Download biotecnología para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas

CAPÍTULO 1.1.7.
BIOTECNOLOGÍA PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS
ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y EL DESARROLLO
DE VACUNAS
INTRODUCCIÓN
Los métodos de biología molecular se aplican cada vez más al diagnóstico de las enfermedades
infecciosas y al desarrollo de vacunas. Para que estos métodos se lleguen a utilizar ampliamente,
es preciso que sean fáciles, seguros, sensibles, reproducibles y finalmente automatizados para
facilitar la evaluación de gran cantidad de muestras.
El propósito de este capítulo es proporcionar una información básica general para el personal no
especializado. Dos entregas de la Revisión Técnica y Científica de la OIE tratan de biotecnología y
el diagnóstico de enfermedades animales, y se pueden consultar para una revisión más detallada
(103, 104). A continuación se describen brevemente los temas tratados en este capítulo.
A.
1.
2.
3.
4.
Detección de ácidos nucleicos
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR en tiempo real
Diagnóstico mediante el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción y
estrategias basadas en las relaciones entre los ADN
Diagnóstico mediante sondas de ADN y la tecnología de las micromatrices de ADN
Extracción del ácido nucleico
B.
1.
2.
3.
4.
Detección de proteínas
Inmunohistoquímica
Inmunoelectrotransferencia
Enzimoinmunoensayo de captura antigénica (ELISA)
Proteómica
C.
1.
2.
Detección de anticuerpos
ELISA competitivo (C-ELISA)
Producción de antígenos mediante la tecnología del ADN recombinante
D.
1.
2.
3.
4.
5.
Vacunas
Vacunas bacterianas con delección génica
Vacunas marcadas y pruebas diagnósticas complementarias
Vacunas con vectores víricos
Vacunas de ADN
Otros avances en la tecnología de las vacunas
A. DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR en tiempo real
La PCR aprovecha los mecanismos de replicación natural del ADN y tiene como resultado la producción in vitro
de grandes cantidades de una secuencia deseada de ADN a partir de una mezcla compleja de secuencias
heterogéneas (134). La PCR puede amplificar una región seleccionada de 50 a varios miles de pares de bases
en billones de copias. Mullis et al. (93) describen una discusión detallada sobre la metodología y las aplicaciones
de la PCR.
La amplificación del ADN mediante la PCR consiste en una sucesión cíclica de etapas de incubación a diferentes
temperaturas. Primero el ADN diana se desnaturaliza por calor para separar las dos cadenas complementarias
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Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
para conseguir moldes monocatenarios. Posteriormente los cebadores específicos (moléculas sintéticas cortas
de ADN complementario para ambas cadenas y que flanquean las secuencias diana) se asocian (hibridan) con
los moldes monocatenarios a baja temperatura y se extienden con ADN polimerasa a una temperatura
intermedia. Una vez que la polimerasa ha sintetizado una nueva cadena de ADN, se separa el producto del
molde calentando a una temperatura mayor. Estas etapas, referidas como ciclos, se repiten 20–40 veces, lo que
conlleva la amplificación de las secuencias del ADN diana. La clave para la amplificación geométrica de las
secuencias del ADN diana mediante la PCR es la selección de los pares de cebadores que, cuando se extienden,
crean lugares de hibridación de los cebadores recíprocos adicionales para la extensión de los cebadores en los
ciclos posteriores. Para detectar el ARN (p.ej. virus de ARN), primero se debe hacer una copia de ADNc del ARN
utilizando la transcriptasa inversa (RT). Entonces el ADNc actúa como molde para la amplificación mediante la
PCR. A esta técnica se la denomina RT-PCR.
Cualquier producto generado con la PCR, tiene, por definición, un tamaño característico. Su identidad se
confirma generalmente empleando sondas de ADN (véase más abajo) o se digiere por restricción, lo que puede
ser utilizado para las pruebas de los RFLP (véase más arriba). Desde la llegada de las técnicas de secuenciación
de ciclo automático, lo más habitual es que la identificación se realice secuenciando de forma directa el producto
de la PCR. Por ejemplo, la secuenciación se ha utilizado en la tipificación de la virulencia del virus de la gripe
aviar tipo A, en el que los motivos estructurales asociados a la virulencia en el sitio de desdoblamiento del gen de
la hemaglutinina son indicadores fiables de patogenicidad elevada en los pollos (63). La sensibilidad de la PCR
puede aumentar utilizando un segundo juego de cebadores para amplificar un subfragmento a partir del producto
de la PCR de la primera reacción. A esta técnica se la denomina normalmente “PCR anidada” y ha sido
empleada para detectar niveles bajos de Anaplasma marginale en bóvidos infectados de forma persistente (158).
Sin embargo, el uso de la PCR anidada puede aumentar la proporción de resultados positivos falsos.
La PCR es un procedimiento muy sensible para detectar agentes infecciosos en tejidos del hospedador y
vectores, incluso cuando sólo se infecta una pequeña cantidad de células del hospedador. La PCR puede
apuntar y amplificar una secuencia génica que se haya integrado en el ADN de las células hospedadoras
infectadas. También puede apuntar y amplificar secuencias génicas víricas no integradas. Está claro que la PCR
cumple una función en las pruebas de detección de contaminación en las vacunas. Sin embargo, no diferencia
entre organismos viables y no viables o fragmentos incompletos del ADN genómico, lo que puede complicar la
interpretación de los resultados y afecta a la aplicabilidad de la PCR en este papel.
La PCR puede resultar muy útil en el diagnóstico de las infecciones crónico-persistentes, tales como las
causadas por retrovirus (virus de la leucemia bovina, virus de la artritis/encefalitis caprina, etc.). Estas
enfermedades presentan problemas serios en términos de diagnóstico y prevención puesto que los animales
infectados son una fuente potencial constante de transmisión.
Cuando se utiliza la PCR con fines diagnósticos, se requiere un extremado cuidado para evitar la contaminación
de las muestras, porque la sensibilidad exquisita de la técnica puede conducir fácilmente a resultados positivos
falsos. Los estudios multicentro han demostrado que en los laboratorios las muestras positivas se detectan sin
excepción, pero frecuentemente se obtienen positivos falsos con muestras negativas conocidas, lo que indica la
presencia continua de problemas de contaminación (139). Se han desarrollado sistemas para solventar este
problema, por ejemplo el sistema dUTP-UNG (d-uracil trifosfato y uracil-N-glicosilasa). Este sistema utiliza una
reacción enzimática para degradar específicamente los productos de la PCR procedentes de la amplificación de
la PCR previa (en la cual se ha incorporado dUTP) sin degradar los ácidos nucleicos moldes nativos (25). De
esta forma, por supuesto, no se excluye la contaminación de la muestra con virus extraños. Actualmente se
dispone de una nueva generación de sistemas automatizados controlados con microprocesadores en los que las
reacciones de la PCR se pueden preparar con tan sólo un tubo que se abre en cualquier momento dado. Esto
reduce enormemente el riesgo de contaminación. También es importante controlar los potenciales resultados
“negativos” causados por la presencia de sustancias que interfieren en la mezcla de reacción de la PCR o en la
muestra del paciente, mediante la inclusión de un molde conocido que da lugar a un producto de la PCR (25).
Estas precauciones permiten que la PCR se convierta en una opción realista para las pruebas diagnósticas.
Para ampliar su utilidad en los diagnósticos veterinarios y en las identificaciones de patógenos, la PCR se ha
modificado ampliamente en los últimos años. La PCR en la que se utilizan cebadores ampliamente conservados
se ha diseñado para la identificación de tipos de patógenos. El mejor ejemplo es el uso de secuencias del gen
16s ARNr, un gen evolutivamente conservado en especies bacterianas (52). Utilizando cebadores de PCR que
son complementarios a estas regiones de secuencias conservadas, se puede determinar la presencia de
cualquier clase de bacteria en la muestra. Debe advetirse que un resultado positivo de la PCR necesita una
caracterización adicional mediante hibridación con sondas específicas de especie, mediante análisis por digestión
de enzima de restricción o mediante secuenciación. Del mismo modo, se ha diseñado una PCR de consenso
para utilizar cebadores degenerados orientados a regiones de secuencias conservadas o motivos de un grupo de
patógenos relacionados (169). El uso de cebadores degenerados dirigidos a las regiones de secuencia del gen
de la polimerasa del ADN herpesviral ha llevado a la identificación de muchos herpesvirus no reconocidos
previamente en varias especies animales (40, 76). Por otro lado, la PCR múltiple se ha diseñado para utilizar dos
o más pares de cebadores dirigidos a las secuencias únicas específicas de patógeno dentro de una única
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Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
reacción para la detección simultánea de múltiples patógenos que son de interés (41). La PCR múltiple tiene la
ventaja de poseer un alto grado de sensibilidad y de especificidad. Sin embargo, han aparecido informes de que
las reacciones múltiples pueden reducir la sensibilidad en comparación con las reacciones únicas, debido a la
competencia. Esto debería tenerse en cuenta cuando se ha de realizar un ensayo muy sensible.
Actualmente los métodos clásicos de la PCR para el diagnóstico de patógenos, tanto bacterianos como víricos,
se complementan y en algunos casos se reemplazan por ensayos de PCR en tiempo real. La PCR en tiempo real
controla la acumulación del producto de la PCR durante la reacción de amplificación, así permite la identificación
de los ciclos durante los cuales se produce la generación del producto de la PCR casi exponencialmente. En
otras palabras, el ensayo puede utilizarse para cuantificar de forma segura el contenido de ADN o ARN en una
muestra dada. En contraste con la PCR convencional, la PCR en tiempo real requiere menos manipulación, es
más rápida que las técnicas de PCR convencional, tiene un formato en tubo cerrado, por lo que decrece el riesgo
de contaminación cruzada, es altamente sensible y específica, por lo que retiene la eficacia cualitativa y
proporciona información cuantitativa. En muchos casos, los ensayos de PCR en tiempo real han demostrado ser
más sensibles que los métodos de referencia existentes (58, 175). El desarrollo reciente de ensayos y máquinas
portátiles de PCR en tiempo real (128) aumenta las perspectivas de estas técnicas para ser utilizadas en el
diagnóstico rápido (menos de 2 horas) de brotes de enfermedad en el campo.
La validación de las técnicas de PCR se incluye en el capítulo 1.1.5. Validación y control de calidad de los
métodos de la reacción en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnóstico de las enfermedades
infecciosas. En este capítulo también se plantean controles internos para garantizar los resultados de la PCR.
2.
Diagnóstico mediante el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción y
otros enfoques relacionados basados en el ADN
Es posible que las pruebas serológicas que se utilizan habitualmente para identificar los microorganismos no
diferencien entre aislamientos de patógenos estrechamente relacionados, sean virus, bacterias, hongos o
parásitos. Un procedimiento basado en el ADN ofrecerá la mejor discriminación que con frecuencia se requiere, y
un punto de partida apropiado pueden ser los análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de
restricción (RFLP).
El enfoque del RFLP se basa en el hecho de que los genomas, incluso los de los patógenos estrechamente
relacionados, se definen por la variación de su secuencia. Por ejemplo, el orden lineal de los nucleótidos
adyacentes que abarca la secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción específico en un genoma
puede estar ausente en el genoma de una cepa o aislamiento estrechamente relacionados.
En la práctica el procedimiento del RFLP consiste en el aislamiento del patógeno diana, la extracción del ADN o
ARN (con la posterior trascripción inversa a ADN) y a continuación la digestión del ácido nucleico con un enzima
de restricción seleccionado de un grupo. Los fragmentos individuales del ADN digerido se separan después en un
gel por electroforesis y se visualizan mediante la tinción con bromuro de etidio. Lo ideal es que cada cepa revele
un patrón único, o “huella dactilar”. Se pueden considerar muchos enzimas de restricción diferentes al comienzo
de cada nueva unidad de trabajo, de modo que se pueda realizar el análisis de muchas huellas dactilares
moleculares a partir de las digestiones con diversos enzimas de restricción individuales, y la combinación del
mejor conjunto de resultados permitirá una diferenciación detallada entre las cepas o los aislamientos. Un buen
ejemplo de la aplicación de esta técnica es la diferenciación de los biotipos del virus de la rabia a partir de perros
o murciélagos vampiros procedentes de Latinoamérica (83).
Para el estudio de los patógenos, resulta de mayor utilidad una modificación de la técnica básica del RFLP por la
que se incorpora la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como etapa preliminar. El ensayo de la PCR
(descrito con más detalle en la sección 1 del presente capitulo) se utiliza para amplificar una región específica del
genoma (cuyas secuencias el investigador sabe que varían de un patógeno a otro), que posteriormente sirve
como ADN molde para la técnica del RFLP. Esta nueva combinación (PCR-RFLP) ofrece una sensibilidad mucho
mayor para la identificación de patógenos y es especialmente útil cuando el patógeno está presente en
cantidades pequeñas o es difícil de cultivar, dos rasgos que caracterizan al parásito protozoario intestinal
Crisptosporidium spp. Tanto el RFLP como, más especialmente, el PCR-RFLP son extremadamente útiles para
la genotipificación de cepas de Criptosporidium, ya que permiten identificar las fuentes de la infección humana y
proporcionar información acerca de su epidemiología y aparición (16, 145). De este modo puede definirse la
implicación de cepas o tipos específicos en un brote de enfermedad, y debería ser posible seguir el rastro
epidemiológico de los aislamientos dentro de un país o entre países.
Existen otros muchos ejemplos en los que se ha demostrado que las técnicas RFLP/PCR-RFLP son útiles para
discriminar entre genotipos; por ejemplo, el hongo Candida (32), el virus del síndrome respiratorio y reproductivo
porcino (162) y la bacteria Helicobacter pylori (54).
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Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
El patógeno humano Candida krusei proporciona un buen ejemplo de la aplicación general de una variedad de
técnicas moleculares. Dassanayake et al. (32) investigaron la diversidad genética de once aislamientos orales de
C. krusei e identificaron cinco genotipos diferentes mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE),
nueve genotipos mediante RFLP empleando el enzima HinfI, mientras que el análisis de huellas dactilares de
ADN basado en el ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD-PCR) reveló tres, ocho u once genotipos
dependiendo de los cebadores utilizados.
La incorporación de la PFGE facilita la separación de fragmentos grandes de ADN (hasta tamaño de megabase)
y puede ser un accesorio útil para el análisis básico por RFLP. Jager et al. (66) utilizaron una combinación del
enzima de restricción de corte infrecuente NotI y la PFGE para caracterizar 80 aislamientos de Coxiella burnetii a
partir de animales y humanos de Europa, EE.UU., África y Asia. Distinguieron 20 patrones de restricción
diferentes y el análisis filogenético de los diferentes patrones RFLP reveló relaciones evolutivas entre los grupos
que se correspondían con el origen geográfico de los aislamientos. En este estudio no se detectó correlación
entre el grupo de restricción y la virulencia de un aislamiento, pero enfoques similares utilizados con otros varios
patógenos sugieren tal conexión. Grigg y Boothroyd (53), por ejemplo, identificaron tres puntos de restricción en
el locus B1 repetido 35 veces que permitió diferenciar las cepas del tipo I (virulenta para el ratón) de las de los
tipos II y III (no virulentas para el ratón) de Toxoplasma gondii.
Los RFLP tienen un valor evidente para los estudios epidemiológicos, pero una interpretación más crítica de los
datos del RFLP supone la construcción de bases de datos para determinar si los perfiles del RFLP están
relacionados con factores tales como la virulencia, la gama de hospedadores y la relevancia clínica. En la
práctica, para clasificar el aislamiento es útil no basarse en un sitio de restricción sino en la utilización de sitios en
varias localizaciones dentro del genoma. Un asunto de permanente interés en el diagnóstico veterinario es la
valoración correcta de cualquier diferencia molecular encontrada entre los aislamientos de un patógeno porque la
pérdida o adquisición del (de los) sitio(s) de restricción puede no estar asociada con diferencias en la capacidad
del patógeno para causar enfermedad, es decir, una diferencia por RFLP puede no ser significativa desde el
punto de vista funcional, excepto como rasgo diferenciador
Los marcadores polimórficos del RAPD que definen cepas individuales, etc. pueden secuenciarse y ser utilizados
como regiones amplificadas de secuencia caracterizada (SCAR). De este modo la conversión de un marcador
polimórfico anónimo a una SCAR significa que se puede realizar un solo PCR para identificar de un modo más
simple un genoma específico. Lewin et al. (75) emplearon este enfoque para identificar 19 genotipos con
multilocus único entre 29 cepas del protozoo Leishmania donovani.
Las técnicas para poder detectar y caracterizar el ADN de un patógeno continúan mejorando y desarrollándose.
El procedimiento discriminatorio fundamental es la secuenciación del genoma. La secuenciación de una porción
del genoma bien caracterizado, está jugando un papel muy importante en la caracterización del patógeno y en los
estudios epidemiológicos. La secuenciación de los productos amplificados por PCR utilizando cebadores
degenerados dirigidos a un gen común a los virus de la misma familia se ha convertido en una importante
herramienta de diagnóstico, especialmente para la identificación de miembros de una misma familia previamente
no reconocidos. Un buen ejemplo es la secuenciación de amplicones de PCR degenerados a partir del gen de la
polimerasa del ADN herpesvírico (169). En unos pocos casos se ha secuenciado el genoma vírico completo. Por
ejemplo, el brote del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), y la secuenciación del genoma de 29.751
bases del coronavirus asociado (86) reveló de modo práctico que el virus estaba relacionado sólo
moderadamente con otros coronavirus conocidos, entre los que se encuentran dos coronavirus humanos y no
parecía tener una relación próxima con ninguno de los tres grupos de coronavirus previamente establecidos. Este
grado de cuestionamiento a nivel del ácido nucleico no estará disponible para estudiar la mayoría de los
patógenos. Hasta dentro de muchos años no se dispondrá del conocimiento a nivel del ácido nucleico para
estudiar a la mayoría de los patógenos. Las técnicas tales como el RFLP, el PCR-RFLP, el RAPD-PCR y los
análisis de las SCAR continuarán desempeñando un papel central en la identificación y discriminación de los
aislamientos de la mayoría de los patógenos.
3.
Diagnóstico mediante sondas de ADN y la tecnología de las micromatrices de ADN
Las pruebas convencionales con sondas de ADN y el análisis de micromatrices son dos lados de la misma
moneda. Para ambos procesos es fundamental la unión (hibridación) del ADN procedente de una muestra
sospechosa de contener un patógeno (el “desconocido”), con un ADN muy bien caracterizado procedente de un
patógeno de interés (el ADN “conocido”).
En las pruebas convencionales con sondas de ADN, el ADN desconocido (o ARN), la diana, se inmoviliza en una
superficie sólida, p.ej. un filtro. El ADN conocido, convertido en sonda mediante marcaje o etiquetado de alguna
manera, se encuentra en la fase líquida y se aplica a la diana. En el diagnóstico de micromatrices es el ADN
conocido (oligonucleótidos grandes o ADN complementario) el que actúa de diana y se inmoviliza en un porta, en
tanto que el ADN desconocido, en la fase líquida, es el que se marca y actúa de sonda.
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Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
En las pruebas convencionales con sondas de ADN la diana pueden ser ácidos nucleicos extraídos a partir de un
material clínico o de células en cultivo y o (a) se añaden a filtros (transferencia de gotas que quedan en forma de
manchas, tipo “dot blot” o en ranura, en forma de línea, tipo “spot blot”) o (b), de manera menos conveniente en
un contexto diagnóstico, se transfieren a un filtro después de una electroforesis en gel. La cantidad de patógeno
en una muestra clínica podría ser demasiado reducida para ser detectada. Consecuentemente, se podría
amplificar el ácido nucleico mediante PCR o PCR de trascripción inversa (RT-PCR), aplicándose el producto de
la PCR al filtro. Con objeto de visualizar una sonda unida a su diana, la sonda se puede marcar con un nucleido
radiactivo, o de forma más habitual y segura, con un “etiquetado” no radiactivo. Por ejemplo, se pueden
incorporar en la sonda biotina o psoraleno–biotina, y unido a la sonda se detecta mediante la adición de
estreptavidina ligada a un enzima para la generación posterior de color o luz (quimioluminiscencia).
La micromatríz se denomina así porque puede constar de 20.000 o más ADNs conocidos diferentes, cada ADN
se coloca en pequeñas muestras sobre portas formando una matriz. Cada mancha de muestra es de tan sólo
10 μm de diámetro. Para preparar las matrices se pueden utilizar ADNs complementarios de partes de genes
seleccionados de los patógenos (17). Sin embargo, si se va a investigar un gran número de patógenos, entonces
sería más fácil desde un punto de vista logístico utilizar oligonucleótidos grandes. La micromatriz que se utilizó
para identificar al virus SARS al ser un coronavirus tenía oligonucleótidos formados por 70 nucleótidos (70-mer)
(174). En el sondeo de la micromatriz esta es la muestra a partir de la que se prepara la sonda. Esencialmente, el
ácido nucleico se extrae a partir de una muestra y se realiza una (RT-) PCR empleando oligonucleótidos
cebadores al azar. De esta manera parte de todos los ácidos nucleicos de la muestra, tanto de origen
hospedador como patógeno, se amplifican. Estos productos de PCR, representativos de cada ácido nucleico de
la muestra, se marcan con un colorante fluorescente y se aplican a la micromatriz. En condiciones óptimas sólo el
ADN procedente del patógeno se unirá al ADN del porta. Si se está interesado en detectar únicamente un
patógeno particular o un grupo de patógenos relacionados entonces los oligonucleótidos específicos del
patógeno se pueden utilizar para amplificarlos en la muestra con el fin de obtener la sonda.
Se pueden diseñar micromatrices para detectar patógenos a distintos niveles de diferenciación. En el caso de
oligonucleótidos ADN diana inicialmente se pueden preparar oligonucleótidos capaces de detectar y diferenciar
patógenos a nivel de género. Se elegiría un número, quizás 10 o así, de oligonucleótidos con un grado elevado
de conservación de secuencia (oligonucleótidos consenso) dentro de un género dado, de modo que una sonda
hecha a partir de una muestra de campo que contenga un miembro de este género probablemente hibridaría con
al menos alguno de los nucleótidos, mientras que no hibridaría (o lo haría en menor grado) con aquellos
correspondientes a los géneros relacionados,( p.ej. para diferenciar los aislamientos de Apthovirus (causantes de
la fiebre aftosa, FMDV) a partir de cepas de Enterovirus de la familia Picornaviridae. Después se podrían
seleccionar otros juegos de oligonucleótidos, colocarlos en el mismo porta de la matriz, capaces de caracterizar
un patógeno de forma más específica, (p.ej. para diferenciar los siete tipos de FMDV e incluso potencialmente
afinar después a nivel de subtipo.)
En el sondeo convencional del ADN la detección de un patógeno está limitada por la cantidad de sondas
empleadas, mientras que en el análisis de micromatrices sólo se está limitado por la cantidad de ADNs diana en
la matriz. Si una micromatriz tiene 1000 oligonucleótidos diferentes, entonces para conseguir el mismo poder de
resolución que el sondeo convencional serían necesarias 1.000 sondas, 1.000 reacciones de sondeo separadas.
La gran ventaja del análisis de micromatrices en la investigación de los patógenos es que cientos de patógenos
se pueden buscar de manera simultánea al sondear un único porta de micromatriz. Claramente, el análisis de
micromatrices presenta un enorme potencial cuando se investigan enfermedades de etiología desconocida,
enfermedades en las que más de un patógeno puede estar presente y cuando se precisa la subtipificación. Para
mejorar la sensibilidad en la detección de los patógenos se pueden complementar las micromatrices con
amplificaciones por la PCR. Estas PCR se diseñan generalmente para amplificar uno o más genes conservados
o secuencias múltiples, tales como la PCR en la que se utilizan cebadores ampliamente conservados, la PCR de
consenso, y la PCR múltiple, como se mencionó en esta sección. Si se tiene un patógeno in mente, entonces la
utilización de una micromatriz está menos justificada, puesto que la producción e hibridación es relativamente
cara. En cambio, para estos casos más simples, se podrían emplear PCRs específicas de patógeno/subtipo,
seguidas de la secuenciación o análisis de los fragmentos de restricción para conseguir la confirmación.
Si la experiencia previa en biotecnología es indicativa del futuro, entonces es de esperar que los reactivos y el
equipamiento de las micromatrices sean menos costosos, lo que conducirá a una mayor aplicación de esta
tecnología en el diagnóstico de las enfermedades animales. Conseguirá que la investigación de los virus o la
caracterización de las cepas bacterianas en términos de virulencia, sensibilidad antimicrobiana, u otros
marcadores importantes. Uno de los mayores retos afrontados cuando se utilizan los métodos basados en la
matríz, es el manejo y el análisis del amplio conjunto de datos que se generan.
4.
Extracción del ácido nucleico
Las principales variantes de los ensayos de diagnóstico moleculares descritos más adelante en esta sección
dependen por completo de la disponibilidad de mezclas de ácido nucleico “limpias” para actuar como molde en
las reacciones. Mientras que es relativamente fácil extraer ADN de cultivos bacterianos o de sangre, es
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Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
técnicamente más complicado preparar material adecuado a partir de muestras fecales o de material procedente
de abortos. Esta fase es crítica porque si el material de pruebas no se ha purificado de contaminantes en la
muestra clínica, se compromete la fase de prueba y pueden obtenerse resultados falsos (capítulo1.1.5 Validación
y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnóstico de
las enfermedades infecciosas). Existe una variedad de métodos especializados para tipos concretos de muestras
y tejidos, algunos de los cuales están actualmente disponibles en el mercado como sistemas manuales o
automatizados para estaciones de trabajo robotizadas. Estas tienen la finalidad de mejorar la fiabilidad de la
extracción del ácido nucleico a partir de diferentes muestras, pero se trata de una tarea que ha de
perfeccionarse.
B. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS
1.
Inmunohistoquímica
Como complemento al aislamiento de los organismos causantes de las enfermedades, la inmunohistoquímica se
está convirtiendo rápidamente en una herramienta estándar en los laboratorios de diagnóstico para la
identificación de antígenos asociados con virus, bacterias y protozoos y la encefalopatía espongiforme
transmisible (124). La detección in situ de antígenos en tejidos fijados ofrece una serie de ventajas sobre otras
técnicas diagnósticas. Estas ventajas son: (a) la comodidad en la presentación de las muestras; (b) el manejo
seguro de los potenciales patógenos humanos; (c) los estudios retrospectivos de muestras conservadas; (d) la
rapidez; y (e) la detección de organismos no viables (55). La inmunohistoquímica también se utiliza para detectar
proteínas priónicas anormales (PrPSc) en el tejido cerebral para confirmar enfermedades como el prurigo lumbar,
la encefalopatía espongiforme bovina y otras encefalopatías espongiformes transmisibles y ha demostrado ser
más sensible que el examen histopatológico para el diagnóstico de estas enfermedades (156). La demostración
de PrPSc en biopsias de tejido linfoide, p.ej. en la membrana nictitante, también puede ser utilizada para el
diagnóstico del prurigo lumbar (101). A medida que aumente la cantidad de anticuerpos monoclonales (MAb)
para definir antígenos, aumentará el empleo de la inmunohistoquímica para la identificación de organismos y
otros marcadores específicos de la autoinmunidad y la neoplasia. La etapa limitante en el proceso de
inmunohistoquímica consiste en identificar una combinación MAb/antígeno que se una a los tejidos fijados con
formalina. Este inconveniente se puede superar utilizando secciones congeladas o empleando técnicas
recuperadoras del antígeno (p.ej. digestión con enzimas proteolíticos, microondas) antes de la inmunotinción.
2.
Inmunoelectrotransferencia
La inmunoelectrotransferencia combina la resolución elevada de la electroforesis en gel con la especificidad de la
detección inmunoquímica y ofrece un medio para identificar los epítopos inmunodominantes reconocidos por los
anticuerpos a partir de animales infectados o los MAb dirigidos contra el agente diana. El procedimiento de
inmunotransferencia se puede dividir en seis etapas:
a)
Preparación de la muestra
b)
Resolución del antígeno mediante electroforesis en gel
c)
Transferencia de los polipéptidos separados a un soporte de membrana (membrana de nitrocelulosa)
d)
Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos en la membrana
e)
Incubación con anticuerpo de detección
f)
Detección del anticuerpo de unión
Es crítica la elección del anticuerpo de detección. Los sueros policlonales están compuestos de una variedad de
anticuerpos que refleja el repertorio completo de la respuesta inmune frente a un antígeno complejo particular.
Por tanto, detectarán una cantidad de polipéptidos distintos que proporciona un “perfil” característico de
reactividad. Los MAb se unen sólo a un epítopo, por lo que son adecuados para identificar polipéptidos muy
específicos. Después de la incubación con el anticuerpo de detección, cualquier anticuerpo que se una a las
bandas de proteínas específicas se visualizará empleando antisueros anti-especie conjugados a enzimas de
marcaje y un sustrato/cromógeno adecuado.
La inmunoelectrotransferencia se lleva a cabo principalmente en los laboratorios de diagnóstico para identificar
y/o caracterizar agentes infecciosos basándose en la especificidad del antígeno o empleando antígenos
conocidos para buscar una respuesta serológica específica. Frecuentemente, los resultados positivos-falsos o
negativos falsos de otros ensayos diagnósticos se pueden resolver mediante una inmunoelectrotransferencia
(89). Como un ejemplo de detección de antígeno, la inmunotransferencia es el principal método de detección
para la EEB y el prurigo lumbar; se ha utilizado en millones de muestras de cerebro en Europa y en otros sitios
para la detección de la proteína del prión (138). Técnicas revisadas de inmunotransferencia (por ejemplo SAF-
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Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
Western blot) se utilizan como métodos de prueba confirmativos (8) y para diferenciar entre el prurigo lumbar y la
EEB (146). Asimismo, se emplea con frecuencia para determinar la especificidad de los MAb individuales. Los
polipéptidos purificados individuales (o proteínas de expresión recombinante) también se pueden transferir a
membranas de nitrocelulosa mediante inmunoelectrotransferencia para examinar la reactividad de los sueros
problema hacia proteínas individuales. Este perfil característico de reactividad se puede utilizar para ayudar a
distinguir entre los animales vacunados y los infectados, tales como la prueba EITB, el método Western Blot para
la fiebre aftosa, que es muy usado en Sudamérica (10). El factor primordial que afecta al éxito de la técnica de
inmunoelectrotransferencia es la naturaleza de los epítopos que son reconocidos por los anticuerpos. Las
técnicas en gel de máxima resolución implican alguna forma de desnaturalización del antígeno. Esto destruye los
determinantes conformacionales y únicamente permite la detección de los epítopos lineales o no
conformacionales. La mayoría de los antisueros policlonales contiene anticuerpos que reaccionan tanto con los
epítopos lineales como con los conformacionales, pero los MAb están dirigidos a los epítopos individuales; así si
ellos apuntan a los epítopos conformacionales, no reaccionarán con proteína desnaturalizada.
Para detectar patógenos en muestras de tejido, que contienen una gran cantidad de proteína, se requiere la
concentración selectiva del antígeno y métodos de detección muy sensibles. Se utilizan buenos ejemplos de
estas técnicas para la detección de la proteína del prión del prurigo lumbar (PrPSc) (91). Después de la
eliminación de la proteína del prión normal mediante la digestión de la proteinasa, el PrPSc se concentra por
precipitación de fosfotungstato sódico o precipitación de alcohol, y se detecta el compuesto anticuerpo-antígeno
en el filtro o en la placa del ELISA mediante el uso de un sustrato de luminiscencia química y la utilización de una
cámara CCD o una placa de rayos X para eliminar la emisión de fondo (12, 133).
3.
Enzimoinmunoensayo de captura antigénica (ELISA)
El enzimoinmunoensayo de captura antigénica (ELISA) facilita la detección de antígenos de patógenos
directamente a partir de un animal antes o durante el desarrollo de la enfermedad clínica. Comúnmente, el ELISA
sigue un formato de ensayo tipo sándwich empleando anticuerpos de captura y de detección (ya sean
anticuerpos policlonales o MAb). Primero el antígeno de la muestra problema se captura mediante un anticuerpo
policlonal o MAb específico unido a un soporte en fase sólida y su presencia se detecta utilizando un segundo
anticuerpo policlonal o MAb, que puede tener marcaje radioactivo o más generalmente, enzimático (conjugado).
Si el anticuerpo de detección no está conjugado entonces se emplea un conjugado (reactivo para el anticuerpo
detector) anti-especie. El anticuerpo de captura selecciona el antígeno diana a partir de otras proteínas
competidoras presentes en las suspensiones de la muestra y asegura que está semi-concentrado para
incrementar las posibilidades de su detección. Las características deseadas del MAb de captura son fuerte unión
al patógeno, reconocimiento de un epítopo conservado y muy específico para el agente diana y la capacidad de
adhesión a las placas ELISA sin que pierda reactividad. Además, con frecuencia se utiliza como parte de un
sistema indicador un segundo MAb que reconoce un epítopo distinto del que es reconocido por el MAb de
captura que se une a la placa ELISA. Sin embargo, puede resultar difícil identificar los MAb de reactividad intratípica completa por lo que es posible que se prefieran los antisueros policlonales para aumentar la probabilidad
de reacción contra todas las variantes antigénicas. Como ejemplos de ELISA de captura antigénica están el
sistema de detección de Anaplasma marginale en sangre de vacas preclínicas (160), la utilización del ELISA de
captura antigénica con muestras de sangre de vaca para detectar el virus de la diarrea vírica bovina (88, 136) y la
detección rápida de los antígenos de los virus de la peste bovina y la peste de los pequeños rumiantes en
muestras clínicas (79). El antígeno respiratorio sincitial en secreciones nasales se capturó empleando un ELISA
con MAb dirigidos contra epítopos de la cápsida vírica (102). Se han validado ampliamente varios Elisa de
captura para la detección de la proteína del prión y se utilizan como métodos rápidos de análisis en todo el
mundo (42, 44, 91). Los Elisa de captura también se utilizan ampliamente para pruebas de la enfermedad de
debilitamiento crónico en ciervos (60), y las pruebas de prurigo lumbar en ovejas y cabras (43). Un método de
captura relacionado con el antígeno, la prueba Priostrip, que es un método en el que se utilizan tiras reactivas,
también se usa como una prueba de análisis rápida de la EEB (44). Actualmente algunos métodos de captura
antigénica relacionados que utilizan perlas inmunomagnéticas se consideran métodos importantes y han tenido
una buena aceptación para detectar ciertas infecciones bacterianas, entre ellas las debidas a Listeria, Salmonella
y Escherichia coli.
El principio de esta tecnología se apoya en la separación inmunomagnética, es decir, la utilización de pequeñas
partículas super-paramagnéticas o perlas recubiertas de anticuerpos contra los antígenos de superficie de las
células. Las bacterias intactas y sus determinantes antígenicos solubles pueden determinarse después de la
extracción magnética de la muestra de prueba, utilizando un segundo anticuerpo en un formato de sandwich. Una
unión libre de superficie sólida, los ensayos de captura antigénica en los que se utilizan perlas
inmunomagnéticas, pueden acentuar la cinética de una reacción de anticuerpo-antígeno. Como resultado, se
reduce tanto la unión no específica como el tiempo de incubación.
La validación de las pruebas para detectar anticuerpos se aborda en el capítulo I.1.4 Principios de validación para
las pruebas de diagnóstico de las enfermedades infecciosas.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
7
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
4.
Inmunocromatografía
La inmunocromatografía proporciona un método apropiado para la detección de antígenos en varios minutos sin
un mecanismo especial (3, 84). La muestra se aplica sobre un extremo del filtro y se emplean las microperlas
(como el oro coloidal) conjugadas con anticuerpo. El anticuerpo se une al complejo antígeno-microperla, se
atrapa en el segundo anticuerpo que está en el filtro y se visualiza fácilmente en el lugar donde se fijó el segundo
anticuerpo.
4.
Proteómica
El proteoma es el conjunto completo de proteínas que se expresan en una célula, un tejido o un organismo y la
proteómica es el estudio de las proteínas, incluyendo su nivel de expresión, modificación post-traduccional e
interacción con otras proteínas, a gran escala. Puesto que no todas las proteínas se expresan a la vez y en todo
momento, pero son dependientes de factores fisiológicos y ambientales, la proteómica puede proporcionar una
visión global excelente de los procesos característicos de la enfermedad a nivel de proteínas. Debido a que la
aplicación de la proteómica en el desarrollo de nuevas drogas promete unas ganancias económicas enormes, las
compañías de todo el mundo han invertido rápidamente sus recursos en este nuevo campo de investigación (22).
Muchos métodos empleados en proteómica, como la electroforesis bidimensional en gel (2DGE) y la
espectrometría de masas (MS) están establecidos desde hace años. Sin embargo, los avances recientes en las
técnicas MS, junto con la secuenciación completa del genoma y el desarrollo de plataformas robóticas y
bioinformáticas potentes, han revolucionado la identificación de las proteínas. El principio general de la
proteómica es que las proteínas se separan, normalmente mediante 2DGE en geles de poliacrilamida, a
continuación las manchas de las proteínas se recortan, se digieren con tripsina y los péptidos resultantes se
analizan mediante MS. Las masas de estos péptidos son entonces comparadas con las masas predecibles de
péptidos procedentes de los análisis informatizados de las bases de datos del genoma, con lo que se consigue la
identificación del gen. También se puede utilizar la MS para deducir la secuencia de aminoácidos de los péptidos
y caracterizar las modificaciones post-traduccionales tales como la glicosilación o la fosforilación. La 2DGE
muestra algunas limitaciones, particularmente para la separación de proteínas hidrofóbicas, y actualmente se
consideran más adecuadas para algunas aplicaciones otras técnicas de separación basadas en la cromatografía
líquida. Sin embargo, la 2DGE es el método de elección para crear mapas cuantitativos de expresión génica y
permite que se puedan analizar muchos miles de proteínas en un corto periodo de tiempo.
Se pueden medir directamente alteraciones en el proteoma de los tejidos o fluidos corporales como el suero, la
orina o el líquido cerebro-espinal de modo que los cambios que sucedan en el desarrollo de la enfermedad se
pueden indicar con toda precisión. Este enfoque puede conseguir identificar moléculas que pueden ser diana de
terapias nuevas y, al mismo tiempo, es una herramienta muy poderosa para el diagnóstico precoz de
enfermedades. Las aplicaciones clínicas mejor establecidas de la proteómica se encuentran por ahora en la
identificación de marcadores para el diagnóstico precoz de casos de cáncer, como el de vejiga de la orina (127).
No obstante, también está en curso una investigación considerable en otras áreas tales como la de la
enfermedad cardiaca (68), la enfermedad de Alzheimer (27) y la diabetes insulina-dependiente (1).
La utilización de la proteómica para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas está al comienzo de su
desarrollo pero puede resultar ser de importancia notable. Por ejemplo, el diagnóstico definitivo de la enfermedad
crónica provocada por el virus de la hepatitis B (HBV) todavía se basa en la biopsia hepática, pero el análisis
proteómico de las muestras del suero muestra que la expresión de al menos siete proteínas séricas cambia
significativamente en los pacientes crónicos con el HBV (57). De manera similar, el diagnóstico diferencial ante
mórtem de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) se puede beneficiar de la proteómica ya que los datos
preliminares muestran que siete proteínas del líquido cerebro-espinal (CSF) se expresan de modo diferente entre
los pacientes con la CJD variante o esporádica (28).
Una aplicación de la proteómica de extremada utilidad para el diagnóstico de enfermedades infecciosas es la
identificación de nuevos antígenos de diagnóstico para estudios de detección en sueros procedentes de
individuos infectados y no infectados enfrentándolos a proteomas de agentes infecciosos sometidos a 2DGE e
inmunotransferencia. Llevando a cabo este tipo de estrategia con los sueros humanos, se han identificado nueve
nuevos antígenos con potencial aplicación inmunodiagnóstica en Helicobacter pylori (50), más de 80 antígenos
en Borrelia burgdorferi que potencialmente podrían diferenciar entre pacientes con síntomas tempranos y tardíos
de la enfermedad de Lyme (68) y siete antígenos de Toxoplasma gondii que quizás podrían diferenciar entre la
toxoplasmosis aguda y latente (68).
Dentro del campo veterinario, en la actualidad están en marcha proyectos de investigación basados en la
proteómica e indudablemente producirán nuevas herramientas de diagnóstico de utilidad en el futuro. Se están
consiguiendo mapas proteómicos de una variedad de patógenos de interés veterinario entre los que hay
bacterias como Brucella melitensis (92) y Streptococcus agalactiae (65), protozoos como Toxoplasma gondii (29),
Eimeria tenella (21) y Trypanosoma brucei (130) y nemátodos como Haemonchus contortus (179).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
C. DETECCIÓN DE ANTICUERPOS
1.
Enzimoinmunoensayo competitivo (C-ELISA)
El ELISA competitivo (C-ELISA) es un inmunoensayo que puede utilizarse para detectar o cuantificar los
anticuerpos o el antígeno, utilizando un método competitivo. El C-ELISA para la detección de anticuerpos
específicos ha reemplazado principalmente al ELISA indirecto para la detección a gran escala y la vigilancia
serológica. El C-ELISA ofrece ventajas significativas sobre el ensayo indirecto puesto que se pueden analizar
muestras de muchas especies sin necesidad de utilizar conjugados específicos de especie marcados con un
enzima para cada especie a probar. La purificación de muchos antígenos es extremadamente difícil o requiere
mucho tiempo. Si se utilizara un ensayo indirecto, se obtendrían valores elevados de fondo debido a uniones
inespecíficas. Sin embargo, se pueden emplear antígenos relativamente crudos en el C-ELISA siempre que el
“anticuerpo de detección” tenga la especificidad deseada. El principio del ensayo competitivo para la detección de
anticuerpos se basa en la competición entre el suero problema y el anticuerpo de detección. La unión específica
del anticuerpo de detección se detecta utilizando un conjugado anti-especie apropiado. La reducción obtenida del
color esperado se debe a la unión de los anticuerpos presentes en el suero problema, lo que impide la unión del
anticuerpo de detección.
El anticuerpo de detección puede ser policlonal o monoclonal dependiendo de la especificidad que se requiera.
Los MAb dirigidos contra epítopos muy conservados darán ensayos de reactividad amplia mientras que los
dirigidos contra epítopos muy específicos tendrán como resultado una prueba muy específica. Una de las
primeras referencias sobre la utilización del C-ELISA fue su empleo en la detección de los anticuerpos anti-virus
de la lengua azul (4). Se utilizó un MAb contra P7 un epítopo muy conservado del virus de la lengua azul (BTV) y
esto permitió detectar anticuerpos frente a los 24 serotipos existentes del BTV. El epitopo no lo comparte ningún
otro serogrupo de los Orbivirus estrechamente relacionados, por tanto, la prueba también es específica de BTV.
La especificidad del ensayo puede, de este modo, ser adaptada en función de la especificidad del anticuerpo de
detección. La sensibilidad del C-ELISA se mejora utilizando anticuerpos de detección conjugados con un enzima
(77).
El formato C-ELISA se ha utilizado con éxito para detectar en gran número de sueros de cerdo los anticuerpos de
la fiebre porcina clásica (177), detectar anticuerpos frente al virus de la fiebre catarral maligna en ovejas, ciervos
y bisontes infectados asintomáticos (77, 78) y anticuerpos frente a Babesia equi y B. caballi en caballos con
infección persistente (71, 72). Se ha utilizado ampliamente un ELISA competitivo para brucelosis, basado en el
lipopolisacárido liso inmunodominante de Brucella como una prueba de análisis para la brucelosis en bovinos
(98), caprinos y ovinos (96), porcinos (97) y mamíferos marinos (99). Más recientemente, se ha empleado el CELISA en fase sólida para la vigilancia serológica durante el brote de FA de 2001 en el Reino Unido (107). Este
ensayo ha facilitado el examen de unos 3 millones de sueros en menos de un año.
2.
Producción de antígenos mediante la tecnología del ADN recombinante
Los avances en genética y biología molecular de la década de 1970 iniciaron el desarrollo de la tecnología del
ADN recombinante. Desde entonces el impacto de esta tecnología es tal que juega un papel vital tanto en la
investigación científica como en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades. La tecnología del ADN
recombinante simplemente se refiere a la transferencia de un gen de un organismo a otro, literalmente, supone la
recombinación del ADN procedente de diferentes fuentes. Entre los objetivos de la tecnología del ADN
recombinante destacan la identificación, el aislamiento, la modificación y la re-expresión de genes en otros
hospedadores u organismos. Estas etapas permiten al personal científico y clínico la identificación de nuevos
genes y las proteínas que estos codifican, corregir defectos genéticos endógenos y producir grandes cantidades
de productos génicos específicos tales como hormonas, antígenos para usar en vacunas y otras proteínas
producidas por agentes biológicos de interés. De particular importancia es el grado de especificidad que se
alcanza en las pruebas de diagnóstico por la utilización de proteínas recombinantes. Un ejemplo es el empleo de
ESAT-6/CFO-10 (antígenos inmunogénicos secretados) presente en las micobacterias virulentas Mycobacterium
bovis and M. tuberculosis pero no en la avirulenta BCG ni en la mayoría de micobacterias ambientales, para el
diagnóstico de la tuberculosis en vacas y en el hombre (24, 161). Los péptidos solapados de los antígenos ESAT6 y CFP-10 de M. tuberculosis aumentan la especificidad cuando se utilizan en la prueba ELISPOT para la
detección del gamma interferón en el diagnóstico de la infección por M. tuberculosis (61). Presenta el potencial
de proporcionar un grado de especificidad en el diagnóstico no alcanzable con la proteína purificada derivada
(PPD), el extracto bacteriano que actualmente se utiliza.
Las proteínas nativas son quizás los antígenos ideales, proporcionando epítopos de secuencias específicas y
estructurales de superficie. Muchas pruebas de diagnóstico actuales necesitan antígenos de prueba que tienen
que ser producidos de forma continua a partir de cultivos celulares o recogiéndolos de animales infectados. Estas
preparaciones antigénicas son costosas y con frecuencia tienen un periodo corto de validez, siendo necesaria la
estandarización del antígeno en cada nuevo lote. En escasas ocasiones se dispone de proteínas naturales en
una forma completamente pura, y a menudo se desarrollan anticuerpos contra polipéptidos contaminantes que
pueden conducir a resultados positivos-falsos. La tecnología del ADN recombinante produce antígenos que
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9
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
ofrecen muchas ventajas sobre los antígenos aislamientos a partir de otras fuentes biológicas. Algunas de estas
ventajas son la alta pureza, la elevada actividad específica y puesto que la proteína se sintetiza en células
crecidas en el laboratorio modificadas genéticamente, cada preparación del producto proteico es idéntica a la
preparación previa, asegurándose la invariabilidad lote a lote. Cuando se utilizan antígenos recombinantes en
combinación con un formato C-ELISA, puede no ser necesaria la purificación del antígeno recombinante a partir
del lisado porque la especificidad del C-ELISA reside principalmente en el MAb utilizado. Un ejemplo de este
procedimiento es la clonación de los genes de la envuelta del lentivirus de la artritis/encefalitis caprina en un
vector de expresión vaccinia (80).
Los péptidos sintéticos también pueden utilizarse como antígenos valiosos para diagnósticos veterinarios de
laboratorio. Las pruebas de diagnóstico basadas en los péptidos se apoyan en la selección de fragmentos cortos
que contienen los epítopos antigénicos (lineales) más potentes que son reconocidos por anticuerpos específicos
inducidos por todas las proteínas víricas. En los últimos años, los péptidos sintéticos que imitan a los epítopos
específicos de las proteínas de agentes infecciosos se han utilizado en sistemas de diagnóstico de varias
enfermedades humanas y animales. Tanto las proteínas recombinantes como los péptidos sintéticos, utilizados
como antígenos, son útiles para las pruebas de diagnóstico acompañantes en DIVA, diferenciando los animales
infectados de los vacunados. Las vacunas marcadoras llevan al menos una proteína antigénica menos que la
correspondiente al tipo de virus de campo, que permite el rastreo serológico de las cepas de campo en individuos
vacunados (59).
A continuación se indica un resumen del procedimiento para la producción de un antígeno mediante la tecnología
del ADN recombinante. La identificación de un antígeno de significación científica o diagnóstica potencial se
consigue mediante el estudio de la respuesta de anticuerpos del hospedador frente a las proteínas del organismo
en cuestión. Los antígenos inmunodominantes, proteínas definidas del organismo contra las que el hospedador
responde con el título diagnóstico potencial mayor, son de interés particular ya que son los principales
estimuladores de la inmunidad celular y humoral contra la enfermedad concreta. Muchos estudios encaminados
al descubrimiento de antígenos tratan de identificar antígenos inmunodominantes, de relevancia biológica para
ser empleados en la generación de MAb y en el desarrollo de vacunas. Una vez que se ha identificado una
proteína de interés, se genera el gen que codifica la proteína utilizando en ARN mensajero (ARNm) del
organismo como molde para fabricar el ADNc. Este método de clonación del gen que codifica la proteína de
interés requiere un conocimiento previo acerca de la secuencia génica, ya sea directamente del organismo en
cuestión o a través de la utilización de secuencias génicas de especies estrechamente relacionadas con él. Un
método alternativo, cuando no se dispone de la secuencia génica, consiste en la generación de librerías
recombinantes procedentes del ADN genómico del organismo o del ADNc sintetizado a partir del ARNm. Se
pueden clonar fragmentos de las librerías recombinantes en un sistema de expresión, que puede ser procariótico
o eucariótico, y se puede examinar la librería génica para detectar la expresión de la proteína.
Existe una amplia variedad de sistemas de expresión. La proteína se puede expresar en bacterias, normalmente
E. coli (121), levaduras (26), células de insectos empleando baculovirus (147), o células eucariotas mediante la
infección con vectores víricos apropiados (143) o mediante transfección permanente. Las diferencias en la
glicosilación cuando se prepara en cultivos celulares de bacterias, insectos o mamíferos pueden modificar la
estructura de la proteína y su reactividad con el anticuerpo. Puede ser necesario extraer el antígeno de la célula o
puede ser secretado. Frecuentemente es necesaria la purificación aunque no siempre. Una tendencia al alza en
la producción de antígenos para la utilización en ensayos consiste en el desarrollo de antígenos peptídicos
sintéticos. Esto permite que los antígenos se prueben como reactivos de diagnóstico basados en la secuencia
génica, sin que sea necesaria la expresión de la proteína completa, lo que acorta el proceso. Un ejemplo es la
producción de antígenos peptídicos de dos antígenos inmunodominantes, de los que se ha publicado que son
candidatos prometedores a ser reactivos de diagnóstico para detectar la infección por M. bovis en vacas (172).
En los últimos años, el uso de plantas para un sistema de expresión de la proteína parece prometedor. Para la
expresión de antígenos candidatos en plantas, los virus de las plantas ofrecen, entre otras ventajas, la rapidez de
elaboración del producto, la flexibilidad y los altos niveles de expresión del gen (48).
Ya han sido determinadas las secuencias de genomas de cientos de bacterias y miles de virus. El gen de
antígeno puede clonarse fácilmente con la tecnología de la PCR, utilizando cebadores diseñados a partir de la
secuencia del nucleótido de especies estrechamente relacionadas (126). El gen también puede manifestarse y su
producto puede purificarse utilizando un péptido apéndice. Entonces puede determinarse la antigenicidad de los
productos del gen. El análisis sistemático del gen del antígeno in silico, a partir de los datos de la secuencia del
genoma, acelera el desarrollo de los kits de diagnóstico y las vacunas (159).
D. VACUNAS
1.
Vacunas bacterianas con delección génica
Durante la década pasada, la tecnología del ADN recombinante ha hecho posible la elaboración de vacunas más
seguras. Las razones para esta mejor protección no están todavía claras, pero una podría ser que las vacunas
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Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
vivas son capaces de expresar antígenos in vivo necesarios para la protección que las preparaciones de las
vacunas muertas no contienen. Otra razón podría ser que las vacunas vivas son capaces de estimular las células
presentadoras de antígeno (APC) de una manera en la que las preparaciones de vacunas muertas son
incapaces. Lo más probable es que se trate de un combinación de ambas, la expresión de nuevos antígenos y la
interacción con APCs. La generación de las vacunas bacterianas vivas atenuadas se basa principalmente en la
generación y la selección de mutantes mediante pases en serie en hospedadores animales alternos, el cultivo
prolongado in vitro, cambios en la temperatura de crecimiento o modificación química, que resultan en
atenuaciones indefinidas basadas en la acumulación de numerosas mutaciones genéticas. En algunos casos, por
razones desconocidas, estos mutantes revierten al fenotipo de campo y, por tanto, no se pueden utilizar como
vacunas (144). En 1981 Hosieth & Stocker (62), utilizando la tecnología del transposón, desarrollaron cepas de
Salmonella typhimurium con mutaciones genéticas definidas de auxotrofía para aminoácidos aromáticos (Aro)
que eran incapaces de sobrevivir en el hospedador inmunocompetente. Estas cepas pueden conferir protección
contra el desafío virulento en el modelo murino de salmonelosis y en varias especies domésticas, aunque por
razones desconocidas, no todos los mutantes son capaces de proporcionar protección en las especies
domésticas (141). En 1992, Jones et al. (67) desarrollaron un mutante de Salmonella viva atenuada empleando la
escisión genómica precisa de dos genes implicados en la ruta de los aminoácidos aromáticos, que tuvo como
resultado incluso una menor probabilidad de reversión de la cepa al fenotipo de campo. Este mutante demostró
ser una vacuna con efectos secundarios clínicos relativamente leves y capaz de conferir protección en vacas
contra el desafío virulento a la edad a la que el hospedador es más susceptible. Esta cepa de la vacuna también
se ha utilizado como vector de transmisión de otros antígenos foráneos, lo cual acerca a la realidad el ideal de
una vacuna de dosis única (170). El desarrollo en el campo de la biología molecular y un mayor conocimiento de
la interacción hospedador-patógeno permitirá el diseño racional de vacunas más seguras y eficaces con
marcadores que permitirán distinguir entre hospedadores vacunados e infectados. Aunque la mayoría de las
explicaciones descritas aquí se centran en Salmonella, se han aplicado tecnologías similares a otras bacterias
patógenas. Se ha utilizado la tecnología en la tuberculosis bovina; si el ganado está vacunado con BCG, el cóctel
de péptidos ESAT-6/CFO-10 detecta los animales infectados, no vacunados, con el ensayo de gamma IF.
2.
Vacunas marcadas y pruebas diagnósticas complementarias
En salud animal, se puede vacunar a los animales con objeto de prevenir la enfermedad o bien intentar eliminar
la infección a través de la aplicación estricta de medidas sanitarias tales como el sacrificio de los animales
infectados y evitando el contacto con otros animales. Para ciertas enfermedades de las que no existe vacuna
(p.ej. fiebre porcina africana) y particularmente para las infecciones zoonósicas (p.ej. infección de cerdos por el
virus Nipah), la única solución disponible es el sacrificio sistemático de los animales infectados. El diagnóstico de
la infección es de importancia extrema cualquiera que sean las medidas que se tomen para combatir la
enfermedad. El diagnóstico puede ser directo, a través de la detección e identificación del agente infeccioso
utilizando técnicas inmunológicas o moleculares, o indirecto, basado en la detección de anticuerpos específicos
contra el agente infeccioso sospechoso. Los últimos métodos tienen como desventaja principal el que se deba
esperar hasta que se sinteticen los anticuerpos por parte del animal después de la infección y generalmente no
permiten distinguir entre la respuesta inmune humoral resultado de una infección o de una vacunación.
Este problema se puede solventar adoptando nuevas estrategias en el desarrollo de las vacunas (105) utilizando
tecnologías moleculares que permiten la producción de vacunas marcadas asociadas con pruebas diagnósticas
complementarias. Actualmente existen dos tipos: las basadas en la detección de una respuesta serológica contra
una proteína cuyo gen delectivo en la cepa de la vacuna (empleada como vacuna replicante o como vacuna
inactivada derivada de tal cepa de vacuna vírica delectiva), o en la detección de la respuesta serológica frente a
proteínas víricas no estructurales (vacunas inactivadas purificadas). En el caso de las vacunas delectivas el gen
que codifica la proteína no esencial, la característica marcadora, está siempre unido con la prueba de detección
mientras que en el caso de vacunas de subunidades (p.ej. la proteína E2 del virus de la peste porcina clásica
expresada en baculovirus) otras proteínas víricas distintas pueden ser seleccionadas como marcadores de los
ensayos. Con fines de armonización, debería elegirse una proteína consenso para la prueba (p.ej. la proteína gE
del virus de la pseudorabia). En el primer tipo de vacunas marcadas, debería utilizarse siempre un marcador
negativo puesto que un marcador positivo, por ejemplo a través de la inserción de un gen que codifica una
proteína foránea, no es adecuado; este último tipo de vacuna sólo podría mostrar si el animal está vacunado pero
no indicaría si también se infectó con el virus de campo. La vacuna marcada que se utilice con la intención de
discriminar una respuesta serológica resultante de una vacunación de la de una infección tendría que estar
siempre asociada con una prueba de diagnóstico complementaria que se pueda emplear durante una campaña
profiláctica con el fin de eliminar el agente infeccioso. Las vacunas previas de uso veterinario se diseñaron
principalmente para prevenir los signos clínicos en los animales después de la infección sin tener demasiado en
cuenta el impacto epidemiológico de la vacunación en la excreción del virus de campo después de la infección y
en su posible diseminación o circulación. Si se utilizan vacunas marcadas con objeto de eliminar un virus se debe
tener claro el posible impacto en la epidemiología de la infección.
Puede haber problemas con este enfoque, por ejemplo si se inhibe la multiplicación del virus de campo hasta el
punto de que no se induzca la síntesis de anticuerpos específicos en todos los animales vacunados. Por tanto, la
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
11
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
mayoría de las vacunas marcadas disponibles sólo se pueden utilizar para la certificación de rebaños y no para
conseguir la de animales individuales.
a)
Vacunas marcadas con delección de un gen: los ejemplos de la pseudorabia y la rinotraqueítis
infecciosa bovina
La pseudorabia en cerdos y la rinotraqueítis infecciosa bovina son dos infecciones causadas por
herpesvirus que se vuelven latentes en el animal, incluso aunque ya esté vacunado (111, 115, 116). Se
dispuso de la primera vacuna marcada para prevenir la infección de cerdos por pseudorabia (165) después
de que Bartha desarrollara en Hungría (7) una cepa atenuada del virus que la causa, que presentaba una
delección espontánea en la glicoproteína gE. Más tarde se han desarrollado vacunas análogas para la
rinotraqueítis infecciosa bovina.
Como se menciona más arriba, el herpesvirus responsable de la rinotraqueítis infecciosa bovina permanece
latente después de la infección, haya sido o no vacunado el animal. No importa si la vacuna es del tipo
inactivado o atenuado, de cualquier manera el animal se convierte en portador latente después de la
infección con un virus de capo. Además, todas las cepas de vacuna atenuada establecen latencia después
de la vacunación, incluida las cepas delectivas en la gE. Se debería tener in mente que las vacunas
atenuadas producidas con cepas idénticas, delectivas o no, generalmente son más eficaces que las
equivalentes inactivadas (18, 69, 70).
En una zona en la que esté prohibida la vacunación, todos los animales sero-positivos en cuanto al virus de
la rinotraqueítis infecciosa bovina se deben considerar como potencialmente infectados y portadores
latentes del virus de campo. De manera similar, en una zona en la que se vacunen los animales con una
vacuna convencional (no delecctiva), sea atenuada o inactivada, es imposible distinguir entre vacas
vacunadas e infectadas de modo que si está preparado un programa de eliminación, también deben ser
eliminados del rebaño todos los animales sero-positivos.
Una solución es la utilización de una vacuna marcada o delectiva que permite la diferenciación del
anticuerpo producido por la vacuna frente al producido por la infección. La proteína delectiva de la cepa
vacunal debe tener las siguientes características:
1)
Ser una proteína estructural, para que sea capaz de producir vacunas inactivadas;
2)
No ser esencial con objeto de poder producir la vacuna;
3)
No ser un inmunógeno protector esencial con el fin de que sea todavía una vacuna eficaz;
4)
Inducir una respuesta humoral significativa y de larga duración si está presente para que se pueda
utilizar (cuando se deleccione) como marcador;
5)
Estar presente en todas las cepas del virus de campo;
6)
Inducir una respuesta inmune humoral o celular por un patógeno en los animales ya vacunados.
Si se emplea una vacuna marcada, siempre que un animal sea sero-positivo hacia la proteína delectiva, se
debería considerar infectado y ser eliminado. La proteína gD de herpesvirus, que es un inmunógeno
protector fundamental, no se puede suprimir pero en cambio puede ser utilizada para desarrollar vacunas de
subunidades. El problema principal que se encuentra con el empleo de las vacunas marcadas contra la
rinotraqueítis infecciosa bovina es su incapacidad para prevenir completamente la circulación del virus de
campo cuando se utiliza dentro del marco de un programa de eliminación.
No se dispone de vacunas que induzcan una inmunidad estéril para estas enfermedades. Como
consecuencia el calendario de vacunación debe ser más riguroso que uno convencional diseñado
meramente para impedir los signos clínicos en el rebaño. Se debe repetir la vacunación de acuerdo con un
programa estricto para reducir la posibilidad de excreción del virus de campo y debe, además, estar
asociada con medidas sanitarias completas (79). Dentro del marco de una campaña de eliminación vírica
coordinada, la vacunación debe prevenir la excreción del virus de campo de los animales sin experiencia
previa y evitar la re-excreción de los animales con infección latente.
En Holanda se ha investigado bajo condiciones de campo la eficacia de una vacunación repetida utilizando
una vacuna negativa gE inactivada que se administra por vía intramuscular. Este estudio ha demostrado la
incidencia significativamente reducida de seroconversión contra el virus de campo en el grupo vacunado al
compararlo con los animales de control inyectados con placebo. Además, la circulación del virus de campo,
aunque no se restringió completamente, no obstante fue reducida significativamente (18) y bajo algunas
circunstancias incluso se evitó (166).
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Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
b)
Vacunación contra la peste porcina clásica con vacunas de subunidades
En la Unión Europea se ha establecido un programa de eliminación de la peste porcina clásica.
Actualmente, está prohibida la vacunación que utiliza las vacunas convencionales y se encuentra en vigor
una política de sacrificio. Esta política está desafiada por la existencia de una relación antigénica fuerte con
otros pestivirus, tales como el virus responsable de la diarrea vírica bovina (DVB/MD), que impide el
diagnóstico serológico, por la circulación insidiosa de cepas hipovirulentas (14) y, por último pero no menos
importante, por la presencia de un reservorio silvestre en el jabalí (Sus scrofa) en Europa continental (5).
Las vacunas convencionales clásicas tuvieron una eficacia probada (123) e incluso evitaron la emergencia
de portadores asintomáticos cuando eran de potencia suficiente (15, 74). Las vacunas vivas atenuadas eran
más eficaces que sus equivalentes inactivadas a este respecto (31) y contribuyeron en gran medida a la
eliminación de la enfermedad. Su única desventaja era la creación de una población de animales seropositivos, lo que no es aceptable si se pone en marcha un plan de sacrificio.
Recientemente se han desarrollado vacunas de subunidades mediante la expresión de la proteína E2, un
inmunógeno fundamental del virus de la fiebre porcina clásica, ya sea en un sistema baculovirus (van Rijn,
1999 129 /id}) o en virus vaccinia o pseudorabia (E1) (132, 168). La vacuna constituida por la proteína E2
expresada en baculovirus permite distinguir los animales infectados de los vacunados cuando se utiliza con
pruebas diagnósticas complementarias fiables para detectar la presencia de anticuerpos específicos
dirigidos contra otros inmunógenos fundamentales del virus de la fiebre porcina clásica no presentes en la
vacuna de subunidades, tales como la proteína NS2, una proteína vírica conservada. Desafortunadamente,
las vacunas inactivadas no son lo suficientemente eficaces desde el punto de vista epidemiológico (37) si se
las compara con las vacunas convencionales anteriores (35, 163). Además, las pruebas de diagnóstico
complementarias disponibles en la actualidad no son del todo fiables y, por tanto, limitan el uso de estas
vacunas de subunidades en el campo.
c)
Vacunación contra la fiebre aftosa utilizando vacunas con un grado de purificación elevado
Desde 1991 en la Unión Europea se ha prohibido la vacunación preventiva. Esta prohibición concluyó
periodo de vacunación de 30 años y, por consiguiente, en la actualidad existen en Europa rebaños de
bovinos completamente susceptibles (149). Esta situación es particularmente nociva cuando la enfermedad
se reintroduce de manera accidental (39). El plan de contingencia que se ha desarrollado para ocuparse de
los brotes inesperados se basa principalmente en la información y preparación de los socios colaboradores
de la Unión Europea. Con vistas a superar los riesgos asociados con la susceptibilidad completa de los
ganados europeos, se han establecido bancos de vacunas del antígeno vírico altamente purificado y
concentrado (135) y existe la posibilidad de utilizarlas como vacunas marcadas en el caso de un brote de
emergencia (34).
Considerando que se utilizan vacunas muy purificadas, siempre que se encuentre un animal sero-positivo
frente a las proteínas no estructurales (NSP) codificadas por el virus utilizando una prueba de diagnóstico
ELISA (kit 33), es posible entonces que se deba a la infección por un virus de campo. La NSP se produce
durante la replicación del virus en el animal infectado y en el cultivo celular. La NSP se debe extraer del
antígeno del FMDV por purificación durante la producción de la vacuna y debe realizarse una prueba
apropiada de los antígenos para demostrar la ausencia de seroconversión a NSP en los animales
vacunados. Las NSP se sintetizan al mismo nivel que las proteínas estructurales durante la infección y por
eso producen una buena respuesta inmune humoral. Los animales infectados se convierten en
seropositivos a la NSP y los anticuerpos contra la NSP se detectan generalmente utilizando los kits de
diagnóstico ELISA o el EITB. Desafortunadamente, las pruebas de diagnóstico complementarias disponibles
en la actualidad sólo permiten la certificación de la ausencia de la fiebre aftosa a nivel de rebaño y no a nivel
de animal individual. Cuando ocurre la multiplicación del virus y no están presentes en los viriones
extracelulares utilizados para producir las vacunas purificadas e inactivadas.
d)
Gripe equina como un caso especial
Se ha aplicado un enfoque similar al utilizado para la FA, en un contexto diferente, para la gripe equina
(110). Cuando se llevan a cabo estudios acerca de la duración de la inmunidad protectora con las vacunas
inactivadas de la gripe equina, es útil tener una herramienta de diagnóstico que permita la exclusión de los
anticuerpos debidos a la infección intercurrente de los animales experimentales mediante un virus de campo
de la influenza. Se ha desarrollado una prueba de diagnóstico (13) basada en la respuesta serológica a una
proteína no estructural codificada por el virus.
3.
Vacunas con vectores víricos
Muchas especies víricas, entre ellas el adenovirus, el herpesvirus y el poxvirus, se han utilizado como sistemas
de transmisión (vectores) para antígenos foráneos. Se puede utilizar el virus simplemente como un vector, por
ejemplo el virus recombinante vaccinia-rabia, o como vector y vacuna contra la infección mediante el propio
vector silvestre. Un ejemplo de un virus que actúa como vector y como vacuna por sí mismo, es el capripoxvirus
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
recombinante que expresa un antígeno del virus de la peste de los pequeños rumiantes (11). Un virus vector
puede experimentar un ciclo completo de multiplicación que conduce a la producción de los virus de la progenie o
un ciclo de multiplicación abortivo sin producción de progenie, como sucede en el caso del vector avipoxvirus en
especies de mamíferos.
Los vectores más habitualmente utilizados son los poxvirus y, por tanto, este capítulo se centrará en la utilización
de los poxvirus como vectores vacunales (117).
Varias características hacen que los poxvirus recombinantes sean adecuados para ser vacunas:
i)
La estabilidad de la vacuna liofilizada (28), su coste reducido, y la facilidad de producir y administrar;
ii)
La vacuna se puede administrar por varias vías (46) e incluso en el caso del virus vaccinia se ha
demostrado que se puede administrar el virus per os (esta característica se ha utilizado para la vacunación
de la fauna salvaje) (113);
iii)
La capacidad de inducir tanto respuesta de anticuerpos como de linfocitos T citotóxicos contra el antígeno
foráneo de forma que se consigue una inmunización de larga duración después de una sola inoculación
(142, 143);
iv)
La flexibilidad de empaquetado del genoma, que permite que cantidades importantes de él se pierdan o
deleccionen y que se pueda insertar ADN foráneo en su lugar (al menos 25 kb), lo que hace posible la
creación de vacunas multivalentes (118, 119, 142, 143);
v)
El uso de poxvirus recombinantes como vacunas permite la discriminación entre los animales infectados de
forma natural y los vacunados ya que la vacuna recombinante exhibe un subconjunto definido de antígenos
de los patógenos correspondientes.
Dentro de cada género de la familia Poxviridae los miembros están relacionados antigénicamente (90). Esta
relación antigénica ha planteado una cuestión importante en relación con la utilización de vectores derivados de
poxvirus como vacunas vivas, ya que la inmunidad preexistente contra el vector podría reducir el éxito de una
vacunación siguiente llevada a cabo con un vector poxvirus homólogo (30, 73). Para solventar este problema, se
ha implementado la utilización de combinaciones diferentes de vectores y/o vías de inmunización (45, 125).
a)
Virus vaccinia como vector
El primer vaccinia recombinante para uso de campo es la vacuna recombinante vaccinia-rabia (VRG)
utilizada para la vacunación oral de zorros contra la rabia. Se desarrolló empleando la cepa Copenhagen y
una vez que se probó en varias especies diana potenciales bajo condiciones de laboratorio (20, 112, 155),
finalmente en 1987 se utilizó bajo condiciones de campo (114) y demostró ser segura y eficaz (20). Se ha
empleado a gran escala en diversos países europeos que, como consecuencia, se han liberado de la rabia
(19) al igual que en Norteamérica.
Se puede incrementar la inocuidad del virus vaccinia mediante delecciones génicas múltiples. Se ha
demostrado con la construcción de la cepa NYVAC del virus vaccinia (152). Se eligió la cepa Copenhagen
del virus vaccinia como sustrato de vacuna y basándose en la secuencia completa del ADN (49), el
conocimiento extenso de los genes relacionados con la virulencia y de los genes que determinan la
competencia de replicación en el rango de hospedadores, se perdió la información genética no deseada del
genoma vírico de una manera muy precisa. El virus resultante, denominado NYVAC, presenta 18 marcos
abiertos de lectura delectiva comparado con la cepa parental. NYVAC está muy atenuado como se ha
demostrado en muchos estudios con animales. La inoculación intracraneal del ratón lactante y del adulto
joven demostró un rango de dosis muy favorable comparado con la cepa parental y otras cepas vaccinia. Lo
más significativo es que no existe diseminación del virus en hospedadores inmunocomprometidos. NYVAC
tiene reducida de forma drástica la capacidad de replicación en una variedad de células de cultivo de tejido
humano y es incapaz de producir partículas infecciosas en el hombre. Varios ensayos en animales y en el
hombre han demostrado la inocuidad de los vectores derivados de la cepa NYVAC (108, 151, 176).
b)
Vectores avipoxvirus
Cuando se considera el desarrollo de vectores derivados de avipoxvirus para la producción de vacunas para
aves, se recomienda la utilización de cepas atenuadas con objeto de reducir el probable riesgo y las
consecuencias potenciales que surgen de la propagación ambiental a otras especies aviares. Se han
probado extensamente derivados atenuados del virus de la viruela aviar, como el TROVAC, y
canarypoxvirus, como el ALVAC, y se ha demostrado que son seguros en varias especies, entre ellas
animales inmunocompromentidos y voluntarios humanos. Estos virus se pueden emplear bajo condiciones
de seguridad de laboratorio de nivel 1, la categoría más baja para organismos recombinantes (109).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
A pesar del hecho de que su multiplicación se encuentra reducida a especies aviares, se ha demostrado
que las cepas atenuadas de avipoxvirus son vectores eficaces y extremadamente seguros para mamíferos.
La inoculación en células de mamífero de recombinantes basadas en avipoxvirus, tiene como resultado la
expresión del gen foráneo y la inoculación en especies de mamíferos induce inmunidad protectora sin que
se produzcan los virus de la progenie (153, 154). Esta observación demuestra que tienen una ventaja
significativa de seguridad para ser utilizada en el hombre y en los animales. Puesto que la inmunización se
puede conseguir en ausencia de una replicación productiva, se elimina el riesgo de diseminación del vector
entre los vacunados y, por tanto, la propagación del vector por contacto a individuos no vacunados o al
ambiente en general. Además, el uso de este vector en especies que no son reservorio de avipoxvirus hace
que la probabilidad de recombinación in vivo sea nula. Adicionalmente, estos vectores se pueden utilizar
para vacunar individuos con inmunidad preexistente hacia el virus vaccinia.
En la pasada década, se ha producido una cantidad abundante de virus recombinantes empleando la cepa
canarypoxvirus atenuada ALVAC como cepa parental. Un número importante de ensayos, tanto en
humanos como en animales, ha demostrado la eficacia protectora y la inocuidad de las vacunas utilizando
este vector.
4.
Vacunas de ADN
La vacunación con ADN consiste en la introducción directa en las células del hospedador de un plásmido de ADN
bacteriano que expresa una proteína antigénica bajo el control de un promotor de la célula eucariótica (129).
Como consecuencia de esto, se expresa el antígeno foráneo dentro de la célula hospedadora y puede estimular
la inducción de respuestas humoral e inmune mediada por células. Este enfoque de la vacunación ha sido
efectivo contra una variedad amplia de virus, bacterias y parásitos y no sólo tiene muchos de los beneficios de las
vacunas vivas, sino que también tiene varias ventajas frente a estrategias más convencionales de vacunación.
Por ejemplo, las vacunas de ADN que codifican genes foráneos son baratas y fáciles de producir; obvian la
necesidad de complejos con organismos portadores; están ausentes los riesgos asociados con vacunas vivas; y
se impide el impacto de la inmunidad preexistente hacia el organismo o vector en la eficacia de la vacuna. Sin
embargo, una desventaja de la vacunación con ADN es que, como el plásmido persiste durante mucho tiempo,
existe la posibilidad de una integración cromosómica teniendo como resultado la transformación celular.
La respuesta inmune de las vacunas de ADN se puede mejorar adicionalmente mediante la inoculación
simultánea de inmunoestimuladores, tales como las secuencias motivo CpG (122), plásmidos que expresen
citoquinas (178), plásmidos que expresen moléculas co-estimuladoras (85), o incluso adyuvantes convencionales
(167). También se puede mejorar la inmunogenicidad utilizando como inductor primero una vacuna de ADN
plasmídico que exprese una proteína inmunogénica y posteriormente el refuerzo siguiente con la proteína o con
un vector vírico recombinante que exprese la proteína, estrategia de combinación llamada “inducciónpotenciación” (prime-boost) (171).
Actualmente se están desarrollando diversas vacunas de ADN para uso veterinario en vacas, cerdos y aves de
corral (100, 106, 167). El ADN innovador del Oeste del Nilo es una nueva vacuna para caballos que ayuda a la
prevención de la viremia causada por el virus potencialmente mortal del Oeste del Nilo; esta vacuna representa
un gran hito en la tecnología y la ciencia del ADN. La administración del ADN se realiza por vía intramuscular,
intradérmica, o intranasal; la administración intradérmica está mediada por partículas empleándose una “pistola
de genes”, en la que el ADN recubre microesferas de oro (82), o se puede efectuar utilizando bacterias
intracelulares atenuadas, tales como Shigella flexneri o Salmonella typhimurium (38). Las vacunas bacterianas
atenuadas vivas permiten la vacunación a través de las superficies mucosas y apuntar de forma específica al
antígeno presentando células localizadas en los sitios inductivos del sistema inmune. Mientras este último
enfoque tiene varias ventajas, existen varias cuestiones de seguridad que se necesitan tratar antes de aceptar
este método de administración. Deberían tenerse presentes las desventajas de la vacunación de ADN: estas
incluyen la posibilidad de una reintegración cromosómica con la consiguiente transformación celular ya que el
plásmido persiste en el hospedador durante un largo tiempo, aunque este riesgo es bajo.
Otra estrategia de vacunación con ADN se basa en la utilización de un vector de ADN que consiste en el ADNc
del virus recombinante Semliki Forest (SFV) bajo el control de un promotor eucariótico y que expresa un gen
foráneo (9). A diferencia de los vectores de ADN convencionales, el promotor no controla directamente la
expresión del antígeno foráneo, sino que dirige la síntesis de un trascrito de ARN replicón del SFV recombinante.
La traducción de esta molécula de ARN produce un complejo replicasa del SFV que permite la replicación del
ARN en el citoplasma celular y tiene como resultado la producción a nivel elevado del ARNm que codifica el
antígeno foráneo. Puesto que la expresión mediada por el vector SFV es transitoria y lítica, existe menos riesgo
de posible integración cromosómica.
Las aplicaciones de la tecnología de cromosomas bacterianos artificiales (BAC) ofrece posibilidades para la
manipulación de grandes genomas de virus de ADN, tales como herpesvirus (2, 23). El uso de clones BAC de
herpesvirus no sólo es una poderosa herramienta para el estudio de las funciones y la patogénesis de los genes
víricos (173), sino que también tiene un gran potencial para el desarrollo de la vacuna herpesviral (94). Los
estudios experimentales en los que se utilizan clones BAC como vacunas para las infecciones por herpesvirus
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
han resultado prometedores (120, 150, 157). Esta tecnología para la generación de vacunas nuevas de
herpesvirus tendrá un gran impacto y aplicación en la medicina veterinaria.
5.
Otros avances en la tecnología de las vacunas
Las vacunas de subunidades, que contienen componentes proteicos o glicoproteicos purificados de un patógeno
que se han identificado que portan epítopos críticos implicados en la inducción de una respuesta inmune
protectora (6) presentan distintas ventajas en cuanto a la inocuidad y los avances recientes en su producción
empleando la tecnología del ADN recombinante pueden facilitar su utilización más amplia (36). También se han
diseñado vacunas peptídicas sintéticas (87), sin embargo hasta el momento no han demostrado ser muy
efectivas en la inducción de protección frente a enfermedades infecciosas. Pueden existir muchas razones por
las que los péptidos sintéticos no puedan inducir inmunidad protectora. Por ejemplo, incluso los llamados
péptidos lineales muestran un grado de flexibilidad conformacional de modo que adoptan una estructura diferente
de aquella de la molécula parental y, por tanto, inducen anticuerpos de avidez baja frente al patógeno en
cuestión. Una desventaja potencial del uso de péptidos que representan sitios antigénicos únicos para estimular
una respuesta de anticuerpos protectora, es la posibilidad de seleccionar mutaciones antigénicas en el patógeno.
Se han desarrollado varias estrategias para inducir respuestas de los linfocitos T citotóxicos (CTL) empleando
péptidos, tal como acoplar epítopos CTL a toxinas que son capaces de invadir células eucarióticas o construir
partículas tipo virus que porten epitopos CTL foráneos (137, 140). Sin embargo, la utilidad de este enfoque en
poblaciones híbridas se encuentra limitada por el polimorfismo de las moléculas del complejo principal de
histocompatibilidad. A partir de partículas producidas procedentes del gen TYA del retrotransposón Ty de
levaduras se han preparado otras vacunas con partículas tipo virus que implican proteínas de autoensamblaje
que se pueden utilizar para transportar antígenos foráneos (47). Una vacuna compuesta por partículas tipo virus
vacías producidas mediante la expresión de las cuatro proteínas estructurales principales del virus de la lengua
azul en baculovirus, ha demostrado que protege contra el desafío con el virus de la lengua azul (131).
Otro enfoque interesante consiste en el desarrollo de “vacunas comestibles”. Se pueden diseñar plantas que
expresan una cantidad de proteínas foráneas y pueden expresar transgenes múltiples en un momento dado
(148). La administración oral de las vacunas de subunidades expresadas en plantas sería de particular interés
para proteger contra los patógenos intestinales. Una desventaja sería que los antígenos administrados por vía
oral fueran susceptibles a degradación proteolítica. Además, la administración oral de los antígenos tiende a
producir tolerancia en vez de inmunidad activa. Sin embargo, la tolerancia se puede solventar mediante la
expresión de una proteína de fusión compuesta por el antígeno con la subunidad B de la enterotoxina termolábil
(LT-B) de E. coli (56).
La clonación del genoma vírico completo ha sido posible por la genética inversa, especialmente la del virus con
ANR de polaridad negativa. Mediante la genética inversa puede clarificarse la función de varias NSP, así como la
de la función oculta de las proteínas de virión. De esta manera se facilita la construcción del virus ARN por
tecnología recombinante. Esta también permite la identificación de la estrategia de escape utilizada por el virus
para evitar los mecanismos de defensa del hospedador, como el interferón (51, 164). La genética inversa también
proporciona un enfoque novedoso para la atenuación de los virus mediante la supresión de los anti-IFN o de las
funciones de las citoquinas de los virus (195). La genética inversa se puede aplicar a los virus ARN que tienen
una estructura genómica relativamente simple, como los virus de la gripe aviar. Se ha observado que la
presencia de residuos de aminoácidos en el sitio de escisión del gen de la hemoaglutinina ayuda al virus de la
gripe aviar a replicarse dentro del animal. Por el contrario, los virus de la gripe aviar altamente patógena, que
tienen este tipo de estructura genética, pueden atenuarse removiendo de ese sitio el residuo de aminoácido
básico (81, 95).
REFERENCIAS
1.
AANSTOOT H.J., KANG S.M., KIM J., LINDSAY L.A., ROLL U., KNIP M., ATKINSON M., MOSE-LARSEN P., FEY S.,
LUDVIGSSON J., ET AL. (1996). Identification and characterization of glima 38, a glycosylated islet cell
membrane antigen, which together with gad65 and ia2 marks the early phases of autoimmune response in
type 1 diabetes. J. Clin. Invest., 97, 2772–2783.
2.
ADLER H., MESSERLE M. & KOSZINOWSKI U.H. (2003). Cloning of herpesviral genomes as bacterial artificial
chromosomes. Rev. Med. Virol., 13, 111–121.
3.
AL-YOUSIF Y., ANDERSON J., CHARD-BERGSTROM C. & KAPIL S. (2002). Development, evaluation, and
application of lateral-flow immunoassay (immunochromatography) for detection of rotavirus in bovine fecal
samples. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 9, 723–725.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
16
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
4.
ANDERSON J. (1984). Use of monoclonal antibody in a blocking ELISA to detect group specific antibodies to
bluetongue virus. J. Immunol. Methods, 74, 139–149.
5.
AUBERT M., PICARD M., FOUQUET E., CONDÉ J., CRUCIÈRE C., FERRY R., ALBINA E., BARRAT J. & VEDEAU F.
(1994). La peste porcine classique du sanglier en europe. Ann. Méd. Vét., 138, 239–247.
6.
BABIUK l.A. (1997). Subunit vaccines. In: Veterinary Vaccinology, Pastoret P.-P., Blancou J., Vannier P. &
Verschueren C., eds. Elsevier Science, Amsterdam, the Netherlands, 262–264.
7.
BARTHA A. (1961). Experiments to reduce the virulence of aujeszky’s virus. Magy. Allartov. Lapja., 16, 42–45.
8.
BEEKES M., BALDAUF E., CASENS S., DIRINGER H., KEYES P., SCOTT A.C., WELLS G.A.H., BROWN P., GIBBS C.J.
JR & GAJDUSEK D.C. (1995). Western blot mapping of disease-specific amyloid in various animal species and
humans with transmissible spongiform encephalopathies using a high-yield purification method. J. Gen.
Virol., 76, 2567–2576.
9.
BERGLUND P., SMERDOU C., FLEETON M.N., TUBULEKAS I. & LILJESTROM P. (1998). Enhancing immune
responses using suicidal DNA vaccines. Nature Biotechnology, 16, 562–565.
10. BERGMANN I.E., DE MELLO P.A., NEITZERT E. & GOMEZ I. (1993). Diagnosis of persistent aphthovirus infection
and its differentiation from vaccination response in cattle by use of the enzyme-linked immunoelectrotransfer
blot analysis with bio-engineered non-structural viral antigens. Am. J. Vet. Res., 54, 825–832.
11. BERHE G., MINET C., LE GOFF C., BARRETT T., NGANGNOU A., GRILLET C., LIBEAU G., FLEMING M., BLACK D.N. &
DIALLO A. (2003). Development of a dual recombinant vaccine to protect small ruminants against peste-despetits-ruminants virus and capripoxvirus infections. J. Virol., 77, 1571–1577.
12. BIFFIGER K., ZWALD D., KAUFMANN L., BRINER A., NAYKI I., PURRO M., BOTTCHER S., STRUCKMEYER T., SCHALLER
O., MEYER R., FATZER R., ZURBRIGGEN A., STACK M., MOSER M., OESCH B. & KUBLER E. (2002).Validation of a
luminescence immunoassay for the detection of PrP(Sc) in brain homogenate. J. Virol. Methods, 101, 79–84.
13. BIRCH-MACHIN I., ROWAN A., PICK J., MUMFORD J.A. & BINNS M.M. (1997). Expression of the non structural
protein NS1 of equine influenza a virus: detection of anti-NS1 antibody in post infection equine sera. J. Virol.
Methods, 65, 255–263.
14. BIRONT P., LEUNEN J., DEPIERREUX R., VANDEVELDE A., PASTORET P.P. & DEWAELE A. (1983). La peste porcine
classique : diagnostic, transmission et prophylaxie. Ann. Méd. Vét., 127, 547–563.
15. BIRONT P., LEUNEN J. & VANDEPUTTE J. (1987). Inhibition of virus replication in the tonsils of pigs previously
vaccinated with a Chinese strain vaccine and challenged oronasally with a virulent strain of classical swine
fever virus. Vet. Microbiol., 14, 105–113.
16. BONNIN A., FOURMAUX M.N., DUBREMETZ J.F., NELSON R.G., GOBET P., HARLY G., BUISSON M., PUYGAUTHIERTOUBAS D., GABRIEL-POSPISIL G., NACIRI M. & CAMERLYNCK P. (1996). Genotyping human and bovine isolates
of Cryptosporidium parvum by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis
of a repetitive DNA sequence. FEMS Microbiol. Lett., 137, 207–211.
17. BOONHAM N., WALSH K., SMITH P., MADAGAN K., GRAHAM I & PARKER I. (2003). Detection of potato viruses
using microarray technology: towards a generic method for plant viral disease diagnosis. J. Virol. Methods,
108, 181–187.
18. BOSCH J.C., KAASHOEK M.J., KROESE A.H. & VAN OIRSCHOT J.T. (1996). An attenuated bovine herpesvirus 1
marker vaccine induces a better protection than two inactivated marker vaccines. Vet. Microbiol., 52, 223–
234.
19. BROCHIER B., DECHAMPS P., COSTY F., HALLET L., LEURIS J., VILLERS M., PEHARPRE D., MOSSELMANS F., BEIER
R., LECOMTE L., MULLIER P., ROLAND H., BAUDUIN B., KERVYN T., RENDERS C., ESCUTENNAIRE S. & PASTORET
P.P. (2001). Elimination de la rage en belgique par la vaccination du renard roux (Vulpes vulpes). Ann. Méd.
Vét., 145, 293–305.
20. BROCHIER B., KIENY M.P., COSTY F., COPPENS P., BAUDUIN B., LECOCQ J.P., LANGUET B., CHAPPUIS G.,
DESMETTRE P., AFIADEMANYO K., LIBOIS R. & PASTORET P.P. (1991). Large-scale eradication of rabies with a
recombinant vaccinia-rabies virus. Nature, 354, 520–522.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
17
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
21. BROMLEY E., LEEDS N., CLARK J., MCGREGOR E., WARD M., DUNN M.J. & TOMLEY F. (2003). Defining the protein
repertoire of microneme secretory organelles in the apicomplexan parasite Eimeria tenella. Proteomics, 3,
1553–1561.
22. BROWER V. (2001). Proteomics: biology in the post-genomic era. EMBO Reports, 2, 558–560.
23. BRUNE W., MESSERLE M. & KOSZINOWSKI U.H (2000). Forward with BACs: new tools for herpesvirus genomics.
Trends Genet., 16, 254–259.
24. BUDDLE B.M., PARLANE N.A., KEEN D.L., ALDWELL F.E., POLLOCK J.M., LIGHTBODY K. & ANDERSEN P. (1999).
Differentiation between Mycobacterium bovis BCG-vaccinated and M. bovis-infected cattle by using
recombinant mycobacterial antigens. Clin Diagn. Lab. Immunol., 6, 1–5.
25. BURKHARDT H.J. (2000). Standardisation and quality control of PCR analyses. Clin. Chem. Lab. Med., 38, 87–
91.
26. CARTER B.L.A., IRANI M. & MACKAY V.L. (1987). Expression and secretion of foreign genes in yeast. In: DNA
Cloning, Volume iii. Glover D.M., ed. Oxford University Press, Oxford, UK, 141–162.
27. CHOE L.H., DUTT M.J., RELKIN N. & LEE K.H. (2002). Studies of potential cerebrospinal fluid molecular markers
for Alzheimer’s disease. Electrophoresis, 23, 2257–2251.
28. CHOE L.H., GREEN A., KNIGHT R.S., THOMPSON E.J. & LEE K.H. (2002). Apolipoprotein E and other
cerebrospinal fluid proteins differentiate ante mortem variant Creutzfeldt-Jakob disease from ante mortem
sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Electrophoresis, 23, 2242–2246.
29. COHEN A.M., RUMPEL K., COOMBS G.H. & WASTLING J.M. (2002). Characterisation of global protein expression
by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry: proteomics of Toxoplasma gondii. Int. J.
Parasitol., 32, 39–51.
30. COONEY E.L., MCELRATH M.J., COREY., HU S.L., COLLIER A.C., ARDITTI D., HOFFMAN M., COOMBS R.W., SMITH
G.E. & GREENBERG P.D. (1993). Enhanced immunity to human immunodeficiency virus (HIV) envelope
elicited by a combined vaccine regimen consisting of priming with a vaccinia recombinant expressing HIV
envelope and boosting with gp 160 protein. Proc. Natl Acad. Sci., USA, 90, 1882–1886.
31. CORTHIER G., GALICHER C. & GELFI J. (1975). Peste porcine : étude comparée du pouvoir immunogène des
vaccins à virus vivant et à virus inactivé par la cinétique des anticorps neutralisants dans le sérum. Ann.
Rech. Vét., 6, 93–101.
32. DASSANAYAKE R.S. & SAMARANAYAKE L.P. (2003). Amplification-based nucleic acid scanning techniques to
assess genetic polymorphism in Candida. Crit. Rev. Microbiol., 29, 1–24.
33. DE DIEGO M., BROCCHI E., MACKAY D. & DE SIMONE F. (1997). The non-structural polyprotein 3 ABC of footand-mouth disease virus as a diagnostic antigen ELISA to differentiate infected from vaccinated cattle. Arch.
Virol., 142, 2021–2033.
34. DECLERCQ C. (2002). La vaccination comme outil de lutte contre la fièvre aphteuse. Ann. Méd. Vét., 146,
155–160.
35. DEPNER K.R., BOUMA A., KOENEN F., KLINKENBERG D., LANGE E., DE SMIT H. & VANDERHALLEN H. (2001).
Classical swine fever (CSF) marker vaccine. Trial ii. Challenge study in pregnant sows. Vet. Microbiol., 83,
107–120.
36. DESMETTRE P. (1999). Diagnosis and prevention of equine infectious diseases: present states, potential and
challenges for the future. Adv. Vet. Med., 41, 359–377.
37. DEWULF J., LAEVENS H., KOENEN F., MINTIENS K. & DE KRUIF A. (2001). An E2 sub-unit marker vaccine does
not prevent horizontal or vertical transmission of classical swine fever virus. Vaccine, 20, 86–91.
39. DONALDSON A.J. & DOEL T.R. (1994). La fièvre aphteuse : le risque pour la grande-bretagne après 1992. Ann.
Méd. Vét., 138, 283–293.
40. EHLERS B., ULRICH S. & GOLTZ M. (1999). Detection of two novel porcine herpesviruses with high similarity to
gammaherpesviruses. J. Gen. Virol., 80, 971–978.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
18
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
41. ELNIFRO E.M., ASHSHI A.M., COOPER R.J. & KLAPPER P.E. (2000). Multiplex PCR: optimization and application
in diagnostic virology. Clin. Microbiol. Rev., 13, 559–570.
42. EUROPERAN COMMISION (2003). Opinion of the Scientific Steering Committee on the Field Trial Evaluation of
Two New Rapid BSE Post Mortem Tests; results achieved using the LIA Test (Prionics) and the aCDI Test
(InPro) in the field trial. European Commission, Health & Consumer Protection Directorate-General,
Scientific Steering Committee, Brussels Belgium. Available at:
http ://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/ssc/out316_en.pdf
43. EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY (EFSA) (2003). Scientific Report on the Evaluation of Rapid post
mortem TSE Tests intended for Small Ruminants. EFSA, Parma, Italy. Available at:
http://www.efsa.eu.int/science/tse_assessments/bse_tse/1157_en.html
44. EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY (EFSA) (2004). Scientific Report on the Evaluation of Seven New Rapid
Post Mortem BSE Tests. EFSA, Parma, Italy. Available at:
http://www.efsa.eu.int/science/tse_assessments/bse_tse/694_en.html
45. FLEXNER C., MURPHY B.R., ROONEY J.F., WOHLENBERG C., YUFEROV V., NOTKINS A.L. & MOSS B. (1988).
Successful vaccination with a polyvalent live vector despite existing immunity to an expressed antigen.
Nature, 335, 259–262.
46. GHERARDI M.M. & ESTEBAN M. (1999). Mucosal and systemic immune responses induced after oral delivery of
vaccinia virus recombinants. Vaccine, 17, 1074–1083.
47. GILBERT S.C. (2001). Virus-like particles as vaccine adjuvants. Molecul. Biotechnol., 19, 169–177.
48. GLEBA Y., KLIMYUK V. & MARILLONNET S. (2007). Viral vectors for the expression of proteins in plants. Curr.
Opin. Biotechnol. 18:134-141..
49. GOEBEL S.J., JOHNSON G.P., PERKUS M.E., DAVIS S.W., WINSLOW J.P. & PAOLETTI E. (1990). The complete
DNA sequence of vaccinia virus. Virology, 179, 247–266.
50. GOEBEL U.B., VOGT K., ROZNOWSKI A.B., WIEDENMANN B.J., MEYER T.F., AEIBISCHER T. & JUNGBLUT P.R.
(2002). Immunoproteomics of Helicobacter pylori infection and relation to gastric disease. Proteomics, 2,
313–324.
51. GOODBOURN S., DIDCOCK L. & RANDALL R.E. (2000). Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral
responses and virus countermeasures. J. Gen. Virol., 81, 2341–2364.
52. GREISEN K., LOEFFELHOLZ M., PUROHIT A., LEONG D. (1994). PCR primers and probes for the 16S rRNA gene
of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J. Clin. Microbiol., 32,
335–351.
53. GRIGG M.E. & BOOTHROYD J.C. (2001). Rapid identification of virulent type I strains of the protozoan pathogen
Toxoplasma gondii by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis at the B1 gene. J. Clin.
Microbiol., 39, 398–400.
54. GZYL A., AUGUSTYNOWICZ E., DZIERZANOWSKA D., ROZYNEK E., DURA W., CELINSKA-CEDRO D. & BERG D.E.
(1999). Genotypes of Helicobacter pylori in polish population. Acta Microbiol. Pol., 48, 261–275.
55. HAINES D.M. & CLARK E.G. (1991). Enzyme immunohistochemical staining of formalin-fixed tissues for
diagnosis in veterinary pathology. Can. Vet. J., 32, 295–302.
56. HAQ T.A., MASON H.S., CLEMENTS J.D. & ARNTZEN C.J. (1995). Oral immunization with a recombinant bacterial
antigen produced in transgenic plants. Science, 268, 714–716.
57. HE Q.Y., LAU G.K., ZHOU Y., YUEN S.T., LIN M.C., KUNG H.F. & CHIU J.F. (2003). Serum biomarkers of hepatitis
B virus infected liver inflammation: A proteomic study. Proteomics, 3, 666–674.
58. HEIM A., EBNET C., HARSTE G. & PRING-AKERBLOM P. (2003). Rapid and quantitative detection of human
adenovirus DNA by real-time PCR. J. Med. Virol., 70, 228–239.
59. HENDERSON L.M. (2005). Overview of marker vaccine and differential diagnostic test technology. Biologicals,
33, 203-209.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
19
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
60. HIBLER C.P., WILSON K.L., SPRAKER T.R., MILLER M.W., ZINK R.R., DEBUSE L.L., ANDERSEN E., SCHWEITZER D.,
KENNEDY J.A., BAETEN L.A., SMELTZER J.F., SALMAN M.D. & POWERS B.E. (2003). Field validation and
assessment of an enzyme-linked immunosorbent assay for detecting chronic wasting disease in mule deer
(Odocoileus hemionus), white-tailed deer (Odocoileus virginianus), and Rocky Mountain elk (Cervus elaphus
nelsoni). J. Vet. Diagn. Invest., 15, 311–319.
61. HILL P.C., JACKSON-SILLAH D., FOX A., FRANKEN K. L., LUGOS M.D., JEFFRIES D.J., DONKOR S.A., HAMMOND A.S.,
ADEGBOLA R.A., OTTENHOFF T.H., KLEIN M.R. & BROOKES R.H. (2005). ESAT-6/CFP-10 fusion protein and
peptides for optimal diagnosis of mycobacterium tuberculosis infection by ex vivo enzyme-linked
immunospot assay in the Gambia. J. Clin. Microbiol. 43, 2070-2074.
62. HOISETH S.K. & STOCKER B.A. (1981). Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and
effective as live vaccines. Nature, 291, 238–239.
63. HORIMOTO T. & KAWAOKA Y. (1995). Direct reverse transcriptase PCR to determine virulence potential of
influenza a virus in birds. J. Clin. Microbiol., 33, 748–751.
64. HORMAECHE C.E., KHAN C.M.A., MASTROENI P., VILLARREAL B., DOUGAN G., ROBERTS M. & CHATFIELD S.N.
(1995). Salmonella vaccines: mechanisms of immunity and their use as carriers of recombinant antigens. In:
Molecular and Clinical Aspects of Bacterial Vaccine Development, Ala’Aldeen D.A.A. & Hormaeche C.E.,
eds. John Wiley and Sons Ltd, Guildford, UK, 119–153.
65. HUGHES M.J., MOORE J.C., LANE J.D., WILSON R., PRIBUL P.K., YOUNES Z.N., DOBSON R.J., EVEREST P., REASON
A.J., REDFERN J.M., GREER F.M., PAXTON T., PANICO M., MORRIS H.R., FELDMAN R.G. & SANTANGELO J.D.
(2002). Identification of major outer surface proteins of Streptococus agalactiae. Infect. Immun., 70, 1254–
1259.
66. JAGER C., WILLEMS H., THIELE D. & BALJER G. (1998). Molecular characterization of Coxiella burnetii isolates.
Epidemiol Infect., 120, 157–164.
67. JONES P.W., DOUGAN G., HAYWARD C., MACKENSIE N., COLLINS P. & CHATFIELD S.N. (1991). Oral vaccination of
calves against experimental salmonellosis using a double aro mutant of Salmonella typhimurium. Vaccine, 9,
29–34.
68. JUNGBLUT P.E., SIMNY-ARNDT U., ZEINDL-EBERHART E., STULIK J., KOUPILOVA K., PLEISSNER K.P., OTTO A.,
MULLER E.C., SOKOLOWSKA-KOHLER W., GRABHER G. & STOFFLER G. (1999). Proteomics in human disease:
cancer, heart and infectious diseases. Electrophoresis, 20, 2100–2110.
69. KAASHOEK M.J., MOERMAN A., MADIC J., RIJSEWIJK F.A., QUAK J., GIELKENS A.L. & VAN OIRSCHOT J.T. (1994). A
conventionally attenuated glycoprotein E-negative strain of bovine herpesvirus type 1 is an efficacious and
safe vaccine. Vaccine, 12, 439–444.
70. KAASHOEK M.J., MOERMAN A., MADIC J., WEERDMEESTER K., MARIS-VELDHUIS M., RIJSEWIJK F.A. & VAN
OIRSCHOT J.T. (1995). An inactivated vaccine based on a glycoprotein E-negative strain of bovine
herpesvirus 1 induces protective immunity and allows serological differentiation. Vaccine, 13, 342–346.
71. KAPPMEYER L.S., PERRYMAN L.E., HINES S.A., BASZLER T.V., KATZ J.B., HENNAGER S.G. & KNOWLES D.P.
(1999). Detection of equine antibodies to Babesia caballi by recombinant B. Caballi rhoptry-associated
protein 1 in a competitive inhibition enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol., 37, 2285–2290.
72. KNOWLES D.P., KAPPMEYER L.S., STILLER D., HENNAGER S.G. & PERRYMAN L.E. (1992). Antibody to a
recombinant merozoite protein epitope identifies horses infected with Babesia equi. J. Clin. Microbiol., 30,
3122–3126.
73. KUNDIG T.M., KALBERER C.P., HENGARTNER H. & ZINKERNAGEL R.M. (1993). Vaccination with two different
vaccinia recombinant viruses: long-term inhibition of secondary vaccination. Vaccine, 11, 1154–1158.
74. LEUNEN J. & STROBBE R. (1977). Capacity of attenuated swine fever vaccines to prevent virus carriers in the
vaccinated pigs, after contact with field virus. Arch. Exp. Vet. Med., 31, 533–536.
75. LEWIN S., SCHONIAN G., EL TAI N., OSKAM L., BASTIEN P. & PRESBER W. (2002). Strain typing in Leishmania
donovani by using sequence-confirmed amplified region analysis. Int. J. Parasitol., 32, 1267–1276.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
20
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
76. LI H., DYER N., KELLER J. & CRAWFORD T.B. (2000). Newly recognized herpesvirus causing malignant
catarrhal fever in white-tailed deer (Odocoileus virginianus). J. Clin. Microbiol., 38, 1313–1318.
77. LI H., MCGUIRE T.C., MULLER-DOBLIES U.U. & CRAWFORD T.B. (2001). A simpler, more sensitive competitive
inhibition ELISA for detection of antibody to malignant catarrhal fever viruses. J. Vet. Diagn. Invest., 13, 361–
364.
78. LI H., SHEN D.T., KNOWLES D.P., GORHAM J.R. & CRAWFORD T.B. (1994). Competitive inhibition enzyme-linked
immunosorbent assay for antibody in sheep and other ruminants to a conserved epitope of malignant
catarrhal fever virus. J. Clin. Microbiol., 32, 1674–1679.
79. LIBEAU G., DIALLO A., COLAS F. & GUERRE L. (1994). Rapid differential diagnosis of rinderpest and pestes des
petits ruminants using an immunocapture ELISA. Vet. Rec., 134, 300–304.
80. LICHTENSTEIGER C.A., KNOWLES D.P., MCGUIRE T.C. & CHEEVERS W.P. (1991). Recombinant gp135 envelope
glycoproteins of caprine arthritis-encephalitis lentivirus variants inhibit homologous and heterologous variantspecific neutralizing antibodies. Virology, 185, 2–9.
81. LIU M., WOOD J.M., ELLIS T., KRAUSS S., SEILER P., JOHNSON C., HOFFMANN E., HUMBERD J., HULSE D., ZHANG
Y., WEBSTER R.G. & PEREZ D.R. (2003). Preparation of a standardized, efficacious agricultural H5N3 vaccine
by reverse genetics. Virology, 314, 580–590.
82. LOEHR B.I., WILLSON P., BABIUK L.A. & VAN DRUNEN LITTLE-VAN DEN HURK S. (2000). Gene gun-mediated DNA
immunization primes development of mucosal immunity against bovine herpesvirus 1 in cattle. J. Virol., 74,
6077–6086.
83. LOZA-RUBIO E., AGUILAR-SETIÉN A., BAHLOUL CH., BROCHIER B., PASTORET P.P. & TORDO N. (1999).
Discrimination between epidemiological cycles of rabies in Mexico. Arch. Med. Res., 30, 144–149.
84. LYOO Y.S., KLEIBOEKER S.B., JANG K.Y., SHIN N.K., KANG J.M., KIM C.H., LEE S.J. & SUR J.H. (2005). A simple
and rapid chromatographic strip test for detection of antibody to porcine reproductive and respiratory
85. MANOJ S., GRIEBEL P.J., BABIUK L.A. & VAN DRUNEN LITTLE-VAN DEN HURK S. (2003). Targeting with bovine
CD154 enhances humoral immune responses induced by a DNA vaccine in sheep. J. Immunol., 170, 989–
996.
86. MARRA M.A., JONES S. J., ASTELL C.R.,
coronavirus. Science, 300, 1399–1404.
ET AL.
(2003). The genome sequence of the SARS-associated
87. MELOEN R.H. (1997). Synthetic peptide vaccines. In: Veterinary Vaccinology, Pastoret P.-P., Blancou J.,
Vannier P. & Verschueren C., eds. Elsevier Science BV, Amsterdam, the Netherlands, 272–276.
88. MIGNON B., DUBUISSON J., BARANOWSKI E., KOROMYSLOV I., ERNST E., BOULANGER D., WAXWEILER S. &
PASTORET P.P. (1991). A monoclonal ELISA for bovine viral diarrhoea pestivirus antigen detection in
persistently infected cattle. J. Virol. Methods, 35, 177–188.
89. MOLINA CABALLERO J.M., ANGUIANO A., FERRER O., SERRANO E. & UCEDA A. (1993). Use of an enzyme-linked
immunosorbent assay for serodiagnosis of clinical paratuberculosis in goats. Study by western blotting of
false-positive reactions. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 12, 629–638.
90. MOSS B. (1996). Poxviridae: the viruses and their replication. In: Fields Virology, Fields B., Knipe D.M. &
Howley P.M., editors. Lippinoctt Raven Press, New York, USA, 2637–2671.
91. MOYNAG J., SCHIMMEL H. KRAMER G.N. (1999). Report on the Evaluation of Tests for the Diagnosis of
Transmissible Spongiform Encephalopathy in Bovines. July 8 1999, European Commission, DirectorateGeneral XXIV, Consumer Policy and Consumer Health Protection, Directorate B – Scientific Health
Opinions, Unit B3 – Management of Scientific Committees II, Brussels Belgium. Available at:
http://europa.eu.int/comm/food/fs/bse/bse12_en.pdf
92. MUJER V.C., WAGNER M.A., ESCHENBRENNER M., HORN T., KRAYCER J.A., REDKAR R., HAGIOUS S., ELZER P. &
DELVECCHIO V.G. (2002). Global analysis of Brucella melitensis proteomes. Ann. NY Acad. Sci., 969, 97–
101.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
21
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
93. MULLIS K.B., FERRE F. & GIBBS R.A., EDS (1994). PCR: The Polymerase Chain Reaction. Birkhäuser Boston,
Cambridge, USA.
94. NAIR V. (2004). Successful control of Marek's disease by vaccination. Dev. Biol. (Basel), 119, 147–154.
95. NEUMANN G., HATTA M. & KAWAOKA Y. (2003). Reverse genetics for the control of avian influenza. Avian Dis.,
47, 882–887.
96. NIELSEN K., GALL D., SMITH P., BALSEVICIUS S., GARRIDO F., FERRER M.D., BIANCIFIORI F., DAJER A., LUNA E.,
SAMARTINO L., BERMUDEZ R., MORENO F., RENTERIA T. & CORRAL A. (2004). Comparison of serological tests for
the detection of ovine and caprine antibody to Brucella melitensis. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 23, 979–987.
97. NIELSEN K., GALL D., SMITH P., VIGLIOCCO A., PEREZ B., SAMARTINO L., NICOLETTI P., DAJER A., ELZER P. &
ENRIGHT F. (1999). Validation of the fluorescence polarization assay as a serological test for the presumptive
diagnosis of porcine brucellosis. Vet. Microbiol., 68 (3-4), 245–253.
98. NIELSEN K., KELLY L., GALL D., NICOLETTI P. & KELLY W. (1995). Improved competitive enzyme immunoassay
for the diagnosis of bovine brucellosis. Vet. Immunol. Immunopathol., 46, 285–291.
99. NIELSEN O., STEWART R.E.A., NIELSEN K., MEASURES L. & DUIGNAN P. (2001). Serologic survey of Brucella spp.
antibodies in some marine mammals of North America. J. Wildl. Dis., 37, 89–100.
100. NOBIRON I., THOMPSON I., BROWNLIE J. & COLLINS M.E. (2003). DNA vaccination against bovine viral diarrhoea
virus induces humoral and cellular responses in cattle with evidence for protection against viral challenge.
101. O’ROURKE K.I., BASZLER T.V., PARISH S.M. & KNOWLES D.P. (1998). Preclinical detection of PrPSc in nictitating
membrane lymphoid tissue of sheep. Vet. Rec., 142, 489–491.
102. OBERT G. & BEYER C. (1988). An enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies for the
detection of respiratory syncytial virus in clinical specimens. Arch. Virol., 100, 37–49.
103. OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (1993). Biotechnology applied to the diagnosis of animal diseases.
Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 12 (2), 313–672.
104. OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (1990). Biotechnology and veterinary science. Rev. sci. tech. Off. int.
Epiz., 9 (3), 611–916.
105. OHISHI K., INUI K., BARRETT T. & YAMANOUCHI K. (2000). Long-term protective immunity to rinderpest in cattle
following a single vaccination with a recombinant vaccinia virus expressing the virus haemagglutinin protein.
J. Gen. Virol., 81, 1439–1446.
106. OSHOP G.L, ELANKUMARAN S. & HECKERT R.A. (2002). DNA vaccination in the avian. Vet. Immunol.
Immunopath., 89, 1–12.
107. PAIBA G.A., ANDERSON J., PATON D.J., SOLDAN A.W., ALEXANDERSEN S., CORTEYN M., WILSDEN G., HAMBLIN P.,
MACKAY D.K.J. & DONALDSON A.I. (2004). Validation of a foot and mouth disease antibody screening solidphase competition ELISA (SPCE). J. Virol. Methods, 115, 145–158.
108. PAOLETTI E., TARTAGLIA J. & TAYLOR J. (1994). Safe and effective poxvirus vectors – NYVAC and ALVAC.
Dev. Biol. Stand., 82, 65–69.
109. PAOLETTI E., TAYLOR J., MEIGNIER B., MERIC C. & TARTAGLIA J. (1995). Highly attenuated poxvirus vectors:
NYVAC, ALVAC and TROVAC. Dev. Biol. Stand., 84, 159–163.
110. PASTORET P.P. (2001). International harmonisation of vaccine standards (equine influenza vaccines,
inactivated). In: Proceedings, Quality Control of Equine Influenza Viruses, 10–11 December 2001, Budapest,
Hungary, 69–78.
111. PASTORET P.P., BABIUK L.A., MISRA V. & GRIEBEL P. (1980). Reactivation of temperature-sensitive and nontemperature-sensitive infectious bovine rhinotracheitis vaccine virus with dexamethasone. Infect. Immun.,
29, 483–488.
112. PASTORET P.P., BROCHIER B., BLANCOU J., ARTOIS M., AUBERT M., KIENY M.P., LECOCQ J.P., LANGUET P.,
CHAPPUIS G. & DESMETTRE P. (1992). Development and deliberate release of a vaccinia-rabies recombinant
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
22
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
virus for the oral vaccination of foxes against rabies. In: Recombinant Poxviruses, Binns M.M., Smith G.L.,
eds. CRC Press, Boca Raton, USA.
113. PASTORET P.P. & BROCHIER B. (1996). The development and use of vaccinia-rabies recombinant oral vaccine
for the control of wildlife rabies: a link between Jenner and Pasteur. Epidemiol. Infect., 116, 235–240.
114. PASTORET P.P., BROCHIER B., LANGUET B., THOMAS I., PAQUOT A., BAUDUIN B., KIENY M.P., LECOCQ J.P.,
DEBRUYN J., COSTY F., ANTOINE H. & DESMETTRE P. (1988). First field trial of fox vaccination against rabies
with a vaccinia-rabies recombinant virus. Vet. Rec., 123, 481–483.
115. PASTORET P.P., THIRY E., BROCHIER B., DERBOVEN G. & VINDEVOGEL H. (1984). The role of latency in the
epizootiology of infectious bovine rhinotracheitis. In: Latent Herpesvirus Infections in Veterinary Medicine,
Wittmann G., Gaskell R.M., Rziha H.J., eds. Martinus Nijhoff Publishers for the Commission of the European
Communities.
116. PASTORET P.P., THIRY E. & THOMAS R. (1986). Logical description of bovine herpesvirus 1 latent infection. J.
Gen. Virol., 67, 885–897.
117. PASTORET P.P. & VANDERPLASSCHEN A. (2003). Poxviruses as vaccine vectors. Comp. Immunol. Microbiol.
Infect. Dis., 26, 343–355.
118. PERKUS M.E., GOEBEL S.J., DAVIS S.W., JOHNSON G.P., NORTON E.K. & PAOLETTI E. (1991). Deletion of 55
open reading frames from the termini of vaccinia virus. Virology, 180, 406–410.
119. PERKUS M.E., PICCINI A., LIPINSKAS B.R. & PAOLETTI E. (1985). Recombinant vaccinia virus: immunization
against multiple pathogens. Science, 229, 981–984.
120. PETHERBRIDGE L., HOWES K., BAIGENT S.J., SACCO M.A., EVANS S., OSTERRIEDER N. & NAIR V. (2003).
Replication-competent bacterial artificial chromosomes of Marek’s disease virus: novel tools for generation
of molecularly defined herpesvirus vaccines. J. Virol., 77, 8712–8718.
121. PINES O. & INOUYE M. (1999). Expression and secretion of proteins in E. coli. Mol. Biotechnol., 12, 25–34.
122. PONTAROLLO R.A., BABIUK L.A., HECKER R. & VAN DRUNEN LITTLE-VAN DEN HURK S. (2002). Augmentation of
cellular immune responses to bovine herpesvirus-1 glycoprotein D by vaccination with CpG-enhanced
plasmid vectors. J. Gen. Virol., 83, 2973–2981.
123. PRÉCAUSTA P., BRUN A., KATO F., TERRE J. & MARCON C. (1975). Peste porcine classique. Etude d’un vaccin
préparé à partir de la souche chinoise CL adaptée à la culture cellulaire. Revue méd. Vét., 126, 969–981.
124. PROCOP G.W. & WILSON M. (2001). Infectious disease pathology. Clin. Infect. Dis., 32, 1589–1601.
125. RAMIREZ J.C., GHERARDI M.M., RODRIGUEZ D. & ESTEBAN M. (2000). Attenuated modified vaccinia virus ankara
can be used as an immunizing agent under conditions of pre-existing immunity to the vector. J. Virol., 74,
7651–7655.
126. RAPPUOLI R. & COVACCI A. (2003). Reverse vaccinology and genomics. Science, 302, 602.
127. RASMUSSEN H.H., .JI H., WOLF H. & CELIS J.E. (1996). Towards a comprehensive database of proteins from
the urine of patients with bladder cancer. J. Urology, 155, 2113–2119.
128. RISATTI G.R., CALLAHAN J.D., NELSON W.M. & BORCA M.V. (2003). Rapid detection of classical swine fever
virus by a portable real-time reverse transcriptase PCR assay. J. Clin. Microbiol., 41, 500–505.
129. ROBINSON H.L. (1997). Nucleic acid vaccines: an overview. Vaccine, 15, 785–787.
130. ROUT M.P. & FIELD M.C. (2001). Isolation and characterization of subnuclear compartments from
Trypanosoma brucei. Identification of a major repetitive nuclear lamina component. J. Biol. Chem., 276,
38261–38271.
131. ROY P., FRENCH T.J.R. & ERASMUS B.J. (1992). Protective efficacy of virus-like particles for bluetongue
disease. Vaccine, 10, 28–32.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
23
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
132. RUMENAF T., STARK R., MEYERS G. & THIEL H.J. (1991). Structural proteins of hog cholera virus expressed by
vaccinia virus: further characterization and induction of protective immunity. J. Virol., 65, 589–597.
133. SAFAR J.G., SCOTT M., MONAGHAN J., DEERING C., DIDORENKO S., VERGARA J., BALL H., LEGNAME G., LECLERC
E., SOLFOROSI L., SERBAN H., GROTH D., BURTON D.R., PRUSINER S.B. & WILLIAMSON R.A. (2002). Measuring
prions causing bovine spongiform encephalopathy or chronic wasting disease by immunoassays and
transgenic mice. Nat. Biotechnol., 20, 1147–1150.
134. SAIKI R., GEFLAND D., STOFFEL S., SCHANF S., HIGUCHI R., HORN G., MULLIS K. & ERLICH H. (1988). Primerdirected enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. Science, 293, 487–491.
135. Salt J.S. (1997). Vaccination against foot and mouth disease, In Veterinary Vaccinology, Pastoret P.P.,
Blancou P., Vannier C. & Verschueren C., eds. Elsevier Science, Amsterdam, 641-652.
136. SANDVIK T. & KROGSRUD J. (1995). Evaluation of an antigen-capture ELISA for detection of bovine viral
diarrhea virus in cattle blood samples. J. Vet. Diagn. Invest., 7, 65–71.
137. SARON M.F., FAYOLE C., SEBO P., LADANT D., ULLMANN A. & LECLERC C. (1997). Anti-viral protection conferred
by recombinant adenylate cyclase toxins from Bordetella pertussis carrying a CD8+ T cell eopitope from
lymphocytic choriomeningitis virus. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94, 3314–3319.
138. SCHALLER O., FATZER R., STACK M., CLARK J., COOLEY W., BIFFIGER K., EGLI S., DOHERR M., VANDEVELDE M.,
HEIM D., OESCH B. & MOSER M. (1999). Validation of a western immunoblotting procedure for bovine PrPSc
detection and its use as a rapid surveillance method for the diagnosis of bovine spongiform encepahlopathy
(BSE). Acta Neuropathol. (Berl.), 98, 437–443.
139. SCHWEIGER B., PAULI G., ZEICHHARDT H. & KUCHERER C. (1997). A multicentre quality assessment study to
monitor the performance of HIV-1 PCR. J. Virol. Methods, 67, 45–55.
140. SEDLIK C., SARON M., SARRASECA J., CASAL I. & LECLERC C. (1997). Recombinant parvovirus-like particles as
an antigen carrier: a novel nonreplicative exogenous antigen to elicit protective antiviral cytotoxic T cells.
Proc. Natl Acad. Sci., USA, 94, 7503–7508.
141. SMITH B.P., REINA-GUERRA M., STOCKER B.A., HOISETH S.K. & JOHNSON E. (1984). Aromatic-dependent
Salmonella dublin as a parenteral modified live vaccine for calves. Am. J. Vet. Res., 45, 2231–2235.
142. SMITH G.L., MACKETT M. & MOSS B. (1983). Infectious vaccinia virus recombinants that express hepatitis b
virus surface antigen. Nature, 302, 490–495.
143. SMITH G.L., MURPHY B.R. & MOSS B. (1983). Construction and characterisation of an infectious vaccinia virus
recombinant that expresses the influenza hemagglutinin gene and induces resistance to influenza virus
infection in hamsters. Proc. Natl Acad. Sci., USA, 80, 7155–7159.
144. SMITH H.W. (1965). The immunization of mice, calves and pigs against Salmonella dublin and Salmonella
cholera-suis infections. J. Hyg. Cam., 63, 117–135.
145. SPANO F., PUTIGNANI L., MCLAUCHLIN J., CASEMORE D.P. & CRISANTI A. (1997). PCR-RFLP analysis of the
Cryptosporidium oocyst wall protein (COWP) gene discriminates between C. wrairi and C. parvum, and
between C. parvum isolates of human and animal origin. FEMS Microbiol. Lett., 150, 209–217.
146. STACK M.J., CHAPLIN M.J. & CLARK J. (2002) Differentiation of prion protein glycoforms from naturally
occurring sheep scrapie, sheep-passaged scrapie strains (CH1641 and SSBP1), bovine spongiform
encephalopathy (BSE) cases and Romney and Cheviot breed sheep experimentally inoculated with BSE
using two monoclonal antibodies. Acta Neuropathol. (Berl.), 104, 279–286.
147. STEWART L.M.D. & POSSEE R.D. (1993). Baculovirus expression vectors. In: Molecular Virology, Davison A.J.
& Elliot R.M., eds. Oxford University Press, UK, 227–254.
148. STREATFIELD S.J. & HOWARD J.A. (2003). Plant-based vaccines. Int. J. Parasitol., 33, 479–493.
149. STROBBE R. (1992). Diminution de l’immunité du cheptel bovin belge après l’arrêt de la vaccination
antiaphteuse et conditions d’une vaccination d’urgence. Ann. Méd. Vét., 136, 513–519.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
24
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
150. SUTER M., LEW A.M., GROB P., ADEMA G.J., ACKERMANN M., SHORTMAN K. & FRAEFEL C. (1999). BAC-VAC, a
novel generation of (DNA) vaccines: A bacterial artificial chromosome (BAC) containing a replicationcompetent, packaging-defective virus genome induces p rotective immunity against herpes simplex virus 1.
Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96, 12697–12702.
151. TARTAGLIA J., COX W.I., PINCUS S. & PAOLETTI E. (1994). Safety and immunogenicity of recombinants based
on the genetically-engineered vaccinia strains, NYVAC. Dev. Biol. Stand., 82, 125–129.
152. TARTAGLIA J., PERKUS M.E., TAYLOR J., NORTON E.K., AUDONNET J.C., COX W.I., DAVIS S.W., VAN DER HOEVEN
J., MEIGNIER B., RIVIERE M. ET AL. (1992). NYVAC: a highly attenuated strain of vaccinia virus. Virology, 188,
217–232.
153. TAYLOR J. & PAOLETTI E. (1988). Fowlpox virus as a vector in non-avian species. Vaccine, 6, 466–468.
154. TAYLOR J., TRIMARCHI C., WEINBERG R., LANGUET B., GUILLEMIN F., DESMETTRE P. & PAOLETTI E. (1991). Efficacy
studies on a canarypox-rabies recombinant virus. Vaccine, 9, 190–193.
155. THOMAS I., BROCHIER B., LANGUET B., BLANCOU J., PEHARPRE D., KIENY M.P., DESMETTRE P., CHAPPUIS G. &
PASTORET P.P. (1990). Primary multiplication site of the vaccinia-rabies glycoprotein recombinant virus
administered to foxes by the oral route. J. Gen. Virol., 71, 37.
156. THORGEIRSDOTTIR S., GEORGSSON G., REYNISSON E., SIGURDARSON S. & PALSDOTTIR (2002). A search for
healthy carriers of scrapie: an assessment of subclinical infection in an Icelandic scrapie flock by three
diagnostic methods and correlation with PRP genotypes. Arch. Virol., 147, 709–722.
157. TIBBETTS S.A., MCCLELLAN J.S., GANGAPPA S., SPECK S.H. & VIRGIN H.W. (2003). Effective vaccination against
long-term gammaherpesvirus latency. J. Virol., 77, 2522–2529.
158. TORIONI DE E.S., KNOWLES D.P., MCGUIRE T.C., PALMER G.H., SUAREZ C.E. & MCELWAIN T.F. (1998). Detection
of cattle naturally infected with Anaplasma marginale in a region of endemicity by nested PCR and a
competitive enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant major surface protein 5. J. Clin.
Microbiol., 36, 777–782.
159. TORTORELLA D., GEWURZ B.E., FURMAN M.H., SCHUST D.J. & PLOEGH H.L. (2000). Viral subversion of the
immune system. Ann. Rev. Immunol., 18, 861–926.
160. TRUEBLOOD E.S., MCGUIRE T.C. & PALMER G.H (1991). Detection of anaplasma marginale rickettsemia prior to
onset of clinical signs by using an antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol.,
29, 1542–1544.
161. ULRICHS T., MUNK M.E., MOLLENKOPF H., ET AL. (1998). Differential T cell response to Mycobacterium
tuberculosis ESAT6 in tuberculosis patients and healthy donors. Eur. J. Immunol., 28, 3949–3958.
162. UMTHUN A.R. & MENGELING W.L. (1999). Restriction fragment length polymorphism analysis of strains of
porcine reproductive and respiratory syndrome virus by use of a nested-set reverse transcriptasepolymerase chain reaction. Am. J. Vet. Res., 60, 802–806.
163. UTTENTHAL A., LEPOTIER M.F., ROMERO L., DEMIA G.M. & FLOEGEL-NIESMANN G. (2001). Classical swine fever
(CSF) marker vaccine. Trial I. Challenge studies in weaner pigs. Vet. Microbiol., 83, 85–106.
164. VALARCHER J.F., FURZE J., WYLD S., COOK R., CONZELMANN K.K. & TAYLOR G. (2003). Role of alpha/beta
interferons in the attenuation and immunogenicity of recombinant bovine respiratory syncytial viruses lacking
NS proteins J. Virol., 77, 8426–8439.
165. VAN OIRSCHOT J.T., GIELKENS A.L.J., MOORMANN R.J.M. & BERNS A.J.M. (1990). Marker vaccines, virus
protein-specific antibody assays and the control of Aujeszky’s disease. Vet. Microbiol., 23, 85–101.
166. VAN OIRSCHOT J.T., KAASHOEK M.J. & RIJSEWIJK F.A.M. (1996). Advances in the development and evaluation
of bovine herpesvirus 1 vaccines. Vet. Microbiol., 53, 43–54.
167. VAN ROOIJ E.M., GLANSBEEK H.L., HILGERS L.A., TE LINTELO E.G., DE VISSER Y.E., BOERSMA W.J., HAAGMANS
B.L. & BIANCHI A.T. (2002). Protective antiviral immune responses to pseudorabies virus induced by DNA
vaccination using dimethyldioctadecylammonium bromide as an adjuvant. J. Virol., 76, 10540–10545.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
25
Capítulo 1.1.7. — Biotecnología en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
168. VAN ZIJL M., WENSVOORT G., DE KLUYVER E., HULST M., VANDER G.H., GIELKENS A., BERNS A. & MOORMANN R.
(1991). Live attenuated psudorabies virus expressing envelope glycoprotein E1 of hog cholera virus protects
swine against both pseudorabies and hog cholera. J. Virol., 65, 2761–2765.
169. VANDEVANTER D.R., WARRENER P., BENNETT L., SCHULTZ E.R., COULTER S., GARBER R.L. & ROSE T.M. (1996).
Detection and analysis of diverse herpesviral species by consensus primer PCR. J. Clin. Microbiol., 34,
1666–1671.
170. VILLARREAL-RAMOS B., MANSER J., COLLINS R.A., DOUGAN G., CHATFIELD S.N. & HOWARD C. (1998). Immune
responses in calves immunised orally or subcutaneously with a live Salmonella typhimurium aro vaccine.
Vaccine, 16, 45–54.
171. VORDERMEIER H.M., LOWRIE D.B. & HEWISON R.G. (2003). Improved immunogenicity of DNA vaccination with
mycobacterial HSP65 against bovine tuberculosis by protein boosting. Vet. Microbiol., 93, 349–359.
172. VORDERMEIER H.M., WHELAN A., COCKLE P.J., FARRANT L., PALMER N. & HEWINSON R.G. (2001). Use of
synthetic peptides derived from the antigens ESAT-6 and CFP-10 for differential diagnosis of bovine
tuberculosis in cattle. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 8, 571–578.
173. WAGNER M., RUZSICS Z. & KOSZINOWSKI U.H. (2002). Herpesvirus genetics has come of age. Trends
Microbiol., 10, 318–324.
174. WANG D., COSCOY L., ZYLBERBERG M., AVILA P.C., BOUSHEY H.A., GANEM D & DERISI J.L. (2002). Microarraybased detection and genotyping of viral pathogens. Proc. Natl Acad. Sci., USA, 99, 15687–15692.
175. WEIDMANN M., MEYER-KONIG U. & HUFERT F.T. (2003). Rapid detection of herpes simplex virus and varicellazoster virus infections by real-time pcr. J. Clin. Microbiol., 41, 1565–1568.
176. WELTER J., TAYLOR J., TARTAGLIA J., PAOLETTI E. & STEPHENSEN C.B. (2000). Vaccination against canine
distemper virus infection in infant ferrets with and without maternal antibody protection, using recombinant
attenuated poxvirus vaccines. J. Virol., 74, 6358–6367.
177. WENSVOORT G., BLOEMRAAD M. & TERPSTRA C. (1988). An enzyme immunoassay employing monoclonal
antibodies and detecting specifically antibodies to classical swine fever virus. Vet. Microbiol., 17, 129–140.
178. XIANG Z. & ERTL C.J. (1995). Manipulation of the immune response to a plasmid-encoded viral antigen by
coinoculation with plasmids expressing cytokines. Immunity, 2, 129–135.
179. YATSUDA A.P., KRIJGSVELD J., CORNELISSEN A.W., HECK A.J. & DE VRIES E. (2003) comprehensive analysis of
the secreted proteins of the parasite Haemonchus contortus reveals extensive sequence variation and
differential immune recognition. J. Biol. Chem., 278, 16941–16951.
*
* *
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
26