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Vacunas recombinantes
Introducción
histórica
Historia de las vacunas

Entendemos por vacuna, sustancia
generalmente fabricada a partir de
microorganismos patógenos para el ser vivo,
que al ser administrada produce defensas frente
a la enfermedad que queremos prevenir.

A lo largo de la historia se ha producido un gran
avance en lo que a vacunas se refiere que nos
ha permitido pasar de la primera vacuna
rudimentaria contra la viruela a la vacunología
reversa que está en vías de desarrollo y
expansión en la actualidad.
Variolización


Los primeros escritos relacionados con la
vacunación (“el tratamiento correcto de la
viruela”) se remontan al siglo XI en China,
donde una monja budista realizó inoculación
antivarólica a partir de enfermos que padecían
viruela.
Otros textos (“El espejo dorado de la medicina”)
también sitúan en China hasta 4 formas
diferentes de inoculación antivariólica.
Primera vacuna


Edward Jenner (médico británico) inventó en
1796 la primera vacuna contra la viruela.
El experimento consistió en inyectar a un niño
de 8 años la vacuna procedente de una pústula
del brazo de una ordeñadora (ésta había sido
contagiada por una vaca) a través de dos cortes
superficiales en el brazo, consiguiendo
inmunizar al niño ante la viruela humana.
Vacunas de Pasteur


Louis Pasteur realizó en 1881 una demostración
pública de vacunación inoculando bacilos
atenuados de ántrax para demostrar que se
podían obtener vacunas a partir de cultivos de
laboratorio; esto le permitió desarrollar la
vacuna contra el cólera de las aves y el
carbunco.
En 1885 obtuvo la vacuna contra la rabia, que
estaba compuesta de agentes debilitados
productores de la enfermedad sacados de
médula espinal de animales rabiosos.
Vacunas de principios del XX




El siguiente paso en la evolución fue la
inactivación química de toxinas.
En 1909 se desarrolló la vacuna contra la
tuberculosis (cuestionada durante toda su
historia).
En 1935 se desarrolló la vacuna contra la
fiebre amarilla.
En 1936 se desarrolló la vacuna contra el virus
influenza A y en 1938 contra la rickettsia.
Edad de oro de la vacunación


A partir del impulso del cultivo celular y la
capacidad de desarrollar virus humanos fuera
de un organismo vivo de manera bastante
sencilla y segura, se produjo el boom en
vacunología.
Se obtuvieron en esta época vacunas contra
poliomielitis (1954), sarampión, paratiroiditis,
rubeola y varicela.
Vacunas en los 70 y 80

En estas décadas se introdujeron las vacunas
formuladas con polisacáridos capsulares o
proteínas purificadas, es decir las que se
conocen como vacunas de subunidades.

En esta época destaca la parición de la vacuna
meningocócica, la vacuna neumocócica y la
primera generación frente a haemophilus
influenzae tipo B.
Vacunas finales del XX

Avery y Goebel demostraron que la
inmunogenicidad del polisacárido podría
incrementarse si se uniese a una proteína
transportadora, de esta idea surgen las
vacunas conjugadas.

La primera vacuna conjugada comercializada
fue contra el haemophilus influenzae tipo B.
Presente y futuro de las vacunas

En 1986 gracias al uso de la ingeniería genética
se formula la primera vacuna DNA
recombinante frente a Hepatitis B.

Actualmente existen diversas vacunas de este
tipo en el mercado y en vías de desarrollo.

En el futuro las expectativas están focalizadas
en la vacunología reversa, es decir el hecho de
que un ordenador sea capaz de elaborar la
vacuna sin pipetas, ni mascarillas ni tubos de
ensayo
Vacunas
recombinantes
Características
Definición

Vacunas obtenidas utilizando la
tecnología del ADN recombinante en
alguna etapa de la producción.
Bondades de una vacuna ideal







Precio competitivo.
Inocuidad.
Estabilidad física y genética.
Posible inmunización simultánea contra múltiples
componentes protectores de diversos patógenos.
Protección de larga duración con 1 sola dosis VO.
Inducción de inmunidad mucosal en máximo 2
semanas.
Estimulación de respuesta inmune humoral y
celular a nivel sistémico.
La vacuna recombinante es un área multidisciplinaria
Inmunología
Biología de patógenos
Química
Bioinformática
Genómica de patógenos
Nuevas vacunas
Proteómica de patógenos

Son un plásmido bacteriano diseñado
para expresar un gen (o genes) de
interés que codifiquen, por ejemplo, para
una proteína inmunogénica de un
patógeno determinado, contra la cual se
desea inducir una respuesta inmune
protectora en el individuo vacunado.

Por tanto su acción imita lo que ocurre
en una infección por patógeno
completo).

Reúnen en un mismo producto biológico:

Eficacia de vacunas vivas convencionales.
 Seguridad
de vacunas inactivadas
convencionales.

Componentes básicos del vector que garantizan
óptima expresión celular:
 Origen de replicación procariótico para amplificación
y propagación del plásmido en bacteria.

Gen marcador de selección de las células
bacterianas portadoras del plásmido.

Promotor eucariótico fuerte que garantiza elevados
niveles de transcripción del gen de interés en la
célula eucariota.

Sitio de múltiple clonaje justo después del promotor
para insertar la secuencia de interés.

Secuencia de terminación de la transcripción y
secuencia estabilizadora del ARNm transcrito.

En el proceso de obtención de las
vacunas recombinantes hemos de prestar
especial atención a 3 características:
 Calidad.
 Seguridad.
 Eficacia.
Calidad

Certificar que no se han experimentado ni
cambios ni mutaciones.

Descripción completa de las células, las
bacterias o las variedades de virus y los
plásmidos* con los que se comienza la
“construcción” de la vacuna
recombinante.
*En caso de presentar indicios de inestabilidad serán
rechazados.


Estrategia de construcción de los vectores
según lo descrito en la directiva
2001/18/EC .
Caracterizar con métodos bioquímicos,
inmunológicos y moleculares el antígeno
expresado por la vacuna , para garantizar
la calidad del producto obtenido.
Seguridad


Ensayos que acrediten la seguridad de la
vacuna en la misma especie animal que
vaya a ser la destinataria del producto
(Directiva 2001/82/EC -Annexo I, título II,
Parte 7 -).
Cerciorar que los animales vacunados no
pueden trasmitir la enfermedad a los
humanos o otros animales (si puede
suceder, se especifica claramente en las
condiciones de uso).

Acreditar que no son patogénicas o lo son
en un nivel insuficiente para poner en
peligro la seguridad del animal vacunado.

Demostrar que la inserción de genes
foráneos no provoca un aumento de la
virulencia ni una modificación en el
tropismo tisular.

Cumplir normativa comunitaria sobre ecotoxicidad
(Directiva 2001/82/CE y 2001/18/EC -Annex II- ):






Estudio de virulencia en situaciones de riesgo en
diferentes especies (tanto diana como no diana).
Estudio de posible transmisión horizontal y
recombinación potencial del vector vacunal o de parte
de él.
Estudio de especificidad de especie diana.
Estudio de la posible instalación en el ambiente.
Método validado para poder distinguir entre vacuna y
microorganismo “salvaje”, especialmente en
situaciones de planes de control y erradicación de la
enfermedad.
Utilización de datos obtenidos de ensayos realizados
con el mismo vector pero acompañado de otras
secuencias.
Eficacia



Estudiar el efecto de la inmunidad
preexistente al vector y/o al antígeno.
Documentar la inmunorespuesta postvacunación y considerar impacto en planes
de vacunación en vigor.
En vacunas que contienen más de un
antígeno, es necesario evaluar la respuesta
a cada antígeno.
TIPOS

Podemos subdividirlas en 3 subtipos:
 Vacunas
que utilizan virus o bacterias
como vectores.
 Vacunas
de ADN desnudo.
 Vacunas
comestibles.
VACUNAS QUE UTILIZAN VIRUS O
BACTERIAS COMO VECTORES




Se incorpora un gen que codifica para una
proteína inmunogénica en el genoma de un
microorganismo atenuado que se denomina
vector.
El vector al replicarse en el organismo receptor,
expresa los genes propios y el que produce la
proteína incorporada.
La proteina incorporada se presenta al sistema
inmune en su superficie celular.
Induce respuesta inmune humoral y celular.

Los vectores más usados son:
 Virus
de família poxviridae.
 Adenovirus.
 Herpevirus.
 Influenza.
 Bacterias como Salmonella,
Streptococcus, Staphilococcus y E-coli.

Existen riesgos asociados:

La multiplicación viral es intracelular, por tanto una
sola partícula en una sola célula puede dar lugar a
millones de virus en poco tiempo.

ADN viral puede integrarse en el genoma de los
hospedadores de forma latente (esta integración
puede tener consecuencias no deseables).

Posibilidad de recombinación genética entre
virus MG y otro cercano que esté circulando
en el receptor, que generaría genotipos y
fenotipos alterados.

Cambios menores en los virus pueden dar
lugar a cambios drásticos en espectro de
hospedador, permisividad y patogenidad.

Características específicas de los nuevos
virus introducidos en el ecosistema.
Vacunas de ADN desnudo

Son plásmidos de DNA en los que se
incorpora gen que expresa antígeno
inmunógeno del patógeno e induce
inmunidad contra él.

Se expresan dentro de células del
organismo receptor y se presentan al
sistema inmune en combinación con
antígenos celulares de clase I (igual que
en infección natural).

Útiles particularmente en inducción de
células T-citotóxicas, por tanto protegen
más ampliamente ante diferentes cepas
virales.

Presentan el antígeno con modificaciones
translacionales y conformacionales
nativas, por tanto estimulan anticuerpos
de óptima especificidad.

Existen riesgos asociados:

Integración potencial del plásmido en el
genoma de las células hospedadoras.

Inducción potencial de anticuerpos contra
ADN del plásmido inyectado.

Problema de conformación no nativa de
proteinas bacterianas en vacunas con ADN
inoculadas en animales.
 Inducción
potencial de autoinmunidad.
 Liberación
accidental de las
construcciones de ADN desnudo
pueden favorecer transferencia
horizontal de genes.
 Tienden
a la inestabilidad, por tanto
posibilidad de generar nuevos virus.

Existen beneficios asociados:

Efectivas en modelos animales sin necesidad
de adyuvantes o sistemas de administración.

Solo expresan genes que inducen
inmunidad.

Las produce el mismo animal, siguiendo las
instrucciones del gen insertado en el
plásmido de expresión.

Menor dependencia de la cadena de frío que
las vacunas con proteínas.
Vacunas comestibles

Se producen a partir de plantas
modificadas genéticamente que actúan
como bioreactores de antígenos de
patógenos que inducen inmunidad.

Administración tan segura como el simple
hecho de comer una fruta.

Su producción puede resultar barata.

Son ideales contra patógenos que causan
enfermedades respiratorias, urogenitales
e intestinales, donde es básico sensibilizar
el sistema inmunitario mucosal.

Se evita el problema de degradación de
proteínas inmunogénicas por temperatura

Existen riesgos asociados:

Posibilidad de intercambio genético entre la
planta modificada genéticamente y especies
silvestres asociadas.

Actualmente la ingeniería genética controla
con precisión las características que se
quiere implementar en las plantas, pero no
controla totalmente la localización de la
inserción dentro del genoma de la planta
hospedadora.
 La
mayoría de los intentos realizados
para producir antígenos de patógenos
animales en plantas, han resultado ser
tóxicas para la planta.
 La
cantidad del antígeno producido no
es uniforme, por tanto la dosificación es
difícil de controlar.
Mecanismo de acción
Estrategias de inmunización

Es ventajoso combinar 2 o más tipos de
vacuna (se administra 1 o más dosis de la
1ª vacuna seguida de 1 o más dosis de la
2ª).

Estrategia ideal :Inmunizar primero con
vacuna de ADN y después administrar una
vacuna de subunidades como recuerdo.

El resultado final de la respuesta inmune puede
verse influido por:
 Modo
de administración.
 Dosis (número, tamaño y frecuencia).
 Adyuvantes.
Modo de administración

Múltiples rutas de inoculación:











Intramuscular.
Subcutánea.
Intraperitoneal.
Intradérmica.
Intravenosa.
Oral.
Rectal.
Vaginal.
Intraorbital.
Intratraqueal.
Intranasal.

Administración vía inyección con aguja (parenteral)
o vía métodos biolísticos con pistola de genes.

La pistola de genes garantiza una mayor eficiencia,
porqué hace que ADN penetre al interior de la
célula, además también representa un ahorro
porqué se necesitan dosis hasta 100 veces
menores.

La administración parenteral es menos eficaz
porqué se queda en medio intersticial (es decir
desprotegida frente a nucleasas).
Dosis

El número de dosis afecta la respuesta inmune
(generalmente, se necesita > 1 inmunización para obtener
respuesta lo suficientemente fuerte como para ser
protectora).

El intervalo entre las dosis resulta crítico (al aumentarlo
aumenta la respuesta inmune conferida por la vacuna).

La cantidad; depende de diferentes factores:
Tamaño del individuo.
 Inmunogenicidad del antígeno utilizado.
 Eficiencia de transfección durante la
administración.

Adyuvantes

Selección en función del tipo de respuesta inmune
que busquemos.

Existen diferentes tipos:
 Adyuvantes químicos (hidróxido de aluminio).
 Adyuvantes genéticos (consisten en
coinmunizar con un gen estimulatorio).
 Adyuvantes que potencian la inmunidad
mucosal (toxina lábil de E.coli mutante, IL
proinflamatorias,…)

El MECANISMO DE ACCIÓN se resume en :
 Inmunización con un plásmido que contiene
la información genética de uno o varios genes
que codifican para proteínas inmunogénicas
de determinado patógeno.
 El plásmido actúa como un vector
permitiendo la expresión en el interior de las
células que son transfectadas por la
inmunización.
 La respuesta inmune generada (humoral o
celular), ayuda a contrarrestar una infección
con el patógeno, por tanto es una buena
herramienta de profilaxis, sobre todo en las
enfermedades (como las virales) que
requieren ambas ramas de la respuesta
inmune.
Mecanismos de presentación
antigénica

Existen al menos tres que garantizan la inducción
de una respuesta inmune:
Estimulación directa mediada por células
somáticas (miocitos, queratinocitos o cualquier
célula MHC II negativa).
 Transfección directa de APC.
 Presentación cruzada (Cross-priming), donde el
plásmido transfecta una célula somática y/o APC,
y la proteína secretada es captada por otra APC
donde es procesada para su presentación a
linfocitos T CD8+ .

Mecanismos de respuesta inmune

Inmunidad HUMORAL frente a numerosas
proteínas en diversas especies.
La respuesta es menor que la obtenida con
virus vivo a dosis subletales y el pico de
anticuerpos es más tardío (no es
desventaja, porqué al ser vacunas de ADN
pueden generar respuesta de memoria).

Inmunidad CELULAR vía LT CD4+
cooperadores .
Si se administra vía IM, el carácter
proinflamatorio de los motivos CpG no
metilados del ADN bacteriano induce
síntesis y excreción de IL-12 y por tanto
una respuesta Th-1.
Si se administra con pistola de genes, se
genera una respuesta de tipo Th-2.

Inmunidad CELULAR vía LT CD8+ citotóxicos,
es una de las principales ventajas de las
vacunas de ADN porqué es difícil de inducir
con las vacunas convencionales.

Inmunidad MUCOSAL, es decisiva en la
protección contra los microorganismos
invasores, ya que la mayoría de patógenos
veterinarios se transmiten a través del epitelio
de los tractos respiratorio, gastrointestinal y
genital.
Las estructuras linfoides asociadas a estas
mucosas, tienen epitelio con células
especializadas que transportan el antígeno
intacto desde la membrana apical expuesta
hasta la superficie basolateral donde el antígeno
interactúa con la APC y se inicia la estimulación
de la respuesta mediada por LT y LB.
Memoria inmunitaria


Esta respuesta depende del tipo de antígeno empleado
en la vacuna.
Existen varias posibilidades para explicarla :
 El antígeno está presente continuamente a bajos
niveles (suficientes para la presentación antigénica
pero por debajo del límite de detección) o bien el
ADN no se detecta pero el antígeno sintetizado
pudiera persistir in vivo, proporcionando así un
reservorio para mantener la respuesta inmune
 El plásmido y el antígeno sintetizado desaparecen y
las respuestas observadas son antígenoindependientes.
 Las células memoria generadas por esta vacunación
son cualitativamente diferentes de las inducidas por
otros tipos de vacuna.
VACUNAS
COMERCIALIZADAS
Vacuno



(1997) Vacuna contra virus sincitial respiratorio bovino, a partir
del gen que codifica para la proteína G del virus; se ha
comprobado que la vacunación intradérmica sin aguja confiere
mayor protección que la intramuscular o intradérmica con
aguja.
(1999)Vacunas contra IBR-1 (virus de rinotraqueitis infecciosa
bovina 1), a partir del gen de la glicoproteína D del virus (con o
sin región transmembrana) ; protege aunque en general el
título de anticuerpos que se obtiene no es elevado (ni se
incrementa con un aumento del número de dosis); además
también protege a terneros recién nacidos con nivel
detectables de anticuerpos calostrales.
(1999) Vacuna contra BVDV (virus de la diarrea viral bovina), a
partir de la proteína E2 del virus, clonada en un vector de
ADN. Se ha demostrado que su administración por vía
intramuscular en solución salina o en liposoma, induce
respuesta de anticuerpos neutralizantes y respuestas
linfoproliferativas específicas a este antígeno.
Porcino

(1996) Vacuna contra la pseudorrabia, a partir del gen clonado de la
glicoproteína D del virus, con la que se ha podido obtener grandes
resultados en lechones de 1 día provenientes de madres no
vacunadas y sin AC anti-virus de la pseudorrabia.

(1997) Vacuna contra la pseudorrabia, a partir del gen de la
glicoproteina C, con la que se ha podido conseguir protección en
animales de más de 1 día.

(2001) Vacuna contra virus de gastroenteritis transmisible, a partir del
gen que codifica para la glicoproteína S, utilizando como vector el
serotipo 5 de adenovirus (se obtiene respuesta inmune de AC
neutralizantes a los 6-7 días post-inoculación).

(2005) Vacuna contra la PPC, a partir del gen de la glicoproteína E2
del virus, con la que se ha obtenido protección total frente al desafío
letal (los animales desarrollaron una marcada respuesta de LT
cooperadores, y una rápida elevación de los niveles de AC
neutralizantes, lo que se correlacionó con la protección ante los
síntomas clínicos y la infección viral ).
Aves

(1993) Vacuna contra la influenza aviar, a partir del gen
de la hemaglutinina viral , donde la administración de 2
dosis de 100 μg cada una separadas 1 mes entre sí,
confirió protección ante el desafío 1-2 semanas después
de la segunda dosis.

(1996) Vacuna contra la enfermedad de Newcastle, a
partir del gen clonado que codifica para la proteína F del
virus ( con la peculiaridad que tan sólo los animales
vacunados con ADN lineal obtuvieron la protección
deseada; lo cual avala el hecho de que la inducción de
inmunidad mucosal en el modelo de infección por este
virus, resulta decisiva).
Equino

(2003) Vacuna contra Influenza Equina y Tétanos
, a partir de Virus canaripox recombinante
Influenza A equina; se utiliza en Inmunización
activa ( efectos visibles 14 días después) de los
caballos de > 4 meses contra la influenza equina
para la reducción de los signos clínicos y de la
excreción vírica después de la infección y contra
el tétanos para prevenir la mortalidad, su efecto
dura 5 meses después de la primera vacunación
y 1 año después de la tercera vacunación.
Gatos y perros


(1997) “Recombitek” (vacuna contra moquillo canino),a
partir de canarypox inocuo donde se ha implantado material
genético de vmc, con esta vacuna se ha conseguido evitar
todos los problemas post-vacunales típicos de las vacunas
tradicionales.
(2005)“Purevax FelV” (vacuna contra la leucemia felina),a
partir de canaripox recombinante que expresa los genes
env y gag del FeLV-A (en condiciones de campo, tan sólo
subgrupo A es infeccioso y la inmunización frente a este
subgrupo induce una protección total contra los subgrupos
A, B y C, porqué después de la inoculación, el virus expresa
las proteínas protectoras, pero sin replicarse) y consigue
inducir inmunidad contra la leucemia felina.
ESTUDIOS ACTUALES

Ejemplos de empresas privadas que trabajan
actualmente en el desarrollo de nuevas
vacunas:
 Large Scale Biology corp
(http://www.lsbc.com) que trabaja en vacunas
personalizadas contra linfoma no-hodgkins,
papilomavirus y parvovirus.

Chlorogen (http://www.chlorogen.com) que
trabaja en vacunas contra cólera, ántrax y
peste.

Ejemplos de empresas e instituciones que actualmente
estudian nuevas vacunas:
 Universidad de Navarra (http://www.unav.es/) que
estudia vacunas en plantas vía transformación
cloroplástica del tabaco.
 INIA (http://www.inia.es) que estudia el diseño de
vacunas recombinantes mejoradas y el desarrollo de
vacunas contra PPA.
 Fort Dodge Veterinaria S.A que estudia vacunas para
prevención de infecciones entéricas y respiratorias en
humanos, nueva vacuna marcadora para PPC, … .
 CNB (http://www.cnb.uam.es) que estudia vacuna
contra infecciones entéricas y respiratorias en porcino,
vectores vacunales basados en genoma de coronaviurs
para porcino, … .






Maltagen Forschung GmBH (http://www.maltagen.de) que
estudia vacuna contra hepatitis ( a partir de la cebada).
Biocem S.A que estudia vacuna contra la rabia a partir del
maíz y el tabaco.
Genomine inc. (http://www.genomine.com) que estudia
vacunas comestibles (veterinarias y humanas).
Guardian Biotechnologies (http://www.guardianbio.com)
que estudia vacunas a partir de melón coreano, tabaco,
cánola y mostaza.
Nexgen biotechnologies inc.
(http://www.nexgenbiotech.com) que estudia vacunas
veterinarias comestibles a partir de melón coreano.
Dow agrosciences (http://www.dowagro.com) que estudia
vacunas veterinarias a partir de maíz.
Algunos de los últimos estudios

(2005) “Recombinant vaccines based on
translocated effector proteins of salmonella
pathogenicity island 2” (Erlangen –Alemania-).

La Salmonella viva entérica atenuada es útil
como portadora de antígenos heterólogos
para la vacunación , la eficacia de estas fue
demostrada con experimentos de vacunación
usando antígenos protectores de Lysteria
Monocytogenes.

(2006) “Durable HIV-1 antibody and T-cell
responses elicited by an adjuvanted multiprotein recombinant vaccine in uninfected
human volunteers” (university of Rochester –
USA-).
 Se vacunaron intramuscularmente 48
personas no infectadas de HIV para analizar
la presencia de respuestas ( AC y LT)
inducidas por la vacuna y como se esperaba
no se detectó respuesta de células T CD8
HIV-específicas.

(2006) “Evaluation of recombinant BCG expressing
rotavirus VP6 as an anti-rotavirus vaccine” (La
boratorio nacional de salud de Ciudad del Cabo).
 BCG recombinante que expresaba el rotavirus
VP6 se estudia como vacuna contra rotavirus y
los resultados (se observa protección – por tanto
inmunidad celular- en ausencia del anticuerpo
perceptible del anti-rotavirus en suero o heces)
sugieren que el transporte de VP6 a la
membrana de BCG es importante para la
inducción de una inmunorespuesta protectora.

(2006) “Generation and evaluation of a recombinant
modified vaccinia virus Ankara vaccine for rabies”
(Instituto agrícola de investigación veterinaria –
Sudafrica- ).
 Este estudio intenta demostrar la eficacia e
inocuidad del uso de MVA (virus de Ankara
modificado) recombinante con un gen de
glicoproteina del virus de la rabia administrado
vía oral; los resultados demuestran que es
inocuo y obtiene respuesta inmunológica
humoral pero si se administra periféricamente
pero no se obtiene si se administra vía oral.

(2007) “Improved formulation of recombinant ricin Achain vaccine increases its stability and effective
antigenicity” ( US Army medical research institute of
infectious diseases –USA-).
 El ricino es una toxina muy potente asociada al
bioterrorismo para la cual, aún no existe ninguna
vacuna disponible; este estudio se basa en el
“prototipo de vacuna recombinante” hecho a
partir de cadena A de ricino y se centra en
intentar incrementar su estabilidad y efectividad;
se llega a la conclusión que la optimización de la
adherencia de un antígeno de la proteína al
coadyuvante de aluminio puede ser de gran
utilidad para alcanzar tal fin.