoma, particularmente presencia o ausencia de CRP (BüchenOsmond, 2010).
La especie PMTV es transmitida por zoosporas de S. subterranea y BSBV es transmitido
por P. betae, ambos plasmodiofóridos que afectan los sistemas radiculares de sus
hospedantes. Estos virus también pueden ser transmitidos por semilla asexual. Los virus
pueden permanecer en las estructuras de resistencia de sus vectores por varios años en el
suelo (Astier et al., 2007; Dijkstra y Khan, 2006).
Potato mop-top virus (PMTV)
PMTV es transmitido de forma persistente y muy específica por S. subterranea f. sp.
subterranea, agente causal de la sarna polvosa de la papa. S. subterranea posee unas
estructuras de resistencia denominadas quistosoros (conglomerado de esporas de resistencia
características del patógeno) que pueden sobrevivir en el suelo durante largos periodos de
tiempo. El patógeno inicia su infección cuando lo quistosoros liberan las zoosporas
primarias, las cuales se adhieren a los pelos radicales de la planta y comienza la fase de
penetración, empleando para ello un “estilete” que se genera posterior a la formación del
“tubo” por el quiste infectivo. Este tubo, junto con el estilete, son los que permiten que el
protoplasto del patógeno ingrese al interior de la célula del hospedero. Una vez dentro de
33
las raíces de la planta, el patógeno forma un plasmodio primario multinucleado con una
delgada membrana que posteriormente se convierte en un zooesporangio, el cual será
liberado a la fase líquida del suelo como zoosporas secundarias (Dijkstra y Khan, 2002;
Merz y Fallon, 2009).
En los ensayos de transmisión del virus se ha observado que éste es transmitido
eficientemente a plantas indicadoras (ej. N. tabacum y N. benthamiana) a partir de muestras
de suelo infestadas con quistes del patógeno (Campbell, 1996; Vélez, 2007).
El virus posee tamaños de 6043 nt (ARN 1), 3134 nt (ARN 2) y 2964 nt (ARN 3) (PMTV
accesiones
de
GenBank
N°
NC_003723.1,
NC_003724.1
y
NC_003725.1,
respectivamente). Su virión consiste en una partícula elongada con simetría helicoidal en
forma de bastón con longitudes de 100 a 150 nm y 250 a 300 nm, y un diámetro de 18 a 20
nm. El coeficiente de sedimentación corresponde a 236S, TIP de 75 a 80°C, LIV mayor a
200 días y el DEX alrededor de 3 (Büchen-Osmond, 2010).
El ARN 1 tiene dos ORF, el primero codifica para la proteína de 149 kDa y el segundo
produce la proteína RdRp mediante la estrategia de supresión del codón de parada. En las
proteínas de dicho ARN se han detectado además dominios de metiltransferasa y helicasa
(Savenkov et al., 1999). El ARN 2 tienen una estrategia similar, con dos ORFs los cuales
codifican para la CP y para una proteína generada por supresión del codón de parada
denominada CP2 (Figura 2). El ARN 3 codifica para TGB y para CRP, como se enunció en
las generalidades de los Pomovirus (Savenkov et al., 2003).
El PMTV constituye un pequeño grupo de virus que para su movimiento sistémico en la
planta hospedante no requiere de la expresión de CP, ni de la formación del virión
(McGeachy y Barker, 2000), debido a que el TGB le ofrece la posibilidad de mover el ARN
34
infeccioso a través de largas distancias en la planta (Melander et al., 2001). Dicho ARN
desnudo se puede encontrar en tubérculos asintomáticos y causar una infección secundaria
para la siguiente temporada de siembra (McGeachy y Barker, 2000). La manifestación de
los síntomas característicos de la enfermedad depende de la presencia de los tres ARN en el
tejido (Savenkov et al., 2003).
Los principales síntomas que causa PMTV en cultivos de regiones templadas corresponden
a mosaicos tipo “aucuba” en las hojas y anillos necróticos y agrietamientos en los
tubérculos. En las variedades cultivadas en los Andes estos síntomas no son evidentes, y en
su lugar se presentan amarillamientos foliares, enanismos y acortamiento de entrenudos
(Salazar, 1995; Dijkstra y Khan, 2006; Büchen-Osmond, 2010). En condiciones
experimentales el virus puede infectar plantas de las familias Chenopodiaceae, Solanaceae
y Tetragoniaceae. Dentro de estas se encuentran las plantas que se usan para su
diagnóstico, las cuales corresponden a Nicotiana debneyi y Chenopodium amaranticolor,
en las que se produce necrosis sistémica y lesiones locales concéntricas cafés,
respectivamente. Nicotiana benthamiana, N. debneyi y N. clevelandii, son las especies más
apropiadas para el mantenimiento y propagación del virus bajo condiciones experimentales
(Büchen-Osmond, 2010).
35
Figura 2. Representación del genoma de PMTV. a. En las cajas se observan las proteínas para las que
codifica el genoma. Las flechas indican las proteínas originadas y los ARN subgenómicos (ARNsg). b.
Representación
de
la
encapsidación
independiente
de
los
tres
ARN
de
PMTV.
Fuente:
http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species/643.html.
3.3.2. Familia Potyviridae
La familia Potyviridae debe su nombre al género Potyvirus. Dentro de la familia se
encuentran los géneros, Brambyvirus (1 especie), Bymovirus (6 especies), Ipomovirus (4
especies), Macluravirus (6 espcies), Potyvirus (143 especies), Rymovirus (3 especies),
Tritimovirus (4 especies) y 3 especies sin género asignado: Spartina mottle virus (SpMoV),
Sugarcane streak mosaic virus (SCSMV) y Tomato mild mottle virus (TomMMoV). Es la
familia taxonómica con mayor número de especies de virus de plantas, con 170 especies
formalmente reconocidas por el ICTV (ICTV, 2010), los que se caracterizan por su
morfología filamentosa y flexuosas de 11 a 15 nm de diámetro con simetría helicoidal y
longitudes de 650 a 900 nm para los virus monopartita (Brambyvirus, Ipomovirus,
36
Macluravirus, Potyvirus, Rymovirus, Tritimovirus) y de 200-300, 500-600 nm para los
virus bipartita del género Bymovirus (Dijkstra y Khan, 2006; Astier et al., 2007) (Figura 3).
Su ARN es de cadena sencilla con sentido positivo y lleva una proteína VPg (Proteína viral
asociada al genoma) de alrededor de 24 kDa unida covalentemente al extremo 5‟ y una
poly-A de longitudes variables hacia el extremo 3‟. Cada ARN comprende un solo ORF
que traduce una poliproteína de 340-370 kDa que es clivada por las proteasas virales para
generar las proteínas funcionales del virus. Su genoma es de 10 kb rodeado por cerca de
2000 copias de la proteína de cápside (CP) (Urcuqui-Inchima et al., 2001). La familia
Potyviridae también se caracteriza por inducir inclusiones cilíndricas citoplasmáticas (CI),
como ruedas de carreta (pinwheels) o agregados laminares. Estas CI contienen proteínas
codificadas por el genoma viral que poseen actividad Adenosín trifosfatasa (ATPasa) y
Helicasa. Otra proteína viral, HC-Pro (Helper component protease) provoca inclusiones
amorfas (AI) en las que generalmente se encuentran asociadas organelas degradadas de la
célula con partículas virales. Esta proteína, también posee funciones de proteinasa y se
asocia a la transmisión por el vector (Dijkstra y Khan, 2006; Urcuqui-Inchima et al., 2001).
Género Potyvirus
El nombre del género Potyvirus se deriva de la especie “Potato virus Y” (Dijkstra y Khan,
2006). El género posee 143 especies aprobadas, lo que le convierte en el más numeroso de
los siete géneros de la familia (ICTV, 2010). Las partículas virales tienen una longitud de
680 a 900 nm, cuyos viriones poseen un coeficiente de sedimentación de 150 a 160S, una
densidad de flotación de 1,31 g/cm3 en CsCl y un genoma de ARN con alrededor 9700 nt
(Dijkstra y Khan, 2006).
37
Como ya se había indicado, el genoma contiene solo un marco de lectura abierto (ORF) que
codifica para una poliproteína de 340-370 kDa (Riechmann, et al., 1992; Riechmann et al.,
1995) que es procesada posteriormente, por acción de tres proteasas en siete proteínas
pequeñas: P1, componente asistente (Helper Component); P3, de inclusión cilíndrica (CI);
inclusión nuclear A (NIa); inclusión nuclear B (NIb); proteína de cápside (CP) y dos
proteínas putativas denominadas 6K1 y 6K2 (Riechmann et al., 1992) (Figura 3). Las
proteasas corresponden a la proteinasa P1 y del componente asistente (HC-pro), que
catalizan solo reacciones autoproteolíticas en los extremos C-terminales (Carrington et al.,
1989; Verchot, et al., 1991), mientras que los clivajes restantes son catalizados mediante
mecanismos trans y autoproteolíticos mediados por la proteína de inclusión nuclear (NIaPro), un homólogo de la proteinasa del Picornavirus 3C (Langenberg y Zhang, 1997). El
procesamiento y función de todas estas proteínas es aún controversial pero se cree que
muchas de ellas son multifuncionales (Riechmann et al., 1992; Verchot y Carrington 1995;
Mahajan et al., 1996).
38
Figura 3. Organización del genoma de un potyvirus. a. Se observa el ARN genómico asociado a VPg hacia el
extremo 5‟ y la poly-A en el extemo 3‟. Dentro de lo demarcado como una caja se detalla la poliproteína con
las proteínas maduras luego del clivaje. Se indican con flechas las proteínas que realizan el clivaje y los
lugares
donde
ocurre
el
mismo.
b.
Representación
del
virión
de
un
Potyvirus.
Fuente:
http://ca.expasy.org/viralzone/all_by_species/50.html
Potato virus Y (PVY)
El virus PVY posee un genoma de 9704 nt (PVY raza N, accesión del GenBank No.
X12456.1), una proteína VPg hacia su extremo 5‟ y poliadenilación (poly-A) hacia el
extremo 3‟ (Shukla et al., 1994). La morfología del virus consiste en una cápside no
envuelta, elongada con simetría helicoidal monopartita y flexuosa, una longitud de 684 nm
a 730 nm, diametro de 11 nm y un canal axial de 2-3 nm (Ogawa et al., 2008). La proteína
de la cápside (CP) es el principal componente del virión con aproximadamente 2000
unidades monoméricas (Urcuqui-Inchima et al., 2001). La densidad de los viriones en CsCl
es de 1.323 g/cm3 para cepas tipo PVY-O y de 1.326 g/cm3 para cepas PVY-N. El punto de
inactivación térmico (TIP) es de 50-62 °C, su longevidad in vitro (LIV) de 7 a 50 días y el
39
exponente decimal (DEX) de la dilución esta usualmente entre 2 a 6. La infectividad de las
partículas no cambia por tratamientos con éter y es inactivado con fenol o diferentes
detergentes (Gibbs y Mackenzie, 1997; Van Regenmortel et al., 2000; Hsu et al., 2005).
La especie PVY esta formada por un complejo de diferentes aislamientos (Smith, 1931),
siendo la primera variante identificada del virus la denominada PVC (Potato virus C), que
luego pasó a ser llamada PVY-C (Bawden, 1943). Históricamente los aislamientos del virus
se han dividido en tres razas principales: PVY-O, PVY-N, y PVY-C, de acuerdo a los
síntomas inducidos en Nicotiana tabacum cv. Samsun y Solanum tuberosum ssp.
tuberosum (Delgado-Sánchez y Grogan, 1970). Hay que tener en cuenta además que no
todas las variantes del virus son transmitidas por áfidos, como ocurre con algunos
aislamientos de la raza PVY-C (Blanco-Urgoiti et al., 1998). Más recientemente se ha
incorporado en la clasificación de sus variantes el criterio del tipo de antigenicidad de su
proteína de cápside y los genes de resistencia que vence en el hospedante; tal es el caso del
aislamiento denominado PVY-Z, el cual esta serológicamente clasificado como PVY-O,
pero que sobrepasa los genes Nytbr y Nc (Jones, 1990) y elicita el gen Nz en las plantas
(Singh et al., 2008). Otro grupo es denominado PVY-N-Wilga (PVY N-Wi), el cual tiene
propiedades biológicas de los aislamientos PVY-N, pero está serológicamente clasificado
como PVY-O, lo que permite deducir que presenta un genoma recombinante entre las
secuencias de los dos tipos de aislamientos (Glais et al., 2002a). En los últimos años se ha
detectado una variante adicional denominada PVY-NTN, serológicamente relacionada con
PVY-N, pero que causa anillos necróticos en tubérculos de papa, enfermedad conocida
como PTNRD (Potato tuber necrotic ringspot disease) y que puede ocasionar pérdidas
hasta del 100% en este cultivo (Kogovsek et al., 2008).
40
Dentro de las regiones que determinan la variabilidad del virus o mejor, del complejo viral,
se ha determinado que las regiones 5´NTR (Región no traducible del 5‟) y de la proteína
P1, corresponden a las secuencias más variables en el género Potyvirus, siendo responsable
hasta de un 28% de la variabilidad total existente entre los grupos O y N (Marie-JeanneTordo et al., 1995; Ward et al., 1995). Hacia el interior de la región CP (Glais et al., 2002a;
Ohshima et al., 2000) ó dentro de la región del gen HC-Pro (Schubert et al., 2007), es
posible que se encuentre la secuencia responsable de los síntomas PTNRD. De otra parte,
las regiones NIb y 3‟-NTR, constituyen puntos de variación y recombinación, y pueden
servir para diferenciar las razas o patotipos del virus a partir del estudio de sus secuencias
(Kogovsek et al., 2008).
El PVY es transmitido de forma mecánica, por injerto y por áfidos de manera no
persistente, principalmente por la especie Myzus persicae, aunque también se han reportado
Aphis fabae, Macrosiphum euphorbiae, Myzus (Nectarosiphon) certus, Myzus (Phorodon)
humuli y Rhopalosiphum insertum. No requiere de un virus auxiliar; sin embargo, si puede
facilitar la transmisión de otros virus como el Potato aucuba mosaic virus.
Experimentalmente,
se
pueden
emplear
especies
de
las
familias
Solanaceae,
Commelinaceae y Chenopodiaceae para las pruebas biológicas de transmisión y expresión
de síntomas, así como también para obtener fuente de inóculo. Dentro de dichas familias, se
destacan
las
especies
Capsicum
annuum,
Capsicum
frutescens,
Chenopodium
amaranticolor, Chenopodium quinoa, Solanum lycopersicum, Nicotiana glutinosa,
Nicotiana tabacum, Physalis floridana, Solanum chacoense, Solanum demissum, Solanum
demissum x S. tuberosum, Solanum tuberosum, Tinantia erecta. Luego de las
inoculaciones, en N. glutinosa y N. tabacum, se pueden desarrollar síntomas tales como
41
moteado sistémico suave o severo y aclaramiento sistémico de venas. En papa,
dependiendo de la variedad y la raza viral, se pueden desarrollar síntomas que van desde
moteados y clorosis en las venas hasta necrosis de tubérculo (Büchen-Osmond, 2010).
3.3.3. Familia Alphaflexiviridae
La familia Alphaflexiviridae pertenece al orden Tymovirales y está compuesta por seis
géneros: Allexivirus (8 especies), Botrexvirus (1 especie, Micovirus), Lolavirus (1 especie),
Mandarivirus (1 especie), Potexvirus (35 especies) y Sclerodarnavirus (1 especie,
Micovirus) que suman un total de 57 especies. Los virus de este grupo taxonómico se
caracterizan por poseer viriones filamentosos flexuosos entre 470 a 800 nm y 12-13 nm de
diámetro, constituidos por subunidades de una sola CP. Son virus monopartita con ARN de
sentido positivo con tamaños de 5.4 a 9 kb, su primer ORF codifica para una RdRp tipo
potex y poseen TGB que se expresan a partir de ARNsg (ARN subgenómico). El extemo 5‟
posee una caperuza de Metilguanosin y su extremo 3‟ tiene una cola poly-A. Su genoma
varía entre 6.400 a 9.300 nt (Huang et al., 2004; Dijkstra y Khan, 2006; Astier et al., 2007;
ViralZone, 2010; DPVweb, 2010). Hacia el extremo 5‟ se encuentra una proteína replicasa
tipo alfa constituida por motivos metiltransferasa, helicasa y RdRp y hacia el extremo 3‟ se
ubica el gen CP, que codifica para proteínas de 22 a 44 kDa (Dijkstra y Khan, 2006). En
esta familia recientemente se incluyó el género Sclerodarnavirus, que carece de cápside e
infecta al hongo Sclerotinia sclerotiorum; de allí deriva su nombre Sclerotinia sclerotiorum
debilitation-associated RNA virus (SsDRV). El virus solo posee un ORF que codifica para
la replicasa tipo alfa, altamente relacionada filogenéticamente con los géneros Allexivirus,
42
Potexvirus y Mandarivirus, siendo la carencia de cápside razón suficiente para ser
considerado un género diferente (Adams y Kreuze, 2008a).
Género Potexvirus
Este nombre se deriva de la especie tipo Potato virus X (PVX). El género se caracteriza por
poseer viriones filamentosos flexuosos con simetría helicoidal y longitudes de 470 a 580
nm (Huang et al., 2004) y un diámetro de 13 nm. Los viriones poseen un coeficiente de
sedimentación que se encuentra entre los rangos 115 a 130S y un coeficiente de densidad
de flotación de 1,31 g/cm3 en CsCl (Dijkstra y Khan, 2006).
La molécula de ARN contiene cinco ORF (Figura 4) y su tamaño es de 6,4 kb. El ARNg,
lleva a la expresión del ORF 1, el cual contiene los motivos metiltransferasa, helicasa y
polimerasa. Desde el ORF 2 al 5, el virus emplea la estrategia de ARNsg. Los ORF 2, 3 y 4
son traslapados y constituyen el TGB, que codifica para proteínas de 25, 12 y 8 kDa,
respectivamente, involucradas en el movimiento del virus célula a célula. El ORF 2
también contiene un segundo motivo helicasa, mientras que el ORF 5 codifica para la
proteína CP (Dijkstra y Khan, 2006; Verchot-Lubicz et al., 2007). Los NTR de los virus de
este género, juegan un papel importante en la regulación y el movimiento del virus a través
de las células de su hospedero. El 5‟NTR está implicado en la regulación de la síntesis del
ARNg, ARNsg, la encapsidación del virus y el transporte del virus por los plasmodesmos.
Por su parte, el 3‟NTR está involucrado en la síntesis, tanto de la cadena positiva del ARN
como de la negativa (Verchot-Lubicz et al., 2007).
43
Dentro del género Potexvirus se han descrito 35 especies (ICTV, 2010). Estos virus se
transmiten fundamentalmente de forma mecánica, aunque algunas especies se transmiten
por semilla, como es el caso de WClMV (White clover mosaic virus) (Astier et al., 2007).
Figura 4. Representación del genoma de un Potexvirus. a. En las cajas se indican los ORF. En la parte
inferior se ilustra la formación de los ARNsg, que dan origen a las proteínas de movimiento (TGB) y CP. b.
Representación del virión de un Potexvirus. Fuente: http://www.expasy.org/viralzone/all_by_species/272.html
Potato virus X (PVX)
El virus PVX se caracteriza por tener una longitud de 470 a 580 nm y un diámetro de 13
nm con simetría helicoidal (ICTV, 2000), un genoma de 6,435 kb de ARN con sentido
positivo (PVX raza Tula, accesión del GenBank N° EU021215.1) contenidos en una varilla
flexuosa (monopartita) (Huisman et al., 1988); posee una caperuza hacia el extremo 5‟ al
igual que una región 5‟NTR compuesta por 84 nt, cinco ORF y una secuencia 3‟NTR de 72
44
nucleotidos (nt) (Skryabin et al., 1988). El virión tiene un canal axial central de cerca de 3
nm de diámetro. La densidad en gradiente de CsCl es de 1,31 g/cm3. La cápside del virus
está compuesta por alrededor 1.000 a 1.500 subunidades de la proteína CP, que en algunos
aislamientos de PVX es glicosilada (ICTV, 2000). Su PI corresponde a un pH de 4,4, con
un TIP de 68-76°C, LIV de 40-60 días y un DEX de 5 a 6. Las proteínas constituyen un
94% del peso de la partícula y su virión sólo tienen una proteína estructural (CP) (BüchenOsmond, 2010).
En la región 5‟NTR, el virus posee un motivo repetitivo de ACCA muy conservado entre
aislamientos de PVX, pero no siempre presente en todas las especies del género Potexvirus;
por ejemplo Potato aucuba mosaic virus no cuenta con dicho motivo. Esta región 5‟NTR,
interactúa con regiones complementarias a lo largo del genoma que funcionan como
promotores de la transcripción de los ARNsg y presentan estructuras secundarias del tipo
tallo-asa (SL) que participan en la regulación de la síntesis del ARN (Vechot-Lubicz et al.,
2007). Mutaciones dirigidas a esta secuencia repetida (ACCA), han mostrado que las
repeticiones localizadas entre los nt 9 a 13 son indispensables para la acumulación del
ARNg y además afectan la replicación viral (Morozov et al., 1991; Verchot et al., 1998;
Park et al., 2008).
El virus se puede transmitir por inoculación mecánica y de manera natural por contacto
entre plantas, pero no por polen o semilla. Las especies susceptibles al virus se encuentran
en las familias Amaranthaceae, Cruciferaceae y Solanaceae, siendo Brassica campestris
ssp. rapa, Datura stramonium, Gomphrena globosa, Nicotiana tabacum y Solanum
tuberosum, especies comúnmente utilizadas para su estudio. Los síntomas en papa varían
dependiendo de su interacción con otros virus, pudiendo originar mosaicos, moteados,
45
manchas anulares y necrosis, mientras que en Datura stramonium y N. tabacum,
corresponden a anillos cloróticos sistémicos seguidos de moteados y anillos cloróticos o
moteados, respectivamente (Büchen-Osmond, 2010).
3.3.4. Familia Betaflexiviridae
La familia Betaflexivirida al igual que Alphaflexiviridae, pertenecen al orden Tymovirales.
La familia está integrada por los géneros Capillovirus (2 especies), Carlavirus (43
especies), Citrivirus (1 especie), Foveavirus (4 especies), Trichovirus (5 especies), Vitivirus
(6 especies), además de seis especies sin un género asignado: African oil palm ringspot
virus (AOPRV), Banana mild mosaic virus (BanMMV), Cherry green ring mottle virus
(CGRMV), Cherry necrotic rusty mottle virus (CNRMV), Potato virus T (PVT) y
Sugarcane striate mosaic-associated virus (SCSMaV), sumando un total de 67 especies en
la familia. Los virus de este grupo se caracterizan por poseer viriones filamentosos
flexuosos de 600 a 1000 nm de longitud y de 12 a 13 nm de ancho. Poseen genomas de
tamaños que oscilan entre 6.5 a 9 kb de ARN de sentido positivo, cuyo extremo 5‟ posee
una caperuza de Metilguanosin y su extremo 3‟ tiene una cola poly-A. Otra característica
determinante de la familia, es que su RdRp es de tipo carlavirus y con tamaños que varían
de 150 a 250 kDa, posee una o varias proteínas de movimiento (TGB en Carlavirus y
Foveavirus y 30K en los demás géneros), la CP posee tamaños variables, de acuerdo al
género, de 22 a 44 kDa. Se denominó Beta, debido a que es la segunda familia creada de la
división de la antigua familia Flexiviridae (Adams y Kreuze, 2008b; ICTV, 2010,
ViralZone, 2010; DPVweb, 2010)
46
Género Carlavirus
El virus tipo del género es el Carnation latent virus (CLV). Los 43 virus del género poseen
partículas flexuosas de 470 a 1000 nm, con diámetros de 12 a 15 nm con simetría
helicoidal. Los viriones tienen coeficientes de sedimentación entre 147 a 176S y densidades
de flotación de 1,31 a 1,33 g/cm3 en CsCl (Dijkstra y Khan, 2006, ViralZone, 2010). Sus
genomas son de ARN de cadena sencilla de sentido positivo con tamaños de 5.8 a 9 kb;
hacia el extremo 5‟ presentan una caperuza y hacia el extremo 3‟ tienen una cola poly-A
(ViralZone, 2010). La TIP se encuentra entre 55 a 85°C, dependiendo de la especie del
virus. Poseen 6 ORF: El ORF 1, representa alrededor del 70% del genoma y su proteína
presenta tres dominios: hacia el N-terminal de metil-transferasa, un dominio con motivos
de helicasa en la parte central y el motivo de polimerasa hacia el extremo C-terminal. Esta
proteína es autocatalítica. Los ORF 2, 3 y 4 forman el TGB involucrado en el movimiento
de la partícula viral, además la proteína 2 posee un motivo helicasa y las proteínas 3 y 4
poseen regiones posiblemente transmembranales muy hidrofóbicas. Estas proteínas se
expresan mediante ARNsg (Figura 5). El ARNsg que se genera de los ORF 5 y 6 da origen
a las proteínas CP y CRP; ésta última permite la unión del ARN a la cápside. Cabe destacar
que la polimerasa de estos virus guarda homología con la polimerasa de los Potexvirus,
Closterovirus y Tymovirus (Foster, 1992; Zavriev et al., 1991).
La transmisión de los virus se da por inoculación mecánica ó por áfidos de forma no
persistente. Algunas especies son transmitidas por Bemisia tabaci (Cowpea mild mottle
virus, CPMMV) o a través de semilla. Los síntomas característicos de los carlavirus se
enmarcan entre infecciones latentes (CLV), mosaicos (Poplar mosaic virus, PopMV),
47
necrosis (Pea streak virus, PeSV) y ocasionalmente causan pérdidas significativas en los
cultivos (Potato virus M, PVM y Potato virus S, PVS) (Astier et al., 2007).
Figura 5. Representación del genoma de los Carlavirus. a. En los cuadros se muestran las proteínas
originadas a partir de cada región del genoma. Se observan los dos ARNsg producidos y las proteínas que
estos
codifican.
b.
Representación
del
virión
de
un
Carlavirus.
Fuente:
http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species/268.html
Potato virus S (PVS)
El virus PVS se caracteriza por poseer un genoma de 8464 nt (PVS aisalmiento Vltava,
accesión del Genbank N° AJ863510). Sus partículas poseen una longitud de 650 nm y un
diámetro de 12 nm (Mackenzie et al., 1989). El ORF 1 característico del género codifica
para la proteína de replicación, con motivos de metiltransferasa (MTR), helicasa (Hel) y
RdRp hacia el extremo 5‟. Produce dos ARNsg hacia el extremo 3‟ del genoma, con
48
tamaños de 2,5 y 1,5 kb, los cuales están incluidos en los filamentos flexuosos de las
partículas del virus. El más pequeño de estos ARNsg codifica para la CP y el segundo para
la proteína de 11 kDa. Se ha encontrado una variabilidad moderada en el virus, que se basa
principalmente en diferencias en las secuencias de los genes CP y CRP. La transmisión del
virus se da mediante áfidos de forma no persistente, e infecta plantas de las familias
Solanaceae y Chenopodiaceae, principalmente (Matousek et al., 2000; Matousek et al.,
2004).
Con base en la infección sistémica y no sistémica en Chenopodium spp., se pueden
reconocer dos razas del virus: PVSA (PVS Andino) y PVSO (PVS Ordinario),
respectivamente. Las homologías entre ambas razas para las secuencias que codifican CP y
la proteína de 11 kDa son de 93% y 79%, respectivamente. En estas proteínas también se
encuentra el mayor número de aminoácidos que difiere entre ambas razas, diferencias que
sugieren los diferentes tipos de transmisión y sintomatologías que inducen (Foster y Mills,
1992). Así por ejemplo, PVSO no causa sintomatología en la mayoría de cultivares de papa
de Europa, pero ocasionalmente produce leves rugosidades en las hojas; mientras que PVSA
induce fuertes síntomas, que incluyen senescencia prematura y pérdida de hojas
especialmente en plantas con infección secundaria, ocasionando pérdidas superiores al 20%
cuando se encuentra asociado a PVX (Jeffries, 1998). La transmisión de PVSO se da
principalmente por contacto más que por áfidos, mientras que PVS A se concentra más en el
tejido y es eficientemente transmitido por áfidos como M. persicae. El virus también puede
ser transmitido a partir de tubérculos infectados e incluso por plantas in vitro (EPPO,
2009).
49
3.3.5. Familia Luteoviridae.
La familia Luteoviridae se deriva del género Luteovirus y se divide de acuerdo al origen
filogenético del gen de la polimerasa y a las propiedades biológicas, en tres géneros:
Enamovirus (1 especie), Luteovirus (6 especies) y Polerovirus (13 especies), además de
ocho especies sin género asignado: Barley yellow dwarf virus-GPV (BYDV-GPV), Barley
yellow dwarf virus-RMV (BYDV-RMV), Barley yellow dwarf virus-SGV (BYDV-SGV),
Chickpea stunt disease associated virus (CpSDaV), Groundnut rosette assistor virus
(GRAV), Indonesian soybean dwarf virus (ISDV), Sweet potato leaf speckling virus
(SPLSV) y Tobacco necrotic dwarf virus (TNDV), lo que suma 28 especies en la familia.
Los viriones son partículas isométricas de 25 a 30 nm de diámetro, los cuales están
compuestos por dos proteínas de cápside con alrededor de 180 copias. Poseen un genoma
de ARN de cadena sencilla con sentido positivo de un tamaño de 5,6 a 6 kb. Los ORF están
agrupados en bloques separados por regiones no codificantes de 100 a 200 nt. La expresión
de los genes comprende las estrategias supresión de codón de parada (readthrough), cambio
en el marco de lectura (frameshift), ARNsg y transactivación de traducción localizada en el
extremo 3‟ (Taliansky et al., 2003; Astier et al., 2007; Dijkstra y Khan, 2006; ViralZone,
2010).
Género Polerovirus.
Los polerovirus se caracterizan por presentar cápside no envuelta con simetría icosahédrica
con diámetro de alrededor de 23 nm (ViralZone, 2010). Los viriones poseen coeficientes de
flotación en CsCl de 1,38 a 1,42 g/cm3, con densidades de 1.34 g/cm3 en Cs2SO4. El
50
coeficiente de sedimentación es de 115S, el TIP es de 70 a 80°C y el DEX se encuentra
alrededor de 4, aunque éste depende del hospedero. Los genomas comprenden tamaños de
5880 a 5990 nt de longitud.
Los virus de este género son transmitidos por vectores generalmente del orden Hemiptera y
la familia Aphididae, así como mediante injertos, pero no por semilla, por inoculación
mecánica, ni a través del polen (Büchen-Osmond, 2010).
El género Polerovirus, presenta al menos siete ORF (Figura 6). El ORF 0 codifica para una
proteína de 29 kDa, que es indispensable para la acumulación del virus. El ORF 1 tiene un
motivo de proteinasa y se cree que de éste se deriva la proteína VPg. El ORF 2 codifica
para la polimerasa a partir de un mecanismo de cambio en el marco de lectura -1
(Ribosomal frameshift). El ORF 3 codifica para la proteína de la cápside viral, y se fusiona
con el ORF 5 mediante supresión del codón de finalización (Ribosomal readthrough),
dando origen a una proteína que parece estar involucrada en la transmisión por áfidos, al
conferir estabilidad a la partícula viral en la hemolinfa del insecto. El ORF 4 está
involucrado con el movimiento del virus en la planta, y se deriva del ORF 3 (Astier et al.,
2007; Dijkstra y Khan, 2006). Las únicas proteínas traducidas directamente del ARNg, son
ORF0 que genera a P0, la poliproteína del ORF1 (P1) y la polimerasa (ORF1-2) que se
origina, cómo se indicó anteriormente, como una fusión por cambio en el marco de lectura
cerca del final del ORF1. La proteína Rap1 se produce por la omisión del primer codón de
inicio (Leaky Scanning) por parte del ribosoma e inicia ésta en un inusual IRES (sitio
interno de entrada del ribosoma) (Figura 6). El resto de los ORF de los polerovirus se
traducen a partir de ARNsg (ViralZone, 2010).
51
Figura 6. Representación del genoma de los Polerovirus. a. Las cajas indican los ORF y debajo de ellas se
muestran las diferentes estrategias para la expresión de las proteínas. b. Representación del virion de un
Polerovirus. Fuente: http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species/610.html.
Potato leafroll virus (PLRV)
El PLRV corresponde a una partícula isométrica que posee un genoma completo de 5865 nt
de ARN de sentido positivo (PLRV raza Zim13, accesión del GenBank N° AF453388), en
52
cuyo extremo 5‟ se encuentra asociado a una VPg (Taliansky et al., 2003). Su cápside tiene
una simetría icosahédrica con diámetro de 24 nm (Peters, 1967; Takanami y Kubo, 1979).
El virión posee una densidad de flotación en CsCl de 1,39 g/cm3, el TIP es de 70.8°C, la
LIV es de 5-10 días y el DEX es de alrededor de 4. Las proteínas representan el 70% del
peso del virión (Büchen-Osmond, 2010).
El virus tiene divido su genoma en ocho ORF densamente empaquetados, con el ORF 1
solapando el ORF 0 y el ORF3 traslapado con el ORF 4 (Mayo y Miller, 1999). El virus
emplea diferentes estrategias para la modulación de su ARN; así los tres primeros ORF
proximales a 5‟ (0 al 2), son expresados a partir del ARNg, y los ORF proximales al
extremo 3‟ (3 al 7), son expresados a partir de ARNsg, lo que hace que el virus sea muy
versátil y económico en el uso de secuencias codificadoras (Taliansky et al., 2003). El ORF
0 esta involucrado en el desarrollo de la sintomatología y se cree que es un supresor del
silenciamiento de genes en sus hospedantes, P1 tiene funciones de proteinasas y contiene la
secuencia que codifica para VPg y posiblemente para una helicasa; el ORF 2 codifica para
RdRP mientras que el ORF 3 lo hace para la CP de 23 kDa. El ORF 4 codifica para una
proteína de movimiento y la fusión de los ORF 3 y 5 genera una proteína estructural menor
de 80 kDa, que se cree participa en la transmisión del virus por áfidos. Los ORF 6 y 7 han
sido descritos recientemente y aunque sus funciones son desconocidas, se especula que P7
tiene propiedades de unión a ácidos nucleicos (Taliansky et al., 2003).
Los aislamientos difieren muy poco unos de otros en sus secuencias. Esto se demostró en
un estudio en el que se usaron 12 secuencias completas de aislamientos del virus y las
identidades fueron del 94 al 98% sobre todos los ORF. Sin embargo, en el mismo estudio
con 19 aislamientos de PLRV que representaban cepas de diferentes continentes, se
53
encontró que comparando las secuencias de los ORF 0 y 5 y parte del 1, era posible dividir
a la especie en tres grupos: aislamientos Australianos, aislamientos Peruanos e Ingleses y
un tercer grupo con aislamientos de Australia, Cuba y algunos europeos. Lo anterior
conduce a plantear dos hipótesis sobre el origen de esta especie: que divergió recientemente
de un ancestro viral como resultado de su adaptación a papa o que es una especie con
fuertes restricciones de selección. En cualquier caso, la estrecha base genética de los
cultivares de papa, puede ser un factor que restrinja la variación de este virus (Guyader y
Ducray, 2002). El virus más relacionado con PLRV en la secuencia de CP es el virus
suramericano SPLSV (Sweet potato leaf speckling virus), el cual guarda una identidad del
70%, mientras que con otros Polerovirus, este valor no supera el 65% de identidad (Fuentes
et al., 1996).
PLRV es transmitido por áfidos de manera persistente no propagativa, multiplicándose en
el floema del huésped (Taliansky et al., 2003). El insecto más eficiente para su transmisión
es M. persicae; sin embargo, Macrosiphum euphorbiae se constituye en un buen vector del
virus, aunque menos eficiente, sobre todo para aislamientos australianos. Las familias
taxonómicas Amaranthaceae, Cruciferaceae, Portulacaceae y Solanaceae, contienen las
especies que bajo condiciones experimentales presentan mayor susceptibilidad al virus,
destacándose Amaranthus caudatus, Capsella bursa-pastoris, Celosia argentea, Datura
stramonium, Gomphrena globosa, Lycopersicon esculentum, Montia perfoliata, Nicotiana
clevelandii, Physalis floridana, Solanum tuberosum, Solanum tuberosum ssp. andigena,
Solanum tuberosum ssp. tuberosum.
Los síntomas principales que ocasiona este virus en papa corresponden a enanismos y
enrollamiento de hojas, acompañados de una grave reducción en el rendimiento. En plantas
54
indicadoras como Datura stramonium, se pueden observar amarillamientos sistémicos entre
venas y en Physalis floridiana se presenta clorosis sistémica entre venas y enrollamiento de
hojas (Büchen-Osmond, 2010).
3.3.6. Familia Closteroviridae
La familia Closteroviridae deriva su nombre del género Closterovirus (9 especies) y se
compone, además del ya mencionado, de los géneros Ampelovirus (8 especies), Crinivirus
(12 especies) y la especie sin género asignado Mint vein banding-associated virus
(MVBV), sumando así 30 especies para la familia. Esta clasificación es basada
principalmente en el modo de transmisión y en las características del ARNg. Los miembros
de la familia poseen viriones flexuosos con una longitud de 650 a 900 nm, ó 1200 a 2200
nm y un diámetro de 10-13 nm. Su genoma posee un rango de tamaños entre 15 y 20 kb
(Karasev, 2000; Martelli et al., 2002). Hacia el extremo 3‟, posee una terminación en
estructura de horquilla (hairpin) y hacia el extremo 5‟ probablemente posee una caperuza
de nucleótidos metilada. Los viriones poseen un coeficiente de sedimentación entre 96 y
140S y densidades de flotación en CsCl de 1,30 a 1,34 g/cm3. Otra característica particular
de la familia es la presencia de genes que codifican para proteínas homólogas a las
proteínas celulares de choque térmico 70 (HSP: heat shock proteins) y para una CP análoga
o adicional, la cual conforma la cola del virión (Dijkstra y Khan, 2006; Astier et al., 2007;
Büchen-Osmond, 2010; ViralZone, 2010).
Los virus de esta familia son generalmente transmitidos por vectores Homópteros de forma
no persistente (Karasev, 2000; Martelli et al., 2002). Ampelovirus y Closterovirus poseen
55
genomas monopartitas, mientras que en el caso de los Crinivirus, se pueden presentar
genomas bipartitas ó tripartitas (Livieratos et al., 2004).
Género Crinivirus
Los virus de este género poseen partículas de 650 a 850 nm y 700 a 900 nm de longitud,
con un diámetro de 12 nm. Su genoma esta segmentado en dos ARN generalmente (Figura
7) (caso especial PYVV con 3 ARN), con tamaños de 8,1 y 7,2 kb, respectivamente. Sus
ARNg son encapsidados independientemente. El ARN 1 lleva el módulo de replicación,
con los ORF 1a, 1b y 2. Los dos primeros están involucrados en la codificación para
proteínas de replicación, incluyendo la RdRp y el tercero (ORF 2), codifica para una
proteína de 31 kDa con función desconocida. El ORF 1b se produce por un cambio en el
marco de lectura +1, que contiene el motivo RdRp (Hull, 2002). El ARN 2, tiene siete
ORFs, correspondiendo el ORF 6 a la proteína CPm (Cápside menor) y el ORF 5 a CP. El
ORF 2 codifica para una proteína HSP70h, esencial para el ensamblaje del virión y su
movimiento entre células (Figura 7) (Aguilar et al., 2003; Hartono et al., 2003).
Los virus se pueden encontrar en células del floema y su transmisión ocurre por insectos de
la familia Alleyrodidae de forma no persistente; no pudiendo ser transmitidos de manera
mecánica. Los síntomas ocasionados por los virus del género corresponden a
amarillamientos de nervaduras en hojas viejas generalmente, y algunas veces pueden
inducir necrosis. Estos virus pueden causar epidemias severas en los cultivos susceptibles
relacionadas con el incremento de su vector en el campo (Astier et al., 2007).
56
Figura 7. Representación del genoma de un Crinivirus. a. Las cajas indican lo ORF y en la parte inferior de
éstas, las estrategias de traducción. b. Representación del virión de un Crinivirus. Fuente:
http://www.expasy.org/viralzone/all_by_species/287.html.
Potato yellow vein virus (PYVV)
La enfermedad causada por el virus PYVV se reportó por primera vez en cultivos de papa
en Antioquia (Colombia) en el año de 1943 (Alba, 1950). El virus se caracteriza por poseer
un genoma tripartita y al menos cinco especies de ARNdc (ARN de doble cadena),
denominados ARNdc 1, ARNdc 2, ARNdc 3, x y y. Presenta en su extremo 5‟ una caperuza
y una estructura de pseudo-nudo hacia el extremo 3‟. El ARN 1 (8035 nt, accesión del
GenBank N° AJ557128.1) posee 3 ORF: ORF 1a y 1b los cuales contienen los dominios
conservados L-Pro, MTR, Hel y RdRp (Figura 8) y la pequeña proteína hidrofóbica p7
(Livieratos et al., 2004). RdRp se produce por el cambio en el marco de lectura +1, como
57
ha sido demostrado para el género Closterovirus (Agranovsky et al., 1994). El ORF 2
produce una pequeña proteína hidrofóbica que contiene putativamente una hélice
transmembranal. Esta proteína varia en su ubicación en los crinivirus (Livieratos et al.,
2004).
El ARN 2 (5339 nt, accesión del GenBank N° AJ557129) tiene cinco ORF potenciales:
Hsp70h, p7, p60, p10 y CP. En su orden, la primera proteína es homóloga a la familia de
chaperonas Hsp70 y está estrechamente relacionada con las Hsp70 de otros closterovirus y
crinivirus. La proteína se asocia a las partículas virales y es indispensable para el correcto
ensamblaje del virión y del movimiento del virus, como se ha visto en Beet yellow virus
(BYV, Closterovirus) (Alzhanova et al., 2001) y Citrus tristeza virus (CTV, Closterovirus)
(Satyanarayana et al., 2000). La proteína del ORF 2 es muy conservada entre los virus de la
familia Closteroviridae, aunque en posiciones diferentes del genoma; sin embargo, aún no
se conoce su función (Livieratos et al., 2004). El ORF 3 codifica para una proteína p60
homóloga para otros Closterovirus y Crinivirus (Karasev, 2000), que en el virus BYV
corresponde a la proteína p64, cuarto componente integral del virión, junto con CP, CPm y
Hsp70h (Napuli et al., 2003). El ORF 4 (proteína p10) codifica para una proteína que no
posee similitud con ninguna otra en las bases de datos, ni siquiera estableciendo
alineamientos de la secuencias con otros Crinivirus en ubicaciones similares del genoma
(Karasev, 2000). Por último el ORF 5 codifica para la proteína putativa CP, que en
homología y tamaño es muy similar a las de otros Crinivirus; además posee una región
consenso de aminoácidos conservados que se encuentra en las CP de muchos virus
flexuosos (Alzhanova et al., 2001).
58
El ARN 3 (3892 nt, accesión del GenBank N° AJ508757) posee tres ORF potenciales: p4,
CPm y p26. La primera proteína no posee su contraparte en los otros genomas descritos de
la familia Closteroviridae, ni homología con ninguna otra secuencia en las bases de datos.
El ORF 2 codifica para una proteína putativa denominada CPm por su homología con la CP
menor de otros closterovirus (Livieratos et al., 2002). El ORF 3 codifica para una proteína
con posición similar y tamaño a la descrita para el ARN 2 de Lettuce infectious yellows
virus (LIYV, Crinivirus) (Klaassen et al., 1995; Büchen-Osmond, 2010), el ARN 2 de
Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV, Crinivirus) (Aguilar et al., 2003), el
ARN 2 de Sweet potato clorotic stunt virus (SPCSV, Crinivirus) (Kreuze et al., 2002) y el
ARN 1 de CuYV (Hartono et al., 2003). Parece ser única para el género Crinivirus; sin
embargo, p26 guarda una limitada identidad con sus contrapartes del género (máximo de
36% con p26 de CuYV) y no presenta homología con otras secuencias en las bases de
datos. Es de destacar que los tres ARN presentes en el virus poseen UTRs (regiones que no
se traducen) con secuencias diferentes cada uno (Livieratos et al., 2004).
El virus presenta una baja variación genética entre los aislamientos de Perú y Colombia,
siendo éstas las regiones de referencia debido a que sus cultivos son los más afectadas por
la enfermedad (Offei et al., 2004). Igualmente, se ha reportado que puede ocasionar
pérdidas de hasta el 50% en los cultivos de papa de dichos países (Salazar et al., 2000). Sus
síntomas característicos corresponden a amarillamientos de las venas secundarias
acompañados de un color amarillo intenso en la lámina foliar. Sin embargo, las nervaduras
pueden recuperar el color verde hasta que la planta muere. Mediante infecciones dirigidas
en diferentes solanáceas, se ha encontrado que además de papa, puede infectar el tomate y
59
algunas plantas arvenses como Polygonum sp., Tagetes sp. y Catharanthus roseus (Salazar
et al., 2000; Arciniegas, 2003; Morales et al., 2004).
Figura 8. Representación esquemática de la organización del genoma del PYVV. Las líneas oscuras
representan el ARNg, las cajas representan las proteínas originadas con su respectivo nombre y los ORFs de
cada proteína se indican en la parte superior o inferior. La flecha indica el sitio de corte de una proteína
autocatalítica. Fuente: Livieratos et al, (2004).
3.4. Métodos de diagnóstico en virología vegetal
En la mayoría de los estudios de virus de plantas, es esencial poder establecer un
diagnóstico acertado, esto implica tener las herramientas para reconocer la enfermedad e
identificar de manera precisa el (los) virus que la causa(n). Por tal razón, es necesario
establecer técnicas de diagnóstico altamente eficientes, rápidas y económicas para el
estudio de la epidemiología de la enfermedad viral, evaluar la eficiencia de los métodos de
manejo ó para garantizar que las plantas y las semillas están libres de virus (Astier et al.,
2007). A continuación se describen brevemente los principales métodos empleados para el
diagnóstico de virus en plantas.
60
3.4.1 Métodos Biológicos
Cuando los virus infectan las plantas, pueden o no inducir síntomas. Si los síntomas son
producidos en las plantas infectadas, éstos pueden tener un valor en el diagnóstico (Salazar,
1995). Los síntomas principales asociados a enfermedades virales incluyen cambios en la
pigmentación normal de las plantas (mosaicos, amarillamientos, grabados), cambios en el
crecimiento (enanismos), necrosis de tejidos (para algunos virus), deformaciones y
reducción en el rendimiento. Las observaciones de la planta en su conjunto y el contexto en
que ocurren dicho cambios y su análisis, constituyen los primeros pasos para el diagnóstico
de virus (Astier et al., 2007).
La sintomatología es la fuente primaria en la descripción de las enfermedades virales. El
nombre de la especie de virus es principalmente tomado sobre la base del síntoma que
causa en la planta en la cual fue identificado por primera vez (Astier et al., 2007). Sin
embargo, la sintomatología se constituye en el método más insensible de diagnóstico, por
cuanto solo la experiencia puede indicar cuándo es conveniente usarla (Salazar, 1995).
Entre los síntomas más comunes se presentan:
Mosaicos: Es una distribución anormal de los pigmentos de clorofila en las hojas,
frecuentemente asociada con la estructura de los cloroplastos. Resulta en la yuxtaposición
de varios tonos de color en la superficie de la hoja.
Variegación: Típico en flores, donde hay una ausencia de antocianinas vacuolares que
generan visos blancos o una acumulación de estos pigmentos que originan tonos rojizos
oscuros.
61
Amarillamientos: Es característico de infecciones virales en las cuales la partícula se
multiplica en los tejidos vasculares. La acumulación de virus en el floema impide el flujo
normal de savia, lo que crea un estado de deficiencia que causa atrofia de raíces y
enanismo.
Necrosis: Los puntos necróticos y la coloración café ocurren por la muerte de las células
infectadas. Algunas necrosis pueden inducir a la muerte de la planta. La necrosis también se
puede observar en frutos o tubérculos como es el caso de PVY-NTN.
Reducción en el crecimiento y deformación: La multiplicación del virus está acompañada
de alteraciones metabólicas que producen generalmente reducción en el vigor de las plantas
infectadas y reducción en su desarrollo. El enanismo es un síntoma característico de
enfermedades virales que se acompaña de hojas pequeñas y acortamiento de entrenudos, así
como también de la reducción en cantidad y tamaño de flores, frutos y semillas (Astier et
al., 2007).
Los síntomas anteriormente descritos, van acompañados a su vez de disminuciones en los
rendimientos de los cultivos.
Algunos virus no llevan a la expresión de síntomas en su planta hospedera, no parecen
causar detrimento de ésta o pasan desapercibidos en el material de propagación. En
ocasiones estos virus tienen un fuerte sinergismo con otros, intensificando su efecto como
es el caso de Lily symptomless virus (LSLV, Carlavirus), el cual, en infecciones conjuntas
con CMV causan la enfermedad de las manchas necróticas en Liliáceas.
A nivel celular también se pueden determinar síntomas, siendo en algunos casos útiles para
identificar un género taxonómico particular (ej: Potyvirus, Carlavirus, Comovirus,
Tobamovirus). Esta técnica, sin embargo, requiere cierto nivel de experiencia pero no
62
equipo muy sofisticado. El tipo de tinción empleado para diferenciar los síntomas también
es determinante en la identificación del grupo viral.
Inoculación mecánica.
Se basa en el uso de plantas herbáceas que reaccionan frente a un alto número de virus
diferentes y se constituyen en plantas indicadoras de la presencia de infecciones virales a
partir de inoculaciones mecánicas. Algunas de éstas plantas son: N. benthamiana, N.
clevelandii, Chenopodium quinoa, C. amaranticolor, entre otras.
Las pruebas de inoculación mecánica deben realizarse en plantas jóvenes mantenidas en
ambientes controlados para asegurar la sensibilidad y reproducibilidad de los síntomas.
Usualmente se emplea una solución tampón a base de fosfato para acompañar el extracto
macerado de la planta infectada, que se aplicará en la superficie de las hojas de las plantas
sanas. La inoculación mecánica se da cuando se frota con la savia infectada el tejido sano
con ayuda de algún material, usualmente carborundum® ó celita, que permiten causar
micro-heridas en éste. Las hojas deben lavarse luego de la inoculación con agua y asegurar
que las plantas permanezcan en un ambiente controlado que favorezca la multiplicación del
virus y la expresión de los síntomas en la planta.
Inoculación por vectores.
Algunos virus no pueden ser transmitidos de forma mecánica, como por ejemplo algunos de
los que están restringidos al floema de las plantas como los Luteovirus, Polerovirus,
Nanovirus, entre otros. En este caso, las plantas indicadoras son inoculadas con sus
vectores específicos, previa alimentación de éstos en plantas sintomáticas.
63
Injertos.
Otro tipo de indexación ampliamente usada para la detección de virus o agentes infecciosos
de etiología poco/no conocida, es la injertación. Esta se da principalmente en especies
frutales y se eligen especies leñosas que manifiesten rápidamente los síntomas de la
enfermedad, lo que generalmente ocurre varios meses después.
Hay que destacar que los síntomas expresados en la planta son de dos tipos, localizados o
restringidos a la hoja inoculada y sistémicos. Los primeros hacen referencia a la reacción
fisiológica de la planta al ingreso del virus y en ocasiones al daño ocasionado por la
inoculación, los cuales se presentan pocos días después de esta. En el segundo caso, son
síntomas que se presentan luego que la partícula viral comienza a desplazarse en la planta y
se expresan en tejido diferente al de la inoculación.
El diagnóstico basado únicamente en expresión de síntomas es insuficiente, debido a que
los síntomas no sólo dependen del virus y sus variantes, sino también del genotipo del
hospedero y de las condiciones bióticas y abióticas prevalecientes durante la prueba (Astier
et al., 2007).
3.4.2. Métodos serológicos.
Estos métodos se basan en la interacción de dos tipos de proteínas: antígenos (proteínas de
origen viral) y anticuerpos (proteínas del tipo inmunoglobulinas que reconocen dichos
antígenos y se produce a partir del sistema inmune de los animales). Por mucho tiempo se
han empleado las partículas virales en sí mismas como antígenos, porque son relativamente
fáciles de obtener y purificar.
64
Los anticuerpos son Inmunoglobulinas (Ig), de las cuales las más usadas son IgG, que
representan a su vez las tres cuartas partes de las inmunoglobulinas producidas en los
mamíferos. Existen dos tipos de anticuerpos para el diagnóstico de virus: los anticuerpos
policlonales (pABs) y los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos policlonales son
producidos generalmente en animales como conejos y cabras, mediante la inyección de
proteínas purificadas del virus que inducen la producción por los linfocitos B de un
complejo de anticuerpos que son colectados en el suero sanguíneo del animal. Por su parte,
los anticuerpos monoclonales (mABs), son obtenidos a partir de células cancerosas que se
obtienen por una fusión del mieloma de ratones y células limfocitarias y se multiplican in
vivo en un medio selectivo. A este cultivo se aplica el antígeno, generándose un
sobrenadante con los anticuerpos que reconocen un epítope particular de la proteína viral,
por lo que este tipo de anticuerpos es mucho más específico que los policlonales (Astier et
al., 2007; Shcherbakova, 2007).
ELISA (Enzyme-linked immuno-sorbent assay)
Esta técnica se basa en la unión o marcaje de las inmunoglobulinas con enzimas que
generan una reacción de color al degradar un sustrato. El conjugado con fosfatasa alcalina
es el más comúnmente empleado. La prueba de ELISA puede ser directa o indirecta,
dependiendo de que tipo de anticuerpo esté asociado a la enzima. En la directa, el antígeno
objetivo es detectado por una enzima conjugada de anticuerpos homólogos (antígeno
específica). En la prueba indirecta, un anticuerpo homólogo al antígeno, pero sin marcar
(ABs1), es el que captura el antígeno objetivo y luego un conjugado de enzima es el que
65
detecta el complejo antígeno-anticuerpo, a partir de un segundo anticuerpo contra ABs1
(Shcherbakova, 2007).
Hay diversidad de protocolos en los que se usan platos de poliestireno como soporte para la
aplicación de las pruebas de ELISA, pero el más común es el formato DAS (double
antibody sandwich), que se basa en poner el antígeno en medio de dos anticuerpos
específicos. La IgG se une fuertemente al poliestireno e interactúa con el antígeno. Para
revelar la reacción se hace uso de la misma IgG pero marcada con la enzima (conjugado),
la cual se fija al antígeno y posteriormente se adiciona el sustrato para que ocurra la
reacción de color. La intensidad del color es medida a una longitud de onda de 405 nm. La
absorbancia puede en ciertos rangos de concentración, ser proporcional al logaritmo de la
concentración (Salazar, 1995; Astier et al., 2007; Shcherbakova, 2007).
Otras variantes de ELISA corresponden al sandwich de ELISA indirecto o TAS-ELISA
(Triple antibody sandwich), que involucra anticuerpos provenientes de dos especies
animales, siendo los anticuerpos que detectan el antígeno objetivo, producidos en una de
estas especies y el anticuerpo del conjugado, producido en la otra especie animal. Una
ventaja de este método es la universalidad del conjugado, ya que puede se empleado para el
análisis de varios antígenos. Otro formato de ELISA es DAC (recubrimiento directo de
antígenos) ó PTA (antígenos atrapados en placa). En este procedimiento, los antígenos son
inmovilizados en una placa, contrario a lo que pasa en el DAS-ELISA. Se usa
preferiblemente para evaluar la respuesta inmune a un antígeno y no tanto para realizar
diagnóstico (Shcherbakova, 2007). Una técnica similar pero realizada en membranas de
nitrocelulosa, es la denominada NCM-ELISA (ELISA en membranas de nitrocelulosa). Se
basa principalmente en fijar el antígeno a la membrana y posteriormente unir los
66
anticuerpos específicos y el conjugado, como en la prueba DAC-ELISA, pero requiere un
paso adicional y es el bloqueo de la membrana luego de fijado el antígeno (Salazar, 1995).
Otros autores describen la técnica como DBIA (dot blot immuno assay) ó dot-ELISA,
pudiéndose
emplear
además
de
membranas
de
nitrocelulosa,
aquellas
de
Polivinilidenofluoruro (PVDF). La técnica de flujo lateral (LFA), es empleada in situ y
consiste en una barra que contiene en su orden superficies con: la región de aplicación de la
muestra, una membrana de nitrocelulosa con pequeñas láminas con los anticuerpos
específicos inmovilizados y la almohadilla absorbente. A medida que el antígeno es
adsorbido por la membrana, éste sube por la barra y se une a los anticuerpos, los cuales se
concentran en las laminillas donde se da la reacción de color. Dos líneas indican una prueba
positiva y una sola línea en la barra indica una prueba negativa o que el antígeno no se
encuentra en la muestra analizada (Shcherbakova, 2007).
Otros métodos de inmunodiagnóstico.
Inmuno-fluorescencia (IFA): actualmente se usan para la prueba anticuerpos monoclonales,
los cuales son marcados con colorantes fluorescentes para producir los conjugados con
moléculas como fluorosceína isotiocianato o rhodamina isotiocianato. En el ensayo directo,
se emplean conjugados con anticuerpos específicos para el antígeno objetivo, en el caso del
ensayo indirecto, como en el TAS-ELISA, el segundo anticuerpo es el que se encuentra
marcado con el colorante fluorescente. El resultado se observa en un microscopio de
fluorescencia, lo que se puede potenciar si se utiliza un software apropiado que cuantifique
las unidades fluorescentes presentes en la placa (Shcherbakova, 2007).
67
Immunobloting: Es denominado también Western bloting. Es un método muy sensible para
la identificación de proteínas y se basa en la combinación de geles de electroforesis y la
interacción antígeno-anticuerpo. El método consta de tres etapas: separación de las
proteínas a analizar en un gel de poliacrilamida desnaturalizante con dodecil sulfato de
sodio (SDS-PAGE), donde pueden ser visualizadas luego de una tinción y comparadas con
las muestras de referencia. La segunda etapa se basa en la transferencia y fijación de las
proteínas a una membrana de nitrocelulosa mediante electroforesis (blotted). Por último, los
pABs o mABs son aplicados a la membrana para realizar la detección mediante reacción
enzimática similar a la descrita en las pruebas de ELISA (Shcherbakova, 2007).
Microscopía electrónica.
La microscopía electrónica permite obtener resultados de diagnóstico a partir de una
evidencia visual mediante la tinción negativa con metales pesados de los tejidos/savia
vegetales (Salazar, 1995). Es frecuente su combinación con métodos inmunológicos
(inmuno-electromicroscopía-IEM) que se constituye en uno de los medios directos más
precisos de identificación de virus. La técnica es simple y rápida y consiste en examinar un
extracto crudo de planta, de manera que los anticuerpos se fijan a los motivos antigénicos
de la cápside viral formando un tipo recubrimiento alrededor de la partícula, que es
fácilmente observable al microscopio electrónico (Salazar, 1995; Astier et al., 2007).
68
3.4.3. Métodos basados en el uso de ácidos nucleicos.
Las técnicas basadas en el uso de ácidos nucleicos han permitido a los investigadores
sobrepasar las desventajas que presentan las técnicas dependientes de la interacción
antígeno-anticuerpo, en particular los problemas asociados a su posible inespecificidad.
Una ventaja de los métodos basados en el uso de ácidos nucleicos es por tanto, la alta
precisión que ofrecen para la detección viral así como su uso simultáneo para la
caracterización genética de los virus bajo estudio e incluso de su interacción con el
hospedero. Estos métodos se dividen básicamente en dos grupos: hibridización con
secuencias de ADN/ARN y aquellos que emplean la metodología de reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) (Shcherbakova, 2007).
Hibridización molecular.
El principio de estas técnicas se basa en la fijación de pequeñas cantidades de extractos de
plantas (Tissue-printing) ó de ácidos nucleicos totales (Dot-blot) en membranas de nylon o
nitrocelulosa, que son reconocidos por sondas marcadas radioactivamente ó por sondas no
isotópicas. El resultado se monitorea por el cambio de coloración que se observa en la
membrana (detección colorimétrica) ó sobre una película de detección (métodos
radioactivos ó quimioluminiscentes) (Astier et al., 2007).
Hibridización Dot-blot: En esta metodología, se parte de una pequeña cantidad de savia de
la muestra a evaluar, a la cual se realiza extracción de ácidos nucleicos procediendo a su
denaturalización a altas temperaturas o por tratamiento con álcali; luego una pequeña
muestra es fijada en la membrana con la ayuda de UV. Los sitios no específicos de
69
reconocimiento en la membrana son bloqueados por incubación en la etapa de
prehibridización, utilizando una solución que contiene una proteína (generalmente
albúmina de suero bovino). Posteriormente, se realiza el proceso de hibridización en la
membrana con una sonda marcada, para luego proceder a lavar y realizar el revelado que
depende del tipo de sonda utilizada (Hull, 2004). Se ha reportado que la técnica puede
detectar hasta 0,5 pg de titulo viral (Khan y Dijkstra, 2006). Considerando que la prueba es
fiable, rápida y fácil de desarrollar, se presenta como una alternativa al uso de la técnica de
ELISA convencional, cuando no se cuentan con anticuerpos específicos para un virus de
interés o cuando los costos de éstos son muy altos (Astier et al., 2007).
Tissue-printing: En este caso, se utiliza una aplicación directa de secciones frescas de tejido
infectado (tallo, hojas o bulbos) en una membrana para visualizar in situ la distribución en
los tejidos de los virus (Makkouk et al., 1993). El procedimiento es rápido, sensible y
simple (no utiliza extracción de virus), es económico por que no requiere de equipo
especializado, además es apropiado para evaluar un alto número de muestras por día
(Webster et al., 2004). Esta técnica permite estudiar aspectos relacionados con la
localización de las partículas virales en los tejidos de las plantas y evaluar su movimiento
entre células y através de los haces vasculares (Más y Pallas, 1995).
Las hibridizaciones son reveladas mediante el marcaje de la prueba con un isotopo
radioactivo (fósforo 32) o un reportero no radioactivo como biotina, acetilaminofluorene
(AAF), fluorovitosina o digoxigenina (Astier et al., 2007).
70
Técnicas basadas en PCR.
Se fundamentan en la amplificación exponencial de una secuencia de ácidos nucleicos que
es flanqueada por un par de cebadores, los cuales son usados por una polimerasa termo
estable de ADN para la formación de las nuevas cadenas. La técnica consta de múltiples
ciclos (usualmente 35 a 40) en los cuales hay desnaturalización de ADN de doble cadena,
anillamiento de los cebadores (oligonucleotidos de 16 a 35 bases), extensión
(polimerización) y nuevamente desnaturalización. Esto permite la detección precisa de una
secuencia viral y posterior secuenciación para caracterizarla con exactitud (Astier et al.,
2007; Shcherbakova, 2007).
En el caso de los virus de ARN es necesario un paso anterior a la PCR, en el cual se pasa el
ARN a su homólogo de ADN, denominado ADN copia (ADNc). Este proceso es realizado
por una enzima transcriptasa reversa de orígen viral.
Los métodos basados en PCR permiten una mayor sensibilidad que las pruebas
mencionadas anteriormente, debido a que una pequeña secuencia es amplificada millones
de veces, posibilitándose su visualización como bandas a través de electroforesis en geles
(Shcherbakova, 2007). Entre las diferentes variaciones que tiene esta técnica se incluyen:
PCR anidada: se fundamenta en el empleo de dos pares de cebadores, los externos que dan
origen a un fragmento que sirve de molde para el segundo par (internos), generando
amplicones altamente específicos. Un ejemplo del uso exitoso de esta técnica en virología,
corresponde a la detección de especies de virus de los géneros Vitivirus y Foveavirus en
plantas de vid (Shcherbakova, 2007; Webster et al., 2004).
PCR-RFLP: En esta técnica se hace uso en conjunto de la metodología RFLP (Restriction
fragment length polymorphism) y PCR, para estudiar las diferencias entre los virus con
71
base en la ausencia/presencia de sitios de restricción en la secuencia de sus genomas. Luego
de la amplificación por PCR, los fragmentos obtenidos son digeridos con una enzima de
restricción y se analiza el patrón de bandas mediante electroforesis. Es un método que
permite diferenciar aislamientos sin los costos que consumen la clonación y la
secuenciación (Webster et al., 2004).
RT-PCR múltiple: Múltiples especies o razas pueden ser detectadas en una sola reacción de
PCR, que combina cebadores específicos para los diferentes virus. La técnica requiere que
los productos de la amplificación posean tamaños diferentes para cada virus y que entre los
cebadores no haya reacciones cruzadas (Webster et al., 2004).
PCR-Inmunocaptura (IC-PCR): Esta metodología combina el reconocimiento del virus con
el uso de anticuerpos específicos y la amplificación por PCR. La reacción antígenoanticuerpo, constituye la primera fase, en la cual se reducen el riesgo de contaminación con
inhibidores presentes en el tejido de la planta, al obtenerse el virus fijado a las placas de
poliestireno. Luego, en condiciones alcalinas y en presencia de un detergente se libera el
ARN ó ADN viral para ser amplificado posteriormente mediante RT-PCR o PCR
convencional (Webseter et al., 2004; Shcherbakova, 2007).
PCR en tiempo real.
Esta metodología permite monitorear la acumulación en tiempo real de los productos de
PCR para cada ciclo durante toda la reacción. La técnica no requiere correr las muestras en
gel de electroforesis ya que la información requerida se obtiene en las gráficas del
monitoreo de la reacción. Es más rápida, específica y sensible que una PCR convencional,
72
además de ser un método cuantitativo al suministrar información de la cantidad de producto
amplificado, previa generación de una curva de calibración (Shcherbakova, 2007).
El equipo para este procedimiento posee instrumentación para la medición de la
fluorescencia generada por la liberación de fluorocromos liberados o incorporados en los
diferentes ciclos de la reacción. Se pueden emplear colorantes como SYBRgreen®, que es
un compuesto que se intercala en el ADN de doble cadena y es la forma de detección más
simple de la técnica; aunque tiene como desventaja el hecho que el colorante se puede
intercalar en amplicones inespecíficos generados durante la reacción (Shcherbakova, 2007).
Otra metodología que evita los problemas de detección inespecífica, consiste en el uso de
sondas Taqman® (25-30 nt), las cuales se unen al interior de la secuencia demarcada por
los cebadores. Posee un marcaje en su extremo 5‟ de un derivado de Fluorosceína
(generalmente 6-FAM) y en el extremo 3‟ un compuesto que absorbe la fluorescencia del
primero, denominado atenuador (quencher) (generalmente TAMRA). La detección se da
cuando la sonda hibridiza en la secuencia de interés (al igual que los cebadores específicos)
y al comenzar la extensión, la acción 5‟-3‟ exonucleasa de la polimerasa degrada la sonda,
liberando el flurocromo que se encuentra hacia el extremo 5‟, siendo posible su detección
por parte del equipo. Otros formatos de la técnica incluyen las denominadas sondas
Scorpion™ ó del tipo Molecular Beacons, en los cuales las sondas forman estructuras
plegadas en forma de asa, que una vez se eleva la temperatura en la reacción son separadas,
produciéndose la fluorescencia y por tanto la detección respectiva (Shcherbakova, 2007).
El uso de PCR en tiempo real viene extendiéndose ampliamente en el campo de la
fitopatología, permitiendo identificar virus y otros patógenos que afectan las plantas. Es un
método de diagnóstico e identificación evaluado en patógenos cuarentenarios como el
73
viroide de la papa (PSTVd) y en virus de gran importancia económica como Tomato
spotted wilt virus (TSWV) y PVY-NTN (Webster et al., 2004; Shcherbakova, 2007).
4. METODOLOGÍA
4.1. Localización
Esta investigación se desarrolló en el Laboratorio de Biología celular y molecular de la
Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Las muestras de plantas de papa fueron
obtenidas en los principales municipios cultivadores de los Departamentos de Antioquia,
Boyacá, Cundinamarca y Nariño (Tabla 1). Las plantas utilizadas para la detección de
PMTV a partir de muestras de suelo infestadas con quistosoros de S. subterranea, fueron
mantenidas en casas malla en el Centro Experimental Paysandú, ubicado en el
corregimiento Santa Elena, municipio de Medellín (bh-MB, 2.550 msnm., temperatura
media 14°C y precipitación promedio anual de 2.000 mm).
Tabla 1. Procedencia de las muestras de papa utilizadas para la detección de virus.
Departamento
Zona
Municipio
La Unión
Oriente
Sonsón
Antioquia
Santuario
Oriente Cercano
Marinilla
Carmen de Viboral
Vereda
N°Lotes
Buena Vista
El Vergel
San Juan
El Cardal
Tasajo
La Honda
El Carmelo
La Ramada
Alto de Mercado
Barbacoa
1
1
1
1
3
1
3
1
1
1
2
74
Continuación Tabla 1
Norte
Cundinamarca
Sta Rosa de Osos
Villapinzón
Villapinzón
Zipaquirá
Zipaquirá
Cota
Occidente
Madrid
Facatativá
Turmequé
TV
Boyacá
Ventaquemada
Tunja
Siachoque
Soracá
Pasto
Pasto
Nariño
Ipiales
Ipiales
El Roble
Santana
Chasques
Joyagua
5
3
3
1
3
1
3
2
2
1
1
2
3
2
1
Siguineque
Chiratá
Juratá
Rosales
Sota
Capellanía
Cormechoque
Jurubita
Quebrada Vieja
Santa Bárbara
1
1
1
1
1
2
3
3
2
1
La Victoria
3
Catambuco
1
Cruz Loma
1
Jongovito
1
Quincha
Bosabita
San Jorge
Alto del Águila
Páramo de Guerrero
Venta Larga
Parcelas
La Variante
Los Árboles
Obonuco
1
Saguarán
1
El Placer Bajo
1
Suras
2
El Chita
1
Giro San Antonio
3
4.2. Evaluación de niveles de incidencia viral en cultivos de papa
Para esta evaluación se realizaron muestreos aleatorios en ocho cultivos de papa de
diferentes variedades ubicados en tres zonas productoras del Departamento de Antioquia
(zona 1: Oriente, zona 2: Oriente cercano, zona 3: Norte Antioqueño), tres zonas en
75
Cundinamarca (zona 4: Zipaquirá, zona 5: Villa Pinzón, zona 6: Occidente), dos zonas en
Boyacá (zona 7: Turmeque-Ventaquemada, zona 8: Tunja) y dos zonas en Nariño (zona 9:
Pasto, zona 10: Ipiales) (Tabla 1). En cada cultivo se realizó un recorrido aleatorio
evaluándose 100 plantas por sintomatología general presumiblemente asociada a virus (AV:
amarillamiento de venas, En: enanismo, EF: enrollamiento foliar, MR: mosaico rugoso, O:
sin síntomas visibles). Estas 100 plantas se dividieron en cuatro grupos de 25, tomándose
dos hojas de las plantas correspondientes a las lecturas 5, 10, 15, 20 y 25 de cada grupo,
para generar una muestra compuesta (bulk) para el análisis serológico. Adicionalmente y
con fines comparativos, de cada zona se tomó una muestra de plantas con cada uno de los
síntomas indicados anteriormente (AV, En, EF, MR), con el fin evaluar la asociación de
dichos síntomas con la presencia de alguno(s) de los virus bajo análisis.
Una vez en el laboratorio, las muestras obtenidas de cada cultivo se evaluaron mediante
pruebas de ELISA con anticuerpos específicos de la compañía Agdia (Indiana, EEUU) para
los virus PVX, Potyvirus, PLRV y PVS. Para la detección del virus PMTV se utilizaron
anticuerpos de la compañía Bioreba (Reinach, Suiza). Las siguientes son las características de
cada uno de las pruebas de ELISA empleadas para esta detección viral:
PLRV: Prueba de DAS-ELISA utilizando anticuerpos policlonales y detección con
anticuerpos policlonales conjugados a la enzima Fosfatasa alkalina.
Grupo de Potyvirus: Prueba de ACP-ELISA utilizando anticuerpos monoclonales
desarrollados por USDA Florist and Nursery Crops Laboratory (Beltsville, Maryland,
USA) y detección con anticuerpo monoclonal conjugado a la enzima Fosfatasa alkalina.
PVX: Prueba de DAS-ELISA utilizando anticuerpos policlonales y detección con
anticuerpos policlonales conjugados a la enzima Fosfatasa alkalina.
76
PMTV: prueba de DAS-ELISA utilizando anticuerpos monoclonales desarrollados por
Scottish Agricultural Science Agency (SASA) y su detección con anticuerpo monoclonal
conjugado a la enzima Fosfatasa alkalina.
PVS: Prueba de DAS-ELISA utilizando anticuerpos policlonales y detección con
anticuerpos policlonales conjugados a la enzima Fosfatasa alkalina.
Para las pruebas de ELISA, se tomaron fracciones de tejido foliar de cada muestra y se
pesaron 100 mg, procediéndose a macerar con el buffer de extracción recomendado para
cada virus en concentración 1X y siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados
colorimétricos fueron cuantificados en un equipo Multiscan (Labsystem, Finlandia),
incluyendo en cada prueba un control positivo (suministrado por el fabricante en forma
liofilizada) y un control negativo (buffer de extracción). Los pozos fueron considerados con
reacción positiva cuando la lectura de absorbancia a 405 nm presentó un valor mínimo del
doble de la lectura obtenida en el control negativo (Matthews, 1993).
Los resultados de niveles de incidencia fueron analizados a través de un modelo lineal
generalizado aleatorio considerando una distribución binomial para la variable incidencia y
utilizando una función de ligamiento logit. Los efectos aleatorios fueron: zona y cultivos de
dentro de zona. Para el análisis estadístico de utilizó el procedimiento GLIMMIX del
programa estadístico SAS versión 9.1.3.
4.3. Detección del PMTV en cultivos afectados por S. subterranea
En cada una de las diez zonas bajo estudio, se ubicó al menos un cultivo afectado por sarna
polvosa, tomándose una muestra de raíces y/o tubérculos sintomáticos, además de una
77
muestra de suelo de 1 kg. Las muestras de tejidos sintomáticos fueron utilizadas para la
detección de PMTV directamente a partir de los quistosoros del patógeno, mediante ELISA
y RT-PCR, como se describe en los otros apartados de la metodología; mientras que la
muestra de suelos fue tamizada para la extracción de quistosoros siguiendo la metodología
de Jaramillo y Botero (2007), en la cual se utiliza un juego de tamices de 250 y 90 μm. Una
vez realizado este procedimiento, se tomaron 5 g del material retenido en el tamiz de 25 μm
(suelo y quistosoros) para realizar su inoculación en macetas con turba de 250 g de
capacidad, en las cuales se transplantaron plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) con
2-3 pares de hojas verdaderas, siguiendo la metodología de Vélez (2007). La concentración
de quistosoros de cada una de las muestras tamizadas fue cuantificada a partir de una
dilución de 100 mg/10 ml de agua mediante un hematocitometro. Tres meses despues de la
siembra se tomaran muestras de hojas y raíces para el diagnóstico de PMTV mediante
pruebas de ELISA y RT-PCR.
4.4. Definición de afinidades filogenéticas de virus asociados a cultivos de papa
mediante RT-PCR y secuenciación
Para el análisis filogenético de los virus PVY, PLRV, PVS, PVX y PYVV se utilizaron
secuencias parciales de la región del genoma que codifica para la cápside viral; mientras
que para PMTV además de esta región, también se realizó el análisis con base en una
porción del gen TGB2.
El ARN molde necesario para la técnica de RT-PCR se obtuvo a partir de extracciones de
ARN total de plantas de papa con los diferentes síntomas virales mediante el kit RNeasy
78
plant mini kit (QIAGEN Inc., California, USA). Para el caso de PMTV, además del análisis
de plantas de papa, también se evaluó tejido foliar de plantas de N. benthamiana
mantenidas en suelos infestados con quistosoros de S. subterranea y directamente de
agallas de raíces y tubérculos con sarna polvosa. Para este procedimiento se maceraron 100
mg de tejido foliar, utilizando 450 μL de buffer RLT (para tejido foliar) o RLC (para raíces
y tubérculos) y 4,5 μl de β-mercaptoetanol, siguiendo las instrucciones del fabricante, pero
con dos centrifugaciones simultáneas en la etapa de lavado del ARN. Al finalizar el
procedimiento, el ARN obtenido fue resuspendido en 40 μl de agua destilada ésteril tratada
con DEPC.
Adicionalmente, ante la dificultad de obtener los amplicones esperados en algunas zonas de
muestreo mediante el procedimiento de extracción de ARN total, se realizó la transcripción
reversa a partir de liberación post-ELISA, siguiendo el procedimiento de inmunocaptura
propuesto por Harju et al. (2005). Brevemente, una vez concluída la prueba de ELISA, se
remueve el sustrato mediante tres lavados de 1 min con PBS-T (PBS suplementado con
0.05% Tween 20) y las partículas virales fueron liberadas con buffer-R (10mM Tris–HCl,
pH 8.0 with 1.0% Triton X-100) bajo incubación a 70°C por 10 min. La solución resultante
se almacenaba a -20°C hasta su uso directo en la RT.
Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos (Two-Steps RT-PCR). Para esto se
utilizaron cebadores específicos (Tabla 2) y/o oligo-dT (para los virus que presentan colas
de poly-A en sus regiones 3‟) en las reacciones de retrotranscripción de un volumen de 20
µl, incluyendo 1,9 µl de agua, 4 µl de buffer RT 5X, 4 µl de MgCl2 25 mM, 2 µl de dNTPs
10 mM, 1 µl de cebador reverso 10 µM, 0,1 µl de inhibidor de RNasa (40U/µl), 2 µl de
enzima M-MuLV Transcriptasa Reversa (20 U/µl )(Fermentas, Lituania) y 5 µl de ARN o
79
alternativamente una dilución 1:5. El programa consistió en 37°C por 60 min, 75°C por 15
min y finalmente las muestras fueron mantenidas a 4°C hasta su uso en el PCR posterior.
Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 µl con 16,2 µl de agua, 2,5 de
buffer de enzima 10X, 1,8 µl de MgCl2 (25 mM), 0,5 µl de dNTPs (10 mM), 0,5 µl de cada
cebador (10 µM) (Tabla 2), 0,2 µl de Taq ADN polimerasa (5 U/µl) (Fermentas) y 2,5 µl de
ADNc, aunque en algunas ocasiones fue necesario preparar diluciones de 1:5 y 1:10 de
ADNc. El programa de PCR consistió en 95°C por 30 s, seguido de 40 ciclos de 95°C por
30s, 52-60°C (Tabla 2) por 45 s, 72°C por 1 min (1 min por cada 1000 pb esperados) y una
extensión final a 72°C por 5 min.
Tabla 2. Cebadores específicos utilizados en la detección por RT-PCR de cada uno de los
virus bajo estudio.
Virus
PVY
PVX
PYVV
Cebador
Secuencia
PVYF
PVYR
PVXF
PVXR
PYVVCPR
5'-ACG TCC AAA ATG AGA ATG CC-3'
5'-TGG TGT TCG TGA TGT GAC CT-3'
5'-TAG CAC AAC ACA GGC CAC AG-3'
5'-GGC AGC ATT CAT TTC AGC TTC-3'
5´-ATG GAA ATC CGA TCG TGG AAC
CT-3´
5´-CTA CTC AAT AGA TCC TGC TA-3´
PVSCPF
5'-CTA GRC AAT TGC GAG CTC AC-3'
PYVVCPF
PVS
PLRVF
5'-ATG ATC GAG TCC AAG GGC ACT G 3'
5' -CGC GCT AAC AGA GTT CAG CC-3'
PLRVR
5'-GCA ATG GGG GTC CAA CTC AT-3'
C819
5‟-CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA
CC-3‟
H360
5‟–CAT GAA GGC TGC CGT GAG GAA
GT-3‟
PVSR
PLRV
PMTV
Tamaño
T°
amplicón annealing
Referencia
480 pb
53°C
Nie y Singh, 2001
562 pb
57ºC
Nie y Singh, 2001
758 pb
55°C
Livieratos et al.,
2002
1288 pb
53°C
Chikh Ali et al.,
2008
Nie y Singh,2001
336 pb
54ºC
Singh et al., 1995
460 pb
56°C
MacKenzie, 1996
80
PMTVF4
5‟ CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG-3‟
PMTVR4
5‟ AGC CAC TAA CAA AAC ATACTGC-3‟
417 pb
56°C
Xu et al., 2004
Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1,5%
suplementado con 4 μL de bromuro de etidio (10 mg/ml), visualizados utilizando un
transiluminador UV (Biometra, Göttingen, Alemania) y su tamaño verificado por
comparación con el marcador de peso molecular Generuler 100 pb DNA ladder
(Fermentas). Los amplicones del tamaño esperado para cada uno de los virus bajo análisis,
fueron purificados directamente del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen),
para proceder a su secuenciación en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores del
RT-PCR en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied Biosystems) de la compañía
Macrogen (Corea del Sur).
Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit
6.0.6 y Chromas 1.45, construyéndose secuencias consenso y confirmándose su identidad
con genes virales por comparación con las bases de datos moleculares, mediante el
programa
nucleotide
BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi).
Esta
información sirvió de base para realizar el análisis de las relaciones filogenéticas de las
cepas virales encontradas y aquellas de otras regiones del mundo, cuyas secuencias están
reportadas en las bases de datos moleculares. Para esto se alinearon las secuencias mediante
el software Clustal W y la matriz generada fue utilizada para obtener un árbol filogenético
basado en Máxima Parsimonia utilizando la opción Heuristic search del programa PAUP
4.0b, asumiendo los espacios (gaps) como nucleótidos eliminados (missing value) y la
orden tree-bisection reconnection (TBR) (Swofford, 1998). El soporte de la topología
81
interna de los dendrogramas fue determinado por análisis de bootstrap con 1000
remuestreos (Felsenstein, 1985).
4.5 Secuencias parciales de los genomas virales
Con el fin de obtener un mayor nivel de información sobre las características de los
genomas de los virus bajo estudio, adicionalmente se evaluaron múltiples cebadores
dirigidos a otras regiones del genoma, diferentes a las utilizadas en el análisis filogenético
(Tabla 3). Para esto se siguieron los procedimientos de extracción de ARN, RT-PCR y
secuenciación descritos anteriormente, pero utilizando un menor número de aislamientos.
Para realizar el ensamblaje de los genomas parciales, las secuencias se editaron mediante
Chromas, generándose los consensos con ambos cebadores usando Bioedit. Posteriormente,
se verificaba el marco de lectura correcto utilizando el servidor de Expasy (Expasy
Proteomic Server, http://www.expasy.ch/tools/dna.html) y se procedía a su alineamiento
con respecto a los genomas completos para cada virus, disponibles en el GenBank. Las
regiones alineadas eran seleccionadas para evaluar sus niveles de identidad en nucleótidos y
aminoácidos con la herramienta de matriz de identidad del programa Bioedit. Con las
secuencias disponibles para cada aislamiento viral, se generaba un ensamble en contigs
mediante la herramienta ContigExpress del software vector NTI (versión 11.0 Invitrogen
Corporation 2008). Finalmente, aquellos genomas que presentaban mayores niveles de
identidad con respecto a las secuencias ensambladas de las cepas nativas, fueron utilizados
como base de referencia para realizar diagramas de su ubicación en el contexto genómico,
mediante el software Vector NTI.
82
Tabla 3. Cebadores específicos utilizados en la detección por RT-PCR de cada uno de los
virus bajo estudio.
Virus
Posición en
T°
el genoma
annealing
(nt)
Cebador
Secuencia
PVYc
5'-AAT TAA AAC AAC TCA ATA CA- 3'
2 a 21
PVYd
5'-TGY GAH CCA CGC ACT ATG AA-3'
955 a 974
5'-CGM ARG GGY GAT AGT GGA GT-3'
880 a 899
5'-GTT TCT GCY GCT GAC ACT CG-3'
2704 a 2723
5'-ACC ATC AAG SAA ATG ACA CA-3'
8564 a 8583
PVYHCProF
PVYHCProR
PVYCPF
PVYCPR
HF
HR
3ntr
5'-CGG AGA GAC ACT ACA TCA CA-3'
9371 a 9390
5'-AAC CAT TCT TCA AGA AGC CAA CAC
4034 a 4063
TGC GTA-3'
5'-TAC GCA GTG TTG GCT TCT TGA AGA ATG
4034 a 4063
GTT-3'
5'-GTC TCC TGA TTG AAG TTT ACA GTC ACT
9670 a 9703
GYT ATG A-3'
3ntrC
5'-GTC TCC TGA TTG AAG TTT AC-3'
9684 a 9703
PVX1F
5'-GAA AAC TAA ACC ATA CAC CAA CAA C3'
1 a 25
PVX1651R
5'-CGC GTT TRG CTT TCT TTR CRG-3'
1651 a 1672
PVX3130F
PVX4495R
PVX5476F
5'-CAA TCA TAG CAG TMA TTA G-3'
5476 a 5494
PVX6415R
5'-ATT TAT ATT CAT ACA ATC-3'
6415 a 6435
PVSCPF
5'-CTA GRC AAT TGC GAG CTC AC-3'
7098 a 7117
PVSCPR
5'-TGG TAT CAC CTC AGT TAC TCC-3'
8366 a 8386
CPm1
5'-ATG GAT AAG TCT GTT TTA GAT G-3'
916 a 937
PYVV
CPm2
FURO-Hel
Glais et al.,
1998
5'-GTS GAG AAT GAG GAG TC-3'
3130 a 3146
5'-CCT AAA CTT TTC AAA CTA NTG ATG AG4495 a 4520
3'
PVS
PMTV
Glais et al.,
2002a
53°C
PVY
PVX
Referencia
5'-TCA AAA GTT TTG ATT CAC ATT C-3'
Rain et al.,
2007
53°C
Chikh Ali et
al., 2008
52°
Livieratos et
al., 2002
58°C
Savenkov et
al., 1999
2919 a 2940
5'-GAT GGT GTA CCC GGA TGT GGA AAG TC3151 a 3176
3'
83
Continuación Tabla 3
123 end
5'-GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC5847 a 5872
3'
PMTV759F
5'-ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG-3'
1072 a 1094
PMTV1552R
5'-GCC AAT TGT CTC AAT CAT ACA CTG-3'
1865 a 1888
C819
5‟-CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA CC-3‟
822 a 844
H360
5‟–CAT GAA GGC TGC CGT GAG GAA GT-3‟
PMTVF4
5‟ CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG-3‟
PMTVR4
5‟ AGC CAC TAA CAA AAC ATA CTG C-3‟
PMTV5
USA RNA3
5'-GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT-3'
PMTV7
USA RNA3
5'-AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC-3'
Presente
Trabajo
MacKenzie,
1996
385 a 407
1726 a 1746
56°C
Xu et al.,
2004
2120 a 2141
1417 a 1436
Lambert et
al., 2003
2044 a 2063
4.6. Diagnóstico de los virus PVY y PMTV mediante RT-PCR en tiempo real
Con el fin de generar una prueba de diagnóstico que permita la detección rápida y sensible
de los virus, se evaluó una metodología de RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR) utilizando
sondas Taqman® y cebadores específicos para los virus PVY y PMTV. Estos virus fueron
seleccionados en la investigación debido a su importancia económica y amplia distribución
en las regiones cultivadoras de papa (PVY) y a su condición de patógeno cuarentenario
(PMTV) asociado a S. subterranea. Se utilizaron 40 muestras de tejido foliar de papa (para
PVY) obtenidas de cultivos de los departamentos de Antioquia y Nariño (Tabla 5) y 40 de
raíces de plantas de N. benthamiana obtenidas de suelos infestados con quistosoros de S.
subterranea de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño (Tabla 6). Todas las muestras
fueron evaluadas mediante ELISA, RT-PCR convencional y qRT-PCR. Las pruebas de
ELISA se realizaron con anticuerpos comerciales para PVY (Agdia) y para PMTV
84
(Bioreba), mientras que los RT-PCR convencional se desarrollaron con cebadores
específicos para PVY: PVYF y PVYUnivR (Tablas 3 y 4); para PMTV se utilizaron los
cebadores diseñados a partir de las secuencias obtenidas en el proyecto PMTV759F y
PMTV1552R (Tabla 3). Las reacciones de qRT-PCR se realizaron en un sólo paso,
utilizando el kit QuantiTect Probe RT-PCR (Qiagen, Alemania) en 20 μl de reacción
conteniendo 10 μl de 2X QuantiTect Probe Master Mix (HotStarTaq DNA Polymerase,
QuantiTect Probe RT-PCR Buffer, dNTPs incluyendo dUTP, ROX buffer), 0,2 μl
QuantiTect RT Mix (Reverso transcriptasas Omniscript y Sensiscript), 6,9 μl de agua libre
de ARNasas, 0,8 μl de cada cebador (10 μM), 0,3 μl de sonda Taqman® (10 μM) (Tabla 4)
y 1 μl de ARN. Las reacciones fueron realizadas en un equipo Rotor-Gene Q 5plex
Platform (Qiagen) y consistieron de 50°C por 30 min, seguido por la activación de la Taq
polimerasa Hotstart a 95°C por 15 min; y el PCR en 40 ciclos de 15 s 94°C y 1 min a 60°C.
Para cada muestra se calcularon los valores Ct utilizando el software del equipo. Los
resultados obtenidos para cada prueba fueron comparados mediante análisis de los niveles
de significancia corregidos por el método de Bonferroni y utilizando el programa SAS
System 9.1.3.
85
Tabla 4. Cebadores específicos y sondas a utilizar en la detección por qRT-PCR de los
virus PVY y PMTV.
Virus
PVY
Cebadores
sondas
Secuencia
UnivF
5'- CAT AGG AGA AAC TGA
GAT GCC AAC T -3´
UnivR
5'- TGG CGA GGT TCC ATT TTC
A -3'
Sonda
UnivPVY
FAM-TGA TGA ATG GGC TTA
TGG TTT GGT GCA-BHQ-1
1948F
5'-GTG ATC AGA TCC GCG TCC
TT-3'
2017R
5'-CCA CTG CAA AAG AAC
CGA TTT-C 3'
Tamaño
amplicón
T°
Annealing
Referencia
73 pb
60ºC
Kogovsek et
al., 2008
70 pb
60°C
Mumford et
al., 2000
PMTV
Sonda
FAM ACC AGA ACT ACG GTG
CCG CGT CG BHQ-1
PMTV1970
Tabla 5. Muestras empleadas para la detección del virus PVY.
Muestra
Localidad
Vereda
Variedad
P3 6-10
Pasto
La Victoria
Parda pastusa
P3 EN
Pasto
La Victoria
Parda pastusa
P4 1-5
Pasto
La Victoria
Nevada
P4 AV
Pasto
La Victoria
Nevada
P4 11-15
Pasto
La Victoria
Nevada
P5 11-15
Pasto
Catambuco
Capiro
P6 11-15
Pasto
Cruz Loma
Capiro
P7 MR
Pasto
Jongovito
Criolla
P8 AV
Pasto
Obonuco
Criolla
P8 16-20
Pasto
Obonuco
Criolla
86
Continuación Tabla 5
IP EF
Ipiales
Saguarán
Capiro
IP ESP
Ipiales
Saguarán
Capio
IP EN
Ipiales
Saguarán
Capiro
IP MR
Ipiales
Saguarán
Capiro
IP1 AV
Ipiales
Saguarán
Capiro
IP2 MR
Ipiales
El placer Bajo
Capiro
IP3 EF
Ipiales
Suras
Capiro
IP3 1-5
Ipiales
Suras
Capiro
IP4 AV
Ipiales
Suras
Criolla
IP4 11-15
Ipiales
Suras
Criolla
U1
La Unión
Las Llamas
Capiro
U2
La Unión
Sta Inés
Capiro
U3
La Unión
Sn juan
Capiro
U4
La Unión
Sn Juan
Capiro
U5
La Unión
Madera
Puracé
U6
La Unión
Las Acacias
Puracé
U7
La Unión
Sn Miguel abajo
Capiro
U8
La Unión
El Guarango
Capirol
SR1
Sta Rosa de Osos
Aragón
Capiro
SR2
Sta Rosa de Osos
Aragón
Capiro
SR3
Sta Rosa de Osos
Aragón
Capiro
SR4
Sta Rosa de Osos
Betania
Capiro
SR5
Sta Rosa de Osos
Betania
Capiro
SR6
Sta Rosa de Osos
Aragón
Capiro
SR7
Sta Rosa de Osos
El Roble
Capiro
SR8
Sta Rosa de Osos
Quitasol
Capiro
SR9
Sta Rosa de Osos
Quitasol
Capiro
B1
Belmira
la Salazar
Capiro
B2
Belmira
la Salazar
Capiro
B3
Belmira
la Salazar
Capiro
Tabla 6. Muestras empleadas para la detección del virus PMTV.
Muestra
C+
C+ 1/5
C+ 1/10
C+ 1/50
7
10
Localidad
KIT ELISA
KIT ELISA
KIT ELISA
KIT ELISA
Ipiales
Pasto
Vereda
Rosario
El Campanero
Variedad
Unica
Parda Pastusa
87
Continuación Tabla 6
10(1)
Pasto
23
Zipaquirá
23(1)
25
25(1)
35
36
Vallejuelito
Villapinzón
Villapinzón(1)
Villapinzón(2)
Madrid
Madrid(1)
Madrid(2)
Zipaquirá
La unión
La unión
La unión
La unión
La unión
Villapinzón
Villapinzón
Villapinzón
Madrid
Madrid
Madrid
Zipaquirá
Zipaquirá
Zipaquirá(1)
Zipaquirá
Zipaquirá(2)
Zipaquirá
Zipaquirá(3)
Zipaquirá
Zipaquirá(4)
Tunja
Tunja(1)
Tunja(2)
Tunja(3)
Ventaquemada
ventaquemada (1)
Ventaqumada(2)
Ventaquemada(3)
SRO L2
SRO L4
SRO L5
SRO L5(2)
SRO L6
SRO L7
TZ1Z1
Zipaquirá
Tunja
Tunja
Tunja
Tunja
Ventaquemada
Ventaquemada
Ventaquemada
Ventaquemada
Sta Rosa de Osos
Sta Rosa de Osos
Sta Rosa de Osos
Sta Rosa de Osos
Sta Rosa de Osos
Sta Rosa de Osos
Turmeqé
El Campanero
Páramo
Guerrero
Páramo
Guerrero
La Cabaña
La Cabaña
Madera
Vallejuelito
Vallejuelito
Chasques
Chasques
Chasques
Los Árboles
Los Árboles
Los Árboles
Páramo
Guerrero
Páramo
Guerrero
Páramo
Guerrero
Páramo
Guerrero
Páramo
Guerrero
Siachoque
Siachoque
Siachoque
Siachoque
Capellanía
Capellanía
Capellanía
Capellanía
Aragón
Aragón
Aragón
Aragón
Aragón
El Tres
Siguineque
Parda Pastusa
Pastos
Pastos
Criolla
Criolla
Criolla
Criolla
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Parda Pastusa
Parda Pastusa
Parda Pastusa
Parda Pastusa
Parda Pastusa
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Criolla
88
5. RESULTADOS
5.1. Evaluación de niveles de incidencia viral en cultivos de papa
Evaluación de incidencia de síntomas en cultivos de papa
El análisis de la sintomatología visual presumiblemente asociada a posibles infecciones
virales indicó que el mosaico rugoso se presenta como el síntoma con mayores niveles de
incidencia en los cultivos de papa de los cuatro departamentos bajo estudio, con un
promedio del 16%, seguido por el enrollamiento foliar (10%) y el amarillamiento de venas
(7%). El síntoma enanismo fue el menos evidente, alcanzando un promedio del 2% (Figura
9).
Figura 9. Promedio de cuatro síntomas visuales posiblemente asociados a enfermedades virales en cultivos de
papa ubicados en cuatro departamentos de Colombia. AV: amarillamiento de venas, EF: Enrollamiento foliar,
EN: enanismo y MR: mosaico rugoso. Sint: representa las observaciones en las que se presentó al menos uno
de los síntomas evaluados. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
89
Figura 10. Síntomas observados en campo sobre tejido foliar de plantas de papa en cuatro departamentos de
Colombia. A: Amarillamiento de Venas (AV); B, D: Mosaico Rugoso (MR); C: Otros síntomas
(verdeamiento de nervaduras). E: Enrollamiento Foliar (EF); F: Enanismo (EN).
Las observaciones de síntomas visuales entre cultivos de papa de diferentes departamentos,
demostraron mayor niveles de incidencia en los cultivos de Antioquia para los cuatro
síntomas evaluados, alcanzando promedios del 34% para el MR, 20% para AV, 18% para
EF y 7% para EN, mientras que los niveles de incidencia de los cuatro síntomas observados
90
en los Departamentos de Boyacá y Cundinamarca fueron muy similares, no superando
valores de 15% para ninguno de ellos, e incluso presentando niveles marginales para el
síntoma EN (< 2%). La situación encontrada en el Departamento de Nariño, indicó bajos
niveles de incidencia para los cuatro síntomas evaluados, con ninguno de ellos superando el
10% (Figura 11).
Figura 11. Promedio de observaciones de plantas con síntomas visuales presumiblemente asociados a
enfermedades virales en cultivos de papa para los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y
Nariño. AV: Amarillamiento de venas, EF: Enrollamiento foliar, EN: Enanismo y MR: Mosaico rugoso. Sint:
representa las observaciones en las que se presentó al menos uno de los síntomas evaluados. Las líneas dentro
de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
91
Al evaluar los niveles de incidencia de los cuatro síntomas bajo estudio en las zonas
muestreadas dentro de cada departamento, se evidenció que la región Oriente cercano (Ant)
presentó los promedios más altos respecto al síntoma AV, siendo éste de 37% y
significativamente superior al del resto de las zonas, con excepción de Ipiales (Nar), cuyo
promedio fue de 20%. Las dos zonas con mayores promedios para EF, fueron Santa Rosa
de Osos (Ant) y Occidente (Cund), cuyos valores fueron 22% y 17%, respectivamente. EN
fue el síntoma con los menores promedios de incidencia en todas las zonas, encontrándose
en rangos de 1% a 5%. Por último, MR fue más frecuente en la zona de Santa Rosa de Osos
(Ant), con promedios del 30%, seguido por Zipaquirá (Cund) con el 27% (Figura 12).
92
Figura 12. Promedio de observaciones de plantas con síntomas visuales presumiblemente asociados a
enfermedades virales en cultivos de papa ubicados en 10 zonas de muestreo dentro de los departamentos de
Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. AV: amarillamiento de venas, EF: enrollamiento foliar, EN:
enanismo y MR: mosaico rugoso. Sint: representa las observaciones en las que se presentó al menos uno de
los síntomas evaluados. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
5.2 Detección serológica de virus en muestras de papa sintomáticas
Con el fin de evaluar la asociación de la presencia de los virus Potyvirus, PVS, PLRV y
PVX con alguno (s) de los cuatro síntomas evaluados visualmente en la investigación, se
realizó un análisis serológico sobre grupos de plantas que compartían los mismos síntomas,
no encontrándose ninguna correlación significativa para las combinaciones virus/síntomas
evaluados. Por el contrario, esta evaluación detectó la ocurrencia de potyvirus en promedios
superiores al 68% para los cuatro síntomas, alcanzándose valores tan altos como 90% en
plantas con EF y EN. Así mismo, las pruebas de ELISA detectaron en una alta proporción
de plantas sintomáticas la presencia de PVS (>30% para los cuatro síntomas), mientras que
PLRV se detectó en un rango del 13 al 25% de las muestras con diferentes síntomas. Por
último, PVX fue el virus con menores niveles de detección en este ensayo en plantas con
síntomas de MR y EF (< 6%), aunque su presencia en plantas con AV y EN superó el 20%
(Figura 13). En síntesis este ensayo conduce a reevaluar la creencia generalizada en
técnicos y agricultores de papa de que plantas presentando síntomas particulares estarían
afectadas por una especie viral determinada, como es el caso evidente con los resultados de
AV, donde se detectaron los cuatro virus en promedios superiores al 15%, no siendo
93
entonces el PYVV el único virus presente en dichas muestras. Para éste último no hay
disponibles anticuerpos comerciales para su detección.
Figura 13. Niveles de detección serológica de los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX con respecto a los
cuatro síntomas evaluados visualmente en la investigación (AV, EN, EF y MR) en cultivos de papa de cuatro
departamentos de Colombia. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
5.3 Niveles de incidencia de virus en cultivos de papa de 10 zonas productoras de
Colombia
Los resultados de la detección serológica de los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX
indican su presencia generalizada en las zonas productoras de papa del país, siendo los
94
Potyvirus y el PVS los que arrojaron mayores niveles de incidencia con promedios
nacionales de 72% y 40%, respectivamente; mientras que el virus PLRV se detectó con un
promedio del 20%. Por otra parte, PVX fue el virus evaluado con menor nivel de
incidencia, alcanzando un valor del 8%. En promedio, el 90% de las muestras colectadas en
la investigación fueron positivas a alguno de los virus estudiados (Figura 14). Al analizar
dichos resultados en cada uno de los cuatro departamentos evaluados, no se encontraron
diferencias significativas para la incidencia de los cuatro virus entre departamentos, aunque
resalta el hecho que algunos virus se presentaron en proporciones muy altas, como el caso
de los Potyvirus en el 76% de las muestras de Boyacá y PVS en el 58% de las muestras
analizadas de Cundinamarca. Contrariamente, PVX presentó valores relativamente bajos
con respecto a los otros virus, siendo las muestras de Nariño donde su proporción promedia
fue mayor (14%), mientras que para Cundinamarca y Boyacá alcanzó el 5%. En promedio,
el 91% de las muestras fueron positivas a alguno de los virus evaluados en Antioquia, 90%
en Boyacá y Cundinamarca y 85% en Nariño (Figura 15).
95
Figura 14. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus Potyvirus, PLRV,
PVS y PVX en cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia. Sint: representa las muestras que
resultaron positivas para al menos uno de los virus en las evaluaciones serológicas. Las líneas dentro de las
barras indican los intervalos de confianza al 95%.
96
Figura 15. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus Potyvirus, PLRV,
PVS y PVX en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. Sint:
representa las muestras que resultaron positivas para al menos uno de los virus en las evaluaciones
serológicas. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
El análisis de la incidencia viral al interior de cada una de las diez zonas cultivadoras de
papa evaluadas indicó que Potyvirus es el grupo predominante, presentando promedios de
hasta el 80% para Santa Rosa de Osos (Ant), seguido por Tunja (Boy) y Oriente Cercano
(Ant) con 77% y 75%, respectivamente, mientras que las demás zonas presentaron valores
superiores al 56%. El segundo virus más incidente dentro de las zonas fue PVS, siendo
Oriente Cercano (Ant) y Pasto (Nar) las zonas donde se obtuvieron mayores promedios
97
(49% y 47% respectivamente). PLRV se ubicó entre valores del 30% (Villapinzón) y 14%
(Zipaquirá), siendo Turmequé-Ventaquemda (Boy) la segunda zona con mayor incidencia
del virus (27%). Pasto (Nar) y Oriente cercano (Ant), reportaron los promedios más altos
para PVX, ubicándose en el orden de 28% y 25%, respectivamente. Las demás zonas
tuvieron promedios por debajo del 9%. En general, la zona Oriente Cercano (Ant) fue la
que presentó mayores niveles de incidencia viral, con un promedio de 94% de las muestras
positivas para al menos uno de los virus (Figura 16).
Figura 16. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus Potyvirus, PLRV,
PVS y PVX en cultivos de papa de 10 zonas productoras de los departamentos de Antioquia, Boyacá,
Cundinamarca y Nariño. Sint: Al menos una de las muestras fue positiva en la prueba serológica Las líneas
dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.
98
5.4 Detección serológica de PMTV en cultivos de papa de Colombia
La detección del virus PMTV a partir de muestras foliares de papa no arrojó resultados
positivos para ninguna de las muestras evaluadas procedentes de las 10 zonas bajo estudio,
razón por lo cual se realizó una evaluación piloto en 12 muestras de raíces de plantas con
síntomas de sarna polvosa y tubérculos con pústulas de la enfermedad, de diferentes
departamentos (Tabla 7). Nuevamente, en los resultados de las pruebas de ELISA no se
detectó ninguna muestra con PMTV, aunque si en los controles positivos del kit de
Bioreba, lo cual validaba el funcionamiento de la prueba. Por esta razón se decidió evaluar
la presencia del virus PMTV a partir de plantas de N. benthamiana cultivadas en macetas
con turba e inoculadas con quistosoros de S. subterranea, tal como se describió en la
metodología. En total se evaluaron las raíces de plantas procedentes de sustratos infestados
con 18 muestras diferentes de S. subterranea (Figura 17), encontrándose que cinco
muestras de Antioquia, y una de Boyacá, Cundinamarca y Nariño arrojaron resultados
positivos en las pruebas de ELISA (Tabla 8).
99
Tabla 7. Detección mediante pruebas de ELISA de PMTV en raíces y tubérculos de plantas
de papa afectadas por S. subterranea.
Muestra
Tejido evaluado
Departamento
Municipio
Absorbancia
Resultado
Control +
2,421 Positivo
Control -
0,112 Negativo
PC
tubérculo cáscara
Boyacá
Siguineque
0,119 Negativo
PP
tubérculo pulpa
Boyacá
Siguineque
0,121 Negativo
Tunja C
tubérculo cáscara
Boyacá
Siachoque
0,116 Negativo
Tunja P
tubérculo pulpa
Boyacá
Siachoque
0,12 Negativo
Ventaquemada C
tubérculo cáscara
Boyacá
Ventaquemada
0,124 Negativo
Ventaquemada P
tubérculo pulpa
Boyacá
Ventaquemada
0,141 Negativo
Solanas C
tubérculo cáscara
Cundinamarca
Villapinzón
0,127 Negativo
Solanas P
tubérculo pulpa
Cundinamarca
Villapinzón
0,12 Negativo
Villapinzón C
tubérculo cáscara
Cundinamarca
Villapinzón
0,124 Negativo
Villapinzón P
tubérculo pulpa
Cundinamarca
Villapinzón
RZ1
Raíz
Cundinamarca
Zipaquirá
0,205 Negativo
RZ5
Raíz
Cundinamarca
Zipaquirá
0,2 Negativo
RZ6
Raíz
Cundinamarca
Zipaquirá
0,222 Negativo
RV2
Raíz
Cundinamarca
Villapinzón
0,221 Negativo
RO6
Raíz
Cundinamarca
Madrid
0,214 Negativo
RTunja1
RTV2
Raíz
Raíz
Boyacá
Boyacá
Siachoque
Siguineque
0,209 Negativo
0,205 Negativo
0,122 Negativo
100
Tabla 8. Detección mediante pruebas de ELISA de PMTV en raíces de plantas de
Nicotiana benthamiana cultivadas en sustratos infestados con S. subterranea.
Procedencia del Suelo tamizado
Muestra
Absorbancia
Departamento
Control +
Control 7
10
25
35
36
SRO L2
SRO L4
SRO L5
SRO L6
SRO L7
Vallejuelito
23
Villapinzón
Madrid
Zipaquirá6
Tunja1
TZ1Z1
TV2
Nariño
Nariño
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Cundinamarca
Cundinamarca
Cundinamarca
Cundinamarca
Boyacá
Boyacá
Boyacá
Municipio
Ipiales
Pasto
La Unión
La Unión
La Unión
Sta Rosas Osos
Sta Rosas Osos
Sta Rosas Osos
Sta Rosas Osos
Sta Rosas Osos
La Unión
Zipaquirá
Villapinzón
Madrid
Zipaquirá
Siachoque
Siguineque
Siguineque
Resultado
Variedad
Única
Parda Pastusa
Criolla
Criolla
Criolla
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Pastos
Capiro
Capiro
Parda Pastusa
Capiro
Criolla
Criolla
2,47
0,12
0,137
0,131
1,215
0,14
0,148
0,139
0,13
0,142
1,015
1,442
0,13
0,154
0,146
0,791
0,124
0,121
0,172
0,487
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
101
Figura 17. Plantas señuelo y fotos de microscopía de sus raíces infectadas con S. subterranea. a. Plantas de
N. benthamiana sembradas en sustratos infestados con S. subterranea. b. Microscopía de raíces de N.
benthamiana sembradas en sustratos infestados con S. subterranea, donde se observan estructuras del
patógeno (40X y 100X).
5.5. Definición de afinidades filogenéticas de virus asociados a cultivos de papa
mediante RT-PCR y secuenciación
Debido al alto número de muestras que resultaron positivas en las pruebas de ELISA para
los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX, se optó por realizar las evaluaciones de RT-PCR y
102
las secuenciaciones correspondientes en al menos una muestra representativa de cada
departamento, obteniéndose un total de 33 secuencias consenso para PVY (seleccionado
por ser el potyvirus de mayor importancia económica en este cultivo en el mundo) (Tabla
9), 18 para PLRV (Tabla 10), 14 para PVX (Tabla 11), 15 para PVS (Tabla 12) y 10 para
PYVV (Tabla 13). Para este último virus, ante la no disponibilidad de anticuerpos
específicos, se tomaron como base de selección las muestras con sintomatología
característica de AV. Para el caso de PMTV, el bajo número de muestras detectadas como
positivas, condujo a la obtención de tres secuencias consenso para la región TGB2 y cuatro
secuencias para una gran porción del gen CP (Tabla 14).
Tabla 9. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVY.
Código
Departamento
Municipio
5MED
6MED
7MED
8MED
11BM
12BM
12COL
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Cundinamarca
Cundinamarca
Antioquia
Sta Rosa Osos
Sta Rosa Osos
Sta Rosa Osos
Sta Rosa Osos
Villapinzón
Villapinzón
Unión
13BM
13COL
13FB
Cundinamarca
Antioquia
Cundinamarca
Zipaquirá
Sonsón
Madrid
14BM
14COL
14FB
15BM
15COL
16BM
17BM
Cundinamarca
Antioquia
Antioquia
Cundinamarca
Nariño
Cundinamarca
Boyacá
Zipaquirá
Sonsón
Carmen de Viboral
Cota
Pasto
Villapinzón
Siachoque
Vereda
El Roble
El Roble
Santana
Santana
Chasques
Buena Vista
Alto del
Águila
Tasajo
Los Árboles
Alto del
Águila
Tasajo
Parcela
Cubijan
Chasques
Cormechoque
Variedad
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Criolla
Capiro
Suprema
Capiro
Capiro
Única
Capiro
Capiro
Capiro
Parda Pastusa
Capiro
Capiro
103
Continuación Tabla 9
17COL
Antioquia
Unión
18BM
18COL
19BM
19COL
20BM
20COL
21BM
21COL
34MY
35MY
36MY
37MR
37MY
38MR
39MR
Boyacá
Antioquia
Boyacá
Antioquia
Boyacá
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Nariño
Nariño
Nariño
Antioquia
Nariño
Antioquia
Antioquia
Soracá
Unión
Turmequé
Unión
Ventaquemada
Sonsón
Unión
Sonsón
Pasto
Ipiales
Ipiales
Santuario
Ipiales
La Ceja
Carmen de Viboral
Buena Vista
Quebrada
Vieja
Buena Vista
Rosales
Buena Vista
Capellanía
Tasajo
Capiro
Única
Capiro
Única
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Tasajo
Capiro
Cruz Loma
Capiro
Saguarán
Capiro
El Placer Bajo Capiro
Valle de María Nevada
Saguarán
Capiro
Capiro
Aldana abajo Nevada
Tabla 10. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PLRV.
Código
1BM
1C
2BM
2C
3BM
4BM
4C
5BM
5C
6BM
6C
7BM
7C
8C
9BM
14MED
20FB
87MY
Departamento
Cundinamarca
Boyacá
Cundinamarca
Cundinamarca
Cundinamarca
Cundinamarca
Antioquia
Cundinamarca
Antioquia
Cundinamarca
Antioquia
Boyacá
Nariño
Nariño
Boyacá
Antioquia
Boyacá
Nariño
Municipio
Villapinzón
Turmequé
Villapinzón
Facatativá
Villapinzón
Zipaquirá
La unión
Madrid
Sonsón
Madrid
La unión
Turmequé
Pasto
Pasto
Siachoque
Sta Rosa de Osos
Turmequé
Ipiales
Vereda
Variedad
Capiro
Siguineque
Suprema
Chasques
Suprema
Criolla
Bosabita
Esmeralda
San Jorge
Suprema
El Vergel
Capiro
Los árboles
Capiro
Tasajo
Capiro
Los árboles
Capiro
Buena vista
Capiro
Siguineque
Crolla
El Campanero ICA Nariño
El Campanero Criolla
Jurubita
Parda Pastusa
Santana
Capiro
Siguineque
Criolla
Suras
Criolla
104
Tabla 11. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVX.
Código
Departamento
Municipio
Vereda
17FB
18FB
19FB
22COL
23COL
27BM
28BM
29BM
50MY
51MY
52MY
53MY
54MY
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Nariño
Cundinamarca
Cundinamarca
Boyacá
Nariño
Nariño
Nariño
Nariño
Nariño
Santuario
Carmen de Viboral
Carmen de Viboral
La Unión
Pasto
Zipaquirá
Zipaquirá
Soracá
Pasto
Pasto
Pasto
Ipiales
Ipiales
58MR
Antioquia
Carmen de Viboral Aldana abajo
Variedad
El Carmelo
Capiro
Capiro
Capiro
El Vergel
Capiro
Cubijan
Parda pastusa
Venta larga
Criolla
Venta larga
Criolla
Quebrada vieja Unica
La Victoria
Parda pastusa
La Victoria
Nevada
Cruzloma
Capiro
Suras
Criolla
Saguarán
Capiro
Nevada
Tabla 12. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVS.
Código
24FB
26FB
55MY
56MY
57MY
58MY
59MY
61MY
62MY
63MY
64MY
65MY
66MY
67MY
68MY
Departamento
Municipio
Vereda
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Cundinamarca
Cundinamarca
Cundinamarca
Nariño
Nariño
Nariño
Nariño
Boyacá
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Santuario
Sonsón
La Unión
Sta Rosa de Osos
Villapinzón
Villapinzón
Villapinzón
Pasto
Pasto
Ipiales
Ipiales
Siachoque
Sta Rosa de Osos
Carmen de Viboral
Santuario
El Carmelo
Tasajo
Vallejuelito
El Roble
Quincha
Chasques
Bosabita
La Victoria
La Victoria
Saguarán
Suras
Jurubita
El Roble
Aldana Abajo
Valle de María
Variedad
Capiro
Criolla
Criolla
Capiro
Esmeralda
Criolla
Esmeralda
Nevada
Nevada
Capiro
Criolla
Suprema
Criolla
Nevada
Capiro
105
Tabla 13. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PYVV.
Código
Departamento
13MED
22FB
23FB
27UN
28UN
Antioquia
Antioquia
Antioquia
Cundinamarca
Antioquia
54MR
90MY
91MY
92MY
93MY
Antioquia
Nariño
Nariño
Nariño
Nariño
Municipio
Vereda
Sonsón
Tasajo
Santuario
El Carmelo
Carmend de Viboral
Facatativá
La Unión
El Vergel
Buena
La Unión
Vista
Pasto
La Victoria
Pasto
Obonuco
Ipiales
Saguarán
Ipiales
Suras
Variedad
Capiro
Capiro
Capiro
Criolla
Capiro
Capiro
Nevada
Criolla
Capiro
Criolla
Tabla 14. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP y TGB2 del virus
PMTV.
Código
11MED
70MR
71MR
71MY
72MY
9MED
66MR
67MR
70MY
Departamento
Antioquia
Antioquia
Cundinamarca
Boyacá
Antioquia
Antioquia
Boyacá
Municipio
Vereda
Control positivo ELISA
La Unión
La Cabaña
La Unión
Vallejuelito
Madrid
Los Árboles
Ventaquemada Capellanía
Control positivo ELISA
La Unión
La Cabaña
La Unión
Vallejuelito
Ventaquemada Capellanía
Variedad
Criolla
Capiro
Capiro
Capiro
Criolla
Capiro
Capiro
Región del
genoma
CP
CP
CP
CP
CP
TGB2
TGB3
TGB4
TGB5
5.5.1. Afinidades filogenéticas de aislamientos de PVY
Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PVYF y PVYR arrojaron los amplicones del
tamaño esperado de ~480 pb (Figura 18). El análisis utilizando 33 secuencias de este virus
106
y de 20 secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PVY representando
diferentes razas de este virus (PVY-O, PVY-C, PVY-N, PVY-NTN y PVY-NWilga) y
orígenes geográficos diferentes, indicaron niveles de identidad para la región estudiada
superiores al 89%; siendo evidente la relación entre las mayoría de cepas obtenidas en este
estudio y aquellas clasificadas como N y NTN, con las cuales compartieron niveles de
identidad superiores al 96%. Por otra parte las identidades entre cepas Colombianas de
PVY fueron superiores al 95% en todos los casos, con una gran proporción de cepas
compartiendo niveles superiores al 98%. Las cepas de referencia con menores niveles de
identidad (89 al 92%) con respeto a las cepas Colombianas fueron aquellas representantes
de las razas PVY-O y PVY-C, aunque tambien esto ocurrió con algunas PVY-NWilga y
PVY-N (Tabla 15).
Figura 18. Amplicones obtenidos con los cebadores PVY F y PVYR (480 pb) a partir de tejido foliar de
plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: Q El Roble, 3: U El Roble, 4: V
Santana, 5: W Santana, 6: Control negativo.
107
ID
0,973
0,975
0,975
0,973
0,973
0,975
0,973
0,973
0,969
0,975
0,973
0,973
0,975
0,975
0,975
0,973
0,975
0,973
0,975
0,975
0,975
0,975
0,982
0,975
0,975
0,969
0,966
0,975
0,975
0,975
0,975
0,973
0,969
0,975
0,975
0,973
0,973
0,977
0,973
ID
0,997
0,997
1
1
0,997
1
0,964
0,988
0,997
0,964
0,964
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
1
0,997
0,997
0,997
0,997
0,986
0,997
0,997
0,991
0,988
0,997
0,997
0,997
0,995
0,964
0,971
0,966
0,966
0,964
0,964
0,969
0,975
0,997
ID
1
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
1
1
1
0,997
1
0,997
1
1
1
1
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1
1
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1
1
1
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0,969
0,964
0,964
0,962
0,962
0,966
0,975
0,997
1
ID
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
1
1
1
0,997
1
0,997
1
1
1
1
0,988
1
1
0,993
0,991
1
1
1
0,997
0,962
0,969
0,964
0,964
0,962
0,962
0,966
0,973
1
0,997
0,997
ID
1
0,997
1
0,964
0,988
0,997
0,964
0,964
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
1
0,997
0,997
0,997
0,997
0,986
0,997
0,997
0,991
0,988
0,997
0,997
0,997
0,995
0,964
0,971
0,966
0,966
0,964
0,964
0,969
0,973
1
0,997
0,997
1
ID
0,997
1
0,964
0,988
0,997
0,964
0,964
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
1
0,997
0,997
0,997
0,997
0,986
0,997
0,997
0,991
0,988
0,997
0,997
0,997
0,995
0,964
0,971
0,966
0,966
0,964
0,964
0,969
0,975
0,997
1
1
0,997
0,997
ID
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
1
1
1
0,997
1
0,997
1
1
1
1
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1
1
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1
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1
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0,962
0,962
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0,973
1
0,997
0,997
1
1
0,997
ID
0,964
0,988
0,997
0,964
0,964
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
1
0,997
0,997
0,997
0,997
0,986
0,997
0,997
0,991
0,988
0,997
0,997
0,997
0,995
0,964
0,971
0,966
0,966
0,964
0,964
0,969
0,973
0,964
0,962
0,962
0,964
0,964
0,962
0,964
ID
0,955
0,962
0,997
0,997
0,962
0,962
0,962
0,962
0,962
0,964
0,962
0,962
0,962
0,962
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0,962
0,962
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0,953
0,962
0,962
0,962
0,964
0,997
0,982
0,995
0,995
0,993
0,993
0,993
0,969
0,988
0,991
0,991
0,988
0,988
0,991
0,988
0,955
ID
0,991
0,955
0,955
0,991
0,991
0,991
0,988
0,991
0,988
0,991
0,991
0,991
0,991
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0,991
0,991
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0,958
0,955
0,955
0,96
0,975
0,997
1
1
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
ID
0,962
0,962
1
1
1
0,997
1
0,997
1
1
1
1
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1
1
0,993
0,991
1
1
1
0,997
0,962
0,969
0,964
0,964
0,962
0,962
0,966
0,973
0,964
0,962
0,962
0,964
0,964
0,962
0,964
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0,955
0,962
ID
1
0,962
0,962
0,962
0,962
0,962
0,964
0,962
0,962
0,962
0,962
0,969
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0,962
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0,962
0,964
1
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0,997
0,995
0,995
0,995
0,962 0,962
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0,975
0,997
1
1
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
1
1
ID
0,997
1
0,997
1
1
1
1
0,988
1
1
0,993
0,991
1
1
1
0,997
0,962
0,969
0,964
0,964
0,962
0,962
0,966
0,962
0,964
0,96
0,96
0,925
0,916
0,916
0,911
0,918
0,898
0,916
0,962
0,962
0,964
0,975
0,997
1
1
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
1
1
1
0,997
ID
0,997
1
1
1
1
0,988
1
1
0,993
0,991
1
1
1
0,997
0,962
0,969
0,964
0,964
0,962
0,962
0,966
0,711
0,964
0,966
0,962
0,962
0,927
0,918
0,918
0,914
0,92
0,9
0,918
0,964
0,964
0,966
0,973
1
0,997
0,997
1
1
0,997
1
0,964
0,988
0,997
0,964
0,964
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
ID
0,997
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0,997
0,991
0,988
0,997
0,997
0,997
0,995
0,964
0,971
0,966
0,966
0,964
0,964
0,969
0,709
0,962
0,964
0,96
0,96
0,925
0,916
0,916
0,911
0,918
0,898
0,916
0,962
0,962
0,964
0,975
0,997
1
1
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
1
1
1
0,997
1
0,997
ID
1
1
1
0,988
1
1
0,993
0,991
1
1
1
0,997
0,962
0,969
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0,964
0,962
0,962
0,966
0,709
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0,964
0,96
0,96
0,925
0,916
0,916
0,911
0,918
0,898
0,916
0,962
0,962
0,964
0,975
0,997
1
1
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
1
1
1
0,997
1
0,997
1
ID
1
1
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1
1
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0,991
1
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0,964
0,962
0,962
0,966
0,709
0,962
0,964
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0,96
0,925
0,916
0,916
0,911
0,918
0,898
0,916
0,962
0,962
0,964
0,975
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0,997
0,997
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ID
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0,962
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0,962
0,964
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0,916
0,916
0,911
0,918
0,898
0,916
0,962
0,962
0,964
0,975
0,997
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1
0,997
0,997
1
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0,991
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0,962
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ID
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0,962
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0,896
0,914
0,969
0,964
0,971
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0,988
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0,986
0,988
0,986
0,969
0,982
0,988
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0,969
0,988
0,988
0,988
0,986
0,988
0,986
0,988
0,988
0,988
0,988
ID
0,988
0,988
0,982
0,98
0,988
0,988
0,988
0,986
0,969
0,971
0,971
0,971
0,969
0,969
0,973
0,709
0,962
0,964
0,96
0,96
0,925
0,916
0,916
0,911
0,918
0,898
0,916
0,962
0,962
0,964
0,975
0,997
1
1
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
1
1
1
0,997
1
0,997
1
1
1
1
0,988
ID
1
0,993
0,991
1
1
1
0,997
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0,96
0,96
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0,916
0,916
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0,9
0,9
0,9
0,89
0,89
0,9
0,89
0,89
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,89
0,89
0,9
0,9
0,9
0,9
0,89
0,89
0,89
0,89
0,9
0,9
0,9
0,72
0,91
0,91
0,91
0,91
0,93
0,93
0,99
0,98
0,99
0,94
ID
0,91
0,91
0,91
0,91
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,91
0,91
0,92
0,91
0,91
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,91
0,92
0,92
0,91
0,91
0,92
0,92
0,92
0,91
0,91
0,91
0,91
0,91
0,91
0,91
0,91
ID
0,707
0,709
0,709
0,713
0,715
0,722
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0,713
0,713
0,72
0,718
0,711
0,709
0,709
Pe pMV
Iran S.Afr
Iran
S.Afr
Egypt
India
S.
2
4
3
5
Kore a
0,704
0,711
0,709
0,709
0,711
0,711
0,709
0,711
0,704
0,711
0,709
0,707
0,707
0,709
0,709
0,709
0,709
0,709
0,711
0,709
0,709
0,709
0,709
0,711
0,709
0,709
0,707
0,704
0,709
0,709
0,709
0,711
0,707
0,715
0,709
0,709
0,709
0,709
0,707
0,975
0,997
1
1
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
1
ID
1
0,997
1
0,997
1
1
1
1
0,988
1
1
0,993
0,991
1
1
1
0,997
0,962
0,969
0,964
0,964
0,962
0,962
0,966
0,962 0,962
0,709
0,962
0,964
0,96
0,96
0,925
0,916
0,916
0,911
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0,898
0,916
0,962
0,964
0,96
0,96
0,925
0,916
0,916
0,911
0,918
0,898
0,916
0,962
0,964
0,96
0,96
0,925
0,916
0,916
0,911
0,918
0,898
0,916
0,964
0,966
0,962
0,962
0,922
0,914
0,914
0,909
0,916
0,896
0,914
0,973
0,964
0,962
0,962
0,964
0,964
0,962
0,964
0,997
0,955
0,962
1
1
0,962
0,962
0,962
0,962
0,962
0,964
0,962
0,962
0,962
0,962
0,969
0,962
0,962
0,958
0,953
0,962
0,962
0,962
0,964
ID
0,984
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0,997
0,995
0,995
0,995
0,964
0,962
0,964
0,96
0,96
0,925
0,916
0,916
0,911
0,918
0,898
0,916
0,975
0,995
0,997
0,997
0,995
0,995
0,997
0,995
0,964
0,988
0,997
0,964
0,964
0,997
0,997
0,997
0,995
0,997
0,995
0,997
0,997
0,997
0,997
0,986
0,997
0,997
0,991
0,988
0,997
0,997
0,997
ID
0,964
0,971
0,966
0,966
0,964
0,964
0,969
0,962
0,962
0,964
0,96
0,96
0,925
0,916
0,916
0,911
0,918
0,898
0,916
0,975
0,997
1
1
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
1
1
1
0,997
1
0,997
1
1
1
1
0,988
1
1
0,993
0,991
1
1
ID
0,997
0,962
0,969
0,964
0,964
0,962
0,962
0,966
0,962
0,709 0,709
0,975
0,997
1
1
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
1
1
1
0,997
1
0,997
1
1
1
1
0,988
1
1
0,993
0,991
1
ID
1
0,997
0,962
0,969
0,964
0,964
0,962
0,962
0,966
0,997 0,964
0,962
0,964
0,96
0,96
0,925
0,916
0,916
0,911
0,918
0,898
0,916
0,975
0,997
1
1
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
1
1
1
0,997
1
0,997
1
1
1
1
0,988
1
1
0,993
0,991
ID
1
1
0,997
0,962
0,969
0,964
0,964
0,962
0,962
0,966
0,991 0,962
0,709
0,973
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,962
0,988
0,997
0,962
0,962
0,997
0,997
0,997
ID
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,986
0,997
0,997
0,991
0,988
0,997
0,997
0,997
0,995
0,962
0,969
0,964
0,964
0,962
0,962
0,966
0,995 0,962
0,973
0,964
0,962
0,962
0,964
0,964
0,962
0,964
0,997
0,955
0,962
1
ID
0,962
0,962
0,962
0,962
0,962
0,964
0,962
0,962
0,962
0,962
0,969
0,962
0,962
0,958
0,953
0,962
0,962
0,962
0,964
1
0,984
0,997
0,997
0,995
0,995
0,995
0,962
0,964
0,96
0,96
0,925
0,916
0,916
0,911
0,918
0,898
0,916
0,975
0,997
1
1
0,997
0,997
1
0,997
0,962
0,991
1
0,962
0,962
ID
1
1
0,997
1
0,997
1
1
1
1
0,988
1
1
0,993
0,991
1
1
1
0,997
0,962
0,969
0,964
0,964
0,962
0,962
0,966
0,995
0,997
0,988
0,993
0,914
0,909
0,905
0,9
0,907
0,892
0,909
2: NT N-GQ853629.1; UK: NT N- EF027897.1; Jordan 1: EU073855.1; CzR: NT N -DQ000988.1; Jordan 2: EU073858.1; USA: H- X68223.1; Jap: NT N- AB295479.1; S.Afr 3: N-Wi- GQ853667.1; Hu:AJ619750.1; Iran 1: C- EF192312.1; Iran 2: C-EF192314.1; S.Afr 4: N-Wi- GQ853653.1; Egypt: N- AF522296.1; Iran 3: O-
0,953
0,955
0,951
0,951
0,916
0,909
0,907
0,903
0,909
0,889
0,907
0,707 0,709
5MED 6MED 7MED 8MED 11BM 12BM 12CO L 13BM 13CO L 13FB 14BM 14CO L 14FB 15BM 15CO L 16BM 17BM 17CO L 18BM 18CO L 19BM 19CO L 20BM 20CO L 21BM 21CO L 34MY 35MY 36MY 37MR 37MY 38MR 39MR
Tabla 15 Matriz de identidad para cepas del virus PVY de cultivos de papa de Colombia y otros países del mundo.
PVY
5MED
6MED
7MED
8MED
11BM
12BM
12CO L
13BM
13CO L
13FB
14BM
14CO L
14FB
15BM
15CO L
16BM
17BM
17CO L
18BM
18CO L
19BM
19CO L
20BM
20CO L
21BM
21CO L
34MY
35MY
36MY
37MR
37MY
38MR
39MR
Cz R 1
China
USA 1
S.Afr 1
S.Afr 2
UK
Jordan
0,975 0,966 0,964 0,964 0,966 0,966 0,964 0,966 0,995 0,958 0,964 0,997
1
Cz R 2 0,969 0,964 0,962 0,962 0,964 0,964 0,962 0,964 0,988 0,955 0,962 0,991
Jordan
0,973 0,964 0,962 0,962 0,964 0,964 0,962 0,964 0,993 0,955 0,962 0,995
2
USA 2 0,973 0,964 0,962 0,962 0,964 0,964 0,962 0,964 0,993 0,955 0,962 0,995
Jap
0,975 0,966 0,964 0,964 0,966 0,966 0,964 0,966 0,995 0,958 0,964 0,997
S.Afr 3 0,966 0,962 0,96
0,96 0,962 0,962
0,96
0,962 0,986 0,953 0,96
0,988
Hu
0,971 0,962 0,96
0,96 0,962 0,962
0,96
0,962 0,991 0,953 0,96
0,993
Iran 1 0,918 0,927 0,925 0,925 0,927 0,927 0,925 0,927 0,914 0,918 0,925 0,914
Iran 2 0,911 0,918 0,916 0,916 0,918 0,918 0,916 0,918 0,909 0,909 0,916 0,909
S.Afr 4 0,907 0,918 0,916 0,916 0,918 0,918 0,916 0,918 0,905 0,909 0,916 0,905
Egypt 0,903 0,914 0,911 0,911 0,914 0,914 0,911 0,914
0,9
0,905 0,911
0,9
Iran 3 0,909 0,92 0,918 0,918 0,92
0,92
0,918
0,92
0,907 0,911 0,918 0,907
India 0,892
0,9
0,898 0,898
0,9
0,9
0,898
0,9
0,892 0,892 0,898 0,892
S.Afr 5 0,907 0,918 0,916 0,916 0,918 0,918 0,916 0,918 0,907 0,909 0,916 0,909
Pe pMV
0,704 0,711 0,709 0,709 0,711 0,711 0,709 0,711 0,704 0,711 0,709 0,707
S.
Kore a
CzR 1: N- DQ000989.1; China:HM036202.1; USA 1: NT N- FJ204166.1; S.Afr 1: O/N- GQ853619.1; S.Afr
EF192319.1; India: O- AY061994.1; S.Afr 5 : N-Wi- GQ853631.1; PepMV South Korea: EU586136.1
108
El análisis filogenético utilizó 454 posiciones, 291 de las cuales resultaron constantes, 92
variables pero no informativas y 71 informativas para el método de máxima parsimonia. El
dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,78, Índice de Retención (RI) de
0,89 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,22 y separó las cepas de PVY bajo análisis en
tres cluster (I, II, III) fuertemente soportados por valores de bootstrap superiores al 89%;
además de un cuarto clado conteniendo dos cepas de Irán, pero con un bajo soporte de
Bootstrap (59%). El grupo I incluyó 29 cepas de PVY obtenidas en este estudio de cultivos
de papa de los cuatro departamentos evaluados, presentando un muy bajo número de
cambios entre sus integrantes (<9); mientras que el clado II agrupó a cuatro cepas de PVY
obtenidas en cultivos del oriente de Antioquia con el conjunto principal de cepas de
referencia de las razas PVY-NTN y PVY-N, además de un aislamiento del tipo H
procedente de EEUU. El tercer grupo no incluyó ninguna cepa secuenciada en este estudio,
y estuvo conformado por cepas de referencia de las razas PVY-O, PVY-C, PVY-N y
PVYN-Wilga, pero no PVY-NTN. Finalmente, la secuencia del Potyvirus Pepper mottle
virus (PepMV) presentó valores de identidad cercanos al 70% con respecto a las secuencias
de los aislamientos de PVY, ubicándose por fuera de los grupos detallados (Figura 19), lo
cual confirmó su utilidad como grupo externo para el análisis.
109
Figura 19. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PVY
obtenidos de cultivos de papa de Colombia y otros países del mundo. Método de máxima parsimonia
utilizando la opción Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y
los valores de Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
110
5.5.2. Afinidades filogenéticas de aislamientos de PYVV
Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PYVVCPF y PYVVCPR produjeron
amplicones del tamaño esperado de ~758 pb (Figura 20). El análisis utilizando 10
secuencias de este virus obtenidas en el presente estudio y 10 secuencias referencia
previamente depositadas en el GenBank de cepas de PYVV procedentes de cultivos de
papa de Colombia y Perú, indicó niveles de identidad para la región de la cápside viral
estudiada superiores al 99 % en todos los casos. Por otra parte las identidades entre cepas
de PYVV y aquella utilizada como grupo externo del Lettuce infectious yellows virus
(LIYV), especie tipo del género Crinivirus, alcanzó niveles de identidad inferiores al 45%
(Tabla 16).
Figura 20. Amplicones obtenidos con los cebadores PYVVCPF y PYVVCPR (758 pb) a partir de tejido
foliar de plantas de papa de tres departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: AVUni Unión, 3: AVF4
Facatativá, 4: Control negativo.
111
0,994
0,995
0,995
0,997
1
0,997
0,99
0,991
0,992
0,99
0,992
0,997
0,998
0,99
0,992
0,991
0,992
0,99
ID
0,99
LIYVUSA
0,991
0,992
0,992
0,994
0,992
0,994
0,987
0,988
0,99
0,987
0,991
0,994
0,991
0,99
ID
0,998
0,991
0,99
0,992
0,997
Col 6 Col 7 Col 8
0,99
0,991
0,991
0,992
0,99
0,992
0,988
0,99
0,991
0,988
0,988
0,992
0,988
ID
0,99
0,988
0,988
1
0,99
0,99
Peru
2
0,992
0,994
0,994
0,995
0,998
0,995
0,988
0,99
0,991
0,988
0,991
0,995
ID
0,988
0,991
0,99
0,991
0,988
0,998
0,988
23FB 27UN 28UN 54MR 90MY 91MY 92MY 93MY Peru 1 Col 1 Col 2 Col 3 Col 4 Col 5
0,997
0,998
0,998
1
0,997
1
0,992
0,994
0,995
0,992
0,995
ID
0,995
0,992
0,994
0,992
0,995
0,992
0,997
0,991
22FB
0,992
0,997
0,997
0,995
0,992
0,995
0,988
0,99
0,991
0,988
ID
0,995
0,991
0,988
0,991
0,992
1
0,988
0,992
0,988
13
MED
Tabla 16 Matriz de identidad para cepas del virus PYVV de cultivos de papa de Colombia y Perú.
PYVV
0,991
0,991
0,991
0,992
0,99
0,992
0,997
0,995
0,997
ID
0,988
0,992
0,988
0,988
0,987
0,985
0,988
0,988
0,99
0,99
0,444
0,445
0,445
0,444
0,443
0,444
0,443
0,443
0,444
0,445
0,445
0,444
0,443
0,441
0,443
0,444
0,445
0,441
0,443
0,443
0,994
0,994
0,994
0,995
0,992
0,995
0,997
0,998
ID
0,997
0,991
0,995
0,991
0,991
0,99
0,988
0,991
0,991
0,992
0,992
0,988
0,99
0,99
0,991
0,99
0,991
0,99
0,991
0,992
0,99
0,988
0,991
0,988
0,99
0,997
0,995
0,988
0,99
0,99
ID
0,992
0,992
0,992
0,994
0,991
0,994
0,997
ID
0,998
0,995
0,99
0,994
0,99
0,99
0,988
0,987
0,99
0,99
0,991
0,991
0,99
0,991
0,991
0,992
0,99
0,992
0,988
0,99
0,991
0,988
0,988
0,992
0,988
1
0,99
0,988
0,988
ID
0,99
0,99
0,991
0,991
0,991
0,992
0,99
0,992
ID
0,997
0,997
0,997
0,988
0,992
0,988
0,988
0,987
0,985
0,988
0,988
0,99
0,99
0,992
0,997
0,997
0,995
0,992
0,995
0,988
0,99
0,991
0,988
1
0,995
0,991
0,988
0,991
0,992
ID
0,988
0,992
0,988
0,997
0,998
0,998
1
0,997
ID
0,992
0,994
0,995
0,992
0,995
1
0,995
0,992
0,994
0,992
0,995
0,992
0,997
0,991
0,99
0,994
0,994
0,992
0,991
0,992
0,985
0,987
0,988
0,985
0,992
0,992
0,99
0,988
0,998
ID
0,992
0,988
0,991
0,995
0,994
0,995
0,995
0,997
ID
0,997
0,99
0,991
0,992
0,99
0,992
0,997
0,998
0,99
0,992
0,991
0,992
0,99
1
0,99
0,995
1
ID
0,998
0,995
0,998
0,991
0,992
0,994
0,991
0,997
0,998
0,994
0,991
0,992
0,994
0,997
0,991
0,995
0,99
0,997
0,998
0,998
ID
0,997
1
0,992
0,994
0,995
0,992
0,995
1
0,995
0,992
0,994
0,992
0,995
0,992
0,997
0,991
0,995
ID
1
0,998
0,995
0,998
0,991
0,992
0,994
0,991
0,997
0,998
0,994
0,991
0,992
0,994
0,997
0,991
0,995
0,99
ID
ID
0,995
0,995
0,997
0,994
0,997
0,991
0,992
0,994
0,991
0,992
0,997
0,992
0,99
0,991
0,99
0,992
0,99
0,994
0,988
0,444 0,445 0,445 0,444 0,443 0,444 0,443 0,443 0,444 0,445 0,445 0,444 0,443 0,441 0,443 0,444 0,445 0,441 0,443 0,443
Peru 1: AJ557129.1; Col 1: AJ586117.1; Col 2: AJ586114.1; Col 3: AJ586116.1; Col 4: GQ397986.1; Col 5: GQ397982.1; Peru 2: 50428964:4284-5051; Col 6:
AJ560291.1; Col 7: 37665095; Col 8: GQ397977.1; LIYV- USA: 20153353:4964-6322
13MED
22FB
23FB
27UN
28UN
54MR
90MY
91MY
92MY
93MY
Peru 1
Col 1
Col 2
Col 3
Col 4
Col 5
Peru 2
Col 6
Col 7
Col 8
LIYVUSA
El112
El análisis filogenético utilizó 749 posiciones, 328 de las cuales resultaron constantes, 407
variables pero no informativas y 14 informativas para el método de máxima parsimonia. El
dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,99, Índice de Retención (RI) de
0,90 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,0 y agrupó las cepas de PYVV bajo análisis en
un gran clado soportado por un 100% de valor de bootstrap. Este clado incluyó
indistintamente cepas de referencia previamente secuenciadas de Colombia y Perú y los 10
aislamientos evaluados en este trabajo. La secuencia del crinivirus LIYV se ubicó
externamente al clado de PYVV con un alto número de cambios con respecto al clado
principal (Figura 21).
113
Figura 21. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PYVV
obtenidos de cultivos de papa de Colombia y Perú. Método de máxima parsimonia utilizando la opción
Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de
Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
114
5.5.3. Afinidades filogenéticas de aislamientos PVS
Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PVSCPF y PVSR generaron los amplicones del
tamaño esperado de ~629 pb (Figura 22). El análisis utilizando 15 secuencias de este virus
y 12 secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PVS de diferentes
orígenes geográficos, indicaron niveles de identidad para la región estudiada superiores al
76%. Los porcentajes de identidad encontrados entre algunas cepas Colombianas de PVS
presentan un alto nivel de identidad (99%) (ej. 24FBPVS y 26FBPVS), mientras que en
otros casos este valor tan sólo alcanzó el 77%. Los aislamientos 57MYPVS, 58MYPVS y
65MYPVS fueron los que compartieron mayores niveles de identidad (>94%) con respecto
a las secuencias de referencia de diferentes países (EEUU, Escocia, China, Siria,
Alemania), mientras que el aislamiento de referencia más distante correspondió al obtenido
de Vltava (República Checa) (AJ863510), que en ningún caso compartió niveles superiores
al 87%. El virus Carnation latent virus (CLV), virus tipo del género Carlavirus utilizado
como grupo externo en el análisis, tan sólo presentó niveles de identidad cercanos al 46%
con respecto a las cepas de PVS (Tabla 17).
115
Figura 22. Amplicones obtenidos con los cebadores PVSCPF y PVSR (629 pb) a partir de tejido foliar de
plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: P3 Pasto-La Victoria, 3:P4
Pasto-La Victoria, 4: P4 2 Pasto-La Victoria, 5: PEF Sta Bárbara, 6: IPesp Ipiales-Saguarán, 7: IP4 IpialesSuras, 8: Control negativo.
El análisis filogenético utilizó 492 posiciones, 147 de las cuales resultaron constantes, 176
variables pero no informativas y 169 informativas para el método de máxima parsimonia.
El dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,74, Índice de Retención (RI)
de 0,86 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,26 y separó las cepas de PVS en dos clados
principales (I, II) fuertemente soportados por valores de bootstrap (98 y 99%). El grupo I
incluyó 12 cepas de PVS obtenidas en este estudio de cultivos de papa de Antioquia,
Cundinamarca y Nariño, además de una cepa de referencia de Vltava (PVS raza A). Sin
embargo, al interior de este clado, se presentaron dos subgrupos fuertemente soportados por
valores de Bootstrap superiores al 99% y con un alto número de cambios entre ellos, que se
manifiestan en porcentajes de identidad inferiores al 80% entre las secuencias de sus
integrantes. En el clado II, se agruparon las secuencias de tres aislamientos de PVS
procedentes de la sabana Cundiboyacense (57MY, 58MY y 65MY) con 11 aislamientos de
116
referencia obtenidos del GenBank, siendo evidente un menor nivel de variabilidad al
interior de este grupo, pues todos los integrantes compartieron porcentajes de identidad en
la secuencia estudiada superiores al 93% (Figura 23).
117
ID
0,989
0,931
0,941
0,794
0,788
0,946
0,964
0,977
0,84
0,771
0,79
0,784
0,769
0,771
0,788
0,788
0,786
0,782
0,778
0,778
0,775
0,769
0,771
0,773
0,757
0,778
24FB
0,431
0,989
ID
0,929
0,939
0,796
0,79
0,939
0,958
0,97
0,834
0,769
0,792
0,782
0,771
0,773
0,786
0,786
0,784
0,784
0,78
0,78
0,778
0,771
0,773
0,775
0,757
0,78
26FB
0,425
0,931
0,929
ID
0,939
0,798
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0,942
0,938
0,95
0,857
0,788
0,794
0,794
0,792
0,792
0,796
0,796
0,792
0,786
0,782
0,782
0,782
0,775
0,78
0,778
0,773
0,786
55MY
0,439
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0,939
0,939
ID
0,809
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0,931
0,95
0,96
0,842
0,786
0,804
0,786
0,782
0,784
0,807
0,807
0,798
0,798
0,792
0,792
0,79
0,784
0,786
0,788
0,763
0,792
56MY
0,462
0,794
0,796
0,798
0,809
ID
0,993
0,795
0,805
0,815
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0,757
0,993
0,769
0,773
0,775
0,968
0,968
0,943
0,939
0,958
0,96
0,96
0,954
0,952
0,952
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57MY
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0,993
ID
0,788
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0,97
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0,962
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0,954
0,954
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58MY
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ID
0,95
0,962
0,853
0,79
0,79
0,795
0,786
0,788
0,795
0,795
0,79
0,788
0,786
0,786
0,784
0,772
0,78
0,782
0,766
0,79
59MY
0,429
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0,938
0,95
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0,95
ID
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0,787
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0,78
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0,785
61MY
0,435
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0,97
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0,962
0,987
ID
0,859
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0,809
0,809
0,804
0,8
0,798
0,798
0,796
0,79
0,792
0,794
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0,796
62MY
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0,857
0,842
0,757
0,751
0,853
0,847
0,859
ID
0,865
0,753
0,859
0,848
0,85
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0,766
0,766
0,757
0,763
0,753
0,753
0,745
0,753
0,751
0,782
0,763
63MY
0,417
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0,769
0,788
0,786
0,757
0,755
0,79
0,778
0,79
0,865
ID
0,755
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0,939
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0,765
0,767
0,767
0,755
0,755
0,751
0,755
0,753
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64MY
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0,794
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0,993
0,995
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0,811
0,753
0,755
ID
0,767
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0,973
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0,956
0,956
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65MY
0,421
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0,794
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0,769
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0,795
0,787
0,798
0,859
0,937
0,767
ID
0,958
0,962
0,775
0,775
0,775
0,782
0,778
0,767
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0,767
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0,782
66MY
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0,771
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ID
0,995
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0,78
0,78
0,782
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0,771
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0,771
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67MY
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0,784
0,775
0,773
0,788
0,78
0,792
0,85
0,939
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0,962
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ID
0,782
0,782
0,782
0,784
0,782
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0,769
0,773
0,771
0,867
0,788
68MY
0,458
0,788
0,786
0,796
0,807
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0,795
0,799
0,809
0,766
0,767
0,973
0,775
0,78
0,782
ID
1
0,956
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0,964
0,973
0,973
0,958
0,964
0,964
0,788
0,95
S co 1
0,458
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0,796
0,807
0,968
0,97
0,795
0,799
0,809
0,766
0,767
0,973
0,775
0,78
0,782
1
ID
0,956
0,962
0,964
0,973
0,973
0,958
0,964
0,964
0,788
0,95
S co 2
0,445
0,786
0,784
0,792
0,798
0,943
0,946
0,79
0,795
0,804
0,766
0,765
0,946
0,775
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0,782
0,956
0,956
ID
0,943
0,952
0,948
0,952
0,935
0,948
0,943
0,798
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Ch 1
0,445
0,782
0,784
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0,941
0,788
0,791
0,8
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0,943
0,782
0,782
0,784
0,962
0,962
0,943
ID
0,943
0,948
0,952
0,931
0,943
0,943
0,788
0,941
Ger 1
0,445
0,778
0,78
0,782
0,792
0,958
0,96
0,786
0,787
0,798
0,763
0,767
0,96
0,778
0,78
0,782
0,964
0,964
0,952
0,943
ID
0,958
0,958
0,941
0,95
0,95
0,786
0,937
S co 3
0,451
0,778
0,78
0,782
0,792
0,96
0,962
0,786
0,789
0,798
0,753
0,755
0,964
0,767
0,771
0,773
0,973
0,973
0,948
0,948
0,958
ID
0,995
0,95
0,987
0,991
0,775
0,941
US A 1
0,456
0,775
0,778
0,782
0,79
0,96
0,962
0,784
0,787
0,796
0,753
0,755
0,964
0,767
0,771
0,773
0,973
0,973
0,952
0,952
0,958
0,995
ID
0,95
0,991
0,991
0,78
0,946
S yria
0,456
0,769
0,771
0,775
0,784
0,954
0,956
0,772
0,78
0,79
0,745
0,751
0,958
0,763
0,767
0,769
0,958
0,958
0,935
0,931
0,941
0,95
0,95
ID
0,946
0,946
0,773
0,921
US A 2
0,453
0,771
0,773
0,78
0,786
0,952
0,954
0,78
0,783
0,792
0,753
0,755
0,956
0,767
0,771
0,773
0,964
0,964
0,948
0,943
0,95
0,987
0,991
0,946
ID
0,991
0,78
0,937
US A 3
0,456
0,773
0,775
0,778
0,788
0,952
0,954
0,782
0,785
0,794
0,751
0,753
0,956
0,765
0,769
0,771
0,964
0,964
0,943
0,943
0,95
0,991
0,991
0,946
0,991
ID
0,778
0,937
US A 4
0,435
0,757
0,757
0,773
0,763
0,778
0,773
0,766
0,762
0,773
0,782
0,834
0,778
0,852
0,865
0,867
0,788
0,788
0,798
0,788
0,786
0,775
0,78
0,773
0,78
0,778
ID
0,782
Ger 2
0,46
0,778
0,78
0,786
0,792
0,933
0,935
0,79
0,785
0,796
0,763
0,765
0,935
0,782
0,786
0,788
0,95
0,95
0,935
0,941
0,937
0,941
0,946
0,921
0,937
0,937
0,782
ID
Ch 2
ID
0,433
0,431
0,425
0,439
0,462
0,46
0,427
0,429
0,435
0,41
0,417
0,46
0,421
0,421
0,425
0,458
0,458
0,445
0,445
0,445
0,451
0,456
0,456
0,453
0,456
0,435
0,46
CLVIreland
Tabla 17. Matriz de identidad para cepas del virus PVS en cultivos de papa de Colombia y el Mundo.
PVS
0,433
Sco 1: GU144327.1; Sco 2: GU144325.1; Ch 1: AJ889246.1; Ger 1: Y15625.1; Sco 3: GU144330.1; USA: FJ813512.1; Syria: AB364946.1; USA 1: S45593.1; USA 3: FJ813514.1; USA 4: FJ813513.1; Ger 2: AJ863510.1; Ch 2: AY687337.1; CLV- Ireland: X52627.1
24FB
26FB
55MY
56MY
57MY
58MY
59MY
61MY
62MY
63MY
64MY
65MY
66MY
67MY
68MY
S co 1
S co 2
Ch 1
Ger 1
S co3
US A 1
S yria
US A 2
US A 3
US A 4
Ger 2
Ch 2
CLVIreland
118
Figura 23. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PVS
obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción
Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de
Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
119
5.5.4. Afinidades filogenéticas de aislamientos PLRV
Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PLRVF y PLRVR generaron los amplicones del
tamaño esperado de ~330 pb (Figura 24). El análisis utilizando 18 secuencias de este virus
y 14 secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PLRV de diferentes
orígenes geográficos, indicó niveles de identidad para la región estudiada superiores al
97%. Estos valores se presentaron tanto entre cepas obtenidas de cultivos de papa de los
cuatro departamentos colombianos evaluados, como con respecto a las cepas de referencia
utilizadas. El virus Cereal yelow dwarf virus (CYDV), un polerovirus utilizado como grupo
externo en el análisis, presentó niveles de identidad cercanos al 77% con respecto a las
cepas de PLRV incluidas en el estudio (Tabla 18).
Figura 24. Amplicones obtenidos con los cebadores PLRVF y PLRVR (330 pb) a partir de tejido foliar de
plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: V2 Villapinzón, 3:V7
Villapinzón, 4: V8 Villapinzón, 5: Z3 Zipaquirá, 6: O4 Madrid, 7: O6 Madrid, 8: Control negativo.
120
El análisis filogenético utilizó 328 posiciones, 241 de las cuales resultaron constantes, 72
variables pero no informativas y 15 informativas para el método de máxima parsimonia. El
dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,87, Índice de Retención (RI) de
0,83 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,12 y agrupó en un sólo clado (100% bootstrap)
todas las cepas de PLRV, incluyendo las obtenidas en este estudio y aquellas de referencia,
no presentándose ningún subgrupo interno soportado con altos valores de bootstrap (Figura
25).
121
Tabla 18. Matriz de identidad para cepas del virus PLRV de Colombia y el Mundo
CYDVPLRV
1BM 1C 2BM 2C 3BM 4BM 4C 5BM 5C 6BM 6C 7BM 7C 8C 9BM 14MED 20FB 87MY India Can S.Kor CzR Fran 1 Neth Ch 1 Ch 2 Ch 3 Fran 2 Fran 3 Fran 4 Fran 5 Fran 6
USA
1BM
ID 0,987 0,993 1 0,996 0,99 0,984 0,99 0,984 0,993 0,987 0,987 0,987 0,987 0,987 0,99 0,996 0,993 0,993 0,993 0,99 0,99 0,99 0,99 0,987 0,987 0,99 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,771
1C
0,987 ID 0,981 0,987 0,984 0,996 0,996 0,99 0,996 0,981 1 0,987 1
1 0,993 0,99 0,984 0,981 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,981 0,984 0,981 0,981 0,984 0,978 0,984 0,777
2BM
0,993 0,981 ID 0,993 0,996 0,984 0,978 0,984 0,978 0,987 0,981 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,99 0,987 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,981 0,981 0,984 0,981 0,981 0,978 0,978 0,978 0,765
2C
1 0,987 0,993 ID 0,996 0,99 0,984 0,99 0,984 0,993 0,987 0,987 0,987 0,987 0,987 0,99 0,996 0,993 0,993 0,993 0,99 0,99 0,99 0,99 0,987 0,987 0,99 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,771
3BM
0,996 0,984 0,996 0,996 ID 0,987 0,981 0,987 0,981 0,99 0,984 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,993 0,99 0,99 0,99 0,987 0,987 0,987 0,987 0,984 0,984 0,987 0,984 0,984 0,981 0,981 0,981 0,768
4BM
0,99 0,996 0,984 0,99 0,987 ID 0,993 0,993 0,993 0,984 0,996 0,99 0,996 0,996 0,996 0,993 0,987 0,984 0,984 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,978 0,981 0,978 0,978 0,981 0,975 0,981 0,774
4C
0,984 0,996 0,978 0,984 0,981 0,993 ID 0,987 1 0,978 0,996 0,984 0,996 0,996 0,99 0,987 0,981 0,978 0,984 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,978 0,981 0,978 0,978 0,981 0,975 0,981 0,774
5BM
0,99 0,99 0,984 0,99 0,987 0,993 0,987 ID 0,987 0,984 0,99 0,996 0,99 0,99 0,99
1
0,987 0,984 0,984 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,978 0,981 0,978 0,978 0,981 0,975 0,981 0,768
5C
0,984 0,996 0,978 0,984 0,981 0,993 1 0,987 ID 0,978 0,996 0,984 0,996 0,996 0,99 0,987 0,981 0,978 0,984 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,978 0,981 0,978 0,978 0,981 0,975 0,981 0,774
6BM
0,993 0,981 0,987 0,993 0,99 0,984 0,978 0,984 0,978 ID 0,981 0,987 0,981 0,981 0,981 0,984 0,99 0,987 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,984 0,981 0,981 0,978 0,978 0,978 0,771
6C
0,987 1 0,981 0,987 0,984 0,996 0,996 0,99 0,996 0,981 ID 0,987 1
1 0,993 0,99 0,984 0,981 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,981 0,984 0,981 0,981 0,984 0,978 0,984 0,777
7BM
0,987 0,987 0,981 0,987 0,984 0,99 0,984 0,996 0,984 0,987 0,987 ID 0,987 0,987 0,987 0,996 0,984 0,981 0,981 0,981 0,978 0,978 0,978 0,978 0,981 0,975 0,978 0,975 0,975 0,978 0,972 0,978 0,771
7C
0,987 1 0,981 0,987 0,984 0,996 0,996 0,99 0,996 0,981 1 0,987 ID
1 0,993 0,99 0,984 0,981 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,981 0,984 0,981 0,981 0,984 0,978 0,984 0,777
8C
0,987 1 0,981 0,987 0,984 0,996 0,996 0,99 0,996 0,981 1 0,987 1
ID 0,993 0,99 0,984 0,981 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,981 0,984 0,981 0,981 0,984 0,978 0,984 0,777
9BM
0,987 0,993 0,981 0,987 0,984 0,996 0,99 0,99 0,99 0,981 0,993 0,987 0,993 0,993 ID
0,99 0,984 0,981 0,981 0,981 0,978 0,978 0,978 0,978 0,981 0,975 0,984 0,975 0,975 0,978 0,972 0,978 0,771
14MED 0,99 0,99 0,984 0,99 0,987 0,993 0,987 1 0,987 0,984 0,99 0,996 0,99 0,99 0,99
ID
0,987 0,984 0,984 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,978 0,981 0,978 0,978 0,981 0,975 0,981 0,768
20FB
0,996 0,984 0,99 0,996 0,993 0,987 0,981 0,987 0,981 0,99 0,984 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987
ID
0,99 0,99 0,99 0,987 0,993 0,993 0,993 0,984 0,99 0,987 0,99
0,99 0,987 0,987 0,987 0,768
87MY
0,993 0,981 0,987 0,993 0,99 0,984 0,978 0,984 0,978 0,987 0,981 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,99
ID 0,987 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,981 0,981 0,984 0,981 0,981 0,984 0,978 0,984 0,765
India
0,993 0,987 0,987 0,993 0,99 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,981 0,987 0,987 0,981 0,984 0,99 0,987 ID
1
0,996 0,996 0,996 0,996 0,993 0,993 0,996 0,993 0,993 0,99
0,99
0,99
0,777
Can
0,993 0,987 0,987 0,993 0,99 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,981 0,987 0,987 0,981 0,984 0,99 0,987 1
ID 0,996 0,996 0,996 0,996 0,993 0,993 0,996 0,993 0,993 0,99
0,99
0,99
0,777
S.Kor
0,99 0,984 0,984 0,99 0,987 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,984 0,978 0,984 0,984 0,978 0,981 0,987 0,984 0,996 0,996 ID 0,993 0,993 0,993 0,99 0,99 0,993 0,99
0,99 0,987 0,987 0,987 0,774
CzR
0,99 0,984 0,984 0,99 0,987 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,984 0,978 0,984 0,984 0,978 0,981 0,993 0,984 0,996 0,996 0,993 ID
1
1 0,99 0,996 0,993 0,996 0,996 0,993 0,993 0,993 0,774
Fran 1
0,99 0,984 0,984 0,99 0,987 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,984 0,978 0,984 0,984 0,978 0,981 0,993 0,984 0,996 0,996 0,993 1
ID
1 0,99 0,996 0,993 0,996 0,996 0,993 0,993 0,993 0,774
Neth
0,99 0,984 0,984 0,99 0,987 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,984 0,978 0,984 0,984 0,978 0,981 0,993 0,984 0,996 0,996 0,993 1
1
ID 0,99 0,996 0,993 0,996 0,996 0,993 0,993 0,993 0,774
Ch 1
0,987 0,987 0,981 0,987 0,984 0,984 0,984 0,984 0,984 0,987 0,987 0,981 0,987 0,987 0,981 0,984 0,984 0,981 0,993 0,993 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 0,993 0,99 0,987 0,987 0,99 0,984 0,99
0,771
Ch 2
0,987 0,981 0,981 0,987 0,984 0,978 0,978 0,978 0,978 0,987 0,981 0,975 0,981 0,981 0,975 0,978 0,99 0,981 0,993 0,993 0,99 0,996 0,996 0,996 0,993 ID 0,99 0,993 0,993 0,99
0,99
0,99
0,771
Ch 3
0,99 0,984 0,984 0,99 0,987 0,981 0,981 0,981 0,981 0,984 0,984 0,978 0,984 0,984 0,984 0,981 0,987 0,984 0,996 0,996 0,993 0,993 0,993 0,993 0,99 0,99 ID
0,99
0,99 0,987 0,987 0,987 0,774
Fran 2 0,987 0,981 0,981 0,987 0,984 0,978 0,978 0,978 0,978 0,981 0,981 0,975 0,981 0,981 0,975 0,978 0,99 0,981 0,993 0,993 0,99 0,996 0,996 0,996 0,987 0,993 0,99
ID
0,993 0,99
0,99
0,99
0,774
Fran 3 0,987 0,981 0,981 0,987 0,984 0,978 0,978 0,978 0,978 0,981 0,981 0,975 0,981 0,981 0,975 0,978 0,99 0,981 0,993 0,993 0,99 0,996 0,996 0,996 0,987 0,993 0,99 0,993
ID
0,99 0,996 0,99
0,771
Fran 4 0,984 0,984 0,978 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,981 0,978 0,984 0,978 0,984 0,984 0,978 0,981 0,987 0,984 0,99 0,99 0,987 0,993 0,993 0,993 0,99 0,99 0,987 0,99
0,99
ID
0,987
1
0,768
Fran 5 0,984 0,978 0,978 0,984 0,981 0,975 0,975 0,975 0,975 0,978 0,978 0,972 0,978 0,978 0,972 0,975 0,987 0,978 0,99 0,99 0,987 0,993 0,993 0,993 0,984 0,99 0,987 0,99 0,996 0,987
ID
0,987 0,774
Fran 6 0,984 0,984 0,978 0,984 0,981 0,981 0,981 0,981 0,981 0,978 0,984 0,978 0,984 0,984 0,978 0,981 0,987 0,984 0,99 0,99 0,987 0,993 0,993 0,993 0,99 0,99 0,987 0,99
0,99
1
0,987
ID
0,768
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ID
USA
India: AF539791.1; Can: D13954.1; S.Kor: U73777.1; CzcheRep: EU313202.2; Fran 1: AF453394.1; Neth: X77322.1; Ch 1: FJ859021.1; Ch 2: FJ859015.1; Ch 3: EF063711.1; Fran 2: OP- AF453389.1; Fran 3: Zim13- AF453388.1; Fran 4: CU87- AF453393.1; Fran 5: FR1- AF453391.1;
Fran 6: NOIR- AF453390.1; CYDV- USA: DQ115534.1
122
Figura 25. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PLRV
obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción
Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de
Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
123
5.5.5. Afinidades filogenéticas de aislamientos PVX.
Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PVXF y PVXR produjeron los amplicones del
tamaño esperado de ~562 pb (Figura 26). El análisis utilizando 14 secuencias de este virus
procedentes de cultivos de papa de Colombia y 20 secuencias de referencia obtenidas del
GenBank de cepas de PVX representando diferentes razas de este virus y orígenes
geográficos diferentes, indicó niveles de identidad para la región estudiada superiores al
76%; presentándose un grupo de 11 cepas que compartieron niveles de identidad superiores
a 94% entre ellas y con el conjunto principal de las cepas de referencia utilizadas en el
análisis. Las otras cepas colombianas (29BM, 23Col, 53MY), presentaron identidades
menores con respecto al grupo principal, variando desde 86% al 77%, destacándose que las
cepas 23Col y 53MY no compartieron niveles superiores al 80% con ninguno de los otros
aislamientos analizados. El nivel de identidad de la secuencia de referencia utilizada como
grupo externo (Cymbidium mosaic virus, CyMV) con relación a las cepas de PVX fue
inferior al 48% (Tabla 19).
El análisis filogenético utilizó 542 posiciones, 188 de las cuales resultaron constantes, 173
variables pero no informativas y 181 informativas para el método de máxima parsimonia.
El dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,73, Índice de Retención (RI)
de 0,72 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,27 y separó las cepas de PVX bajo análisis en
tres clados (I, II, III) fuertemente soportados por valores de bootstrap superiores al 92%,
siendo el grupo I mayoritario al contener 11 cepas de Colombia y 18 de referencia, mientras
que el clado II tan sólo contiene dos cepas (23Col y 53MY), al igual que el clado III, que
124
incluye dos cepas de referencia del Reino Unido. Adicionalmente, dentro del clado I, se
presentó el aislamiento 29BM como un cluster individual, pero no soportado por el análisis
de bootstrap (Figura 27).
Figura 26. Amplicones obtenidos con los cebadores PVXF y PVXR (562 pb) a partir de tejido foliar de
plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 9: AVOP Carmen de Viboral, 10:
MRijk Santuario, 11: P Carmen de Viboral, 12: Control negativo.
125
ID
0,946
0,946
0,974
0,786
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0,962
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0,964
0,964
0,784
0,962
0,987
0,773
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0,964
0,951
0,946
0,979
0,975
0,977
0,975
0,975
0,964
0,955
0,942
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0,97
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ID
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0,946
0,779
0,773
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0,955
0,957
0,949
0,959
0,962
0,957
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0,953
0,953
0,946
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18FB
0,479
0,946
0,998
ID
0,957
0,79
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0,866
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0,788
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0,781
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ID
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0,868
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0,964
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ID
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ID
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Korea
S co 1
1
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0,964
0,975
0,949
0,964
0,957
0,964
0,959
S pain
0,477
0,977
0,957
0,957
0,981
0,794
0,97
0,977
0,87
0,975
0,975
0,974
0,792
0,974
0,981
0,775
0,773
0,983
0,97
0,959
0,99
0,987
ID
0,981
0,983
0,975
0,97
0,955
0,97
0,977
0,955
0,97
0,962
0,97
0,964
Ch 3
0,477
0,975
0,949
0,949
0,974
0,795
0,962
0,97
0,858
0,968
0,968
0,966
0,794
0,966
0,981
0,766
0,768
0,968
0,955
0,953
0,983
0,983
0,981
ID
0,975
0,968
0,962
0,948
0,959
0,97
0,944
0,959
0,957
0,959
0,957
S co 2
0,477
0,975
0,959
0,959
0,994
0,79
0,964
0,972
0,864
0,974
0,977
0,968
0,788
0,968
0,975
0,775
0,775
0,97
0,968
0,953
0,988
0,981
0,983
0,975
ID
0,977
0,964
0,949
0,964
0,99
0,949
0,964
0,957
0,964
0,959
UK 3
0,47
0,964
0,962
0,962
0,972
0,792
0,97
0,979
0,868
0,979
0,983
0,974
0,79
0,974
0,964
0,771
0,773
0,968
0,961
0,957
0,974
0,97
0,975
0,968
0,977
ID
0,972
0,957
0,972
0,968
0,957
0,972
0,961
0,972
0,966
Ch 4
0,468
0,955
0,957
0,957
0,959
0,795
0,974
0,979
0,87
0,979
0,979
0,977
0,794
0,977
0,961
0,773
0,771
0,962
0,959
0,951
0,968
0,968
0,97
0,962
0,964
0,972
ID
0,957
0,97
0,955
0,957
0,977
0,955
0,974
0,964
UK 4
0,477
0,942
0,948
0,949
0,944
0,781
0,961
0,961
0,87
0,962
0,962
0,961
0,779
0,961
0,948
0,773
0,779
0,949
0,955
0,955
0,953
0,949
0,955
0,948
0,949
0,957
0,957
ID
0,961
0,94
0,955
0,957
0,959
0,962
0,955
India
0,47
0,959
0,953
0,953
0,959
0,79
0,97
0,975
0,866
0,974
0,974
0,972
0,788
0,975
0,962
0,769
0,766
0,961
0,955
0,955
0,968
0,964
0,97
0,959
0,964
0,972
0,97
0,961
ID
0,955
0,955
0,97
0,959
0,974
0,972
Iran
0,481
0,97
0,953
0,953
0,992
0,788
0,955
0,962
0,864
0,964
0,968
0,959
0,786
0,959
0,97
0,777
0,777
0,964
0,959
0,944
0,983
0,975
0,977
0,97
0,99
0,968
0,955
0,94
0,955
ID
0,944
0,955
0,948
0,955
0,949
Ch 5
0,474
0,94
0,946
0,946
0,948
0,782
0,957
0,961
0,86
0,962
0,962
0,961
0,781
0,961
0,944
0,769
0,768
0,946
0,944
0,948
0,953
0,949
0,955
0,944
0,949
0,957
0,957
0,955
0,955
0,944
ID
0,957
0,951
0,966
0,957
0,479
0,955
0,957
0,957
0,959
0,792
0,97
0,975
0,87
0,975
0,975
0,974
0,79
0,974
0,959
0,768
0,766
0,961
0,955
0,951
0,968
0,964
0,97
0,959
0,964
0,972
0,977
0,957
0,97
0,955
0,957
ID
0,955
0,977
0,968
0,483
0,949
0,938
0,938
0,951
0,792
0,955
0,964
0,855
0,961
0,961
0,959
0,79
0,959
0,955
0,766
0,771
0,953
0,959
0,996
0,961
0,957
0,962
0,957
0,957
0,961
0,955
0,959
0,959
0,948
0,951
0,955
ID
0,959
0,951
Japan Korea Korea
1
2
3
0,474
0,959
0,957
0,957
0,959
0,786
0,968
0,975
0,864
0,974
0,974
0,972
0,784
0,972
0,962
0,771
0,766
0,964
0,959
0,955
0,968
0,964
0,97
0,959
0,964
0,972
0,974
0,962
0,974
0,955
0,966
0,977
0,959
ID
0,975
Ch 6
0,474
0,961
0,955
0,955
0,953
0,782
0,962
0,97
0,866
0,968
0,968
0,966
0,781
0,97
0,961
0,76
0,756
0,959
0,949
0,948
0,962
0,959
0,964
0,957
0,959
0,966
0,964
0,955
0,972
0,949
0,957
0,968
0,951
0,975
ID
ID
0,481
0,479
0,479
0,481
0,463
0,468
0,47
0,479
0,476
0,474
0,476
0,463
0,474
0,481
0,468
0,477
0,47
0,474
0,481
0,477
0,476
0,477
0,477
0,477
0,47
0,468
0,477
0,47
0,481
0,474
0,479
0,483
0,474
0,474
Japan CyMV2
Korea
Tabla 19. Mariz de identidad para cepas del virus PVX de Colombia y el Mundo
PVX
0,481
UK 1: DY- X88781.1; UK2: X88782.1; Ch 1: EF063709.1; Ch 2: EU095494.1; Korea 1: KO2- AF260641.1; Scotland 1: GU144353.1; Spain: AJ505748.1; Ch 4: GU373815.1; Scotland 2: GU144360.1; UK 3: X88783.1; Ch 4: HM036197.1; UK 4: NI- X88784.1; India: GU256064.1; Iran: FJ461343.1; Ch 5:
U19790.1; Japan 1: BS- AB056719.1; Korea 2: AF373782.1; Korea 3: KO1- AF260640.1; Ch 6: Taiwan- AF272736.2; Japan 2: AB056718.1; CyMV- Korea: AB541573.1
17FB
18FB
19FB
22COL
23COL
27BM
28BM
29BM
50MY
51MY
52MY
53MY
54MY
58MR
UK 1
UK 2
Ch 1
Ch 2
Korea 1
S co 1
S pain
Ch 3
S cot 2
UK 3
Ch 4
UK 4
India
Iran
Ch 5
Japan 1
Korea 2
Korea 3
Ch 6
Japan 2
CyMVKorea
126
Figura 27. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PVX
obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción
Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de
Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
127
5.5.6. Afinidades filogenéticas de aislamientos PMTV
Las pruebas de RT-PCR para el virus PMTV se realizaron con dos pares de cebadores:
PMTVF4 y PMTVR4 que produjeron los amplicones del tamaño esperado de ~417 pb
(Figura 28) y H360 y C819 que a su vez produjeron los amplicones del tamaño esperado de
~460 pb (Figura 30). El análisis para el primer par de cebadores se hizo empleando tres
secuencias de este virus procedentes de cultivos de papa de Colombia, junto con una
secuencia obtenida por inmuno-captura post-ELISA del control positivo del kit de Bioreba
y siete secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PMTV representando
diferentes orígenes geográficos. Los resultados indicaron niveles de identidad para la región
TGB2 superiores al 97% entre los aislamientos colombianos; siendo la excepción la cepa
70MY, que presentó niveles superiores al 86% con respecto a las cepas Colombianas y a las
de referencia. El nivel de identidad de la secuencia de referencia utilizada como grupo
externo Beet soil-borne virus (BSBV) con relación a las demás cepas fue inferior al 67%
(Tabla 20).
El análisis filogenético utilizó 424 posiciones, 256 de las cuales resultaron constantes, 148
variables pero no informativas y 20 informativas para el método de máxima parsimonia. El
dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,97, Índice de Retención (RI) de
0,82 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,03 y agrupó las cepas de PMTV en estudio con
las de referencia en un clado fuertemente soportado por un bootstrap de 100%. Dentro de
este clado se ubicaron dos cluster soportados por valores de boostrap superiores al 70%,
donde el primero agrupó el aislamiento correspondiente al post-ELISA del kit Bioreba con
cepas de Suecia y Reino Unido, mientras que el segundo agrupó dos de las cepas
128
Colombianas (66MR y 67MR) con cepas de Dinamarca y República Checa. Por otro lado,
la cepa 70MY se localizó por fuera del clado como un cluster individual, no soportado por
el análisis bootstrap (Figura 29).
Figura 28. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb) a partir de tejido de raíz
de N. benthamiana de dos departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: R25 La Unión, 3: R36 La
Unión, 4: RValle La Unión, 5: R25 dilución 1/10, 6: R36 dilución 1/10, 7: RValle dilución 1/10, 8: Control
negativo.
129
Tabla 20. Matriz de identidad para cepas del virus PMTV (TGB) de Colombia y el Mundo.
Sweden
Denmark
Denmark Sweden
BSBVPMTV
9MED 66MR 67MR 70MY
CzRep 1
CzRep 2
UK
1
1
2
2
China
9MED
ID
0,98
0,98
0,86
0,988
0,983
0,983
0,98
0,98
0,978
0,988
0,672
66MR
0,98
ID
1
0,867
0,98
0,99
0,99
0,988
0,973
0,985
0,98
0,667
67MR
0,98
1
ID
0,867
0,98
0,99
0,99
0,988
0,973
0,985
0,98
0,667
70MY
0,86
0,867 0,867
ID
0,86
0,865
0,865
0,865
0,86
0,86
0,86
0,646
Sweden 1
0,988
0,98
0,98
0,86
ID
0,99
0,99
0,988
0,988
0,985
1
0,674
CzRep 1
0,983
0,99
0,99 0,865
0,99
ID
1
0,997
0,983
0,995
0,99
0,674
Denmark
0,983
0,99
0,99 0,865
0,99
1
ID
0,997
0,983
0,995
0,99
0,674
1
CzRep 2
0,98
0,988 0,988 0,865
0,988
0,997
0,997
ID
0,98
0,992
0,988
0,677
UK
0,98
0,973 0,973 0,86
0,988
0,983
0,983
0,98
ID
0,978
0,988
0,679
Denmark
0,978 0,985 0,985 0,86
0,985
0,995
0,995
0,992
0,978
ID
0,985
0,669
2
Sweden 2
0,988
0,98
0,98
0,86
1
0,99
0,99
0,988
0,988
0,985
ID
0,674
BSBV0,672 0,667 0,667 0,646
0,674
0,674
0,674
0,677
0,679
0,669
0,674
ID
China
Sweden 1: AJ277556.1; CzechRepublic 1: AY187010.1; Denmark: AY426745.1; CzechRepublic 2: DQ144451.1; UK: D30753.1; Denmark 2:
AY353719.2; Sweden 2: NC_003725.1; BSBV- China: EF545142.1
130
Figura 29. Árbol filogenético basado en secuencias parciales del TGB2 viral para aislamientos de PMTV
obtenidos cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción
Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de
Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
131
Para el segundo par de cebadores, el análisis se realizó empleando cuatro secuencias de éste
virus procedentes de cultivos de papa de Colombia, junto con una secuencia obtenida por
inmuno-captura post-ELISA del control positivo del kit de Bioreba y 15 secuencias de
referencia obtenidas del GenBank de cepas de PMTV representando diferentes orígenes
geográficos. Dicho análisis indicó niveles de identidad para la región CP superiores al 98%;
con excepción de los aislamientos 71MY y 72MY, los cuales presentaron niveles
superiores al 76% respecto a las otras cepas Colombianas y a las de referencia. El nivel de
identidad de la secuencia de referencia utilizada como grupo externo Beet soil-borne virus
(BSBV) con relación a las demás cepas, fue inferior al 59% (Tabla 21).
Figura 30. Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (460 pb) a partir de tejido de raíz de N.
benthamiana de tres departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: R25 La Unión, 3: R36 La Unión, 4:
RValle La Unión, 5: R25 dilución 1/10, 6: R36 dilución 1/10, 7: RValle dilución 1/10, 8: Control negativo.
132
Tabla 21. Matriz de identidad para cepas del virus PMTV (CP) de Colombia y el Mundo.
Pol
CzR Den BSBV2
3 China
Can
Jap
Fin 5
Den
Den
Thai
1
2
Fin 4
Sw
Fin 3
0,997 0,997 0,997
CzR
1
Fin 2
0,997
11
70MR 71MR 71MY 72MY Fin 1
MED
0,997
PMTV
0,997
0,591
1
0,987
0,992
0,763
0,766
0,997
0,997
1
1
1
1
1
1
0,997
0,992
0,995
0,995
0,997
ID
0,997
1
1
0,985
0,99
0,761
0,763
0,995
0,995
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,995
0,99
0,992
0,992
ID
0,997
0,995
0,995 0,997
0,763 0,766
1
0,99
0,992
0,985
0,987
0,992
0,763
0,766
0,997
0,997
1
1
1
ID
1
1
0,997
0,992
0,995
0,995
0,997
1
0,997
1
ID
0,987
0,992
0,763
0,766
0,997
0,997
1
1
ID
1
1
1
0,997
0,992
0,995
0,995
0,997
1
0,997
1
11MED
0,987
0,992
0,763
0,766
0,997
0,997
1
ID
1
1
1
1
0,997
0,992
0,995
0,995
0,997
1
0,997
0,596
0,596
0,591
0,591
0,591
0,591
0,591
0,591
0,591
0,591
0,591
0,591
0,593
0,586
0,591
0,591
0,588
0,591
0,588
0,987
0,992
0,763
0,766
0,997
0,997
ID
1
1
1
1
1
0,997
0,992
0,995
0,995
0,997
1
0,997
ID
0,99
0,99
0,76
0,76
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0,99
0,99
0,99
1
1
ID
0,985
0,99
0,763
0,766
1
ID
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,995
0,995
0,992
0,997
0,995
0,997
0,995
0,591 0,591 0,591 0,59 0,59 0,591 0,59 0,588 0,591 0,59
0,98
0,99
0,76
0,77
1
1
1
1
1
1
1
1
0,99
0,99
0,99
ID
0,99
1
0,99
0,985
0,99
0,763
0,766
ID
1
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,995
0,995
0,992
0,997
0,995
0,997
0,995
0,591
0,982
0,987
0,761
0,763
0,992
0,992
0,995
0,995
0,995
0,995
0,995
0,995
0,992
0,987
ID
0,99
0,992
0,995
0,992
0,756
0,761
ID
0,992
0,763
0,763
0,763
0,763
0,763
0,763
0,763
0,763
0,761
0,758
0,761
0,763
0,761
0,763
0,761
0,591
0,98
0,99
0,76
0,76
1
1
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
ID
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
0,995
ID
0,761
0,763
0,99
0,99
0,992
0,992
0,992
0,992
0,992
0,992
0,99
0,985
0,987
0,987
0,99
0,992
0,99
0,591
0,99
0,99
0,76
0,76
1
1
1
1
1
1
1
1
ID
0,99
0,99
0,99
1
1
1
ID
0,995
0,756
0,758
0,985
0,985
0,987
0,987
0,987
0,987
0,987
0,987
0,985
0,98
0,982
0,982
0,985
0,987
0,985
0,591
0,987
0,992
0,763
0,766
0,997
0,997
1
1
1
1
1
ID
0,997
0,992
0,995
0,995
0,997
1
0,997
0,985
0,99
0,763
0,766
1
1
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,997
0,995
0,995
0,992
0,997
0,995
0,997
0,995
0,591
0,987
0,992
0,763
0,766
0,997
0,997
1
1
1
1
ID
1
0,997
0,992
0,995
0,995
0,997
1
0,997
70MR
71MR
71MY
72MY
Fin 1
Fin 2
Fin 3
Fin 4
Fin 5
Can
CzR 1
Sw
Den 1
Thai
Den 2
Jap
Pol
CzR 2
Den 3
0,596 0,591 0,591
0,758
0,763
0,992
ID
0,766
0,766
0,766
0,766
0,766
0,766
0,766
0,766
0,763
0,761
0,763
0,766
0,763
0,766
0,763
BSBV0,591 0,596
China
Fin 1: AM503617.2; Fin 2: AM503631.1; Fin 3: AM503632.1; Fin 4: AM503626.1; Finlad 5: AM503623.1; Can: AY327117.1; CzR 1: DQ102381.1; Sw: AJ243719.1;
Den 1: AF487407.4; Thai: EU016676.1; Den 2: AY196094.2; Jap: D16193.1; Pol: GQ503252.1; CzR: AF393507.1; Den 3: AF487408.2; BSBV- China: EF545141.1
133
El análisis filogenético utilizó 406 posiciones, 200 de las cuales resultaron constantes, 109
variables pero no informativas y 97 informativas para el método de máxima parsimonia. El
dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,99, Índice de Retención (RI) de
0,98 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,01 y agrupó las cepas de PMTV en estudio en
dos clados (I y II) furtemente soportados por valores de bootstrap del 100%. En el primer
clado (I) se agruparon las cepas 70MR y 71MR junto con todas las cepas de referencia,
mientras que en el segundo clado (II) se agruparon las cepas Colombianas 71MY y 72MY
procedentes del altiplando Cundiboyacense (Figura 31).
134
Figura 31. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PMTV
obtenidos cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción
Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de
Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.
135
5.6. Secuencias parciales de los genomas virales
En la tabla 22 se describen los aislamientos y las regiones secuenciadas para la
caracterización parcial de los genomas de los virus estudiados en este trabajo.
Tabla 22. Aislamientos de los virus en estudio y secuencias parciales de sus genomas.
Muestra
Ceja
Carmen
Codigos
secuencias
38MY, 40MY,
42MY, 44MY,
46MY, 48 MY
39MY, 41MY,
45MY, 47MY,
49MY,
Vereda
Municipio
Departamento
Virus
Región
secuenciada
La Lomita
La Ceja
Antioquia
PVY
5' UTR, P1, CP, 3'
UTR
Aldana Abajo
Carmen de
Viboral
Antioquia
PVY
5' UTR, P1, CP, 3'
UTR
RdRp parcial al 3',
TGB1 parcial 5',
TGB3 parcial 3', CP
5' UTR, RdRp
parcial al 5' y 3', CP,
TGB 1 parcial al 5',
TGB3 parcial al 3'
Ceja
59MR, 62MR,
64MR
La Lomita
La Ceja
Antioquia
PVX
Carmen
58MR, 60MR,
61MR, 63MR,
65MR
Aldana Abajo
Carmen de
Viboral
Antioquia
PVX
Carmen
67MY
Aldana Abajo
Antioquia
PVS
CP, 3' UTR
Santuario
Ip4 11-15
TV2 11-15
P4AV
Ip1AV
68MY
87MY
20FB
90MY, 94MY
92MY, 96MY
70MR, 78MR,
84MR, 81MY,
66MR, 68MR,
82MY
Valle de María
Suras
Siguineque
Obonuco
Saguarán
Carmen de
Viboral
Santuario
Ipiales
Turmequé
Pasto
Ipiales
Antioquia
Nariño
Boyacá
Nariño
Nariño
PVS
PLRV
PLRV
PYVV
PYVV
CP, 3' UTR
CP parcial
CP parcial
CP, CPm
CP, CPm
La Cabaña
La Unión
Antioquia
PMTV
CP, CPRT, TGB1
parcial, TGB2,
TGB3, CRP
PMTV
CP parcial, CPRT
parcial, TGB1
parcial, TGB2,
TGB3 parcial, CRP
R25
Rvalle
71MR, 85MY,
67MR, 69MR,
83MY
Vallejuelito
La Unión
Antioquia
5.6.1. Secuencias parciales del genoma de PMTV
Para la amplificación de algunas regiones del genoma del virus PMTV, se tomaron dos
aislamientos del municipio de La Unión, (Antioquia) (Tabla 22) y se realizaron las
136
reacciones de RT-PCR como se indicó en la metodología, empleándose para ello los
cebadores dirigidos al ARN2 (CP) C810 - H360 (Figura 30), H360 – PMTV2017R (Figura
32), PMTV759F – PMTV1552R (Figura 33), PMTV1948F – 123end (Figura 34) y los
cebadores dirigidos al ARN3 (TGB) PMTVF4 – PMTVR4 (Figura 28), PMTV5 USA
RNA3 – PMTV7 USA RNA3 (Figura 35) y PMTVF4 – 123end (Figura 33). Los cebadores
dirigidos al ARN 1 (RdRP) FURO-Hel – 123end, no fueron exitosos para las cepas
evaluadas en este estudio, ya que las secuencias de los amplicones obtenidos de ~2800 pb y
de ~350 pb, no estuvieron relacionadas con el genoma de PMTV o correspondian a una
región ya secuenciada de TGB, respectivamente (Figura 34). Cabe resaltar que a partir de la
secuencia obtenida con la combinación de cebadores H360 – PMTV2017R se realizó el
diseño de los cebadores PMTV759F – PMTV1552R, utilizados en las pruebas de qRTPCR.
137
Figura 32. Amplicón obtenido con los cebadores H360 y PMTV2017R (2000 pb) a partir de tejido de raíz de
N. benthamiana de dos departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 5: Control negativo, 6: RValle La
Unión, 7: R36 La Unión, 8: R25 dilución.
Figura 33. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 – 123end (1067 pb) (carriles 2 a 4) y
PMTV759 – PMTV1552R (817 pb) (carriles 5 a 7), a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrado en
sustrato infestado con S. subterranea. 1: Marcador 100pb, 2: R25 La Unión Ant, 3: RValle La Unión Ant, 4:
Control negativo, 5: R25 La Unión Ant, 6: RValle La Unión Ant, 7: Control negativo.
138
Figura 34. Amplicónes obtenidos con los cebadores Furo-Hel – 123end (2722 pb) (carriles 2 a 4) y
PMTV1948F – 123end (448 pb) (carriles 5 a 7), a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrado en
sustrato infestado con S. subterranea. 1: Marcador 100pb, 2: R25 La Unión Ant, 3: RValle La Unión Ant, 4:
Control negativo, 5: R25 La Unión Ant, 6: RValle La Unión Ant, 7: Control negativo.
Figura 35. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTV5 USA RNA3 y PMTV7 USA RNA3 (647 pb) a
partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrada en sustrato infestado con S. subterranea. 1: Marcador
100pb, 2: R25 La Unión, 3: R36 La Unión, 4: RValle La Unión, 5: R25 dilución 1/10, 6: R36 dilución 1/10,
7: RValle dilución 1/10, 8: Control negativo.
139
El ensamblaje de las secuencias para cada ARN obtenido, se realizó con relación a los
genomas completos de PMTV de diferentes orígenes geográficos. Así, para el aislamiento
R25 se encontraron identidades superiores al 98% en la secuencia de nucleótidos para el
fragmento de CP (ARN2) hacia el extremo 5‟ (Figura 36), e identidades del 99% cuando se
empleó la secuencia de aminoácidos (Tabla 23). Para el fragmento de CP hacia el extremo
3‟ y con respecto al genoma de referencia (NC 003724), se encontraron identidades
superiores al 97%
para nucleótidos y de 95% cuando se usaron aminoácidos en las
comparaciones (Tabla 24).
Tabla 23. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del primer fragmento de la
región CP secuenciada para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden
NC_003724.1 PMTV Sweden
AM503633.1 PMTVCP Finland
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
R25 PMTVCP
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden
NC_003724.1 PMTV Sweden
ID
1,00
ID
0,99
0,99
1,00
1,00
0,99
0,99
AM503633.1 PMTVCP Finland
Aminoácidos
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden
NC_003724.1 PMTV Sweden
AM503633.1 PMTVCP Finland
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
R25 PMTVCP
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden
NC_003724.1 PMTV Sweden
ID
1,00
ID
0,99
0,99
1,00
1,00
0,99
0,99
AM503633.1 PMTVCP Finland
ID
0,99
0,98
ID
0,99
0,99
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
ID
0,99
R25 PMTVCP
0,99
ID
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
ID
0,99
R25 PMTVCP
ID
Tabla 24. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del segundo fragmento de la
región CP secuenciado para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden
NC_003724.1 PMTV Sweden
AM503633.1 PMTVCP Finland
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
R25 PMTVCP
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden
NC_003724.1 PMTV Sweden
ID
1,00
ID
0,97
0,97
0,99
0,99
0,98
0,98
AM503633.1 PMTVCP Finland
Aminoácidos
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden
NC_003724.1 PMTV Sweden
AM503633.1 PMTVCP Finland
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
R25 PMTVCP
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden
NC_003724.1 PMTV Sweden
ID
1,00
ID
0,96
0,96
0,99
0,99
0,97
0,97
AM503633.1 PMTVCP Finland
ID
0,98
0,97
ID
0,98
0,95
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
ID
0,98
R25 PMTVCP
ID
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
ID
0,97
R25 PMTVCP
ID
140
707884MRPMTVCP: 384 » 1836
500
NC_003724.1Potatomop-topvirusRNA3: 1 » 3138
1
CP
1000
1500
CPRT
78MR81MYPMTVCP: 1853 » 2959
2000
gi 20373119 ref NC 003724.1
3134 bp
2500
3000
Figura 36. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de la cepa R25 de PMTV
respecto a la secuencia de referencia NC 003724. Se observan dos fragmentos de CP para R25, uno cercano al
extremo 5‟ (707884MRPMTVCP 384-1836) y el segundo cercano al extremo 3‟ (78MR81MYPMTVCP
1853-2959).
141
Para la misma cepa, las secuencias obtenidas para la región TGB (ARN3) se compararon
con cinco secuencias completas del GenBank, presentándose indentidades superiores al
97% con respecto a los genomas de referencia en nucleótidos y del 94% para aminoácidos
(Tabla 25). La secuencia comparada corresponde a un fragmento parcial de TGB1, TGB2,
TGB3 y CRP (Figura 37).
Tabla 25. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del fragmento secuenciado
de la región TGB para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo.
Nucleótidos
NC_003725.1 PMTVTGB Sw AY187010.1 PMTVTGB Den D30753.1 PMTVTGB UK DQ144451.1 PMTVTGB CzRp AJ277556.1 PMTVTGB Sw R25 PMTVTGB
NC_003725.1 PMTVTGB Sweden
ID
AY187010.1 PMTVTGB Denmark
0,97
ID
D30753.1 PMTVTGB UK
0,98
0,97
ID
DQ144451.1 PMTVTGB CzechRepublic
0,97
1,00
0,97
ID
AJ277556.1 PMTVTGB Sweden
1,00
0,97
0,98
0,97
ID
R25 PMTVTGB
0,98
0,98
0,97
0,98
0,98
ID
Aminoácidos
NC_003725.1 PMTVTGB Sw AY187010.1 PMTVTGB Den D30753.1 PMTVTGB UK DQ144451.1 PMTVTGB CzRp AJ277556.1 PMTVTGB Sw R25 PMTVTGB
NC_003725.1 PMTVTGB Sweden
ID
AY187010.1 PMTVTGB Denmark
0,94
ID
D30753.1 PMTVTGB UK
0,96
0,93
ID
DQ144451.1 PMTVTGB CzechRepublic
0,94
1,00
0,93
ID
AJ277556.1 PMTVTGB Sweden
1,00
0,94
0,96
0,94
ID
R25 PMTVTGB
0,95
0,95
0,94
0,95
0,95
ID
Para el caso de la región CP de la cepa RValle de PMTV, se obtuvieron dos fragmentos de
tamaños menores a los alcanzados para la cepa R25, que abarcaron además la región CPRT
hacia el centro del genoma (Figura 38). El análisis se hizó utilizando las mismas secuencias
genómicas de referencia que se emplearon para R25, e indicó para el primer fragmento
(CP), identidades del 99% en las secuencias de nucleótidos y 100% para aminoácidos
(Tabla 26). Para el segundo fragmento (CPRT) las identidades para las secuencias de
nucleótidos fueron del 98%, mientras que para aminoácidos estuvieron por encima del 97%
(Tabla 27).
142
NC_003725.1PMTVTGB: 1 » 2966
1
500
1000
TGBp1
1500
2000
TGBp2
6668MR82MYPMTVTGB: 1426 » 2747
gi 20373121 ref NC 003725.1
2964 bp
TGBp3
2500
CRP
Figura 37. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región TGB de la cepa R25de PMTV con
respecto a la secuencia de referencia NC 003725.
143
Tabla 26. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del primer fragmento de la
región CP secuenciado para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden
NC_003724.1 PMTV Sweden
AM503633.1 PMTVCP Finland
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
RValle PMTVCP
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden NC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland
ID
1,00
ID
1,00
1,00
ID
1,00
1,00
1,00
0,99
0,99
0,99
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
Aminoácidos
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden
NC_003724.1 PMTV Sweden
AM503633.1 PMTVCP Finland
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
RValle PMTVCP
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden NC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland
ID
1,00
ID
1,00
1,00
ID
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
RValle PMTVCP
ID
0,99
ID
RValle PMTVCP
ID
1,00
ID
Tabla 27. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del fragmento de la región
CPRT secuenciada para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden
NC_003724.1 PMTV Sweden
AM503633.1 PMTVCP Finland
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
RValle PMTVCP
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden NC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R
ID
1,00
ID
0,99
0,99
ID
1,00
1,00
0,99
ID
0,98
0,98
0,98
0,98
RValle PMTVCP
Aminoácidos
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden
NC_003724.1 PMTV Sweden
AM503633.1 PMTVCP Finland
DQ102381.1 PMTVCP Czech R
RValle PMTVCP
AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden NC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R
ID
1,00
ID
0,99
0,99
ID
1,00
1,00
0,99
ID
0,98
0,98
0,97
0,98
RValle PMTVCP
Para el análisis de la región TGB de la cepa RValle, se evaluaron además cinco cepas de
referencia que contenian la porción del genoma comprendida entre TGB1 parcial a CRP
(Figura 39). El análisis de dichas secuencias demostró identidades superiores al 97% para
nucleótidos y del 94% para aminoácidos (Tabla 28).
144
ID
ID
Tabla 28. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región TGB
secuenciada para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo.
Nucleótidos
NC_003725.1 PMTVTGB Sweden
AY187010.1 PMTVTGB Denmark
D30753.1 PMTVTGB UK
DQ144451.1 PMTVTGB Czech R
AJ277556.1 PMTVTGB Sweden
RValle PMTVTGB
NC_003725.1 PMTVTGB Sw AY187010.1 PMTVTGB Den D30753.1 PMTVTGB UK DQ144451.1 PMTVTGB CzR AJ277556.1 PMTVTGB Sw RValle PMTVTGB
ID
0,97
ID
0,98
0,97
ID
0,97
1,00
0,97
ID
1,00
0,97
0,98
0,97
ID
0,98
0,97
0,97
0,97
0,98
ID
Aminoácidos
NC_003725.1 PMTVTGB Sweden
AY187010.1 PMTVTGB Denmark
D30753.1 PMTVTGB UK
DQ144451.1 PMTVTGB Czech R
AJ277556.1 PMTVTGB Sweden
RValle PMTVTGB
NC_003725.1 PMTVTGB Sw AY187010.1 PMTVTGB Den D30753.1 PMTVTGB UK DQ144451.1 PMTVTGB CzR AJ277556.1 PMTVTGB Sw RValle PMTVTGB
ID
0,96
ID
0,96
0,93
ID
0,96
1,00
0,93
ID
1,00
0,96
0,96
0,96
ID
0,96
0,95
0,94
0,95
0,96
ID
145
71MR-H360-C819RVALLE: 384 » 843
500
NC_003724.1Potatomop-topvirusRNA3: 1 » 3134
1
CP
1000
85MYPMTVRVALLE: 1081 » 1838
1500
CPRT
2000
gi 20373119 ref NC 003724.1
3134 bp
2500
3000
Figura 38. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de la cepa RValle de PMTV con
respecto a la secuencia de referencia NC 003724. Se observan dos fragmentos de CP para RValle, uno
cercano al extremo 5‟ (71MR 384-843) y el segundo cercano al extremo 3‟ (85MY 1081-1838).
146
NC_003725.1PMTVTGB: 1 » 2968
1
500
1000
TGBp1
1500
2000
TGBp2
6769MR83MYPMTVTGBRVALLE: 1416 » 2749
gi 20373121 ref NC 003725.1
2964 bp
TGBp3
2500
CRP
Figura 39. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región TGB de la cepa RValle de PMTV
con respecto a la secuencia de referencia NC 003725.
147
5.6.2. Secuencias parciales del genoma de PVY
Para el estudio de las secuencias parciales del genoma de PVY se utilizaron dos
aislamientos del departamento de Antioquia (Tabla 22), encontrándose secuencias de
óptima calidad para los amplicones obtenidos con las combinaciones de cebadores PVYc –
PVYd, PVYCPF – PVYCPR, PVYF – 3ntr, PVYF – 3ntrC (Figura 40), PVYCPF – 3ntr,
PVYCPF – 3 ntrC (Figura 41).
Figura 40. Amplicones obtenidos a partir de tejido foliar de papa de dos cepas de PVY del departamento de
Antioquia, con los cebadores PVYc – PVYd (967 pb) carriles 7 a 9; PVYCPF – PVYCPR (827 pb) carriles 10
a 12; PVYF – 3ntr (1061 pb) carriles 13 a 15; PVYF – 3ntrC (1061 pb) carriles 16 a 18. 1: Marcador 100pb,
7: Ceja, 8: Carmen, 9: Control negativo, 10: Ceja, 11: Carmen, 12: Control negativo, 13: Ceja, 14: Carmen,
15: Control negativo, 16: Ceja, 17: Carmen, 18: Control negativo.
148
Figura 41. Amplicones obtenidos con los cebadores PVYCPF – 3ntr (1219 pb) carriles 5 a 7, PVYCPF –
3ntrC (1219 pb) carriles 8 a 10, a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia.
1: Marcador 1Kb, 5: Ceja, 6: Carmen, 7: Control negativo, 8: Ceja, 9: Carmen, 10: Control negativo.
El análisis de las secuencias ensambladas se realizó con cada una de las cepas
individualmente y con 11 genomas completos de PVY depositados en el GenBank. Así,
para la región P1 y parte del 5‟NTR de la cepa Ceja (Figura 42), se encontraron identidades
del 99% en nucleótidos con cepas de las razas PVY-N y PVY-NTN y superiores al 99%
para aminoácidos (Tabla 29). Para el mismo aislamiento se obtuvieron dos secuencias
diferentes de la región CP. En la primera secuencia se obtuvo además de la región CP, una
porción del extremo 3‟NTR (Figura 43), que compartió identidades superiores al 95% en
nucleótidos con cepas de las razas PVY-NTN y PVY-N de Europa, USA y Canada y
superiores al 97% en aminoácidos (Tabla 30). La otra secuencia de CP obtenida para dicho
aislamiento (Figura 44), compartió identidades superiores al 97% con cepas de las razas
PVY-N y PVY-NTN para nucleótidos y del 98% para aminoácidos (Tabla 31).
149
Tabla 29. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región P1 secuenciada
para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos
AF237963.2PVYnnpItaly
AF522296.1PVYNEgypt
AJ585195.1PVYSASA110UK
AJ584851.1PVYstrainNUK
AJ585196.1PVYSCRIOUK
AJ585342.1PVYNTNUK
AJ889866.1PVYNTNPoland
AJ889867.1PVYWilgaGermany
U09509.1PVYcommonCanada
AY166867.1PVYNCanada
AY884983.1PVYNUSA
Ceja PVY
AF237963.2 PVYnnp Italy pepper
ID
AF522296.1 PVYN Egypt
0,88
ID
AJ585195.1 PVY UK
0,89
0,95
ID
AJ584851.1 PVYN UK
0,70
0,71
0,71
ID
AJ585196.1 PVYO UK
0,90
0,96
0,95
0,72
ID
AJ585342.1 PVYNTN UK
0,70
0,71
0,71
0,99
0,71
ID
AJ889866.1 PVY NTN Poland
0,82
0,83
0,84
0,86
0,83
0,86
ID
AJ889867.1 PVYN-Wi Germany
0,82
0,83
0,85
0,86
0,83
0,86
0,98
ID
U09509.1 PVYC Canada
0,89
0,97
0,95
0,71
0,96
0,71
0,82
0,82
ID
AY166867.1 PVYN Canada
0,71
0,71
0,71
0,91
0,72
0,91
0,83
0,83
0,71
ID
AY884983.1 PVYN USA
0,70
0,71
0,71
0,99
0,72
0,99
0,86
0,86
0,71
0,91
ID
Ceja PVY
0,70
0,71
0,71
0,99
0,72
0,99
0,86
0,86
0,71
0,91
0,99
ID
Aminoácidos
AF237963.2PVYnnpItaly
AF522296.1PVYNEgypt
AJ585195.1PVYSASA110UK
AJ584851.1PVYstrainNUK
AJ585196.1PVYSCRIOUK
AJ585342.1PVYNTNUK
AJ889866.1PVYNTNPoland
AJ889867.1PVYWilgaGermany
U09509.1PVYcommonCanada
AY166867.1PVYNCanada
AY884983.1PVYNUSA
38MYPVY
AF237963.2 PVYnnp Italy pepper
ID
AF522296.1 PVYN Egypt
0,86
ID
AJ585195.1 PVY UK
0,88
0,94
ID
AJ584851.1 PVYN UK
0,68
0,68
0,69
ID
AJ585196.1 PVYO UK
0,88
0,94
0,95
0,69
ID
AJ585342.1 PVYNTN UK
0,68
0,68
0,69
0,99
0,68
ID
AJ889866.1 PVY NTN Poland
0,83
0,82
0,84
0,84
0,82
0,83
ID
AJ889867.1 PVYN-Wi Germany
0,83
0,82
0,84
0,84
0,82
0,84
0,98
ID
U09509.1 PVYC Canada
0,87
0,95
0,93
0,68
0,93
0,68
0,81
0,81
ID
AY166867.1 PVYN Canada
0,67
0,67
0,67
0,89
0,67
0,88
0,79
0,79
0,66
ID
AY884983.1 PVYN USA
0,69
0,68
0,70
1,00
0,69
0,99
0,84
0,85
0,68
0,89
ID
Ceja PVY
0,68
0,68
0,69
1,00
0,69
0,99
0,84
0,84
0,68
0,89
1,00
ID
150
Tabla 30. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos
AF237963.2PVYnnpItaly
AF522296.1PVYNEgypt
AJ585195.1PVYSASA110UK
AJ584851.1PVYstrainNUK
AJ585196.1PVYSCRIOUK
AJ585342.1PVYNTNUK
AJ889866.1PVYNTNPoland
AJ889867.1PVYWilgaGermany
U09509.1PVYcommonCanada
AY166867.1PVYNCanada
AY884983.1PVYNUSA
Ceja PVY
AF237963.2 PVYnnp Italy pepper
ID
AF522296.1 PVYN Egypt
0,92
ID
AJ585195.1 PVY UK
0,92
0,98
ID
AJ584851.1 PVYN UK
0,93
0,99
0,98
ID
AJ585196.1 PVYO UK
0,93
0,99
0,98
0,99
ID
AJ585342.1 PVYNTN UK
0,90
0,92
0,92
0,93
0,92
ID
AJ889866.1 PVY NTN Poland
0,91
0,92
0,92
0,93
0,92
0,99
ID
AJ889867.1 PVYN-Wi Germany
0,93
0,99
0,98
0,99
0,99
0,93
0,93
ID
U09509.1 PVYC Canada
0,93
0,98
0,97
0,98
0,98
0,92
0,92
0,98
ID
AY166867.1 PVYN Canada
0,90
0,90
0,89
0,91
0,90
0,96
0,96
0,91
0,90
ID
AY884983.1 PVYN USA
0,91
0,90
0,90
0,91
0,90
0,97
0,97
0,91
0,90
0,98
ID
Ceja PVY
0,90
0,91
0,91
0,91
0,91
0,95
0,95
0,91
0,91
0,96
0,96
ID
Aminoácidos
AF237963.2PVYnnpItaly
AF522296.1PVYNEgypt
AJ585195.1PVYSASA110UK
AJ584851.1PVYstrainNUK
AJ585196.1PVYSCRIOUK
AJ585342.1PVYNTNUK
AJ889866.1PVYNTNPoland
AJ889867.1PVYWilgaGermany
U09509.1PVYcommonCanada
AY166867.1PVYNCanada
AY884983.1PVYNUSA
Ceja PVY
AF237963.2 PVYnnp Italy pepper
ID
AF522296.1 PVYN Egypt
0,95
ID
AJ585195.1 PVY UK
0,94
0,98
ID
AJ584851.1 PVYN UK
0,95
0,99
0,98
ID
AJ585196.1 PVYO UK
0,95
0,99
0,98
0,99
ID
AJ585342.1 PVYNTN UK
0,95
0,95
0,94
0,96
0,95
ID
AJ889866.1 PVY NTN Poland
0,95
0,95
0,94
0,96
0,95
0,99
ID
AJ889867.1 PVYN-Wi Germany
0,95
0,99
0,98
0,99
0,99
0,96
0,96
ID
U09509.1 PVYC Canada
0,96
0,98
0,97
0,98
0,98
0,94
0,94
0,98
ID
AY166867.1 PVYN Canada
0,94
0,94
0,93
0,95
0,94
0,98
0,98
0,94
0,93
ID
AY884983.1 PVYN USA
0,95
0,95
0,94
0,96
0,95
0,99
0,99
0,96
0,94
0,99
ID
Ceja PVY
0,94
0,95
0,94
0,95
0,95
0,97
0,97
0,95
0,94
0,97
0,98
ID
Tabla 31. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo
Nucleotidos
AF237963.2PVYnnpItaly
AF522296.1PVYNEgypt
AJ585195.1PVYSASA110UK
AJ584851.1PVYstrainNUK
AJ585196.1PVYSCRIOUK
AJ585342.1PVYNTNUK
AJ889866.1PVYNTNPoland
AJ889867.1PVYWilgaGermany
U09509.1PVYcommonCanada
AY166867.1PVYNCanada
AY884983.1PVYNUSA
Ceja PVY
AF237963.2 PVYnnp Italy pepper
ID
AF522296.1 PVYN Egypt
0,91
ID
AJ585195.1 PVY UK
0,90
0,97
ID
AJ584851.1 PVYN UK
0,91
0,98
0,98
ID
AJ585196.1 PVYO UK
0,91
0,98
0,98
0,99
ID
AJ585342.1 PVYNTN UK
0,89
0,91
0,91
0,91
0,91
ID
AJ889866.1 PVY NTN Poland
0,89
0,91
0,90
0,91
0,91
0,99
ID
AJ889867.1 PVYN-Wi Germany
0,91
0,98
0,98
0,99
0,99
0,91
0,91
ID
U09509.1 PVYC Canada
0,91
0,97
0,96
0,97
0,98
0,91
0,90
0,97
ID
AY166867.1 PVYN Canada
0,88
0,89
0,88
0,89
0,89
0,96
0,96
0,89
0,89
ID
AY884983.1 PVYN USA
0,89
0,89
0,89
0,89
0,89
0,97
0,97
0,90
0,89
0,98
ID
Ceja PVY
0,89
0,91
0,90
0,91
0,91
0,99
0,99
0,91
0,90
0,96
0,97
ID
Aminoácidos
AF237963.2PVYnnpItaly
AF522296.1PVYNEgypt
AJ585195.1PVYSASA110UK
AJ584851.1PVYstrainNUK
AJ585196.1PVYSCRIOUK
AJ585342.1PVYNTNUK
AJ889866.1PVYNTNPoland
AJ889867.1PVYWilgaGermany
U09509.1PVYcommonCanada
AY166867.1PVYNCanada
AY884983.1PVYNUSA
Ceja PVY
AF237963.2 PVYnnp Italy pepper
ID
AF522296.1 PVYN Egypt
0,94
ID
AJ585195.1 PVY UK
0,93
0,97
ID
AJ584851.1 PVYN UK
0,94
0,98
0,98
ID
AJ585196.1 PVYO UK
0,93
0,98
0,98
0,99
ID
AJ585342.1 PVYNTN UK
0,93
0,94
0,93
0,94
0,93
ID
AJ889866.1 PVY NTN Poland
0,92
0,94
0,93
0,94
0,93
0,99
ID
AJ889867.1 PVYN-Wi Germany
0,94
0,98
0,98
0,99
0,99
0,94
0,93
ID
U09509.1 PVYC Canada
0,95
0,98
0,96
0,97
0,97
0,93
0,92
0,97
ID
AY166867.1 PVYN Canada
0,91
0,93
0,92
0,93
0,92
0,98
0,98
0,93
0,91
ID
AY884983.1 PVYN USA
0,93
0,94
0,93
0,94
0,93
0,99
0,99
0,94
0,93
0,99
ID
151
Ceja PVY
0,92
0,94
0,93
0,94
0,93
0,99
0,98
0,94
0,92
0,98
1,00
ID
1000
1500
HC-Pro
AJ584851.1PVYstrainNUK: 1 » 9651
500
38MYPVY: 23 » 892
1
P1
2000
2500
3000
P3
3500
6K1
4000
4500
CI
5000
5500
6K2
6000
6500
NIa-Pro
NIa-VPg
gi 209395183 gb FJ214726.1
9773 bp
7000
7500
NIb
8000
8500
9000
CP
9500
Figura 42. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región P1 de PVY de la cepa Ceja respecto a
la secuencia de referencia AJ584851.1.
152
AY884983.1PVYNUSA: 1 » 9703
500
1500
HC-Pro
1000
AY166867.1PVYNCanada: 1 » 9703
1
P1
2000
2500
P3
3000
3500
6K1
4000
4500
CI
5000
5500
6K2
6000
6500
NIa-Pro
NIa-VPg
gi 209395183 gb FJ214726.1
9773 bp
7000
7500
NIb
8000
9000
9500
42444648MYPVY: 8610 » 9658
8500
CP
Figura 43. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la cepa Ceja respecto
a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867.
153
500
1000
1500
2000
HC-Pro
AJ585342.1PVYNTNUK: 1 » 9647
1
P1
2500
3000
P3
3500
6K1
4000
4500
CI
5000
5500
6K2
6000
6500
NIa-Pro
NIa-VPg
gi 209395183 gb FJ214726.1
9773 bp
7000
7500
NIb
8000
9000
9500
40MYPVYCP: 8575 » 9310
8500
CP
Figura 44. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la cepa Ceja respecto
a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867.
154
El análisis de los ensambles para la cepa Carmen, mostró dos tipos de asociación con
secuencias de referencia para la región CP. La primera (CP y 3‟NTR) se dió con secuencias
de las razas PVY-NTN (Figura 45), presentando identidades del 99% para nucleótidos y del
98% en aminoácidos (Tabla 32). El segundo fragmento de CP al igual que el fragmento
correspondiente a la región P1 y 5‟NTR (Figura 46), se asoció con secuencias de referencia
de la raza PVY-N de USA y Canadá, con identidades para CP del 96% para nucleótidos y
del 97% cuando se evaluaron aminoácidos (Tabla 33). En el caso de la región genómica P1,
se encontraron identidades del 94% para nucleótidos con respecto a una cepa Canadiense
de PVY-N y del 93% para aminácidos (Tabla 34).
Tabla 32. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos
AF237963.2PVYnnpItaly
AF522296.1PVYNEgypt
AJ585195.1PVYSASA110UK
AJ584851.1PVYstrainNUK
AJ585196.1PVYSCRIOUK
AJ585342.1PVYNTNUK
AJ889866.1PVYNTNPoland
AJ889867.1PVYWilgaGermany
U09509.1PVYcommonCanada
AY166867.1PVYNCanada
AY884983.1PVYNUSA
Carmen PVY
AF237963.2 PVYnnp Italy pepper
ID
AF522296.1 PVYN Egypt
0,93
ID
AJ585195.1 PVY UK
0,93
0,98
ID
AJ584851.1 PVYN UK
0,93
0,99
0,98
ID
AJ585196.1 PVYO UK
0,94
0,99
0,98
0,99
ID
AJ585342.1 PVYNTN UK
0,92
0,94
0,93
0,94
0,94
ID
AJ889866.1 PVY NTN Poland
0,92
0,94
0,93
0,94
0,94
0,99
ID
AJ889867.1 PVYN-Wi Germany
0,93
0,99
0,98
0,99
0,99
0,94
0,94
ID
U09509.1 PVYC Canada
0,94
0,99
0,98
0,99
0,99
0,94
0,94
0,99
ID
AY166867.1 PVYN Canada
0,91
0,91
0,90
0,92
0,91
0,96
0,96
0,92
0,91
ID
AY884983.1 PVYN USA
0,92
0,91
0,91
0,92
0,91
0,97
0,97
0,92
0,92
0,98
ID
Carmen PVY
0,92
0,94
0,93
0,94
0,94
0,99
0,99
0,94
0,94
0,96
0,97
ID
Aminoácidos
AF237963.2PVYnnpItaly
AF522296.1PVYNEgypt
AJ585195.1PVYSASA110UK
AJ584851.1PVYstrainNUK
AJ585196.1PVYSCRIOUK
AJ585342.1PVYNTNUK
AJ889866.1PVYNTNPoland
AJ889867.1PVYWilgaGermany
U09509.1PVYcommonCanada
AY166867.1PVYNCanada
AY884983.1PVYNUSA
Carmen PVY
AF237963.2 PVYnnp Italy pepper
ID
AF522296.1 PVYN Egypt
0,96
ID
AJ585195.1 PVY UK
0,95
0,99
ID
AJ584851.1 PVYN UK
0,96
0,99
0,99
ID
AJ585196.1 PVYO UK
0,96
0,99
0,99
0,99
ID
AJ585342.1 PVYNTN UK
0,96
0,96
0,95
0,97
0,96
ID
AJ889866.1 PVY NTN Poland
0,96
0,96
0,95
0,97
0,96
0,99
ID
AJ889867.1 PVYN-Wi Germany
0,96
0,99
0,99
0,99
0,99
0,96
0,96
ID
U09509.1 PVYC Canada
0,97
1,00
0,98
0,99
0,99
0,96
0,96
0,99
ID
AY166867.1 PVYN Canada
0,94
0,95
0,94
0,95
0,94
0,98
0,98
0,95
0,94
ID
AY884983.1 PVYN USA
0,96
0,96
0,95
0,97
0,96
0,99
0,99
0,96
0,96
0,99
ID
Carmen PVY
0,95
0,95
0,94
0,96
0,95
0,98
0,98
0,95
0,95
0,98
0,99
ID
155
Tabla 33. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos
AF237963.2PVYnnpItaly
AF522296.1PVYNEgypt
AJ585195.1PVYSASA110UK
AJ584851.1PVYstrainNUK
AJ585196.1PVYSCRIOUK
AJ585342.1PVYNTNUK
AJ889866.1PVYNTNPoland
AJ889867.1PVYWilgaGermany
U09509.1PVYcommonCanada
AY166867.1PVYNCanada
AY884983.1PVYNUSA
Carmen PVY
AF237963.2 PVYnnp Italy pepper
ID
AF522296.1 PVYN Egypt
0,92
ID
AJ585195.1 PVY UK
0,91
0,97
ID
AJ584851.1 PVYN UK
0,92
0,99
0,98
ID
AJ585196.1 PVYO UK
0,93
0,99
0,98
0,99
ID
AJ585342.1 PVYNTN UK
0,89
0,91
0,90
0,92
0,91
ID
AJ889866.1 PVY NTN Poland
0,89
0,91
0,90
0,92
0,91
0,99
ID
AJ889867.1 PVYN-Wi Germany
0,92
0,98
0,98
0,99
0,99
0,91
0,92
ID
U09509.1 PVYC Canada
0,92
0,98
0,96
0,97
0,98
0,91
0,91
0,97
ID
AY166867.1 PVYN Canada
0,89
0,89
0,89
0,90
0,89
0,96
0,96
0,90
0,90
ID
AY884983.1 PVYN USA
0,90
0,89
0,89
0,90
0,90
0,97
0,98
0,90
0,89
0,97
ID
Carmen PVY
0,90
0,90
0,90
0,91
0,91
0,96
0,96
0,91
0,91
0,96
0,96
ID
Aminoácidos
AF237963.2PVYnnpItaly
AF522296.1PVYNEgypt
AJ585195.1PVYSASA110UK
AJ584851.1PVYstrainNUK
AJ585196.1PVYSCRIOUK
AJ585342.1PVYNTNUK
AJ889866.1PVYNTNPoland
AJ889867.1PVYWilgaGermany
U09509.1PVYcommonCanada
AY166867.1PVYNCanada
AY884983.1PVYNUSA
Carmen PVY
AF237963.2 PVYnnp Italy pepper
ID
AF522296.1 PVYN Egypt
0,95
ID
AJ585195.1 PVY UK
0,94
0,97
ID
AJ584851.1 PVYN UK
0,95
0,98
0,98
ID
AJ585196.1 PVYO UK
0,95
0,98
0,98
0,99
ID
AJ585342.1 PVYNTN UK
0,95
0,95
0,94
0,96
0,95
ID
AJ889866.1 PVY NTN Poland
0,95
0,95
0,94
0,96
0,95
0,99
ID
AJ889867.1 PVYN-Wi Germany
0,95
0,98
0,98
0,99
0,99
0,96
0,96
ID
U09509.1 PVYC Canada
0,96
0,98
0,97
0,98
0,98
0,95
0,95
0,98
ID
AY166867.1 PVYN Canada
0,93
0,94
0,93
0,95
0,94
0,97
0,97
0,94
0,93
ID
AY884983.1 PVYN USA
0,95
0,95
0,94
0,96
0,95
0,99
0,99
0,96
0,95
0,98
ID
Carmen PVY
0,94
0,95
0,94
0,95
0,95
0,97
0,97
0,95
0,94
0,97
0,98
ID
Tabla 34. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región P1 secuenciada
para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos
AF237963.2PVYnnpItaly
AF522296.1PVYNEgypt
AJ585195.1PVYSASA110UK
AJ584851.1PVYstrainNUK
AJ585196.1PVYSCRIOUK
AJ585342.1PVYNTNUK
AJ889866.1PVYNTNPoland
AJ889867.1PVYWilgaGermany
U09509.1PVYcommonCanada
AY166867.1PVYNCanada
AY884983.1PVYNUSA
Carmen PVY
AF237963.2 PVYnnp Italy pepper
ID
AF522296.1 PVYN Egypt
0,89
ID
AJ585195.1 PVY UK
0,90
0,95
ID
AJ584851.1 PVYN UK
0,70
0,72
0,71
ID
AJ585196.1 PVYO UK
0,90
0,95
0,95
0,72
ID
AJ585342.1 PVYNTN UK
0,70
0,72
0,71
0,99
0,72
ID
AJ889866.1 PVY NTN Poland
0,82
0,83
0,84
0,86
0,83
0,85
ID
AJ889867.1 PVYN-Wi Germany
0,82
0,83
0,85
0,86
0,83
0,86
0,98
ID
U09509.1 PVYC Canada
0,90
0,97
0,95
0,71
0,96
0,71
0,83
0,83
ID
AY166867.1 PVYN Canada
0,71
0,71
0,71
0,91
0,72
0,91
0,82
0,83
0,71
ID
AY884983.1 PVYN USA
0,70
0,71
0,71
0,99
0,72
0,99
0,86
0,86
0,71
0,91
ID
Carmen PVY
0,72
0,72
0,71
0,92
0,73
0,91
0,82
0,82
0,72
0,94
0,91
ID
Aminoácidos
AF237963.2PVYnnpItaly
AF522296.1PVYNEgypt
AJ585195.1PVYSASA110UK
AJ584851.1PVYstrainNUK
AJ585196.1PVYSCRIOUK
AJ585342.1PVYNTNUK
AJ889866.1PVYNTNPoland
AJ889867.1PVYWilgaGermany
U09509.1PVYcommonCanada
AY166867.1PVYNCanada
AY884983.1PVYNUSA
Carmen PVY
AF237963.2 PVYnnp Italy pepper
ID
AF522296.1 PVYN Egypt
0,86
ID
AJ585195.1 PVY UK
0,88
0,94
ID
AJ584851.1 PVYN UK
0,69
0,69
0,70
ID
AJ585196.1 PVYO UK
0,88
0,94
0,94
0,69
ID
AJ585342.1 PVYNTN UK
0,69
0,69
0,69
1,00
0,69
ID
AJ889866.1 PVY NTN Poland
0,84
0,83
0,85
0,83
0,83
0,83
ID
AJ889867.1 PVYN-Wi Germany
0,84
0,83
0,84
0,84
0,83
0,84
0,98
ID
U09509.1 PVYC Canada
0,87
0,94
0,93
0,69
0,93
0,68
0,82
0,82
ID
AY166867.1 PVYN Canada
0,68
0,67
0,68
0,89
0,68
0,88
0,78
0,78
0,67
ID
AY884983.1 PVYN USA
0,69
0,69
0,70
1,00
0,69
0,99
0,84
0,84
0,69
0,88
ID
Carmen PVY
0,69
0,67
0,68
0,90
0,68
0,90
0,78
0,79
0,67
0,93
0,90
ID
156
500
1000
1500
HC-Pro
AJ585342.1PVYNTNUK: 1 » 9647
1
P1
2000
2500
3000
P3
3500
6K1
4000
4500
CI
5000
5500
6K2
6000
6500
7000
NIa-Pro
NIa-VPg
gi 209395183 gb FJ214726.1
9773 bp
7500
NIb
8000
8500
9500
454749MYPVY: 8738 » 9617
9000
CP
Figura 45. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la cepa Carmen
respecto a la secuencia de referencia AJ585342.
157
AY884983.1PVYNUSA: 1 » 9704
39MYPVY: 55 » 922
500
1000
1500
HC-Pro
AY166867.1PVYNCanada: 1 » 9704
1
P1
2000
2500
P3
3000
3500
6K1
4000
4500
CI
5000
5500
6K2
6000
6500
NIa-Pro
NIa-VPg
gi 209395183 gb FJ214726.1
9773 bp
7000
7500
NIb
8000
9000
9500
41MYPVY: 8617 » 9272
8500
CP
Figura 46. Contextualización de las secuencias obtenidas para las regiones CP y P1 de PVY de la cepa
Carmen respecto a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867.
158
5.6.3. Secuencias parciales del genoma de PVX
Para el estudio de las secuencias parciales del genoma de PVX se utilizaron dos cepas del
departamento de Antioquia (Tabla 22), realizándose las reacciones de RT-PCR con las
combinaciones de cebadores PVX1F – PVX1651R, PVX3130F – PVX4495R, PVX5476F PVX6415R y PVX5476F – PVXR (Figura 47).
Figura 47. Amplicones obtenidos con los cebadores PVX5476F-PVXR (749 pb) carriles 5 a 7, PVX1FPVX1651R (1651 pb) carriles 8 a 10, PVX3130-PVX4495 (1365 pb) carriles 11 a 13, PVX5476F-PVX6415R
(939 pb) carriles 14 a 16, a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia. 1:
Marcador 100pb, 5: Carmen, 6: Ceja, 7: Control negativo, 8: Ceja, 9: Carmen, 10: Control negaativo, 11:
Ceja, 12: Carmen, 13: Control negativo, 14: Ceja, 15: Carmen, 16: Control negativo.
Las secuencias ensambladas se contextualizaron respecto a la secuencia de referencia
EU021215. De la cepa Ceja se obtuvieron dos fragmentos, los cuales correspondieron al
extremo 3‟ de la región que codifica para RdRp y TGB3-CP parcial hacia el extremo 5‟
(Figura 48). El análisis de las secuencias, que empleó siete genomas de referencia, indicó
identidades superiores al 95% para nucleótidos y al 98% para aminoácidos para la región
159
RdRp (Tabla 35). El fragmento TGB3-CP, presentó identidades igualmente superiores al
95% para nucleótidos y del 100% para aminoácidos con respecto a cepas de PVX de China
y Taiwan (Tabla 36).
Tabla 35. Matriz de identidad de nucleótidos y aminoácidos de la región RdRp secuenciada
para la cepa Ceja de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos
EF423572.1PVXChina
M72416.1PVXRussia
M38480.1PVXRussia
FJ461343.1PVXIran
AF272736.2PVXTaiwan
AB056718.1PVXosJapan
AB056719.1PVXbsJapan
Ceja PVX
EF423572.1 PVX China
ID
M72416.1 PVX Russia
0,95
ID
M38480.1 PVX Russia
0,95
1,00
ID
FJ461343.1 PVX Iran
0,96
0,96
0,96
ID
AF272736.2 PVX Taiwan
0,96
0,96
0,96
0,97
ID
AB056718.1 PVX os Japan
0,96
0,95
0,95
0,97
0,99
ID
AB056719.1 PVXbs Japan
0,95
0,95
0,95
0,97
0,97
0,97
ID
Ceja PVX
0,95
0,95
0,95
0,96
0,95
0,95
0,95
ID
Aminoácidos
EF423572.1PVXChina
M72416.1PVXRussia
M38480.1PVXRussia
FJ461343.1PVXIran
AF272736.2PVXTaiwan
AB056718.1PVXosJapan
AB056719.1PVXbsJapan
Ceja PVX
EF423572.1 PVX China
ID
M72416.1 PVX Russia
0,99
ID
M38480.1 PVX Russia
0,99
1,00
ID
FJ461343.1 PVX Iran
0,99
0,99
0,99
ID
AF272736.2 PVX Taiwan
0,99
0,99
0,99
0,99
ID
AB056718.1 PVX os Japan
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
ID
AB056719.1 PVXbs Japan
0,98
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
ID
Ceja PVX
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
0,98
ID
160
Tabla 36. Matriz de identidad de nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para la cepa Ceja de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo.
Nucleotidos
EF423572.1PVXChina
M72416.1PVXRussia
M38480.1PVXRussia
FJ461343.1PVXIran
AF272736.2PVXTaiwan
AB056718.1PVXosJapan
AB056719.1PVXbsJapan
Ceja PVX
EF423572.1 PVX China
ID
M72416.1 PVX Russia
0,96
ID
M38480.1 PVX Russia
0,96
1,00
ID
FJ461343.1 PVX Iran
0,97
0,96
0,96
ID
AF272736.2 PVX Taiwan
0,97
0,96
0,96
0,98
ID
AB056718.1 PVX os Japan
0,97
0,96
0,96
0,97
0,98
ID
AB056719.1 PVXbs Japan
0,95
0,95
0,95
0,96
0,97
0,96
ID
Ceja PVX
0,96
0,96
0,96
0,96
0,96
0,96
0,95
ID
Aminoácidos
EF423572.1PVXChina
M72416.1PVXRussia
M38480.1PVXRussia
FJ461343.1PVXIran
AF272736.2PVXTaiwan
AB056718.1PVXosJapan
AB056719.1PVXbsJapan
Ceja PVX
EF423572.1 PVX China
ID
M72416.1 PVX Russia
0,98
ID
M38480.1 PVX Russia
0,98
1,00
ID
FJ461343.1 PVX Iran
0,99
0,97
0,97
ID
AF272736.2 PVX Taiwan
1,00
0,98
0,98
0,99
ID
AB056718.1 PVX os Japan
0,99
0,97
0,97
0,98
0,99
ID
AB056719.1 PVXbs Japan
0,98
0,96
0,96
0,97
0,98
0,97
ID
Ceja PVX
1,00
0,98
0,98
0,99
1,00
0,99
0,98
ID
161
500
EU021215.1PVX: 1 » 6436
1
1000
1500
2000
2500
RdRp
3000
6264MR-PVX: 3185 » 4472
3500
4000
4500
5000
CP
6000
59MR-PVX5476F-PVXR: 5485 » 6226
5500
TG B3
TG B2
TG B1
gi 154816334 gb EU021215.1
6435 bp
Figura 48. Contextualización de las secuencias obtenidas para una región parcial de RdRp y CP de la cepa
Ceja de PVX, respecto a la secuencia de referencia EU021215.
162
De la cepa Carmen de PVX, se obtuvieron tres fragmentos correspondientes al 5‟NTRRdRp parcial, RdRp parcial hacia el 3‟ y TGB3 parcial al 3‟-CP-3‟NTR (Figura 49). Para el
primer framento se encontraron identidades del 97% para nucleótidos con secuencias de
cepas de China y con una cepa de la raza PVX-bs de Japón, mientras que para la secuencia
de aminoácidos las identidades fueron superiores al 98% en todos los casos (Tabla 37).
Para el segundo fragmento de RdRp, las identidades correspondieron al 95% para
nucleótidos con excepción de las razas PVX-os y PVX-bs, las cuales fueron del 94%. Para
aminoácidos fue muy similar, siendo las identidades de 99% y 98%, respectivamente
(Tabla 38). Por último, el fragmento que correspondió al extremo 3‟ del genoma de PVX,
mostró identidades del 97% para nucleótidos con cepas de Rusia e Iran y del 100% para
aminoácidos (Tabla 39).
Tabla 37. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 5‟NTR-RdRp
secuenciada para la cepa Carmen de PVX y su comparación con otros aislamientos del
mundo.
Nucleotidos
EF423572.1PVXChina
M72416.1PVXRussia
M38480.1PVXRussia
FJ461343.1PVXIran
AF272736.2PVXTaiwan
AB056718.1PVXosJapan
AB056719.1PVXbsJapan
Carmen PVX
EF423572.1 PVX China
ID
M72416.1 PVX Russia
0,97
ID
M38480.1 PVX Russia
0,97
1,00
ID
FJ461343.1 PVX Iran
0,96
0,96
0,96
ID
AF272736.2 PVX Taiwan
0,97
0,97
0,97
0,96
ID
AB056718.1 PVX os Japan
0,96
0,96
0,96
0,95
0,99
ID
AB056719.1 PVX bs Japan
0,97
0,97
0,97
0,97
0,98
0,98
ID
Carmen PVX
0,97
0,96
0,96
0,96
0,96
0,96
0,97
ID
Aminoácidos
EF423572.1PVXChina
M72416.1PVXRussia
M38480.1PVXRussia
J461343.1PVXIran
AF272736.2PVXTaiwan
AB056718.1PVXosJapan
AB056719.1PVXbsJapan
Carmen PVX
EF423572.1 PVX China
ID
M72416.1 PVX Russia
0,99
ID
M38480.1 PVX Russia
0,99
1,00
ID
FJ461343.1 PVX Iran
0,99
0,99
0,99
ID
AF272736.2 PVX Taiwan
0,99
0,99
0,99
0,99
ID
AB056718.1 PVX os Japan
0,99
0,99
0,98
0,99
1,00
ID
AB056719.1 PVX bs Japan
1,00
1,00
0,99
1,00
1,00
0,99
ID
Carmen PVX
0,99
0,99
0,98
0,99
0,99
0,98
0,99
ID
163
Tabla 38. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 3‟ RdRp
secuenciada para la cepa Carmen de PVX y su comparación con otros aislamientos del
mundo.
Nucleotidos
EF423572.1PVXChina
M72416.1PVXRussia
M38480.1PVXRussia
FJ461343.1PVXIran
AF272736.2PVXTaiwan
AB056718.1PVXosJapan
AB056719.1PVXbsJapan
Carmen PVX
EF423572.1 PVX China
ID
M72416.1 PVX Russia
0,95
ID
M38480.1 PVX Russia
0,95
1,00
ID
FJ461343.1 PVX Iran
0,96
0,96
0,96
ID
AF272736.2 PVX Taiwan
0,96
0,96
0,96
0,97
ID
AB056718.1 PVX os Japan
0,96
0,95
0,95
0,97
0,99
ID
AB056719.1 PVX bs Japan
0,95
0,95
0,95
0,97
0,97
0,97
ID
Carmen PVX
0,95
0,95
0,95
0,95
0,95
0,94
0,94
ID
Aminoácidos
EF423572.1PVXChina
M72416.1PVXRussia
M38480.1PVXRussia
FJ461343.1PVXIran
AF272736.2PVXTaiwan
AB056718.1PVXosJapan
AB056719.1PVXbsJapan
Carmen PVX
EF423572.1 PVX China
ID
M72416.1 PVX Russia
0,99
ID
M38480.1 PVX Russia
0,99
1,00
ID
FJ461343.1 PVX Iran
0,99
0,99
0,99
ID
AF272736.2 PVX Taiwan
0,99
0,99
0,99
0,99
ID
AB056718.1 PVX os Japan
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
ID
AB056719.1 PVX bs Japan
0,98
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
ID
Carmen PVX
0,99
0,99
0,99
0,99
0,98
0,98
0,98
ID
Tabla 39. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 3‟TGB3-CP3‟NTR secuenciada para la cepa ¨Carmen¨ de PVX y su comparación con otros
aislamientos del mundo.
Nucleotidos
EF423572.1PVXChina
M72416.1PVXRussia
M38480.1PVXRussia
FJ461343.1PVXIran
AF272736.2PVXTaiwan
AB056718.1PVXosJapan
AB056719.1PVXbsJapan
Carmen PVX
EF423572.1 PVX China
ID
M72416.1 PVX Russia
0,96
ID
M38480.1 PVX Russia
0,96
1,00
ID
FJ461343.1 PVX Iran
0,97
0,96
0,96
ID
AF272736.2 PVX Taiwan
0,97
0,96
0,96
0,98
ID
AB056718.1 PVX os Japan
0,96
0,96
0,96
0,97
0,98
ID
AB056719.1 PVX bs Japan
0,95
0,95
0,95
0,96
0,97
0,96
ID
Carmen PVX
0,96
0,97
0,97
0,97
0,96
0,96
0,95
ID
Aminoácidos
EF423572.1PVXChina
M72416.1PVXRussia
M38480.1PVXRussia
FJ461343.1PVXIran
AF272736.2PVXTaiwan
AB056718.1PVXosJapan
AB056719.1PVXbsJapan
Carmen PVX
EF423572.1 PVX China
ID
M72416.1 PVX Russia
0,98
ID
M38480.1 PVX Russia
0,98
1,00
ID
FJ461343.1 PVX Iran
0,99
0,98
0,98
ID
AF272736.2 PVX Taiwan
1,00
0,98
0,98
0,99
ID
AB056718.1 PVX os Japan
0,99
0,98
0,98
0,99
0,99
ID
AB056719.1 PVX bs Japan
0,98
0,97
0,97
0,98
0,98
0,98
ID
Carmen PVX
1,00
0,98
0,98
0,99
1,00
0,99
0,98
ID
164
61MR-PVX1F: 71 » 728
500
EU021215.1PVX: 1 » 6438
1
1000
1500
2000
gi 154816334 gb EU021215.1
2500
RdRp
3000
3500
4000
63MR-PVX3130F-PVX4495R: 3184 » 4480
6435 bp
4500
TG B1
5000
5500
CP
6000
58-60-65MR: 5491 » 6391
TG B3
TG B2
Figura 49. Contextualización de las secuencias obtenidas para las regiones 5‟NTR-5‟ RdRp parcial, 3‟RdRp
parcial y TGB3 parcial-CP-3‟NTR de la cepa ¨Carmen¨ de PVX, respecto a la secuencia de referencia
EU021215.
165
5.6.4. Secuencias parciales del genoma de PVS
Para el estudio de secuencias parciales del genoma de PVS, se emplearon cebadores
dirigidos a la región CP PVSCPF-PVSCPR (Figura 50), para dos cepas del departamento
de Antioquia (Tabla 22) realizándose las reacciones de RT-PCR como se describió en la
metodología.
Figura 50. Amplicones obtenidos con los cebadores PVSCPF-PVSCPR (1288 pb) carriles 12 a 20, a partir de
tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia. 1: Marcador 1 Kb, 12: Control negativo, 13:
Vergel Sta Rosa de Osos, 14: Estación Berrio Sta Rosa de Osos, 15: El Roble Sta Rosa de Osos, 16: Sta Ana
Sta Rosa de Osos, 17: Buena Vista La Unión, 18: Vía Sonsón La Unión, 19: Valle de María Santuario, 20:
Valle de María Santuario2.
De las dos cepas estudiadas, se obtuvieron dos fragmentos de CP (Figura 51), cuyo análisis
indicó identidades para el primer fragmento de 86% y 87% para nucleótidos, en las cepas
de Carmen y Santuario, respectivamente. Para el caso de aminoácidos, ambas cepas
tuvieron identidades del 92% con respecto a un aislamiento del virus obtenido en Alemania
(Tabla 40). Para el segundo fragmento, que comprendió a CP-3‟NTR, las identidades
166
fueron del 90% para nucleótidos y de 97% para aminoácidos con la cepa de referencia
(Tabla 41).
Tabla 40. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para las cepas Carmen y Santuario de PVS y su comparación con otros aislamientos del
mundo.
Nucleotidos
AJ863509.1 PVS Germany
AJ863510.1 PVS Germany
FJ813512.1 PVS USA
FJ813513.1 PVS USA
Carmen PVSCP
Santuario PVSCP
AJ863509.1PVSLeonaGermany
AJ863510.1PVSVltavaGermany
FJ813512.1PVSWaDefUS
FJ813513.1PVSId4106US
Carmen PVSCP
Santuario PVSCP
ID
0,79
ID
0,96
0,79
ID
0,96
0,79
0,99
ID
0,78
0,86
0,78
0,78
ID
0,78
0,87
0,78
0,78
1,00
ID
Aminoácidos
AJ863509.1 PVS Germany
AJ863510.1 PVS Germany
FJ813512.1 PVS USA
FJ813513.1 PVS USA
Carmen PVSCP
Santuario PVSCP
AJ863509.1PVSLeonaGermany
AJ863510.1PVSVltavaGermany
FJ813512.1PVSWaDefUS
FJ813513.1PVSId4106US
Carmen PVSCP
Santuario PVSCP
ID
0,83
ID
0,96
0,85
ID
0,96
0,85
0,99
ID
0,87
0,92
0,88
0,88
ID
0,87
0,92
0,88
0,88
0,99
ID
Tabla 41. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP-3‟NTR
secuenciada para las cepas Carmen y Santurio de PVS y su comparación con otros
aislamientos del mundo.
Nucleotidos
AJ863509.1 PVS Germany
AJ863510.1 PVS Germany
FJ813512.1 PVS USA
FJ813513.1 PVS USA
Carmen PVSCP
Santuario PVSCP
AJ863509.1PVSLeonaGermany
AJ863510.1PVSVltavaGermany
FJ813512.1PVSWaDefUS
FJ813513.1PVSId4106US
Carmen PVSCP
Santuario PVSCP
ID
0,85
ID
0,95
0,86
ID
0,96
0,86
0,98
ID
0,82
0,90
0,84
0,83
ID
0,81
0,90
0,84
0,83
1,00
ID
Aminoácidos
AJ863509.1 PVS Germany
AJ863510.1 PVS Germany
FJ813512.1 PVS USA
FJ813513.1 PVS USA
Carmen PVSCP
Santuario PVSCP
AJ863509.1PVSLeonaGermany
AJ863510.1PVSVltavaGermany
FJ813512.1PVSWaDefUS
FJ813513.1PVSId4106US
Carmen PVSCP
Santuario PVSCP
ID
0,99
ID
0,98
0,99
ID
0,99
1,00
0,99
ID
0,96
0,97
0,96
0,97
ID
0,96
0,97
0,96
0,97
1,00
ID
167
AJ863510.1PVSVltavaGermany: 1 » 8480
500
1000
AJ863509.1PVSLeonaGermany: 1 » 8480
1
1500
2000
2500
3000
RdRp
3500
4000
4500
5000
5500
gi 226359395 gb FJ813513.1
8485 bp
6000
6500
12 k Da
25 k Da
7000
68MY-PVSCPR: 7828 » 8335
67MY-PVSCPR: 7801 » 8335
67MY-PVSCPF: 7162 » 7754
8000
68MY-PVSCPF: 7162 » 7712
7500
CP
11 k Da
7 kDa
Figura 51. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP-3‟NTR de cepas Carmen y
Santuario de PVS, respecto a las secuencias de referencia AJ863510 y AJ863509.
168
5.6.5. Secuencias parciales del genoma de PLRV
Para PLRV no se contó con cebadores que flanquearan otras regiones del genoma
diferentes a la usada para el análisis filogenético. Es por ello que sólo se contextualizaron
con respecto a un genoma de referencia (AF453388) dos de las secuencias obtenidas para la
región que codifica CP (Tabla 22) (Figura 52). Se emplearon siete genomas completos de
diferentes orígenes geográficos y razas del virus para el análisis de las secuencias,
mostrando identidades superiores al 98% para nucleótidos con las secuencias obtenidas. En
el caso de las identidades para aminoácidos, la cepa ¨Siguineque¨ tuvo identidades del 99%
con aislamientos de las razas PLRV-Noir, PLRV-CU87 y una cepa de Egipto, mientras que
la cepa ¨Suras¨ presentó identidades del 98% con respecto a dichos aislamientos (Tabla 42).
Tabla 42. Matriz de identidad para nucleótidos y aminácidos de la región parcial de CP
secuenciada para las cepas Siguineque y Suras de PLRV y su comparación con otros
aislamientos del mundo.
Nucleótidos
AF453388.1AF453389.1
PLRV Zim13AF453390.1
PLRV
Francia
OP Spain
AF453391.1
PLRV Noir France
AF453392.1
PLRV Fr1 France
AF453393.1
PLRV CIP01AY138970.1
PLRV
FranceCU87Siguineque
PLRV
Cuba Egypt
PLRV Suras PLRV
AF453388.1 PLRV Zim13 Francia
ID
AF453389.1 PLRV OP Spain
0,99
ID
AF453390.1 PLRV Noir France
0,99
0,99
ID
AF453391.1 PLRV Fr1 France
1,00
0,99
0,99
ID
AF453392.1 PLRV CIP01 France
0,99
0,99
0,99
0,98
ID
AF453393.1 PLRV CU87 Cuba
0,99
0,99
1,00
0,99
0,99
ID
AY138970.1 PLRV Egypt
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
ID
Siguineque PLRV
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
0,99
ID
Suras PLRV
0,98
0,98
0,99
0,98
0,98
0,99
0,98
0,99
ID
Aminoácidos
AF453388.1AF453389.1
PLRV Zim13AF453390.1
PLRV
Francia
OP Spain
AF453391.1
PLRV Noir France
AF453392.1
PLRV Fr1 France
AF453393.1
PLRV CIP01AY138970.1
PLRV
FranceCU87Siguineque
PLRV
Cuba Egypt
PLRV Suras PLRV
AF453388.1 PLRV Zim13 Francia
ID
AF453389.1 PLRV OP Spain
0,98
ID
AF453390.1 PLRV Noir France
0,99
0,99
ID
AF453391.1 PLRV Fr1 France
0,99
0,97
0,98
ID
AF453392.1 PLRV CIP01 France
0,99
0,98
0,99
0,98
ID
AF453393.1 PLRV CU87 Cuba
0,99
0,99
1,00
0,98
0,99
ID
AY138970.1 PLRV Egypt
0,99
0,99
1,00
0,98
0,99
1,00
ID
Siguineque PLRV
0,98
0,98
0,99
0,97
0,98
0,99
0,99
ID
Suras PLRV
0,97
0,97
0,98
0,96
0,97
0,98
0,98
0,99
ID
169
500
1000
AF453388.1PLRVstrainZim13France: 1 » 5865
1
P1
1500
2000
P2
2500
3000
3500
P4
87MY-PLRV: 3653 » 3978
4000
20FB-PLRV: 3652 » 3978
P3-CP
AF453388.1PLRVstrainZim13France
5865 bp
4500
P5
5000
P6
P7
5500
Figura 52. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región parcial CP de las cepas de PLRV
Siguineque y Suras, respecto a la secuencia de referencia AF453388 .
170
5.6.6. Secuencias parciales del genoma de PYVV
Del virus PYVV se eligieron dos cepas (Tabla 22) para estudiar otra región del genoma
diferente a la región de CP que se empleó en el análisis filogenético (Figura 54). Dicha
región correspondió a la codificante para CPm en el ARN3 y se emplearon para su
amplificación mediante RT-PCR los cebadores CPm1-CPm2, obteniendo los amplicones
del tamaño esperado (Figura 53).
Figura 53. Amplicones obtenidos con los cebadores CPm1-CPm2 (2025 pb), a partir de tejido foliar de papa
de dos cepas del departamento de Nariño. 1: Marcador 100, 2: Obonuco, 3: Saguarán, 4: Control negativo.
El análisis de las secuencias se realizó comparándolas con dos genomas completos del virus
obtenidos del Perú y depositados en el GenBank (NC_006063.1 y AJ557129.1), tanto para
la región CPm (Figura 54), como para CP (Figura 55). Dicho análisis mostró identidades
del 99% para la región de nucleótidos correspondiente al 5‟ de CPm de ambas secuencias
(Obonuco y Saguarán), mientras que para aminoácidos fue del 98% (Tabla 43). El segundo
171
segmento de CPm hacia el extremo 3‟, presentó identidades para nucleótidos y aminoácidos
superiores al 98% (Tabla 44).
Tabla 43. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región parcial del
extremo 5‟de CPm secuenciada en las cepas Obonuco y Saguarán con dos cepas de PYVV
del Perú.
Nucleotidos
AJ508757.2PYVVCPmPeru
NC_006061.1PYVVCPmPeru
Obonuco
AJ508757.2 PYVV CPm Peru
ID
NC_006061.1 PYVV CPm Peru
1,00
ID
Obonuco PYVV
0,99
0,99
ID
Saguarán PYVV
0,99
0,99
0,99
Saguarán
Aminoácidos
AJ508757.2PYVVCPmPeru
NC_006061.1PYVVCPmPeru
Obonuco
AJ508757.2 PYVV CPm Peru
ID
NC_006061.1 PYVV CPm Peru
1,00
ID
Obonuco PYVV
0,98
0,98
ID
Saguarán PYVV
0,98
0,98
0,99
Saguarán
ID
ID
Tabla 44. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región parcial del
extremo 3‟de CPm secuenciada en las cepas Obonuco y Saguarán con dos aislamientos de
PYVV del Perú.
Nucleotidos
AJ508757.2PYVVCPmPeru
NC_006061.1PYVVCPmPeru
Obonuco
AJ508757.2 PYVV CPm Peru
ID
NC_006061.1 PYVV CPm Peru
1,00
ID
Obonuco PYVV
0,99
0,99
ID
Saguarán PYVV
0,99
0,99
0,99
Saguarán
Aminoácidos
AJ508757.2PYVVCPmPeru
NC_006061.1PYVVCPmPeru
Obonuco
AJ508757.2 PYVV CPm Peru
ID
NC_006061.1 PYVV CPm Peru
1,00
ID
Obonuco PYVV
0,99
0,99
ID
Saguarán PYVV
0,98
0,98
1,00
Saguarán
ID
ID
172
El análisis de la región CP mostró identidades para nucleótidos respecto a las dos
secuencias de referencia del 99% y para aminoácidos igualmente del 99% (Tabla 45).
Tabla 45. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada
para las cepas Obonuco y Saguarán y dos aislamientos de PYVV del Perú.
Nucleotidos
NC_006063.1PYVVCPPeru
AJ557129.1PYVVCPUK
Obonuco Saguarán
NC_006063.1 PYVVCP Peru
ID
AJ557129.1 PYVVCP Perú
1,00
ID
Obonuco
0,99
0,99
ID
Saguarán
0,99
0,99
1,00
ID
Aminoácidos
NC_006063.1PYVVCPPeru
AJ557129.1PYVVCPUK
Obonuco Saguarán
NC_006063.1 PYVVCP Peru
ID
AJ557129.1 PYVVCP Perú
1,00
ID
Obonuco
0,99
0,99
ID
Saguarán
0,99
0,99
1,00
ID
173
NC_006061.1PYVVCPmPeru: 1 » 3892
500
AJ508757.2PYVVCPmPeru: 1 » 3892
1
P4
94MYCPm1: 978 » 1737
96MYCPm1: 967 » 1706
1000
1500
CPm
2000
96MYCPm2: 2133 » 2889
94MYCPm2: 2112 » 2899
2500
gi 30172189 emb AJ508757.2
3892 bp
3000
P26
3500
Figura 54. Contextualización de las secuencias obtenidas para CPm parcial de las cepas de PYVV Obonuco y
Sagruarán, respecto a las secuencias de referencia NC_006063.1 y AJ557129.1.
174
AJ557129.1PYVVCPUK: 1 » 5339
500
NC_006063.1PYVVCPPeru: 1 » 5339
1
1000
1500
Hsp70
2000
P7
2500
3000
P60
3500
gi 46518016 emb AJ557129.1
5339 bp
4000
P10
90MY-PYVV: 4311 » 5023
92MY-PYVV: 4302 » 5038
4500
CP
5000
Figura 55. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de cepas de PYVV Obonuco y
Sagruarán, respecto a las secuencias de referencia NC_006063.1 y AJ557129.1.
175
5.7. Diagnóstico de los virus PVY y PMTV mediante RT-PCR en tiempo real.
5.7.1. Pruebas de detección de PVY.
Las reacciones de RT-PCR (Figura 56) y qRT-PCR (Figura 57) resultaron en
amplificaciones exitosas del genoma de PVY cuando se emplearon los cebadores descritos
en la metodología (Tablas 3 y 4), obteniéndose los fragmentos de ~227pb y las curvas de
amplificación del reporte de emisión de fluorescencia esperados, respectivamente.
Al comparar los niveles de detección en tejido foliar de papa del virus PVY mediante RTPCR en tiempo real (qRT-PCR) con relación a RT-PCR y ELISA, se encontró que esta
metodología detectó la presencia del virus en la totalidad de las muestras evaluadas (con
excepción del control negativo), mientras que la RT-PCR convencional y la prueba de
ELISA detectaron el virus en el 88% y 63% de las muestras. El análisis estadístico arrojó
diferencias significativas al nivel del 95% entre la prueba de ELISA y qRT-PCR, pero no
entre ELISA y PCR convencional (Figura 58).
176
Figura 56. Amplicones obtenidos con los cebadores PVYF y PVYUnivR (227 pb) a partir de tejido foliar de
plantas de papa de dos departamentos de Colombia (Tabla 5). 1: Marcador 100pb, 2: P3 6-10, 3: P3 EN, 4: P4
1-5, 5: P4 AV, 6: P4 11-15, 7: P5 11-15, 8: P6 11-15, 9: P7 MR, 10: P8 AV, 11: P8 16-20, 12: Ip EF, 13: Ip
Esp, 14: Ip EN, 15: Ip MR, 16: Ip1 AV, 17: Ip2 MR, 18: Ip3 1-5, 19: Ip8 EF, 20: Ip4 AV, 21: Marcador
100pb, 22: Ip4 11-15, 23: U1, 24: U2, 25: U3, 26: U4, 27: U5, 28: U6, 29: U7, 30: U8, 31: SR1, 32: SR2, 33:
SR3, 34: SR4, 35: SR5, 36: SR6, 37: SR7, 38: SR8, 39: SR9, 40: B1. (Vease Figura 58b: muestras B2, B3 y
Control negativo).
177
Figura 57. Gráfica de amplificación de qRT-PCR con los cebadores PVYUnivF, PVYUnivR y la sonda
PVYUniv a partir de tejido foliar de plantas de papa de dos departamentos de Colombia.
Figura 58. Porcentajes de detección del virus PVY empleando ELISA, RT-PCR y qRT-PCR en muestras de
tejido foliar de papa de los departamentos de Antioquia y Nariño.
178
5.7.2. Pruebas de detección de PMTV
Las reacciones de RT-PCR (Figura 59) y qRT-PCR (Figura 60) resultaron en
amplificaciones exitosas de PMTV empleándose los cebadores descritos en la metodología
(Tablas 3 y 4), obteniéndose los amplicones de ~816 pb y curvas de reporte de la emisión
de fluorescencia esperados, respectivamente.
Al analizar los niveles de detección en raíces de N. benthamiana sembradas en turba
inoculada con el suelo tamizado con quistosoros de S. subterranea, se encontró que la
prueba de qRT-PCR determinó la presencia del virus en el 45% de las muestras analizadas,
mientras que mediante ELISA y RT-PCR convencional se diagnosticaron 25 y 28% de las
muestras como positivas para este virus. Sin embargo, el análisis estadístico no indicó
diferencias significativas al nivel del 95% entre las tres pruebas analizadas (Figura 61). Al
observar individualmente la capacidad de las pruebas para detectar el PMTV, resultó
llamativo el hecho que algunas muestras fueran positivas para dos de las tres pruebas, e
incluso se presentaron casos en los que la prueba de ELISA detecto el virus pero no las
pruebas basadas en RT-PCR, lo cual sugiere problemas con la inhibición de las reacciones
enzimáticas o con los cebadores empleados (Tabla 46).
179
Tabla 46. Detección del virus PMTV en muestras de tejido de raíz de plantas de N.
benthamiana sembradas en turba inoculada con S. subterranea, empleando tres
metodologías (ELISA, RT-PCR, qRT-PCR).
Muestra
Localidad
Vereda
C+
C+ 1/5
C+ 1/10C+ 1/57
KIT ELISA
KIT ELISA
KIT ELISA
KIT ELISA
Ipiales
Rosario
10
Pasto
El Campanero
10(1)
Pasto
23
Zipaquirá
23(1)
25
25(1)
35
36
Vallejuelito
Villapinzón
Villapinzón(1)
Villapinzón(2)
Madrid
Madrid(1)
Madrid(2)
Zipaquirá
La unión
La unión
La unión
La unión
La unión
Villapinzón
Villapinzón
Villapinzón
Madrid
Madrid
Madrid
El Campanero
Páramo
Guerrero
Páramo
Guerrero
La Cabaña
La Cabaña
Zipaquirá
Zipaquirá
Zipaquirá(1)
Zipaquirá
Zipaquirá(2)
Zipaquirá
Zipaquirá(3)
Zipaquirá
Zipaquirá(4)
Tunja
Tunja(1)
Tunja(2)
Tunja(3)
Ventaquemada
ventaquemada (1)
Ventaqumada(2)
Ventaquemada(3)
Zipaquirá
Tunja
Tunja
Tunja
Tunja
Ventaquemada
Ventaquemada
Ventaquemada
Ventaquemada
Vallejuelito
Chasques
Chasques
Chasques
Los Árboles
Los Árboles
Los Árboles
Páramo
Guerrero
Páramo
Guerrero
Páramo
Guerrero
Páramo
Guerrero
Páramo
Guerrero
Siachoque
Siachoque
Siachoque
Siachoque
Capellanía
Capellanía
Capellanía
Capellanía
Variedad
ELISA
RT-PCR
qRT-PCR
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
-
+
+
Pastos
-
-
+
Pastos
Criolla
Criolla
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
+
-
+
+
-
Unica
Parda
Pastusa
Parda
Pastusa
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Parda
Pastusa
Parda
Pastusa
Parda
Pastusa
Parda
Pastusa
Parda
Pastusa
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
Capiro
180
Continuación Tabla 46
SRO L2
SRO L4
SRO L5
SRO L5(2)
SRO L6
SRO L7
TZ+Z+
Sta Rosa de
Osos
Sta Rosa de
Osos
Sta Rosa de
Osos
Sta Rosa de
Osos
Sta Rosa de
Osos
Sta Rosa de
Osos
Turmeqé
Aragón
Capiro
-
-
-
Aragón
Capiro
-
-
+
Aragón
Capiro
-
+
-
Aragón
Capiro
-
+
-
Aragón
Capiro
+
+
+
El Tres
Siguineque
Capiro
Criolla
+
-
+
-
+
-
181
Figura 59. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTV759F y PMTV1552R (816 pb) a partir de tejido
de raíz de plantas de N. benthamiana cultivadas en suelos infestados con S. subterranea de cuatro
departamentos de Colombia (Tabla 6). a. 1: Marcador 100pb, 2: C+, 3: C+ 1/5, 4: C+1/10, 5: C+ 1/50, 6: 7, 7:
10, 8: 10 (1), 9:23, 10: 23 (1), 11: 25, 12: 25 (1), 13: 35, 14: 36, 15: Valle, 16: Villapinzón, 17: Villapinzón
(1), 18: Villapinzón (2), 19: Madrid, 20: Madrid (1), 21: Marcador 100pb, 22: Madrid (2), 23: Zipaquirá, 24:
182
Zipaquirá (1), 25: Zipaquirá (2), 26: Zipaquirá (3), 27: Zipaquirá (4), 28: Tunja, 29: Tunja (1), 30: Tunja (2),
31: Tunja (3), 32: Ventaquemada, 33: Ventaquemada (1), 34: Ventaquemada (2), 35: Ventaquemada (3). b. 1:
Marcador 100pb, 2: SRO L2, 3: SRO L4, 4: SRO L5, 5: SRO L5 (1), 6: SRO L6, 7: SRO L7, 8: TZ1Z1, 9:
Marcador 100pb, 10: Control negativo para PMTV, 11: B2, 12: B3, 13: Control negativo para PVY.
Figura 60. Gráfica de amplificación de qRT-PCR con los cebadores PMTV1948F, PMTV2017R y la sonda
PMTV1970 a partir de tejido de raíz de plantas de N. benthamiana cultivadas en suelos infestados con S.
subterranea de cuatro departamentos de Colombia
183
Figura 61. Porcentajes de detección del virus PMTV empleando ELISA, RT-PCR y qRT-PCR en muestras de
tejido de raíz de N. benthamiana cultivadas en suelos procedentes de cuatro departamentos de Colombia.
184
6. DISCUSIÓN
La papa es el cuarto cultivo de producción mundial luego del arroz, maíz y trigo, que
provee la subsistencia básica a personas de diferentes continentes y es considerado por
algunas sociedades como el segundo pan (Secor y Rivera-Varas, 2004). Sin embargo, este
cultivo es afectado por un sinnúmero de patógenos, dentro de los cuales se destacan los
virus. Dichos patógenos, se han venido reportando regularmente en los cultivos de papa del
país, incluyendo PVY, PLRV; PVX, PVS y PYVV; este último ha aumentado su
importancia en las últimas décadas por su rápida diseminación y efectos sobre el cultivo
(Guerrero, 1978; Guzman et al., 2004a; Zapata, 2004). Para los virus mencionados se han
realizado diversos estudios en el país, con el fin de evaluar su incidencia en algunas
regiones productoras o en variedades cultivadas, así como también su efecto sobre la
producción y rendimiento (Guerrero y Martinez, 1980; Sánchez de Luque et al., 1991;
Zapata, 2004; Guzmán et al., 2004a). Recientemente, como avance de este trabajo (Gil et
al., 2009), se reportaron altas incidencias para Potyvirus en los cultivos de tres regiones de
Antioquia (41 a 75%), mientras que el virus PLRV presentó niveles de 9 al 16% y PVX
sólo se encontró en la región de Marinilla-Rionegro en una proporción del 22%. Esto
enfatiza la importancia de reforzar los programas de certificación de semilla, debido a que
el agricultor emplea en la mayoría de los casos, semilla de repetición infectada por virus y
como resultado hay una degeneración continua del material de siembra y de los
rendimientos esperados del cultivo.
Por otro lado, la reciente documentación de la presencia del virus PMTV en el país (Vélez,
2007) conduce a pensar que adicional a los virus tradicionalmente estudiados y
contemplados en los programas de certificación de semilla, existen otros que son
185
prevalentes y de importancia cuarentenaria, pero que aún no se reportan debido a que no se
ha realizado una evaluación de su presencia en el país, como podría ser el caso de los virus
PVM, PAMV, AMV, APMV, PVT, APLV, entre otros y cuyo reporte se ha dado
previamente en otros países andinos y de Centro América (Salazar, 1995; Vásquez et al.,
2006).
Al realizar las evaluaciones visuales de los síntomas presentes en los cultivos de papa del
país, se trató de simular la actividad realizada por los técnicos de campo y agricultores para
determinar la presencia o no de afecciones virales. Como resultado se evidenció que no
siempre se presentan síntomas individuales, sino que éstos generalmente pueden estar
combinados y que como es bien sabido, no siempre corresponden a enfermedades virales,
por lo que son referidos en este trabajo como presumiblemente asociados a virus. Es por
esto que algunos amarillamientos y rugosidades foliares, fácilmente se pueden confundir
con síntomas virales, aunque pueden ser debidos a desórdenes fisiológicos ocasionados por
exceso en las aplicaciones de biocidas (fitotoxicidad), cambios drásticos en las condiciones
ambientales y de nutrición de los cultivos, así como corresponder a químeras genéticas.
Los cultivos en Antioquia presentaron los mayores niveles de incidencia visual para los
cuatro síntomas evaluados (AV, EF, EN, MR), lo cual estuvo acompañado por la detección
en este departamento de los mayores niveles de incidencia de los virus estudiados mediante
pruebas de ELISA. Por otro lado, los resultados obtenidos de las muestras síntomáticas
evaluadas mediante las pruebas serológicas específicas para los virus Potyvirus, PVX,
PLRV, PVS, indican que no necesariamente los síntomas observables son atribuibles a
determinados virus y que la ausencia de síntomas no representa ausencia de virus en los
cultivos. Los resultados visuales de Boyacá, Cundinamarca y Nariño fueron muy similares
186
entre ellos, al igual que las incidencias evaluadas mediante ELISA, pero con promedios
inferiores a lo encontrado en Antioquia. Sin embargo, al evaluar estos resultados es
necesario contemplar la posible ocurrencia de otros virus no determinados en este trabajo,
así como las diferencias en las variedades y épocas de muestreo para cada una de las zonas
estudiadas, ya que es es bien sabido que la temperatura, precipitación, poblaciones de
insectos vectores y estado fenológico del cultivo, entre otros factores, influyen
dramáticamente en la manisfestación de los síntomas inducidos por virus.
Un antecedente que demuestra la necesidad de realizar monitoreos regulares sobre los
cultivos de papa del país con el fin de evaluar su incidencia y de realizar estudios tendientes
a identificar nuevos virus asociados al cultivo, es el del trabajo llevado a cabo en Costa
Rica para identificar los virus de papa presentes en este país y fortalecer su programa de
certificación de semilla. Dicho estudio, contempló, la evaluación de siete virus no incluidos
en su programa de certificación de semilla y la determinación de la incidencia de seis virus
contenidos en este programa, empleando para ello pruebas de ELISA. Como resultado se
encontró que virus como PAMV y TRSV presentaron incidencias muy altas y superiores a
las de virus comúnmente estudiados (Vásquez et al., 2006). El caso de PAMV llama la
atención, debido a que no se había reportado en dicho país a pesar de ser un virus con
amplia dispersión en Centro y Suramérica, de fácil transmisión por áfidos y común asocio
con PVY (Baulcombe et al., 1993; Brunt et al., 1996; Salazar, 1995). Así mismo, se
encontró una incidencia de PMTV del 50% en muestras tomadas entre las altitudes 1800 a
2500 msnm, alturas similares a las regiones donde se siembra papa en nuestro país. Además
de estos resultados, se reportó las presencia de seis de los siete virus que aún no habían sido
documentados en Costa Rica (Vásquez et al., 2006).
187
Para el caso particular de PMTV, la literatura describe que su sintomatología en papa
incluye moteados amarillos y mosaicos en las hojas nuevas, al igual que zonas cloróticas en
forma de V y acortamiento de entrenudos hacia los brotes (síntoma del que proviene el
nombre de Mop-Top). Los síntomas en las hojas parecen estar presentes solo en climas
muy fríos y cuando el tubérculo semilla ha sido infectado con anterioridad. En algunas
variedades los tubérculos desarrollan anillos necróticos concéntricos en la superficie,
síntoma conocido como “Spraing” (Rydén et al., 1986; Rydén et al., 1989; Harrison y
Reavy 2002). Partiendo de este precedente, los muestreos en campo de nuestra
investigación, estuvieron dirijidos a la observación de dichos síntomas, especialmente en
los sitios más altos de las zonas evaluadas. Desafortunadamente, no fue posible detectar
PMTV mediante ELISA o RT-PCR a partir de tejido de papa con síntomas similares a los
descritos anteriormente, ni en raíces y tubérculos de papa afectados por S. subterranea,
hecho por el cual se decidió evaluar la presencia del virus a partir de plantas señuelo,
principalmente N. benthamiana, siguiendo los reportes planteados por Sjöberg (2006) y
Vélez (2007). De esta forma, se diagnosticó la ocurrencia del virus en al menos una
muestra de los cuatro departamentos evaluados. No obstante, persiste la pregunta sobre los
niveles de incidencia de PMTV en las diferentes regiones cultivadoras de papa del país y
sobre su efecto en la degeneración del tubérculo semilla y/o en la producción; lo cual de
resultar significativo, sería muy grave al adicionar este problema al causado por S.
subterranea, su agente vector, que puede ocasionar reducciones en rendimiento hasta del
40% (Gilchrist et al., 2009).
Para complementar el análisis de incidencia de los virus bajo estudio y obtener mayor
información sobre aquellos de los cuales no se pudo hacer análisis de incidencia, se
188
realizaron los análisis filogenéticos de los seis virus bajo estudio (PVY, PYVV, PVS, PVX,
PLRV y PMTV). En todos los casos la región del genoma utilizada para dicho análisis
correspondió a aquella que codifica para CP; aunque para el caso de PMTV se empleó
adicionalmente una fracción de la región que codifica para la proteína TGB2.
El virus PVY fue el virus del cual se obtuvo un mayor número de aislamientos para el
análisis filogenético. Dicho análisis presentó para este virus, identidades superiores al 89%
de las cepas Colombianas con respecto a las de referencia de diferentes países, lo que
demuestra que todas son variantes de la misma especie, según los criterios taxonómicos
definidos para el género Potyvirus (Glais et al., 2002b; Adams et al., 2005). De dichas
comparaciones, resultó destacado el hecho que todas las cepas secuenciadas se ubicaron en
un clado filogenético compartiendo identidades superiores al 95% con aislamientos que
representan las razas del virus PVY-N y PVY-NTN. Con respecto a las secuencias parciales
del genoma de PVY de los aislamientos del departamento de Antioquia, se encontraron
igualmente altas identidades con las razas PVY-N y PVY-NTN para la región que codifica
la proteína P1, CP y los UTR 5‟ y 3‟. Lo anterior, sugiere la posible presencia de la
enfermedad PTNRD en el país. Dicha enfermedad se caracteriza por la presencia de anillos
necróticos en los tubérculos, que pueden aparecer cuando estos se cosechan, pero más
comúnmente cuando se almacenan (Glais et al., 2002a). Debido a que en Colombia no es
una práctica usual el almacenamiento de tubérculos, los síntomas de la presencia de la
enfermedad PTNRD pueden ser confundidos o verse enmascarados por otros factores,
como los climáticos y los agrietamientos ocasionados por la herramienta de labranza e
incluso por otros patógenos en el tubérculo. Al parecer los síntomas foliares de la raza
PVY-NTN son más severos que los producidos por PVY-N, produciendo también anillos
189
en la lámina foliar (Kogovsek et al., 2008). Sin embargo, es necesario disponer de mayor
información relacionada con las secuencias de los aislamientos generadas en este estudio
para conocer con certeza las identidades taxonómicas de éstos, así como los eventos
recombinatorios que presentan y de esta forma, direccionar los estudios tendientes a
identificar la sintomatología, daño asociado a cada una de las variantes de PVY y su efecto
en los programas de certificación de semilla y mejoramiento genético que se realizan en el
país. Lo anterior permitirá conocer además, sí existe una relación entre las características
del genoma viral y la habilidad de dichas variantes para romper la resistencia a los
materiales mejorados y/o naturalamente tolerantes a este virus (Schubert et al., 2007).
El análisis filogenético del virus PYVV, mostró identidades superiores al 99% con las
secuencias de referencia de Perú y Colombia. Esto también sucedió cuando se analizó la
región que codifica para la proteína CPm del virus. Desafortunadamente, no existe mucha
información disponible de las secuencias de este virus, dificultándose la realización de
análisis de variabilidad genética. PYVV, se puede considerar un virus “exótico” y
restringido al subcontinente Suramericano, ya que aún no se ha reportado en otros lugares
del mundo, lo que a su vez lo constituye en un virus de gran importancia cuarentenaria para
los países europeos, principalmente (Lopez et al., 2006). La importancia de su infección
radica en que puede ocasionar pérdidas en el rendimiento de hasta el 50% en el cultivo de
la papa y a que, en algunos cultivares, el virus puede permanecer como una enfermedad
latente, no necesariamente causando su sintomatología típica de amarillamiento de las
nervaduras secundarias (Salazar et al., 2000). En el árbol filogenético obtenido, se aprecia
claramente que todas secuencias se agrupan en un clado y que los cambios de nucleótidos
son mínimos. Este resultado es muy similar al encontrado por Offei et al, (2004), cuando
190
compararon aislamientos de PYVV colombianos con peruanos, obteniendo 99% de
identidad de nucleótidos en todas las secuencias evaluadas. Sin embargo, un estudio más
reciente realizado por Guzmán et al, (2006), basado en RT-PCR RFLP, se encontraron tres
diferentes patrones de restricción (A, B y C) con la enzima HinfI para 18 aislamientos de
los departamentos de Antioquia, Cundinamarca y Nariño, predominando en un 80% el
patrón A. Adicionalmente, se observó que hubo combinación de patrones de restricción A
con B ó con C, indicando posibles infecciones combinadas de al menos dos diferentes
genotipos de PYVV. El patrón de restricción A sólo se observó en Nariño, mientras que los
tres patrones estuvieron presentes en las muestras de Antioquia y Cundinamarca. Estudios
independientes sugieren que PYVV se diseminó a partir de Colombia y Ecuador hacia otros
países vecinos como Perú y Venezuela (Salazar et al., 2000; Offei et al., 2004), por lo que
es posible que el nivel de variación hasta ahora encontrado, esté subestimado o mejor
representado en otras regiones del genoma diferentes a la cápside viral. En este sentido, en
un estudio realizado sobre 50 aislamientos de PYVV en S. phureja en Colombia, se
reportaron cuatro perfiles electroforéticos mediante la metodología de polimorfismo
conformacional de la cadena sencilla (SSCP) (Guzmán et al., 2009). Como se puede inferir
de estos resultados, se requiere de un estudio más profundo del virus PYVV en nuestro
país, para determinar con mayor precisión sus posibles variantes, las implicaciones
epidemiológicas de éstas y su efecto en los rendimientos de las variedades cultivadas en
Colombia.
Con respecto al análisis de secuencias del virus PVS, se presentaron valores de identidad
superiores al 76% entre las cepas Colombianas y aquellas de referencia, lo que indica un
alto grado de variabilidad en este virus. Matousek et al. (2000), describen alta variabilidad
191
entre aslamientos andinos y ordinarios de PVS (PVSA y PVSo, respectivamente), siendo
mayor cuando se comparan las regiones localizadas hacia el extremo N-terminal de la CP.
En el presente estudio, dicha variabilidad se evidencia en el árbol filogenético, en el cual
las diferentes cepas del país se agrupan con las cepas de referencia en dos clados, con altos
soportes de bootstrap. El clado I aparentemente esta relacionado con la raza PVSA, al
ubicarse allí una de las cepas características de esta raza (Vltava). Sin embargo, dentro del
mismo clado existe una gran variación entre las cepas colombianas, las que incluso se
dividen en dos subclados bien definidos. El clado II, estuvo representado por cepas
pertenecientes a PVSo junto con tres cepas del altiplano Cundiboyacense (Chikh et al.,
2008; Cox & Jones, 2010a). Cox & Jones (2010a), obtuvieron resultados muy similares a
los aquí reportados, aunque las identidades encontradas para la región CP en el presente
trabajo, resultaron aún más bajas que las indicadas por dichos autores. Respecto a la
secuenciación parcial del genoma de PVS, se obtuvo un fragmento de mayor tamaño de la
región CP para dos aislamientos del departamento de Antioquia. Uno de ellos fue obtenido
del mismo material de papa del que se obtuvo PVY (identificado como Carmen) para la
secuenciación parcial de su genoma. Los datos indicaron identidades superiores al 78% en
esta región con respecto a cepas de referencia de USA y Alemania, confirmándose así los
resultados de variación encontrados en el análisis filogenético.
En esta investigación se encontró una alta incidencia de PVY y PVS infectando papa en
Colombia, a partir de cepas con niveles importantes de variación, para ambos virus. Es por
esto, que se deben fortalecer las medidas de diagnóstico y control para estos virus,
principalmente en los programas de certificación de semilla, y especialmente considerar el
manejo de sus vectores en regiones que favorezcan su diseminación.
192
PLRV ha sido uno de los virus más estudiados y prevalentes en el cultivo de la papa a nivel
mundial, así como uno de los que probablemente causan mayores daños en el cultivo
(Solomon-Blackburn y Barker, 2001). Sin embargo, reiteradamente no se ha encontrado
una notable diferencia entre las secuencias de sus aislamientos alrededor del mundo, hecho
que se repitió en este trabajo al analizar las secuencias obtenidas de la región que codifica
para CP. El análisis filogenético mostró diferencias de máximo un 3% con respecto a las
secuencias de referencia y agrupó a todas las cepas en un solo clado. Cuando se realizó el
análisis de la contextualización de las secuencias obtenidas de PLRV respecto a los
genomas de referencia, se encontraron igualmente identidades del orden del 99% y 98%
para nucleótidos y aminoácidos respectivamente, para la cepa Siguineque, mientras que la
cepa Suras, presentó identidades del 98% y 97% para nucleótidos y aminoácidos. Según la
literatura, la varibilidad estudiada y reportada para el virus, se centra principalmente en la
región codificante para P0. Dicha región permite la discriminación entre diferentes
aislamientos del virus y la distinción en tres grupos de aislamientos, con valores de
identidad que fluctúan entre 94,7% y 98,5% (Plchova et al., 2009). Se ha planteado que los
bajos niveles de variación encontrados en este virus son posiblemente resultado de su
reciente divergencia a partir de otro virus que se especializó en la afección a papa y/o a las
fuertes presión de selección que ejerce la estrecha base genética de las variedades de S.
tuberosum cultivadas en el mundo (Guyader y Ducray, 2002; Taliansky et al., 2003). Es
necesario entonces, para conocer la verdadera variabilidad de las cepas de PLRV presentes
en el país, analizar las secuencias de las regiones hacia el extremo 5‟ del genoma del virus,
como lo es P0.
193
Para el caso del virus PVX, el análisis de las secuencias obtenidas junto con las de
referencia mostró diferentes grupos y una variabilidad relativamente baja de los
aislamientos colombianos, aunque algunos de ellos presentaron diferencias importantes con
respecto a las secuencias de referencia (86% al 77%). El árbol filogenético separó las cepas
colombianas en dos clados, siendo mayoritario el número de éstas ubicado en el clado I;
mientras que el clado II sólo estuvo conformado por dos cepas del departamento de Nariño.
En cuanto a la secuenciación parcial del genoma de PVX, los dos aislamientos utilizados
provinieron del departamento de Antioquia. La cepa Carmen, se obtuvo del mismo material
en el cual se detectaron los virus PVS y PVY utilizados en el análisis de secuencias y
denominados bajo este mismo nombre. El análisis mostró que en los dos casos las
secuencias obtenidas no presentaron un alto grado de variabilidad respecto a las secuencias
de los genomas de referencia, fluctuándo éstos valores entre 94 y 98% para nucleótidos y
98 a 100% para aminoácidos. Basados en los resultados de Yu et al, (2010), que separan las
cepas de PVX con base en secuencias de CP en dos diferentes orígenes geográficos
(Eurasia y America), y en los resultados obtenidos en este trabajo, donde se obtuvo una
separación de las cepas de referencia en los mismos grupos, se podría decir que el clado I
contiene cepas asociadas al grupo ¨Eurasia¨ y el clado III posee cepas asociadas al grupo
¨America¨. A partir de lo anterior, se puede inferir que el clado II es evidentemente un
grupo no asociado a los descritos por Yu et al, (2010), y que podría coincidir con un clado
recientemente descrito por Cox y Jones (2010b), que incluye seis aislamientos de los Andes
suramericanos. Cabe preguntarse entonces, cuales serían las implicaciones biológicas de
este grupo aparentemente diferente con respecto a la epidemiología y efecto del virus PVX
en los cultivos de papa de Colombia. Es necesario entonces, secuenciar y analizar un mayor
194
número de aislamientos del país y evaluar su grado de virulencia frente a diferentes
materiales de papa, de manera que se genere una mejor perspectiva sobre la estructura
poblacional de PVX en nuestro país.
Del virus PMTV se realizó el análisis filogenético para dos regiones del genoma
amplificadas con los cebadores H360-C819 y PMTVF4-R4, utilizados previamente por
Vélez (2007) en un estudio que incluyó muestras de diferentes regiones del país. La
primera región codifica para CP (ARN2) y la segunda para la proteína TGB2 (ARN3). En
el primer caso, dos de las cuatro secuencias de cepas colombianas (70MR y 71MR), se
agruparon en el mismo clado con las secuencias de referencia de PMTV de otros países y
compartiendo identidades superiores al 98%, mientras que las otras dos cepas (71MY y
72MY) se ubicaron en un clado independiente y con bajos niveles de identidad con respecto
al clado I (~76%). Esta situación ya había sido reportada por Vélez (2007), al encontrar que
algunos aislamientos Colombianos de PMTV presentaban identidades cercanas al 80% en
la secuencia de nucleótidos que codifica para la región de CP con relación a las cepas cuyas
secuencias se encontraban disponibles en el GenBank. Lo anterior muestra que el grado de
variación que presenta el virus, al menos en esa región del genoma, es alto para algunas
cepas de Colombia e incluso permite plantear la posibilidad de que correspondan a
diferentes especies virales del género Pomovirus. Esta situación requiere de un análisis
completo del genoma y de estudios epidemiológicos que evaluen el efecto de estas
variantes sobre la transmisión del virus, su nivel de virulencia en diferentes materiales de
papa y su distribución en la planta. Nielsen y Nicolaisen (2003), reportaron la presencia en
Dinamarca de dos grupos de PMTV basado en análisis de las secuencias de CP,
encontrando que éstos comparten 98% de identidad, pero con diferencias notables en la
195
reproducción de síntomas en plantas indicadoras. Una situación similar fue encontrada por
Mayo et al. (1996) al comparar las secuencias de CP de ocho aislamientos de PMTV
obtenidos en los Andes Peruanos y tres procedentes de Escocia. Xu et al (2004), reportaron
la presencia del virus en USA y Canadá, y altos niveles de identidad con los aislamientos
reportados hasta ese momento en Perú y Europa. Adicionalmente, en dicho trabajo se
confirmó la distribución errática del virus en la planta, recomendándose la necesidad de
tomar muestras de distintas partes de un mismo tubérculo para detectar el virus. Para el
caso de las secuencias obtenidas de la región TGB2, se obtuvieron niveles de identidad para
nucleótidos superiores al 97% para dos de las tres cepas locales, mientras que la restante
(70MY) presentó identidades cercanas al 86%. Como es de notar, las dos cepas que
mostraron marcada diferencia respecto a las demás para la región CP y esta última descrita
para la región TGB2 son de de la sabana Cundiboyacense, lo que permite suponer que en
dicha zona, es posible que se encuentren genotipos diferentes a los mundialmente
reportados para este virus. Dichas diferencias pueden estar muy relacionadas con la
variabilidad encontrada en S. subterranea en el país, la cual separa al patógeno en dos
grupos de acuerdo al tejido de donde éste se ha aislado (tubérculo o raíz). En este sentido,
recientemente Carreño (2009) evaluó la variabilidad de S. subterranea en Colombia
mediante la técnica SSCP a partir de amplicones de la región ITS, confirmando la presencia
de al menos dos grupos de aislamientos. La relación entre las diferencias encontradas entre
las poblaciones de ambos patógenos son de interés debido a que es CP y más
específicamente CPRT, la proteína relacionada con la transmisión del virus por dicho
plasmodioforido, tal como se demuestra del trabajo de Reavy et al. (1998), quienes
reportaron que el aislamiento PMTV-T, que carece de un fragmento representativo de
196
secuencia en el ARN2, no puede ser transmitido por S. subterranea, pero sí mediante
inoculación mecánica. Esta situación aparentemente se debe a la deleción de una porción de
la región CPRT del ARN2 del virus (Sandgren et al., 2001).
La contextualización en el genoma viral de las dos secuencias obtenidas en cepas de PMTV
del departamento de Antioquia, indicó que se tratan de aislamientos representativos del
genoma ordinario de PMTV y no de las variantes encontradas en el análisis filogenético.
Sus identidades para las porciones del ARN2 y ARN3 secuenciadas fueron altas (>97%)
con respecto a los genomas reportados en trabajos anteriores (Cerovska et al., 2007;
Sandgren et al., 2001), por lo que se plantea la necesidad de secuenciar dichas regiones en
al menos un aislamiento de las variantes referidas. Los resultados encontrados en esta
investigación permiten plantear que el caso de PMTV en Colombia es aparentemente
singular, dada la presencia de dos variantes genéticas, de los altos niveles de afección que
genera S. subterranea en cultivos de papa de diferentes departamentos y de las diferencias
notables en la manisfestación de síntomas de la sarna polvosa entre variedades locales
(Carreño, 2009; Gilchrist et al., 2009), situación que amerita continuar con los estudios de
dichos patosistemas.
Además del análisis de incidencia de cuatro virus de importancia económica en cultivos de
papa de Colombia y la caracterización molecular de porciones del genoma de seis virus; en
esta investigación se evaluó la posibilidad de incorporar la metología de RT-PCR en tiempo
real (qRT-PCR) como una herramienta adicional para la detección de los virus que efectan
este cultivo en nuestro país. Diversos estudios registran el aumento en los niveles de
sensibilidad para la detección virus fitopatógenos que ofrece esta técnica (Mumford et al.,
2000; Olmos et al., 2005; López et al., 2006; Kogovsek et al., 2008; Davey, 2009). Así por
197
ejemplo, Olmos et al, (2005), al evaluar la presencia de PPV directamente en áfidos,
encontraron que la qRT-PCR podría detectar niveles tan bajos como 4 copias del genoma
viral y a partir de este límite inferior su rango de acción alcanzó 4 x 108 copias. Los autores,
al comparar la sensibilidad de esta técnica con respecto a RT-PCR convencional, anidado y
ELISA, encontraron que qRT-PCR podría aún generar curvas de amplificación en
diluciones de transcritos del genoma viral tan bajas como 1:65,536,000; mientras que RTPCR anidado y RT-PCR convencional/ELISA lo hacían en niveles de 1:32,768,000 y
1:256,000, respectivamente. Esta situación corresponde en términos prácticos a aumentos
de sensibilidad de 100 y 1000 veces, un valor similar al encontrado por Fabre et al. (2003),
evaluando la detección de Barley yellow dwarf virus (BYDV).
El uso de la técnica de qRT-PCR en esta investigación, permitió efectivamente detectar
tanto el virus PVY como PMTV en el 100% de las muestras analizadas para el primer virus
y en el 45% para PMTV. Estas proporciones de detección fueron superiores en ambos casos
con respecto a las técnicas de ELISA y RT-PCR convencional, siendo diagnósticado el
virus PVY en un 34% más de las muestras que lo encontrado mediante ELISA y en un 9%
más con respecto a RT-PCR convencional. Similarmente, el virus PMTV fue detectado por
el qRT-PCR en una proporción superior en 20 y 17% más con respecto a ELISA y RT-PCR
convencional, respectivamente. Estudios realizados para evaluar la utilidad de la técnica de
qRT-PCR en el diagnóstico de PVY, han encontrado no sólo aumentos en los niveles de
sensibilidad de la detección, sino la posibilidad de utilizar esta metodología para la
diferenciación de las razas del virus, lo cual posibilita por ejemplo, la determinación rápida
de la proporción de cepas asociadas al PTNRD en un cultivo o región particular (Kogovsek
et al., 2008). Esta situación requiere ser evaluada en los cultivos de nuestro país, pues los
198
análisis de secuencias de este trabajo, sugieren la presencia de cepas asociadas a esta grave
enfermedad en Colombia.
En forma similar, diversos trabajos se han realizado con el fin de evaluar el potencial de
qRT-PCR para su uso en programas de certificación de tubérculo semilla de papa y la
detección de PMTV y de su vector S. subterranea en lotes de cultivo (Mumford et al.,
2000; van de Graaf et al., 2003). Davey (2009) indica que mediante qRT-PCR es posible la
detección del PMTV en bioensayos basados en tomate luego de un periodo tan corto como
dos semanas, lo cual al compararse con la metodología convencional, representa un ahorro
de tiempo cercano a dos meses. Por otra parte, Mumford et al, (2000), diseñaron cebadores
y una sonda bajo el sistema de qRT-PCR Taqman para la detección de PMTV en tejido
foliar y tubérculos de papa, encontrando que esta metodología aumenta el nivel de
sensibilidad del diagnóstico de dicho virus en 10000 veces con respecto al procedimiento
de ELISA comúnmente utilizado. De gran interés resultará ampliar la base de análisis de la
metodología planteada en esta investigación, de manera que se evalue el efecto de
inhibidores, variabilidad genética de los virus y su distribución (especialmente de PMTV),
en las plantas afectadas, con miras a incorporar estas metodologías en el programa de
certificación de semilla que regula el ICA en nuestro país. Finalmente, este experimento de
comparación de metodologías, conduce a inferir que sí la técnica ELISA presenta niveles
de sensibilidad inferiores en 100 a 10000 veces con respecto a qRT-PCR, y particularmente
en nuestro estudio de entre 20 y 34% menos, es posible que los niveles de incidencia de los
virus detectados en cultivos de papa de Colombia sean aún mayores a los encontrados en
esta investigación, lo cual resulta de gran preocupación para la agroindustria de producción
de papa en Colombia.
199
CONCLUSIONES
En esta investigación se determinó la presencia e identificación molecular de los genotipos
de los virus PLRV, PMTV, Potyvirus (PVY), PVS, PVX y PYVV en cultivos de papa de
cuatro departamentos de Colombia. Los análisis de incidencia realizados mediante ELISA
para cuatro de ellos (PLRV, PVS, PVX, Potyvirus) arrojaron resultados que indican altos
niveles infección viral en los cultivos de papa, siendo las incidencias de los potyvirus y
PVS las más altas con 72 y 40%, respectivamente, mientras que el PLRV y PVX se
encontraron en el 20 y 8% de las muestras evaluadas. Estos niveles variaron entre las zonas
evaluadas en cada Departamento, pero notablemente fueron muy superiores a las
evaluaciones de síntomas visuales realizadas, lo que sugiere la necesidad de incorporar con
mayor intensidad métodos de diagnóstico serológico y/o molecular en las evaluaciones
fitosanitarias que realizan los técnicos, gremios y entes gubernamentales de sanidad
vegetal.
Los estudios moleculares utilizando cebadores específicos para los seis virus bajo análisis,
permitieron su detección en diversos cultivos de papa de Colombia, confirmándose la
presencia del virus PMTV en al menos una de las muestras procedentes de cada
departamento incluido en la investigación. El aumento en la distribución e importancia
económica de S. subterranea, agente vector del PMTV, conduce a plantear la necesidad de
estudiar con más detalle las características propias de estos patosistemas en los
agroecosistemas paperos de los Andes Colombianos y evaluar su efecto sobre la producción
y calidad del tubérculo semilla en forma independiente y conjunta.
200
Los análisis de secuencias de la región de la cápside de los seis virus analizados,
permitieron inferir las afinidades filogenéticas de los genotipos virales afectando los
cultivos de papa en Colombia. En términos generales, se encontraron bajos niveles de
variación y diferenciación con respecto a cepas de referencia de otros lugares del mundo en
los virus PLRV y PYVV; mientras que los virus PVY y PVS resultaron con niveles
apreciables de variación, detectándose la asociación entre un alto número de cepas
colombianas de PVY con las raza PVY-NTN, responsable en el mundo de la enfermedad
conocida como PTNRD. Los virus PVX y PMTV presentaron una estructura poblacional
basada en un alto número de cepas con bajos niveles de variabilidad, pero con algunas
variantes divergentes con respecto a los genotipos de referencia mundial.
Un aporte importante de esta investigación correspondió al aumento de la información
disponible sobre las secuencias de diferentes regiones de los genomas de virus de papa en
Colombia. Dicha información se presentaba en forma marginal o no estaba disponible para
la gran mayoría virus analizados y podrá ser utilizada como base para análisis de estructura
poblacional en el ámbito científico y en forma más práctica para el diseño de técnicas de
diagnóstico ajustadas a las realidades genotípicas de estos patógenos en los cultivos de papa
del país; metodologías necesarias para el apoyo de los programas de certificación de
tubérculo semilla y para la formulación de programas de manejo integrado de las
enfermedades virales.
Los análisis de las secuencias parciales de los virus de papa estudiados en esta
investigación indican de la presencia de diferencias importantes entre cepas de una misma
especie viral; e incluso la contextualización realizada con respecto a genomas previamente
secuenciados, demostró que las diferentes regiones evaluadas para cada cepa, no
201
necesariamente estaban asociadas a un genoma de referencia en particular, lo cual sugiere
que fenómenos como la recombinación y el rearreglo interno de genes son importantes en
la definición de la estructura genética de las poblaciones de algunos de los virus. Estos
hallazgos deben ser considerados en los estudios epidemiológicos de dichos virus que se
realicen en el país.
En este trabajo se presentó y validó una metodología de qRT-PCR para la detección de los
virus PVY y PMTV en cultivos de papa de Colombia con miras a su utilización en los
programas de certificación de semilla que se adelantan en el país. La ventajas que ofrece el
establecimiento de cultivos de papa libres de patógenos virales se han demostrado en
múltiples estudios y es por esto que los principales países productores de este tubérculo han
implementado sistemas robustos de certificación de semilla, en los que se emplean diversos
métodos de diagnóstico viral que incluyen observaciones visuales de síntomas, detección
serológica y qRT-PCR. Esta última metodología viene tomando gran fuerza, gracias a que
ofrece mayores niveles de sensibilidad, agilidad en la obtención de resultados e
información sobre las características genotípicas de las variantes virales encontradas en una
región o país.
202
AGRADECIMIENTOS
El autor desea expresar su gratitud a la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín,
Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, Universidad de Nariño, Fedepapa, Fritolay y
al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08, Bases
para la implementación de prácticas de exclusión de Spongospora subterranea y el
virus asociado Mop-top (PMTV) en cultivos de papa mediante el desarrollo de
herramientas de diagnóstico in situ y en laboratorio) que aportaron los recursos físicos,
humanos, técnicos y financieros para adelantar este trabajo. La investigación se realizó en
las instalaciones de los Laboratorios de Biología Celular y Molecular de la Universidad
Nacional de Colombia Sede Medellín y en el Laboratorio de Sanidad Vegetal del
Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid.
203
BIBLIOGRAFÍA
ADAMS M. J., ANTONIW J. F. & FAUQUET, C. M. 2005. Molecular criteria for genus
and species discrimination within the family Potyviridae. Archives of Virology 150: 459479.
ADAMS, M., KREUZE, J. 2008a. Taxonomic proposal to the ICTV Executive Committee.
New genus Sclerodarnavirus for Sclerotinia sclerotiorum debilitation-associated RNA
virus. ICTV Files and Discussion. Discussion Forum and File distribution for the ICTV.
Disponible
en:
http://talk.ictvonline.org/files/ictv_official_taxonomy_updates_since_the_8th_report/m/pla
nt-2008/1095.aspx. Visitado el 10 de Julio de 2010.
ADAMS, M., KREUZE, J. 2008b. Taxonomic proposal to the ICTV Executive Committee.
Creation of new family Betaflexiviridae. ICTV Files and Discussion. Discussion Forum and
File
distribution
for
the
ICTV.
Disponible
en:
http://talk.ictvonline.org/files/ictv_official_taxonomy_updates_since_the_8th_report/m/pla
nt-2008/1098.aspx. Visitado el 10 de Julio de 2010.
ADAMS, M. J., ANTONIW, J. F., KREUZE, J. 2009. Virgaviridae: a new family of rodshaped plant viruses. Archives of Virology. 154:1967-1972.
AGUILAR, J. M., FRANCO, M., MARCO, C. F., BERDIALES, B., RODRIGUEZCEREZO, E., TRUNIGER, V., ARANDA, M. A. 2003. Further variabiliy within the genus
Crinivirus, as revealed by determination of the complete RNA genome sequence of
Cucurbit yellow stunting disorder virus. Journal of General Virology 84: 2555-2564.
204
AGRANOVSKY, A. A., KOONIN, E. V., BOYKO, V. P., MAISS, E., FRO¨ TSCHUL, R.,
LUNINA, N., ATABEKOV, J. G. 1994. Beet yellows closterovirus: complete genome
structure and identification of a leader papain-like thiol protease. Virology 198: 311–324.
ALBA, V. 1950. Viropatógenos. Conferencia Latinoamericana de Especialistas en Papa
(Bogota, Colombia), pp. 52-58.
ALZHANOVA, D. V., NAPULI, A. J., CREAMER, R., DOLJA, V. V. 2001. Cell-to-cell
movement and assembly of a plant closterovirus: roles for the capsid proteins and Hsp
homolog. EMBO Journal 20: 6997–7007.
ARCINIEGAS, N. 2003. Técnicas de diagnóstico y evaluación de resistencia al virus del
Amarillamiento de las Nervaduras de la papa (PYVV) en accesiones de la Colección
Central Colombiana de Solanum phureja. Tesis de Maestría en Ciencias Agrarias.
Universidad Nacional de Colombia.
ASTIER, S., ALBOUY, J., MAURY, Y., ROBAGLIA, C., LECOQ, H. 2007. Principles of
Plant Virology. Genome, Pathogenicity, Virus Ecology. Science Publishers, Enfield, NH,
USA. 112 p.
BAULCOMBE, D. C., LLOYD, J., MANOUSOPOLUS, I. N., ROBERTS, I. M.,
HARRISON, B. D., 1993. Signal for Potyvirus depend aphid transmission of Potato aucuba
mosaic virus and the effect of its transfer to potato virus X. Journal of General Virology.
74: 1245-1253.
BAWDEN, F.C. 1943. Some properties of the potato viruses. Annals of Applied Biology
30: 82-83.
205
BENZA-PFLÜCKER, G. 2008. Una cura para el alza de precios. En. El Comercio, Perú.
http://www.elcomercio.com.pe/edicionimpresa/Html/2008-02-29/una-cura-alzaprecios.html. Visitado el 21 de marzo de 2009.
BLANCO-URGOITI, B., SANCHEZ, F., PEREZ DE SAN ROMAN, C., DOPAZO, J.,
PONZ, F. 1998. Potato Virus Y group C isolates are a homogeneous pathotype but two
different genetic strains. Journal of General Virology 79: 2037-2042.
BRUNT, A., CRABTREE, K., DALLWITZ, M., GIBBS, A., WATSON, L. 1996. Viruses
of plants; descriptions and list from the Virus Database. CAB International. Cambridge
University, Cambridge, Reino Unido. p. 150-151
BÜCHEN-OSMOND, C. 2010. The Universal Virus Database of the International
Committee on Taxonomy of Viruses. Disponible en: http://www.ictvdb.org. Consultado el
10 de Julio de 2010.
CANTOS DE RUIZ, S.T., ANDRADE, F.H., MENDIBURU, A. 1989. Rendimiento
potencial del cultivo de papa en Balcarce, causas que limitan la productividad real. Revista
Latinoamericana de la Papa 2: 29-45.
CAMPBELL, R.N. 1996. Fungal transmission of plant viruses. Annual Review of
Phytopathology 34: 87-108.
CARREÑO, A. J., 2009. Evaluación de la variabilidad genética de Spongospora
subterranea f.sp. subterranea mediante la comparación de regiones ITS del ADN
ribosomal de cepas procedentes de las regiones productoras de papa en Colombia. Tesis de
206
Maestría en Ciencias Agrarias con énfasis en Fitopatología. Universidad Nacional de
Colombia, Bogotá. Pág. 104.
CARRINGTON, J.C., FREED, D.D., SANDERS T.C. 1989. Autocatalytic processing of
the potyvirus helper component proteinase in Escherichia coli and in vitro. Journal of
Virology 63: 4459-4463.
CEROVSKA, N., PECENKOVA, T., FILIGAROVÁ, M., DEDIC, P. 2007. Sequences
analysis of the Czech Potato Mop-Top virus (PMTV) isolate Korneta-Nemilkov. Folia
Microbiologica 52(1): 61-64.
CHIKH, M., MAOKA, T., NATSUAKI, K. 2008. The Occurrence of Potato Viruses in
Syria and the Molecular Detection and Characterization of Syrian Potato virus S Isolates.
Potato Research 51: 151 – 161.
COX, B., JONES, R. 2010a. Genetic variability in the coat protein gene of Potato virus S
isolates and distinguishing its biologically distinct strains. Archives of Virology 155: 1163
– 1169.
COX, A., JONES, R. 2010b. Genetic variability in the coat protein gene of Potato virus X
and the current relationship between phylogenetic placement and resistance groupings.
Archives of Virology 155:1349-56
DEACON, J. 2010. The Microbial World: Fungal zoospores II. Chytrids and
plasmodiophorids. Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh.
Disponible en: http://www.biology.ed.ac.uk/research/groups/jdeacon/microbes/chytrid.htm.
Consultado el 9 de Julio de 2010.
207
DEFRA (Department for Environment Food and Rural Affairs). 2005. Agriculture in the
UK. Defra Statistics, York, UK.
DEFRA. 2006. Statutory Instruments. The Seed Potatoes (England) Regulations 2006
N°1161. UK. 38 p.
DELGADO-SÁNCHEZ, S., GROGAN, R.G. 1970. Potato Virus Y. CM1/AAB
Descriptions of Plant Viruses No. 37, CM1/AAB. Kew, Surrey, England, 4 pp.
DIJKSTRA, J., KHAN, J. A. 2002. Virus Transmission by Fungal Vectors. En: Plant
Viruses as Molecular Pathogens. Jawaid A. Khan y Jeanne Dijkstra Editores. 537 pág.
DIJKSTRA, J., KHAN, J.A. 2006. Handbook of Plant Virology. Haworth Press, Inc. New
York, US. Jawaid A. Khan, Jeanne Dijkstra, Editores. 452 pág.
DPVweb, 2010. Description of Plant Viruses. En: http://www.dpvweb.net. Visitado el 10
de Julio de 2010.
EPPO. 2009. European and Mediterranean Plant Protection Organization. Potato Virus S
Andean
Strain.
00/7892.
3
p.
En:
http://www.eppo.org/QUARANTINE/Pest_Risk_Analysis/PRAdocs_virus/draftds/007892%20DS%20PVS000.pdf. Visitado el 8 de abril de 2009.
EZETA, F.N.; SCHEIDEGGER, U.C. 1985. Semilla básica: Un nuevo programa de
producción y distribución para el Perú. CIP Circular 13: 1-5.
208
FABRE, F., KERVARREC, C., MIEUZET, L., RIAULT, G., VIALATTE, A., JACQUOT,
E., 2003. Improvement of Barley yellow dwarf virus-PAV detection in single aphids using
a fluorescent real-time RT-PCR. Journal of Virology Methods 110: 51–60.
FAO. 1987. World crop and livestock statistics 1948-1985. Rome, Italy. p. 159.
FAO.
2008.
Año
internacional
de
la
papa.
El
mundo
de
la
papa.
En:
http://www.potato2008.org/es/mundo/index.html. Visitado el 19 de Marzo de 2009.
FELSENSTEIN, J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach using the
bootstrap. Evolution 39: 783-791.
FOSTER, G.D. 1992. The structure and expression of the genome Carlaviruses. Research
in Virology 143: 103-102.
FOSTER, G.D., MILLS, P. 1992. The 3„ nucleotide sequence of an ordinary strain of
Potato virus S. Virus Genes 6:213-220.
FUENTES, S., MAYO, M.A., JOLLY, C.A., NAKANO, M., QUERCI, M. SALAZAR,
L.F. 1996. A novel luteovirus from sweet potato, sweet potato leaf speckling virus. Annals
of Applied Biology 128: 491–504.
GIBBS, A., MACKENZIE, A. 1997. A primer pair for amplifying part of the genome of all
potyvirids by RT-PCR. Journal of Virological Methods 63:9-16.
GIL, J.F., QUINTERO M., GONZÁLEZ E.P., COTES J.M., MARÍN MONTOYA M.
2009. Detección serológica y molecular de virus en cultivos de papa de tres regiones de
209
Antioquia. Memorias 29 Congreso Nacional de Fitopatología y Ciencias Afines. Medellín,
Colombia. Pág. 121.
GILCHRIST, E., JARAMILLO, S., REYNALDI, S. 2009. Efecto sobre la sarna polvosa de
cuatro aislamientos del hongo Trichoderma asperellum en tres tipos de suelo. Revista
Facultad Nacional de Agronomía, Medellín 62: 4783 – 4792.
GLAIS, L., TRIBODET, M., KERLAN, C. 2002a. Genomic variability in Potato potyvirus
Y (PVY): evidence that PVYNW and PVYNTN variants are single to multiple
recombinants between PVYO and PVYN isolates. Archives of Virology 147: 363-378.
GLAIS, L., KERLAN, C., ROBAGLIA, C. 2002b. Variability and Evolution of Potato
virus Y, the Type species of the Potyvirus genus. En: KHAN J. A., DIJKSTRA J. 2002.
Plant viruses as Molecular Pathogens. Jawaid Khan y Jeanne Dijkstra editors. Pág. 557.
GUERRERO, G.O. 1978. Evaluación de pérdidas ocasionadas en la variedad de papa ICAPuracé por los virus "Potato Virus X", "Potato Virus Y" y "Potato Leafroll Virus". Tesis
M.Sc. ICA-U.N. Bogotá, Colombia. 76 p.
GUERRERO-GUERRERO, O.; MARTÍNEZ-LÓPEZ, G. 1980. Evaluación de pérdidas
ocasionadas en la variedad de papa lea Puracé por los virus "Potato Virus X", "Potato Virus
Y" y "Potato Leafroll Virus". Fitopatología Colombiana 9:3-40.
GUERRERO, O. 1997. Reconocimiento del hongo Spongospora subterranea causante de
la roña de la papa en el Departamento de Nariño. Curso de manejo sanitario del cultivo de
la papa. Memorias. Pasto, Colombia.
210
GUERRERO, O. 2000. La roña o sarna polvosa en el Departamento de Nariño. Papas
Colombianas 2000 con el Mejor Entorno Ambiental. Segunda Edición. Fedepapa. 127-129
p.
GUYADER, S., DUCRA, Y, D.G. 2002. Sequence analysis of Potato leafroll virus isolates
reveals genetic stability, major evolutionary events and differential selection pressure
between overlapping reading frame products. Journal of General Virology 83: 1799–1807.
GUZMAN, M., CARO, M. Y GARCIA, Y. 2004a. Validación de la Técnica Serológica de
Inmunoimpresión para Detección de Diferentes Virus que Afectan el Cultivo de Papa. En:
CEVIPAPA (Centro Virtual de Investigación de la Cadena Agroalimentaria de la Papa).
Memorias, I Taller Nacional sobre Patógenos del Suelo, Virus e Insectos Plagas diferentes
a Tecia solanivora. Bogotá, Colombia, Noviembre 29-30. 2004.
GUZMAN, M., ARCINIEGAS, N. ÑUSTES, C. 2004b. Resistencia de Solanum phureja al
Virus del Amarillamiento de Hojas (PYVV). Análisis en 80 genotipos de la colección
Colombiana de S. phureja. En: CEVIPAPA (Centro Virtual de Investigación de la Cadena
Agroalimentaria de la Papa). Memorias, I Taller Nacional sobre Patógenos del Suelo, Virus
e Insectos Plagas diferentes a Tecia solanivora. Bogotá, Colombia, Noviembre 29-30.
2004.
GUZMÁN, M., RUIZ, E., ARCINIEGAS, N., COUTTS, A. 2006. Occurrence and
Variability of Potato yellow vein virus in three Departments of Colombia. Journal of
Phytopathology 154: 748 – 750.
211
GUZMÁN, M., FRANCO, L., RODRIGUEZ, P. A. 2009. Molecular detection of Potato
yellow vein virus in leaves and shoot-tubers of Solanum phureja from Colombia.
Phytopathology 99 supplement: 189.
HARRISON B.D., REAVY B. 2002. En: DPVweb, 2010. Description of Plant Viruses.
Disponible en: http://www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dpvno=389 Visitado el 28 de
Julio de 2010.
HARJU, V. A., SKELTON, A., CLOVER, G. R. G., RATTI, C., BOONHAM, N.,
HENRY, C. M., MUMFORD, R. A. 2005. The use of real-time RT-PCR (TaqMan®) and
post-ELISA virus release for the detection of Beet necrotic yellow vein virus types
containing RNA 5 and its comparison with conventional RT-PCR. Journal of Virology
Methods 123:73-80.
HARTONO, S., NATSUAKI, T., GENDA, Y., OKUDA, S. 2003. Nucleotide sequence and
genome organization of Cucumber yellows virus, a member of the genus Crinivirus.
Journal of General Virology 84: 1007-1012.
HERRERA, J.E., SCOTT, G.J. 1993. Factores limitantes en la producción y uso de la papa:
Resultados de la encuesta a los programas nacionales de América Latina. Revista
Latinoamericana de la Papa. 5/6: 122-134.
HORTON, D. 1992. La papa: Producción, comercialización y programas. Centro
Internacional de la Papa (CIP), Lima, Perú y Editorial Hemisferio Sur, Montevideo,
Uruguay. 260 p.
212
HOWARD, H.W. 1978. The production of new varieties. En: Harris, P.M. (ed.) The potato
crop. The scientific bases for improvement. Chapman & Hall, London. p. 625-627.
HSU, Y.C., YEH, T.J., CHANG, Y.C. 2005. A new combination of RT-PCR and reverse
dot blot hybridization for rapid detection and identification of potyviruses. Journal of
Virological Methods 128: 54-60.
HUANG, Y. L., HAN, Y. T., CHANG, Y. T., HSU, Y. H., MENG, M. 2004. Critical
residues for GTP methylation and formation of the covalent m7GMP-enzyme intermediate
in the capping enzyme domain of bamboo mosaic virus. Journal of Virology 78:1271–
1280.
HUISMAN, M.J., LINTHORST, H.J., BOL, J.F., CORNELISSEN, J.C. 1988. The
complete nucleotide sequence of potato virus X and its homologies at amino acid level with
various plus-stranded RNA viruses. Journal of General Virology 69:1789-1798.
HULL, R. 2002. Matthews Plant Virology. Cuarta edición. San Diego, California, USA.
Elsevier, 2002. 1001 p. ISBN 0-12-361160-1.
ICTV.
2000.
Potato
virus
X,
Virion
properties.
En:
http://phene.cpmc.columbia.edu/Ictv/index.htm. Visitado 26 de marzo de 2009.
ICTV, 2010. International Committee on Taxonomy of Viruses. Virus taxonomy 2009
Release. Disponible en: http://www.ictvonline.org. Consultado el 10 de Julio de 2010.
JARAMILLO, S., BOTERO, J.M. 2007. Respuesta de diferentes poblaciones de
Spongospora subterranea f. sp. subterranea a la rotación entre dos variedades de papa
213
(Solanum tuberosum ssp. andigena). Revista Facultad Nacional de Agronomía Medellín
60:3859-3876.
JEFFRIES, C.J. 1998. Potato FAO/IPGRI Technical guidelines for the safe movement of
germplasm No 19: 62-63.
JONES, R.A.C. HARRISON, B.D. 1972. Ecological studies on Potato mop-top virus in
Scotland. Annals of Applied Biology 71: 47-57.
JONES, R.A.C. 1990. Strain group specific and virus specific hypersensitive reaction to
infection with potyviruses in potato cultivars. Annal of Applied Biology 117:93-105.
JOHNSON, S.B. 2009. Potato Mop-Top Virus (PMTV). University of Maine Cooperative
Extension
Bulletin
N°
2437.
En:
http://www.umext.maine.edu/onlinepubs/htmpubs/2437.htm
KARASEV, A. V. 2000. Genetic diversity and evolution of closteroviruses. Annual
Review of Phytopathology 38: 293–324.
KLAASSEN, V. A., BOESHORE, M. L., KOONIN, E. V., TIAN, T., FALK, B. W. 1995.
Genome structure and phylogenetic analysis of lettuce infectious yellows virus, a whiteflytransmitted, bipartite closterovirus. Virology 208: 99–110.
KOGOVSEK, P., GOW L., POMPE-NOVAK, M., GRUDEN, K., FOSTER, G.D.,
BOONHAM, N., RAVNIKAR, M. 2008. Single-step RT real-time PCR for sensitive
detection and discrimination of potato virus Y isolates. Journal of Virological Methods 149:
1-11.
214
KREUZE, J. F., SAVENKOV, E. I., VALKONEN, J. P. T. 2002. Complete genome
sequence and analysis of the subgenomic RNAs of Sweet potato chlorotic stunt virus reveal
several new features for the genus Crinivirus. Journal of Virology 76: 9260–9270.
LAMBERT, D. H., LEVY, L., MAVRODIEVA, V. A., JOHNSON, S. B., BABCOCK, M.
J., VAYDA, M. E. 2003. First Report of Potato mop-top virus on Potato from the United
States. Plant Disease 87:872.
LANGENBERG, W.G., ZHANG, L. 1997. Immunocytology shows the presence of
Tobacco etch virus P3 protein in nuclear inclusions. Journal of Structural Biology 118:
243-247.
LIVIERATOS, I. C., MULLER, G., SALAZAR, L. F., ELIASCO, E., COUTTS, R. H. A.
2002. Identification and sequence analysis of Potato yellow mosaic virus capsid protein
minor gene. Virus Genes 25:317–322.
LIVIERATOS, I.C., ELIASCO, E., MÜLLER, G., OLSTHOORN, R.C.L., SALAZAR, L.
F., PLEIJ, C.W.A., COUTTS, R.H.A. 2004. Analysis of the RNA of Potato Yellow Vein
Virus: evidence for a tripartite genome and conserved 3‟-terminal structures among
members of the genus Crinivirus. Journal of General Virology 85: 2065-2075.
MACKENZIE, D.J., TREMAINE, J.H., STACE-SMITH, R. 1989. Organization and
interviral homologies of the 3‟-terminal portion of Potato Virus S RNA. Journal of General
Virology 70: 1053-1063.
215
MACKENZIE, D.J. 1996. Detection of potato mop-top virus in leaf or tuber tissue by
reverse transcription-polymerase chain reaction. Document CPHBT96K03, Centre for Plant
Health, Agriculture and Agri-Food Canada, Sidney, B.C., Canada.
MADR (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural), Observatorio Agrocadenas. Cuarto
informe
de
coyuntura
2006.
Papa.
En:
http://www.agrocadenas.gov.co/documentos/coyuntura/Inf_Coyuntura_papa_4.pdf.
Visitado el 19 de Marzo de 2009.
MAHAJAN, S.S., DOLJA, V.V., CARRINGTON, J.C. 1996. Roles of the sequence
encoding tobacco etch virus capsid protein in genome amplification: requirements for the
translation process and a cis-active element. Journal of Virology 70: 4370-4379.
MAKKOUK, K.M., HSU, H.T. Y KUMARI, S.G. 1993. Detection of three plant virases by
dot-blot and tissue-blot immunoassay using chemiluminescent and chromogenic substrates.
Journal Phytopathology 139: 97-102.
MARIE-JEANNE-TORDO,
V.,
CHACHULSKA,
A.M.,
FAKHFAKH,
H.,
LE
ROMANCER, M., ROBAGLIA, C., ASTIER-MANIFACIER, S. 1995. Sequence
polymorphism in the 5‟-NTR and in the P1 coding región of potato virus Y genomic RNA.
Journal of General Virology 76: 939-949.
MARTELLI, G. P., AGRANOVSKY, A. A., BAR-JOSEPH, M. & 13 other authors. 2002.
The family Closteroviridae revised. Archives of Virology 147:2039–2044.
MÁS, P., PALLAS, V. 1995. Non-isotopic tissue-printing hybridization: a new technique
to study long-distance plant virus movement. Journal of Virological Methods 52: 317-326.
216
MATTHEWS, R. E. F. 1993. Diagnosis of plant virus diseases. CRC Press. 374 p.
MATOUSEK, J., SHUBERT, J., DEDIC, P., PTACEK, J. 2000. A broad variability of
Potato virus S (PVS) revealed by analysis of virus sequences amplified by reverse
transcriptase - polymerase chain reaction. Canadian Journal of Plant Pathology 22: 29 – 37.
MATOUSEK, J., SCHUBERT, J., PTACEK, J., KOZLOVA, P., DEDIC, P. 2004.
Complete nucleotide sequence and molecular probing of potato virus S genome. Acta
Virologica 49:195-205.
MAYO, M. A, TORRANCE, L, COWAN, G., JOLLY, C. A., MACINTOSH, S. M.,
ORREGO, R., BARRERA, C., SALAZAR, L. F. 1996. Conservation of coat protein
sequence among isolates of Potato mop-top virus from Scotland and Peru. Archives of
Virology 141:1115-1121.
MAYO, M.A. AND MILLER, W.A. 1999. The structure and expression of luteovirus
genomes. En: The Luteoviridae (Smith, H.G. and Barker, H., eds). Wallingford, UK: CAB
International. pp. 23–42.
MCGEACHY, K. D., BARKER, H. 2000. Potato mop-top virus RNA can move long
distance in the absence of coat protein: Evidence from resistant, transgenic plants.
Molecular Plant-Microbe Interactions 13:125-128.
MELANDER, M., LEE, M., SANDGREN, M. 2001. Reduction in potato mop-top virus
accumulation and incidence in tubers of potato transformed with a modified triple gene
block gene of PMTV. Molecular Breeding 8:197-206.
217
MERZ, U., FALLON, R. E. 2009. Review: Powdery Scab of Potato-Increased Knowledge
of Pathogen Biology and Disease Epidemiology for Effective Disease Management. Potato
Research 52:17-37.
MEUNIER, A., SCHMIT, J. F. O., STAS, A., KUTLUK, N., BRAGARD, C. 2003.
Multiplex Reverse Transcription-PCR for Simultaneous Detection of Beet Necrotic Yellow
Vein Virus, Beet Soilborne Virus and Beet Virus Q and Their Vector Polymyxa betae
KESKIN on Sugar Beet. Applied and Environmental Microbiology 69:2356-2360.
MORALES, F. J., MARTÍNEZ, A. K., OLAYA, C., ARROYO, J. 2005. Detección en
tomate (Lycopersicon esculentum) del virus del amarillamiento de las nervaduras de la papa
(patata amarilla virus de la vena) en Cundinamarca, Colombia. Fitopatología Colombiana
28:40-44.
MOROZOV, S., MIROSHNICHENKO, N.A., SOLOVYEV, A.G., FEDORKIN, O.N.,
ZELENINA, D.A., LUKASHEVA, L.I., KARASEV, A.V., DOLJA, V.V., ATABEKOV,
J.G., 1991. Expression strategy of the potato virus X triple gene block. Journal of General
Virology 72: 2039–2042
MUMFORD, R.A., WALSH, K., BARKER, I., BOONHAM, N. 2000. Detection of Potato
mop top virus and Tobacco rattle virus using a Multiplex Real-Timer Fluorescent ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology 90: 448-453.
NAPULI, A. J., ALZHANOVA, D. V., DONEANU, C. E., BAROFSY, D. F., KOONIN,
E. V., DOLJA, V. V. 2003. The 64-kilodalton capsid protein homolog of Beet yellows
virus is required for assembly of virion tails. Journal of Virology 77: 2377–2384.
218
NIE, X., SINGH, R.P. 2001. A novel usage of random primers for multiplex RT-PCR
detection of virus and viroid in aphids, leaves, and tubers. Journal of Virological Methods
91: 37–49.
NIELSEN, S. L., NICOLAISEN, M. 2003. Identification of two nucleotide sequence subgroups within Potato mop-top virus. Archives of Virology 148: 381 – 388.
NUÑEZ,
K.
2009.
El
cultivo
de
la
papa
en
Perú.
En:
http://www.monografias.com/trabajos35/cultivo-papa-peru/cultivo-papa-peru.shtml.
OFFEI, S.K., ARCINIEGAS, N., MULLER, G., GUZMAN, M., SALAZAR, L.F.,
COUTTS, R.H.A. 2004. Molecular variation of Potato yellow vein virus isolates. Archives
of Virology 149: 821–827.
OGAWA, T., TOMITAKA, Y., NAKAGAWA, A. Y OHSHIMAB, K. 2008. Genetic
structure of a population of Potato virus Y inducing potato tuber necrotic ringspot disease
in Japan; comparison with North American and European populations. Virus Research 131:
199–212.
OHSHIMA, K., SAKO, K., NAKAGAWA, A., MATSUO, K., OGAWA, T., SHIKATA,
E., SAKO N. 2000. Potato tuber necrotic ringspot disease occurring in Japan: its
association with potato virus Y necrotic strain. Plant Disease 84:1109-1115.
PARK, M.R., KWON, S.J., CHOI, H.S., HEMENWAY, C.L., KIM, K.H. 2008. Mutations
that alter a repeat ACCA element located at 5‟ end of Potato virus X genome affect RNA
accumulation. Virology 378:133-141.
219
REAVY, B., ARIF, M., COWAN, G. H., TORRANCE, L. 1998. Association of sequences
in the coat protein/readthrough domain of potato mop-top virus with transmission of
Spongospora subterranean. Journal of General Virology 79:2343-2347.
RIECHMANN, J.L., LAIN, S., GARCIA, J.A. 1992. Review Article: Highlights and
prospects of potyvirus molecular biology. Journal of General Virology 73: 1-16.
RIECHMANN, J.L., CERVERA, M.T., GARCÍA, J.A., 1995. Processing of the Plum pox
virus polyprotein at the P3-6K1 junction is not required for virus viability. Journal of
General Virology 76: 951-956.
ROJAS, M.R, GILBERTSON, R.L, RUSSELL, D.R, MAXWELL, D.P. 1993. Use of
degenerate primers in the polymerase chain reaction to detect whitefly-transmitted
geminiviruses. Plant Disease 77: 340-347.
RYDÉN K., ERIKSSON B., INSUNZA V. 1986. Rostringar hos potatis orsakade av
potatismopptoppvirus (PMTV). Växtskyddsnotiser 50: 97-102.
RYDÉN K., SANDGREN M., LÖVGREN L. 1989. Potatismopptoppvirus (PMTV) –
jordprovsundersökningar och symtomutveckling hos några potatissorter. Växtskyddsnotiser
53: 123-128.
SALAZAR, L.F. 1982. Manual. Enfermedades virosas de la papa. Centro Internacional de
la Papa (CIP). Lima, Perú. 111 p.
220
SALAZAR, L.F. 1986. Detección de virus en la producción de semilla de papa.
Montevideo, Hemisferio Sur y Centro Internacional de la Papa. Boletín de información
técnica 18. 14 p.
SALAZAR, L.F. 1995. Los Virus de la Papa y su control. Centro Internacional de la Papa
CIP (Perú). Publicado por el Centro Internacional de la Papa. 226 p.
SALAZAR, L.F. 1997a. Identificación y Control de Enfermedades Virales y Fitoplasmas
de la Papa. Simposium Internacional de la Papa. Metepec, Estado de México. 3 p.
SALAZAR, L.F. 1997b. La Enfermedad del Amarillamiento de las Venas de la Papa:
Evidencia de la Presencia de un Virus Inusual. Agroenfoque (Perú) 12:24-26.
SALAZAR, L.F., MULLER, G., QUERCI, M., ZAPATA, J.L., OWENS, R.A. 2000.
Potato yellow vein virus: its host range, distribution in South America, and identification as
a crinivirus transmitted by Trialeurodes vaporariorum. Annals of Applied Biology 137: 7–
19.
SALAZAR, L.F. 2006. Emerging and Re-emerging Potato Diseases in the Andes. Potato
Research 49: 43-47.
SANCHEZ DE LUQUE, C., CORZO, P., PEREZ, O. 1991. Incidencia de virus en papa y
su efecto sobre rendimientos en tres zonas agroecológicas de Colombia. Revista
Latinoamericana de la Papa 4:36-51.
SANDGREN, M., SAVENKOV, E., VALKONEN, J. P. 2001. The readthrough region of
Potato mop-top virus (PMTV) coat protein enconding RNA, the second largest RNA of
221
PMTV genome, undergoes structural changes in naturally infected and experimentally
inoculated plants. Archives of Virology 146: 467-477.
SANTOS-ROJAS, J. 1985. Efecto del Virus del Enrollamiento de la Hoja de la Papa
(PLRV) sobre el rendimiento total de cuatro variedades de papa en el Sur de Chile,
Simiente 55:38.
SATYANARAYANA, T., GOWDA, S., MAWASSI, M., ALBIACH-MARTI, M. R.,
AYLION, M. A., ROBERTSON, C., GARNSEY, S. M., DAWSON, W. O. 2000.
Closterovirus encoded HSP70 homolog and p61 in addition to both coat proteins function
in efficient virion assembly. Virology 278: 253–265.
SAVENKOV, E.I.; SANDGREN, M. y VALKONEN, J.P.T. 1999. Complete sequence of
RNA 1 and the presence of tRNA-like structures in all RNAs of Potato moptop virus,
genus Pomovirus. Journal of General Virology 80: 2779-2784.
SAVENKOV, E.I.; GERMUNDSSON, A.; ZAMYATHIN, A.A.; SANDGREN, M.;
VALKONEN, J.P.T. 2003. Potato mop-top virus: The coat protein-encoding RNA and the
gene for cysteine-rich protein are dispensable for systemic virus movement in Nicotiana
benthamiana. Journal of General Virology 84:1001-1005
SCHUBERT,
J.,
FOMITCHEVA,
V.,
SZTANGRET-WISNIEWSKA,
J.
2007.
Diferentiation of Potato virus Y strains using improved sets of diagnostic PCR primers.
Journal of Virological Methods 140: 66-74.
SECOR, G. A., RIVERA-VARAS, V. 2004. Emerging diseases of cultivated potato and
their impact on Latin America. Suplemento Revista Latinoamericana de la Papa. 8 p.
222
SHUKLA, D.D., WARD, C.W., BURNT, A.A. 1994. The Potyviridae. Cambridge
University Press, Cambridge.
SJÖBERG, P. 2006. Detection of Tobacco ratle tobravirus and Potato mop-top pomovirus
in Swedish soil samples by the use of different bait plants and analysis by ELISA and
Biotest. Bachelor Project in the Danish-Swedish Horticulture Programme ISSN 1652 1579. Swedish University of Agricultural Sciences. Pág. 36.
SKRYABIN, K.G., MOROZOV, S., KRAEV, A.S., RAZANOV, M.N., CHERNOV, B.K.,
LUKASHEVA, L.I., ATABEKOV, J.G. 1988. Conserved and variable elements in RNA
genomes of potexviruses. FEBS Letters 240:33-40.
SINGH, R.P., KURZ, J., BOITEAU, G., BERNARD, G. 1995. Detection of Potato leafroll
virus in single aphids by the reverse transcription polymerase chain reaction and its
potential epidemiological application. Journal of Virological Methods 55: 133-143.
SINGH, R.P., VALKONEN, J.P.T., GRAY, S.M., BOONHAM, N., JONES, R.A.C.,
KERLAN, C., SCHUBERT J. 2008. Brief review. Discussion paper: The naming of potato
virus Y strains infecting potato. Archives of Virology 153:1-13.
SHCHERBAKOVA, L.A. 2007. Advanced methods of plant pathogen diagnostics. En:
DYAKOV, Y. T., DZHAVAKHIYA, V.G., KORPELA, T. 2007. Comprehensive and
molecular phytopathology. Elsevier B. V. 483 pp.
SMITH, K.M. 1931. On the composite nature of certain potato virus diseases of the mosaic
group as revealed by the use of plant indicators. Proceedings of the Royal Society of
London 109:251-267.
223
SOKMEN, M.A.; BARKER, H. y TORRANCE, L. 1998. Factors affecting the detection of
Potato mop-top virus in potato tubers and improvement of test procedures for more reliable
assays. Annals of Applied Biology 133: 55-63.
SOLOMON-BLACKBURN, R.M., BARKER, H. 2001. Breeding virus resistant potatoes
(Solanum tuberosum): a review of traditional and molecular approaches. Heredity 86: 1735.
SWOFFORD, D.L. 1998. PAUP: Phylogenetic analysis using parsimony (* and other
methods). Version: 4. Sunderland, USA: Sinauer Associates.
TALIANSKY, M., MAYO, M.A. BARKER, H. 2003. Potato leafroll virus: a classic
pathogen shows new tricks. Molecular Plant Pathology 4: 81-89.
TENORIO, J., CHUQUILLANQUI, C., GARCIA, A., GUILLÉN, M., CHAVEZ, R.,
SALAZAR, L.F. 2000. Symptomatology and efect on potato yield of a new virus
transmitted through the psyllid Russelliana solanicola. Fitopatología 38:32-36.
URCUQUI-INCHIMA, S., HAENNI, A. L. Y BERNARDI, F. 2001. Potyvirus proteins: a
wealth of functions. Virus Research 74:157-175.
VAN REGENMORTEL, M. H.V., FAUQUET, C.M., BISHOP, D.H.L., CARSTENS,
E.B., ESTES, M.K., LEMON, S.M., MANILOFF, J., MAYO, M.A., MCGEOCH, D.J.,
PRINGLE, C.R., WICKNER, R.B. 2000. Virus taxonomy. Seventh report of the
International Committee on taxonomy of viruses. San Diego, USA: Academic Press.
224
VÁSQUEZ, V., MONTERO-ASTÚA, M., RIVERA, C. 2006. Incidencia y Distribución
Altitudinal de 13 virus en cultivos de Solanum tuberosum (Solanaceae) en Costa Rica.
Revista de Biología Tropical. Vol 54 (4): 1135-1141.
VÉLEZ, P.B. 2007. Detección e identificación del Potato Mop – top virus (PMTV) en áreas
de producción de papa donde se encuentra Spongospora subterránea en dos departamentos
de Colombia. Tesis de Maestría, 115 p. Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá.
VERCHOT, J., KOONIN, E.V., CARRINGTON, J.C. 1991. The 35-kDa protein from the
N-terminus of the potyviral polyprotein functions as a third virus-encoded proteinase.
Virology 185: 527-535.
VERCHOT, J., CARRINGTON, J.C. 1995. Debilitation of plant potyvirus infectivity by P1
proteinase-inactivating mutations and restoration by second site modifications. Journal of
Virology 69: 1582-1590.
VERCHOT, J., ANGELL, S.M., BAULCOMBE, D.C., 1998. In vivo translation of the
triple gene block of potato virus X requires two subgenomic mRNAs. Journal of Virology
72: 8316–8320.
VERCHOT-LUBICZ, J., YE, C.M., BAMUNUSINGHE, D. 2007. Molecular biology of
potexvirus: recent advances. Journal of General Virology 88:1643-1655.
VIRALZONE,
2010.
ViralZone
www.expasy.org/viralzone,
Swiss
Institute
of
Bioinformatics. Visitado el 10 de Julio de 2010.
225
WARD, C.W., WEILLER, G.F., SHUKLA, D.D., GIBBS, A.J. 1995. Molecular
systematics of the Potyviridae, the largest plant virus family. En. GIBBS A.J., CALISHER
C.H., GARCIA-ARENAL F. (eds.), Molecular Basis of Virus Evolution, Cambridge
University Press, Cambridge. 477-500 pp.
WEBSTER, C.G., WYLIE, S.J., JONES, M.G. 2004. Diagnosis of plant viral pathogens.
Current Science 86: 1604-1607.
XU, H. DEHAAN, T.L. DE BOER, S.H. 2004. Detection and confirmation of Pota moptop virus in Potatoes produced in the United States and Canada. Plant Disease. 88: 363-367.
YU, X-Q. JIA, J-L. ZHANG, C-L. LI, X-D. WANG, Y-J. 2010. Phylogenetic analyses of
an isolate obtained from potato in 1985 revealed potato virus X was introduced to China via
multiple events. Virus Genes 40: 447 – 451.
ZAPATA, J.L. 2004. Algunos Aspectos Sobre los Virus de la Papa en Colombia. En:
CEVIPAPA (Centro Virtual de Investigación de la Cadena Agroalimentaria de la Papa).
Memorias, I Taller Nacional sobre Patógenos del Suelo, Virus e Insectos Plagas diferentes
a Tecia solanivora. Bogotá, Colombia, Noviembre 29-30. 2004.
ZAVRIEV, S.K., KANYUKA, K.V., LEVAY, K.E. 1991. The genome organization of
potato virus M RNA. Journal of General Virology 72: 9-14.
226
ANEXOS
Anexo 1. Síntomas diferentes a AV, EF, EN y MR observados en los cultivos de papa de
cuatro departamentos de Colombia.
Anexo 2. Planta de papa infectada con S. subterranea. Se observan agallas generadas por la
infección.
227
Anexo 3. Concentración de quistosoros de S. subterranea encontrados en los suelos
empleados para la detección del virus PMTV mediante plantas señuelo.
Localidad
qistosoros/ml
7
17200
10
16000
25
8200
35
89000
36
111800
SRO L2
SRO L5
13600
21800
9800
29600
Vallejuelito
23
18800
12800
Villapinzón
24400
44066
10600
11200
SRLO L3
SRO L4
Madrid
Zipaquirá6
Tunja1
TZ1Z1
Ventaquemada
20400
35400
228