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Separación de poblaciones celulares
Diferenciación de las células
sanguíneas a partir de células
madre de médula ósea
Células del sistema inmune
Poblaciones celulares en sangre entera
Leucocitos
No granulosos
Células nucleadas
Se producen en medula ósea (humanos a un ritmo de 80 millones por
minuto)
Se pueden reconocer por sus propiedades de tinción
y su estructura interna
•Linfocito
•Heterogeneidad morfologica, 6-10um.
•Citoplasma basófilo muy escaso.
•Puede tener granulaciones escasas
•Nucleo redondo, oval o ligeramente escotado, se tiñe de color
violeta y estructura compacta.
•Monocito
•Citoplasma basófilo.
•Tiene numerosas granulaciones pequeñas y distribuidas
regularmente (no se ven con aumentos bajos)
• Nucleo lobulado en forma de herradura, violeta claro,
no compacto
Leucocitos
polimorfonucleares
Tienen una vida media de 2-3 dias
En humanos constituyen el 60-70% de los leucocitos totales de la sangre.
No muestran ninguna especificidad para los antígenos pero desempeñan un Importante papel en la
inflamación aguda
•Neutrófilo
•Citoplasma acidófilo color rosa pálido (con eosina ácida se tiñe de amarillo).
•Tiene granulaciones neutrofílicas chicas , regularmente distribuidas,
abundantes; pueden ser primarios o secundarios
•Nucleo multilobulado
•10-20um de diametro
•Eosinófilo
•Citoplasma acidófilo con granulaciones acidófilas grandes, menos
númerosas que en neutrofilos, distribución regular y muy
refringentes
•Núcleo bilobulado en forma de anteojos, violeta oscuro y compacto.
•Basófilo
•Citoplasma acidófilo o antófilo (no toma colorante)
•granulaciones basófilas grandes,poco númerosas, distribución irregular de
color azul violeta intensos.
•Núcleo lobulado, puede ser bisegmentado, violeta oscuro y compacto
Basófilo
Tinción de leucocitos en frotis
Extendido de sangre en portaobjeto, dejar secar
Coloración ideal:
May Grunwald (azul de metileno/eosina)
Tiñé citoplasma y granulaciones
Giemsa (azul de metileno/eosina y azur)
Tiñé el núcleo
Tipos celulares
Neutrófilos
Eosinófilos
Linfocitos
Monocitos
Basófilos
Punción cardíaca
Sangre periférica
Frotis
Fórmula leucocitaria (en humanos)
Neonatos
1año
Adultos
Neutrófilos en banda
9%
600-3000
3%
50-700
2 -8 %
1800-7000
Neutrófilos
52%
3300-17000
28%
1800-4600
46 - 66 %
0-700
Eosinófilos
2%
20-850
3%
50-700
1-5%
0-450
Basófilos
0%
0-640
0%
0-200
0 -1 %
0-200
Linfocitos
31 %
2000-11000
61 %
4000-10500
20 - 40 %
1000-4800
Monocitos
6%
400-3100
6%
50-1100
2 - 10 %
100-800
En rata, el % de linfocitos es mayor al de neutrófilos (la relación se invierte)
Fórmula leucocitaria
1. Para determinar el porcentaje de los diferentes tipos celulares se cuenta un
número fijo de células por frotis (por ejemplo 100), diferenciando los tipos
celulares siguientes: linfocito, macrófago y granulocitos.
2. La diferenciación celular se basa en la relación del tamaño núcleo/citoplasma,
la morfología del núcleo y la coloración que adquiere el citoplasma.
3. Barrer el preparado en guarda griega porque las células no se distribuyen
homogéneamente: linfocitos en franja central, monocitos y polimorfos nucleares
en el borde.
4. Las proporciones de la fórmula leucocitaria varían según:
* Edad
*especie (humanos predominan los neutrófilos, rata predominan
los linfocitos)
Obtención de células de órganos linfoides
Sangre
Ganglios linfáticos
Linfocitos T 70 %
órganos linfoides secundarios.
Linfocitos B 24 %
Linfocitos T 77 %
Linfocitos B 18 %
Bazo
órgano linfoide secundario.
Linfocitos T 35 %
Linfocitos B 38 %
Ganglios axilares
Timo
Timo
órgano linfoide primario.
Linfocitos T 97 %
Linfocitos B 1 %
Bazo
Ganglios
mesentéricos
Placas
de
Peyer
Ganglios
inguinales
Médula ósea
Médula ósea
órgano linfoide primario.
Generación de células
del SI.
Capacidad
hematopoyética
Preparación de suspensiones celulares
Obtención de M.O.
RPMI 1640
Centrifugar
Resuspender en medio de cultivo
Contar
Obtención de células linfoides
Timo
Bazo
Ganglios
Recuento de células
•
Determinación de la concentración de células en una
suspensión
•
cámara de Neubauer
∑n
4
X 10 x dil
Nº de células/ml=
4
Separación de poblaciones celulares
Un método eficiente debe reunir :
• Buena recuperación
• Alta pureza
• Mantenimiento de la funcionalidad celular
Sirven para: enriquecer o depletar una población de células
Métodos basados en tamaño y densidad
Velocidad de sedimentación a 1 x g
Ley de Stokes:
Fuerza de fricción experimentada por objetos esféricos moviéndose en un fluido
viscoso en un régimen laminar de bajo número de Reynolds (Re< 2000).
Una célula que sedimenta obedeciendo la Ley de Stokes (en general es válida para
partículas pequeñas moviéndose a velocidades bajas), llega a una velocidad terminal dada
por:
Densidad de la célula
V=
Densidad del medio
2 g ( - ´) r2
9
Radio de la célula
Constante gravitacional
Viscosidad del medio
La temperatura puede modificar la velocidad de sedimentación alterando la viscosidad
Velocidad de sedimentación (mm/h)
10
9
8
7
Densidad celular
6
1,09
1,08
1,07
1,06
5
4
3
2
6
7
8
9
10
11
12
Diámetro (µ)
El diámetro influye más que la densidad de la célula en la determinación de la velocidad
de sedimentación
Separación en base al tamaño principalmente (medio de baja densidad)
Ventajas:
• Buena reproducibilidad
• Buena recuperación
• Puede separar una gran cantidad de células
Desventaja:
• Tiempo requerido para la separación
Separación en base a la densidad
Centrifugación en gradiente de densidad:
utiliza un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior.
el gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular en un
solvente en el que la muestra a analizar puede ser suspendida
permite separar los componentes de una muestra
realizar medidas analíticas
 Dos variantes:
Centrifugación zonal: la muestra se deposita en la parte superior de un gradiente
de densidad preformado. Bajo fuerza centrifuga las partículas sedimentan moviéndose
a diferentes velocidades dependiendo de su masa.
Centrifugación isopícnica : la muestra se disuelve en una sn en donde está el soluto
formador del gradiente. Durante la centrifugación el soluto se distribuye en el tubo y las
particulas de la muestra se reorientan de acuerdo a su densidad. (sedimentación a altas
g a través de un medio cada vez más denso)
Cuando la densidad del medio y de las células son iguales, entonces v = 0 y la
célula flota en una posición de equilibrio.
Las células muy densas llegan al fondo del tubo y pueden morir por compresión.
Las células muertas también son muy densas y llegan al fondo del tubo.
Se utilizan altas g para alcanzar más rápido el equilibrio y evitar mezclas por
efectos de difusión.
Cuanto mayor es la relación núcleo : citoplasma, mayor es la densidad de la
célula
Medio hipotónoico: células menos densas; medio hipertónico: células más
densas
Se utilizan gradientes de BSA lineales o discontinuos y sílica gel coloidal, Percoll.
Separación en base a tamaño y densidad (Hypaque-Ficoll)
Separación de una suspensión celular a través de un medio de alta densidad
por centrifugación a baja velocidad
Ficoll. Se trata de un polisacárido sintético de alto peso molecular (400 kDa). Presenta
un alto contenido en grupos hidroxilo por lo que tiene una buena solubilidad en
medios acuosos. Además no presenta grupos ionizables que puedan servir de unión a
las muestras. Es estable a pH neutro y alcalino, pudiendo ser autoclavado sin
degradarse. Su viscosidad es menor que la de la sacarosa, aunque sigue siendo algo
elevada, lo que supone un inconveniente y no altera la presión osmótica del medio.
Debido a sus propiedades, el ficoll se ha utilizado para la separación de células y
partículas subcelulares mediante centrifugación zonal.
Densidad del medio para células
humanas : 1,075 g/cm3
ratón : 1,09 g/cm3
rata: 1,089 g/cm3
Ficoll
Hypaque
Polímero sintético de sacarosa y
epiclorhidrina
Hypaque sódico (diatrizoato sódico)
(C12H22O11)n.(C3H5ClO)n
PM: 400.000
sodio 3,5-diacetamido-2, 4, 6triiodobenzoate (C11H8I3N2NaO4)
contiene 59.87 % de Iodo
Obtención de células mononucleares de sangre periférica por Ficoll- Hypaque
Antes de centrifugar
Sangre
diluida
Después de centrifugar
Centrifugación
Plasma y plaquetas
Mononucleares
400 g 30´ temp amb
Ficoll Hypaque
Ficoll
Hypaque
Polimorfonucleares +
Glóbulos rojos
Mononucleares: Linfocitos + monocitos
Purificación de PMN provenientes de Ficoll-Hypaque
• Por sedimentación sobre dextran 6 %
Agitación por inversión y
sedimentación por 30’
Dextran
PMN + GR
*
Lisis con H2O (1’)
Llevar a isotonicidad
PMN + GR + SF
GR
El dextran es un polisacárido complejo y ramificado formado por muchas moléculas de glucosa
unidades en cadenas de longitud variable (de 10 a 150 kDa). La cadena consiste en uniones
glucosídicas α1->6 entre moléculas de glucosa, mientras que las ramificaciones empiezan en
uniones α1->4 (en algunos casos también en uniones α1->2 y α1->3). El dextrano es sintetizado a
partir de la sacarosa por ciertas bacterias ácido-lácticas( Leuconostoc mesenteroides y
Streptococcus mutans).
Separación de células sanguíneas humanas por centrifugación
en gradiente de Percoll
Plasma
Monocitos, NK
50 % (1065)
Mononucleares
(linfocitos)
60 % (1077)
PMN
70 % (1083)
GR
Cuando la densidad del medio
y de las células son iguales,
entonces v = 0 y la célula flota
en una posición de equilibrio.
• Gradiente de Percoll (50-70 %): Buena recuperación
y pureza mayor al 90 %
•Percoll.
Se trata de una suspensión de partículas (5.15
nm) de ácido silícico revestidas de un derivado
de polivinilo (polivinilpirrolidona, PVP) que presenta
baja viscosidad a densidades altas, no afecta
prácticamente a la presión osmótica del medio y
es estable a pH comprendidos entre 5 y 10.
Es soluble en solución acuosa y estable en ellas
siempre que no haya aniones bivalentes (sulfato),
especialmente a bajos pH.
El compuesto puede ser utilizado para
centrifugaciones zonales, preformando gradientes,
o bien para centrifugación isopícnica, ya que la
centrifugación de percoll en rotores angulares
durante 20-30 minutos y 20.000-100.000g produce
un ligero gradiente, independientemente de la
densidad inicial del percoll.
Métodos basados en adherencia
3 categorías:
1- Adherencia activa: Requiere del metabolismo celular y es temperatura
dependiente (ej: macrófagos, polimorfonucleares)
2- Adherencia física: Se puede realizar a 4 °C o a 37 °C (ej: subsets de
células B)
3- Adherencia de células muertas o dañadas
Sustancias empleadas:
• Sephadex G10: Quedan retenidas las células adherentes.
La separación se basa en adherencia y tamaño.
• Polvo de hierro (Carbonyl iron powder): Las células que fagocitan o se
adhieren a las partículas de hierro, son removidas con un imán. (ej: Remoción
de linfocitos B)
• Lana de nylon: Se utiliza para obtener células T libres de células B.
El rendimiento es bajo (15 a 25 %).
Puede haber retención diferencial de subpoblaciones T.
• Adherencia a superficies de vidrio o plástico
Métodos basados en adherencia
Rendimiento bajo (15-25 %)
Alta pureza.
Adherencia a lana de nylon
* Purificación de linfocitos T
Adherencia a superficies de vidrio o plástico
* Purificación de macrófagos
(células adherentes)
* Separación por agentes químicos
(quelante de calcio, EDTA o tripsina)
o por rastrillado.
Métodos basados en afinidad (Interacción receptor-ligando)
*Rosetas
*Columnas con anticuerpos
*Panning: superficies plásticas recubiertas con anticuerpo
*Beads magnéticas
*Aglutinina de maní: interacciona con residuos D-galactosa de timocitos inmaduros,
aglutinando las células (las células maduras presentan éstos residuos enmascarados
por ácido siálico.
*Aglutinina de soja: aglutina células B pero no células T.
*FACS
Métodos basados en afinidad
(Interacción receptor-ligando)
A partir de interfase de Ficoll- Hypaque
Rosetas espontáneas
CD 2
GRc
LT
(humanos)
GR
c
GRc
Ficoll-Hypaque
GRc
Monocitos + LB
LT
GRc
GRc
Roseta
Rosetas T
Métodos basados en afinidad
Panning
Beads magnéticas
YYYYYYYYYYY
superficies plásticas recubiertas
con anticuerpos
CD 3 (Linfocito T)
CD 19 (Linfocito B)
Selección positiva
Selección negativa
Utilización de pequeñas beads recubiertas
con anticuerpos monoclonales que se unen
específicamente a los linfocitos T o B. Una
vez hecha la unión las células se extraen
con la ayuda de un separador magnético.
La pureza es excelente. Se trabaja a
temperatura ambiente
Técnicas inmunomagnéticas
Receptor de la superficie celular que se combina con un ligando (basado en
la especificidad de la interacción)
Antisuero + complemento: Eliminación de una subpoblación que lleva un
antígeno de membrana específico.
Otros métodos de separación
Método basado en filtración por columna de bolitas de vidrio
53 a 65 µ de diámetro
Las células más grandes se retrasan con respecto a las más pequeñas.
El vidrio debe estar siliconado
Metodo basado en carga eléctrica neta
En roedores hay una distribución bimodal de movilidades correspondiendo a
células B y T.
En humanos esa distribución no se puede correlacionar con las poblaciones B y T
Métodos basados en la separación funcional por inactivación de
células proliferantes
1- Pulso de timidina marcada con radioisótopos
Linfocitos expuestos a Ag o mitógenos se dividen y la timidina se incorpora al ADN
La desintegración radioactiva mata las células proliferantes.
(Reacciones mixtas de linfocitos, respuestas citotóxicas mediadas por células).
X
La timidina se
incorpora al ADN
celular
2- Pulso de 5-Br-2-Deoxiuridina (BUdR)
Se incorpora al ADN en células en división como análogo de la timidina.
Cuando se activa con luz UV, causa el daño del ADN.
X
3- Mitomicina C
Causa cross-linking del ADN y las funciones que requieren división
celular son abolidas
4- Irradiación
Rayos X, Cobalto (60Co), Cesio (137Cs), rayos gamma.