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CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE Y AISLAMIENTO
DE ÁCIDOS NUCLEICOS
La tecnología del ADN recombinante incluye una
serie de procedimientos que permiten generar,
cortar y pegar fragmentos de ADN, lo que posibilita fabricar secuencias de ADN que tengan interés
científico o terapéutico. Para poder manipular el
ADN, primeramente hay que aislarlo de los tejidos
o células. Existen diferentes métodos para aislar
ADN (y ARN); los métodos clásicos se basan en
su mayoría en una primera separación mediante
una extracción en fases orgánicas seguida de una
precipitación de los ácidos nucleicos presentes
en la fase acuosa resultante, mediante soluciones
alcohólicas. Una vez obtenido el ácido nucleico,
es importante analizarlo para verificar su calidad.
Un método rápido y ampliamente extendido para
tal propósito es la electroforesis en geles de agarosa (fig. e2-1). Estos geles están constituidos por
matrices porosas en las que se introduce la muestra de ácido nucleico, se aplica una diferencia de
potencial (voltaje) a lo largo de la matriz y, en
virtud de la carga negativa que poseen tanto el
ARN como el ADN, estos migran a través de dicha
matriz. En el caso del ADN, debido a su gran longitud, debe ser fragmendo previamente mediante
enzimas de restricción (v. más adelante), para que
pueda tener lugar la migración. Los fragmentos de
ADN generados mediante PCR (v. «Reacción en
cadena de la polimerasa») pueden ser sometidos
directamente a electroforesis, ya que sus tamaños
son compatibles con la migración a través del gel.
Debido al tamaño de los poros del gel (que es del
orden de magnitud del de las propias moléculas
de ácido nucleico), se da un fenómeno de separación de los distintos ácidos nucleicos en función
de su tamaño (fenómeno llamado «movilidad
electroforética»). Determinar que el tamaño de
los fragmentos de ADN/ARN analizados es el
esperado es una prueba importante para asegurar
su calidad y comprobar que se ha obtenido el
fragmento adecuado. La aparición de especies
de tamaño menor del esperado puede indicar
degradación de la muestra. La visualización de
los ácidos nucleicos en los geles se logra con el
colorante bromuro de etidio (que se une de forma
estequiométrica a los ácidos nucleicos de doble
cadena) y la aplicación de luz ultravioleta. También es importante la cuantificación de la cantidad
FIGURA E2-1 Electroforesis en gel de agarosa para la observación del ADN. A. Esquema de la técnica. El ADN se carga
en unos pocillos realizados en el gel y, tras someterlo a un campo eléctrico, se desplaza a través del gel. La longitud
recorrida en el gel depende del tamaño de cada una de las especies de ADN. B. Imagen de un gel de agarosa observado
en un transiluminador tras teñirlo con bromuro de etidio (foto superior) y tras obtener una foto del mismo (imagen inferior).
27.e1
Biología celular biomédica
27.e2
de ácido nucleico obtenido. Para ello se utiliza
la propiedad física de la absorbancia, ya que las
bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos absorben luz con una longitud de onda de 260 nm.
Realizando la medición de absorbancia de una
solución de ácido nucleico a 260 nm, se puede
estimar con mucha precisión la concentración
de este.
Para cortar el ADN se utilizan las llamadas
«endonucleasas de restricción» o, en general,
enzimas de restricción. Estas enzimas de origen
bacteriano son capaces de cortar el ADN cuando
reconocen una secuencia concreta de nucleótidos.
Las secuencias que la mayor parte de las enzimas
reconocen tienen de 4 a 6 nucleótidos, y se caracterizan por un tipo especial de simetría interna: se llaman secuencias palindrómicas, es decir, secuencias
que son iguales si se leen en una dirección, o en la
dirección contraria (fig. e2-2). Existen gran cantidad
de enzimas que cortan el ADN en secuencias específicas. Los cortes originados por algunas enzimas
dejan extremos escalonados (o cohesivos) de ADN
con un pequeño fragmento monocatenario que
puede unirse a otra molécula semejante de ADN
para restaurar la doble cadena. Otras enzimas de
restricción cortan las dos hebras a la misma altura,
generando lo que se llaman fragmentos de restricción de extremos romos. Para unir los fragmentos
de ADN se utilizan enzimas denominadas ligasas.
El corte y empalme del ADN permite clonar
genes para obtener múltiples copias del mismo.
Existen dos formas principales de clonar un gen:
la clonación celular y la clonación acelular. En la
clonación celular se utilizan organismos (normalmente bacterias) para producir billones de copias
de nuestro fragmento de ADN (cuya cantidad
inicial suele ser muy escasa). El ADN se introduce
en bacterias en forma de plásmido modificado
(al que se denomina vector) y estas, mediante
su crecimiento normal, multiplican las copias
del plásmido (v. fig. e2-2). La clonación acelular
sucede en un tubo de ensayo. El método principal
de este tipo de clonación es la PCR (v. «Reacción
en cadena de la polimerasa»). Mediante esta reac­
ción se puede multiplicar millones o incluso
billones de veces la cantidad de una determinada
secuencia de ADN. La clonación permite crear
vectores con genes de uso terapéutico que pueden
ser utilizados en terapia génica o para producir
proteínas recombinantes. Un ejemplo de la aplicación de la tecnología del ADN recombinante
y la clonación es la producción de insulina. El
FIGURA E2-2 A. El ADN puede ser cortado por diversas enzimas de restricción. En el ejemplo se muestra el corte
de un plásmido y de ADN genómico por la enzima EcoR1. El corte produce extremos cohesivos (escalonados) en el ADN,
lo que permite la unión por hibridación del ADN del plásmido linearizado con fragmentos del ADN genómico, con la ayuda
de una ADN ligasa. B. Mediante este procedimiento se pueden clonar genes de interés en plásmidos que pueden
ser introducidos en bacterias y multiplicados durante su crecimiento normal.
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
gen de la insulina humano se corta y pega en un
vector adecuado que permitirá la producción de
grandes cantidades de la proteína en bacterias o
células de mamífero, con vistas a su uso terapéutico en pacientes con diabetes de tipo I.
REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA
En el año 1985, el investigador norteamericano
Kary Mullis desarrolló el método de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polymerase chain reaction) por el que recibió el premio
Nobel de Química en 1993. La técnica se basa en
multiplicar de forma exponencial un segmento
determinado de ADN, a partir de una muestra
muy pequeña (menos de 1 mg de ADN). Previamente, es necesario conocer la secuencia de los
nucleótidos correspondientes a los extremos del
fragmento que se desea amplificar para diseñar
dos oligonucleótidos sintéticos de ADN complementarios a las secuencias de sus extremos 3’.
Estos oligonucleótidos cebadores (primers) tienen
una extensión promedio de 20 nucleótidos. El
desarrollo de esta técnica ha supuesto un enorme
avance en biomedicina, ya que la PCR tiene innumerables aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.
Amplificación del ADN
La reacción tiene tres etapas: desnaturalización,
hibridación y extensión. La desnaturalización
consiste en la separación de las dos hebras del
ADN por ruptura de los puentes de hidrógeno
intercatenarios, generando moléculas de ADN
en forma de cadena simple. Esto se logra por un
aumento de la temperatura (90-94 °C) durante
unos 5 min para asegurar la desnaturalización
total de todas las moléculas de ADN; en caso contrario, el ADN tenderá a renaturalizarse, dificultando la etapa siguiente. En el paso de hibridación
se disminuye la temperatura de la reacción hasta
40-60 °C para permitir la unión por complementariedad entre los cebadores (primers en inglés) y
las secuencias que flanquean el fragmento que se
desea amplificar. La temperatura de hibridación
debe ser unos 5-8 ºC menor que la temperatura
de fusión (Tm) de los cebadores. La Tm depende
de la longitud de los cebadores y el porcentaje de
CG de su secuencia. Si la temperatura de hibridación es inferior a la óptima, los cebadores se
unirán inespecíficamente, y si la temperatura es
superior, disminuirá la eficiencia de la reacción. La
Tm puede aproximarse para cebadores de 18 a 24
bases con la fórmula de Wallace, que contempla la
proporción de bases del oligonucleótido:
Tm = 2(A + T) + 4(G + C)
Finalmente, la extensión ocurre a 72 °C y consiste en la adición de los desoxirribonucleótidos
a partir de los extremos 3’ de los cebadores,
utilizando el ADN como molde y por acción
de la polimerasa Taq. Esta enzima, llamada así
porque se aisló de la bacteria termófila Thermus
aquaticus, es resistente a la desnaturalización por
calor, lo que le permite ejercer su actividad aun
a altas temperaturas. Normalmente una extensión
de 20 s es suficiente para fragmentos menores de
500 pares de bases, y 40 s para fragmentos por encima de 1,2 Kb. Tras este primer ciclo se obtienen dos
moléculas bicatenarias del fragmento de interés
(fig. e2-3). En cada repetición del ciclo se produce
un aumento exponencial del número de copias
de la secuencia específica (2n, siendo n el número
de ciclos), ya que las moléculas amplificadas en
el ciclo anterior sirven de molde para el próximo
ciclo. Por lo tanto, tras 20 ciclos se obtienen un
millón de copias de la molécula molde (fig. e2-3).
La mezcla de reacción contiene el ADN que se
quiere amplificar, dos oligonucleótidos sintéticos
(cebadores o primers: P1 y P2) que servirán como
cebadores, una ADN polimerasa termoestable
(Taq), los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato
(dATP, dGTP, dCTP y dTTP), una solución tamponada y el cofactor de la Taq polimerasa (magnesio). La reacción se lleva a cabo de forma rápida
y automatizada con un termociclador, que básicamente consiste en un bloque térmico que
FIGURA E2-3 Esquema de la reacción de PCR. Cada ciclo incluye una desnaturalización de la doble cadena del ADN,
hibridación de los cebadores sintéticos (P1 y P2) y extensión de las cadenas. Al finalizar un ciclo, comienza otro tomando
a las cadenas recién sintetizadas como molde, por lo que la amplificación es exponencial.
27.e3
Biología celular biomédica
aumenta y disminuye la temperatura de acuerdo
a las condiciones programadas por el operador. El
producto de la amplificación se analiza por electroforesis en gel de agarosa, colocando además un
marcador de peso molecular y, por comparación,
se comprueba si el producto amplificado tiene el
tamaño esperado. Finalmente, se puede secuenciar el producto de amplificación (v. más adelante), con el fin de verificar su correspondencia con
la secuencia de ADN estudiada.
Variantes del procedimiento
27.e4
La PCR anidada consiste en la amplificación de
una secuencia dentro de otra secuencia previamente amplificada, lo que permite aumentar
la especificidad del producto obtenido. En la
PCR multiplex se amplifican varios fragmentos
simultáneamente. Se aplica para la detección
de posibles mutaciones o polimorfismos en un
gen grande, y es muy útil cuando se requiere la
identificación de varios patógenos en la sangre u
otros fluidos corporales. La PCR-RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción)
(v. más adelante) amplifica regiones con posibles polimorfismos genéticos que, al ser tratados
con enzimas de restricción específicas, producen
fragmentos de ADN de diferentes longitudes
según la presencia o ausencia de determinados
polimorfismos. La RT-PCR es una variante de la
PCR que utiliza la enzima transcriptasa inversa
(o retrotranscriptasa) para obtener ADN complementario (ADNc) a partir del ARN. El ADNc
es luego utilizado como molde en la PCR. De
esta forma se puede evaluar la cantidad de ARN
mensajero (ARNm), es decir, la expresión de un
gen concreto en un tejido o incluso en una única
célula, lo que equivaldría (aunque no siempre es
así) a conocer la cantidad de esa proteína. Esto
puede ser de gran utilidad cuando se quieren analizar variaciones en la expresión génica debidas a
situaciones patológicas.
Actualmente se utiliza la PCR a tiempo real o
cuantitativa (qPCR, del inglés quantitative PCR).
A diferencia de la PCR convencional, donde se
detecta el producto acumulado al cabo de cierto
número de ciclos, en la qPCR el producto se mide
a medida que se va formando. Para ello se utilizan
sondas o reactivos fluorescentes que, a medida
que el producto se amplifica, emiten un nivel de
fluorescencia que es proporcional a la cantidad
de ADN (o ADNc) presente en la muestra.
Aplicaciones biomédicas
Son numerosas las aplicaciones biomédicas
derivadas de la PCR. A partir del ADN genómico
humano, generalmente obtenido de linfocitos,
se puede detectar la presencia de mutaciones
y polimorfismos asociados con enfermedades
hereditarias (talasemias, hemofilias, deficiencia de antitripsina, distrofias musculares y
muchas otras), o con la predisposición a distintas enfermedades (como los polimorfismos
de ciertos genes asociados a la aparición de algunos tumores malignos).
También permite diagnosticar la presencia de
gérmenes patógenos, bacterianos o víricos con
una alta sensibilidad, gracias al elevado poder de
amplificación de esta técnica. El ADN o ARN del
microorganismo puede ser detectado antes de la
producción de anticuerpos específicos («período
ventana» o estado seronegativo de las enfermedades infecciosas), e incluso antes de la aparición de
síntomas. Por ejemplo, es habitual utilizar la PCR
para la detección e identificación del virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) (fig. e2-4).
Además de su utilidad en el seguimiento de
las terapias retrovíricas, esta técnica permite la
detección precoz del virus en bancos de sangre o
en neonatos de madres seropositivas. La técnica
consiste en detectar secuencias específicas de los
genes víricos gag, env o pol, ya sea de ARN vírico o
del ADN provírico inserto en las células del hospedador. El ARN vírico se detecta en muestras de
plasma sanguíneo mediante RT-PCR; es decir, primero se hace la retrotranscripción de ARN vírico
a ADNc y luego se amplifican las secuencias de
interés. Existen diversos productos comerciales
para detectar las secuencias de interés diagnóstico,
FIGURA E2-4 Ejemplo de amplificación por RT-PCR
del gen env del VIH-1 a partir de plasma de pacientes
portadores del virus (calles 2, 3 y 4) y no portadores del virus
(calles 5 y 6). La calle 1 es el marcador de peso molecular
y las calles 7 y 8 son controles positivos (muestras que dan
a conocer el resultado positivo de la RT-PCR). (Imagen
procedente de: Dra. A. M. Suburo. Facultad de Ciencias
Biomédicas, Universidad Austral.)
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
que generalmente utilizan qPCR por proporcionar
resultados cuantitativos.
FINGERPRINT DE ADN
La huella genética o fingerprint de ADN permite la
identificación de diferentes individuos dentro de
una misma especie o población. Aunque en una
misma especie los genomas poseen una secuencia
común, también poseen regiones variables que
son propias de cada sujeto. Estos polimorfismos
pueden ser utilizados para la identificación de
personas, ya que es poco probable que dos seres
humanos no relacionados tengan los mismos polimorfismos. El conjunto de polimorfismos espe­
cíficos de cada persona se conoce como perfil
genético y es único e invariable a lo largo de la
vida.
Actualmente se conoce la ubicación física
(locus), en cada cromosoma, de las distintas
secuencias codificantes o no codificantes que
componen el genoma. Cada locus cromosómico
puede tener una o más variantes de esa secuencia,
conocidas como alelos. En la población pueden
existir múltiples alelos, pero cada célula diploide
solo tiene dos alelos de cada gen: uno de origen
materno y otro de origen paterno. El polimorfismo se define como la existencia simultánea, en
una población, de genomas con distintos alelos
para un locus determinado. Los polimorfismos
pueden encontrarse tanto en regiones codificantes como no codificantes del genoma. Cuando
el polimorfismo afecta a un único nucleótido se
denomina polimorfismo de nucleótido único
(SNP, del inglés single-nucleotide polymorphism).
Por ejemplo, en el gen del receptor tipo 1 de
TGF-b (TGFBR1) se describen diversas variantes
polimórficas. Una de ellas es la Int7G24A, denominación que indica que la G24 del intrón 7 puede estar reemplazada por una A (fig. e2-5). Para
determinar la presencia de una u otra variante,
la zona del ADN genómico correspondiente al
TGFBR1 es amplificada por qPCR.
Existen diversos tipos de polimorfismos,
como las secuencias repetidas VNTR-minisatélites (del inglés variable number of tandem repeats)
y las STR (del inglés short tandem repeats) que
difieren en el número de repeticiones. El análisis de los polimorfismos de longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP, del inglés restriction fragment length polymorphism) fue la primera
técnica utilizada para evaluar estas variantes en
1985 por Sir Alec Jeffreys. Como se mencionó en
el apartado de la PCR, el fragmento que se va a
estudiar se amplifica previamente y luego es digerido por enzimas de restricción, que producen
fragmentos diferentes según la secuencia amplificada. Actualmente existen diversas técnicas más
eficientes y rápidas, como las amplificaciones
de secuencia por PCR multiplex y la separación de los fragmentos por electroforesis capilar
o ensayos comerciales de amplificación por
qPCR. En el caso de los SNP, puede utilizarse la
secuenciación (v. más adelante) para verificar las
bases modificadas.
Los polimorfismos son de gran utilidad en
medicina forense, ya que el análisis de restos
humanos (especialmente en casos de incendios, accidentes o desastres), mediante fingerprint de ADN permite la identificación de sospechosos de delitos y puede utilizarse también
en pruebas de paternidad o parentesco. Otros
polimorfismos se asocian con determinadas
patologías, ya que indican susceptibilidad a
presentar determinadas enfermedades como
cáncer, enfermedades cardiovasculares, diabetes
o patologías del sistema nervioso. También se
conocen polimorfismos asociados a la distinta
respuesta a fármacos. Este es un campo novedoso, aunque sujeto a controversias, de desarrollo
cada vez más acelerado, ya que se intenta llegar a
FIGURA E2-5 Secuenciación para determinar el polimorfismo Int7G24A del TGFBR1 en pacientes con cáncer colorrectal.
Los esquemas muestran las secuencias de tres pacientes, un homocigoto para la variante G (G/G), un heterocigoto (G/A)
y un homocigoto para la variante A (A/A). (Imagen procedente de: Castillejo et al. BMC Cancer 2009;9:406.)
27.e5
Biología celular biomédica
una medicina personalizada, donde los métodos
de diagnóstico y el tratamiento se adecúen al
genoma de cada individuo.
El ADN mitocondrial (ADNmt) también puede ser utilizado para el análisis de individuos.
Las mitocondrias contienen ADN circular que
codifica para 37 genes y que es de herencia materna. El uso del ADNmt es ventajoso, ya que en
cada célula existen hasta 1.000 copias, superando
enormemente a las dos copias del ADN genómico. Esto permite la obtención de ADN aun en
casos de muestras muy escasas, con ADN degradado o que sufrieron el paso del tiempo (p. ej.,
restos esqueléticos). Además puede resultar útil
para determinar la filiación por vía materna. Las
STR del cromosoma Y son muy convenientes
para estudiar el patrón genético de un individuo
masculino. Por ejemplo, en los casos de agresión
sexual, permiten identificar pequeñas cantidades
de ADN masculino en presencia de grandes cantidades de ADN femenino. También se pueden
usar para determinar el parentesco de varones a
través de la vía paterna.
27.e6
SECUENCIACIÓN DE ADN
Junto con la PCR, la secuenciación del ADN
es, sin duda, otro gran pilar en el campo de
la biología molecular y del diagnóstico médico. Secuenciar el ADN significa determinar la
secuencia de nucleótidos (A, T, G, C) que conforma una hebra de ADN (y, por lo tanto, su
complementaria) en el orden correcto. Algunos
ejemplos de los usos que tiene la secuenciación
del ADN son el diagnóstico genético, las pruebas forenses, el desarrollo de medicamentos
basados en la tecnología del ADN recombinante, el desarrollo de terapias génicas, etc. Durante
las décadas de los sesenta y setenta del siglo xx
se desarrollaron diversos métodos para la se­
cuenciación del ADN. Sanger y sus colabora­
dores crearon un método que se estableció como
referencia y en el cual se han basado otros
­sistemas de secuenciación posteriores. Los se­
cuenciadores de alto rendimiento de final del
siglo xx (que permitieron, entre otros hitos, se­
cuenciar el genoma humano) se basan en la tec­
nología desarrollada por Sanger.
El método de secuenciación de Sanger se
fundamenta en el concepto de «interrupción
de la cadena». Se trata de una reacción de PCR
especial. A esta PCR se añaden desoxirribonucleótidos dA, dC, dT y dG como en las PCR
rutinarias, pero además se añade una versión
modificada de cualquiera de los cuatro nucleótidos ddA, ddC, ddT o ddG (aquí dd significa
«didesoxi-»). Se realizan cuatro reacciones de
secuenciación. En ellas, la PCR sigue su curso
normal, pero cuando la polimerasa añade un
nucleótido dd a la cadena sintetizada, la reacción
se para. Los nucleótidos dd son suficientemente
parecidos químicamente a los d, que son los
verdaderos componentes del ADN, como para
ser reconocidos por la polimerasa y añadidos a
la hebra de ADN, pero la carencia de un grupo
hidroxilo 39 imposibilita la unión covalente del
siguiente nucleótido en la secuencia, parándose
entonces la reacción. Puesto que en la reacción
coexisten los nucleótidos d y los dd, la inclusión
de unos u otros en la cadena se produce al azar.
Por lo tanto, en la reacción se generan productos
de PCR de todos los tamaños posibles. Mediante electroforesis de ADN, se pueden analizar
estos fragmentos y determinar la secuencia.
Una modificación que sufrió esta técnica fue
la adición de marcadores fluorescentes de distintos colores a los didesoxirribonucleótidos;
de este modo, en vez de cuatro reacciones, se
pasó a un único tubo y se posibilitó en análisis
automático informatizado de los resultados de
la electroforesis (fig. e2-6).
Existen otras técnicas de secuenciación
que han sido desarrolladas recientemente y
que, basándose en distintos principios, alcanzan una mayor eficacia en la secuenciación a
precios más asequibles (lo cual es importante
debido a la gran longitud de los genomas). A
estas tecnologías se les denomina secuenciación
de nueva generación. Algunos ejemplos son
la pirosecuenciación, SOLiD o Solexa. En un
futuro próximo, estos tipos de secuenciación
irán sustituyendo la metodología basada en la
reacción de Sanger, que sigue siendo actualmente el método más utilizado.
HIBRIDACIÓN IN SITU
DE ÁCIDOS NUCLEICOS
La técnica de hibridación in situ (ISH) permite localizar una secuencia específica de ácidos
nucleicos en cortes de tejidos. Actualmente, se
ha convertido en una herramienta muy útil en
cualquier laboratorio de investigación dedicado
a la biología molecular y celular. La hibridación
in situ se aplica para estudiar la expresión génica
diferencial o las alteraciones genómicas en distintas patologías. Esta técnica se basa en la complementariedad de bases de los ácidos nucleicos,
de modo que un polinucleótido marcado denominado sonda hibridará con una secuencia complementaria (diana) localizada en una sección
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
FIGURA E2-6 Esquema del proceso de secuenciación del ADN. La reacción de PCR incluye los desoxirribonucleótidos
empleados para construir la cadena normal de ADN, junto con didesoxirribonucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP)
marcados con sustancias fluorescentes. La introducción al azar de cualquiera de estos didesoxirribonucleótidos en la hebra
de ADN en formación interrumpe la adición de un nuevo nucleótido. Esto hace que se formen especies de ADN con todos los
tamaños posibles: desde las que contienen todos los nucleótidos hasta las que solo han incorporado uno; esto permite conocer
la secuencia del ADN.
histológica, en células aisladas o en cromosomas
(fig. e2-7).
En función de las moléculas implicadas,
podemos encontrar tres tipos de uniones: ADNADN, ADN-ARN y ARN-ARN. La técnica de ISH
permite detectar cambios estructurales en el
genoma (ADN-ISH), o cambios en los niveles de
expresión del ARN (ARN-ISH). El marcaje de la
sonda puede ser radiactivo (algunos átomos de
los nucleótidos se sustituyen por isótopos radiactivos como 32P, 33P, 3H, 35S, 125I) y no radiactivo (unión
a los nucleótidos de moléculas no radiactivas
como la biotina, digoxigenina o fluorocromos).
Las moléculas marcadoras se pueden detectar posteriormente por una reacción antígeno-anticuerpo.
Cuando la molécula marcadora es un fluorocromo,
la técnica se denomina hibridación in situ fluorescente (FISH) y la reacción se puede visualizar
directamente en un microscopio de fluorescencia.
En la detección de ARN se pueden usar sondas
de ARN o ADN, aunque el empleo de sondas de
ARN (ribosondas) es más frecuente, ya que la
unión ARN-ARN es más estable que la unión
ARN-ADN, y las sondas de ARN hibridan mejor
in situ que las de ADN. A pesar de las numerosas
ventajas de las ribosondas, su obtención es laboriosa y requiere el empleo de diferentes técnicas
de biología molecular. Además, el manejo y la
conservación del ARN son delicados debido al
carácter ubicuo de las ARNasas, enzimas de difícil
inactivación. Las ribosondas se obtienen mediante
transcripción in vitro a partir de una secuencia de
ADN clonada en un vector que posea los promotores para su transcripción. El marcaje de los
transcritos se realiza mediante la incorporación
de nucleótidos marcados en la reacción de transcripción. Para localizar secuencias de ADN se utilizan sondas de ADN. En el protocolo es necesario
incluir un paso de desnaturalización del ADN
para que pueda tener lugar la hibridación de la
sonda diana. También existen sondas LNA y PNA,
constituidas por análogos de ácidos nucleicos, que
hibridan con mayor especificidad y estabilidad.
Las aplicaciones de la ISH en el diagnóstico
clínico se centran principalmente en dos aspectos:
●
Detección de la expresión de ARNm en patologías. Se emplea por ejemplo en tumores
27.e7
Biología celular biomédica
27.e8
FIGURA E2-7 Hibridación in situ de ácidos nucleicos. A. Esquema simplificado de la técnica. La hibridación in situ implica
la fabricación de una sonda marcada cuya secuencia es complementaria a la que se quiere detectar en el ADN problema.
La molécula marcadora permitirá detectar la unión de la sonda solo en las células en las cuales está presente la secuencia
problema. B. Imagen de hibridación in situ que muestra un ganglio linfático con células infectadas por el virus Epstein
Barr (en color azul oscuro). En este caso, la sonda hibrida específicamente con una secuencia del genoma viral. (Imagen
procedente de: Dra. Jackeline Agorreta, Departamento de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra.)
neuroendocrinos para confirmar que las
células del tumor son las responsables de un
aumento del nivel de alguna hormona en
sangre, pero el tumor es negativo por inmunohistoquímica. Asimismo, la técnica de
ISH se emplea en el diagnóstico de tumores
hepáticos y linfomas de células B.
● En virología, esta técnica se utiliza tanto para
identificar una infección vírica como para deter­
minar su extensión. Se usa para el análisis de
diversas infecciones como las del virus del
papiloma humano, virus de la hepatitis B
y C y virus Epstein Barr (v. fig. e2-7). La combinación de la técnica de ISH con la inmunohistoquímica permite localizar los lugares de
infección activa y detectar infecciones víricas
ocultas en pacientes inmunodeprimidos.
TERAPIA GÉNICA
Como hemos indicado con anterioridad, la tecnología del ADN recombinante permite la manipulación y transferencia de genes entre distintos
organismos. Tras su desarrollo, no tardó mucho
en plantearse el empleo de dicha tecnología en el
campo de la medicina. La terapia génica consiste
en tratar enfermedades mediante la introducción
en el organismo de genes terapéuticos, es decir,
genes «sanos» que reemplacen los genes que están
alterados o ausentes en una determinada enfermedad. Por lo tanto, en vez del uso clásico de fármacos, consistiría en corregir el defecto genético que
da lugar a esa enfermedad, mediante la aplicación
exógena de genes (fig. e2-8).
Actualmente se investiga sobre la posibilidad
de aplicar la terapia génica en un gran número de
enfermedades, pero, por desgracia, solo un
pequeño porcentaje de ellas están siendo tratadas
con éxito en humanos. No obstante, el campo de
la terapia génica sigue mirando con optimismo
al futuro, y va incorporando nuevos avances técnicos de la biología molecular para solventar las
dificultades de bioseguridad que en su momento
impidieron la aplicación eficaz de estrategias terapéuticas concretas.
Dependiendo del defecto genético causante
de la patología, la estrategia de la terapia génica
será distinta. En el caso de que una enfermedad
sea causada por la falta de un gen concreto, la
introducción del gen permite que se produzca
la proteína. En cambio, en otros casos la causa molecular es la mutación de un gen que
genera una proteína anómala que causa la enfermedad. En este caso, la terapia génica intenta
corregir dicha mutación o eliminar las variantes
mutantes. Las alternativas terapéuticas de la terapia génica son fundamentalmente las siguientes:
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
27.e9
FIGURA E2-8 Esquema de la terapia génica ex vivo. El gen terapéutico se inserta en un virus modificado para que no
se produzcan efectos adversos. Las células patológicas extraídas del paciente (médula ósea, sangre, etc.) se infectan con
el virus y el gen terapéutico corrige su defecto. Posteriormente las células se reintroducen en el paciente.
●
●
●
●
●
Terapia de aumento génico (GAT, del inglés
gene augmentation therapy): consiste en introducir el gen terapéutico del cual carece el
tejido enfermo.
Corrección de mutaciones.
Eliminación selectiva de las células patológicas, mediante la transferencia de genes
«tóxicos».
Activación del sistema inmunitario contra el
tejido enfermo mediante estrategias de terapia
génica, como vacunación con ADN recombinante o transferencia de ADN codificante para
citoquinas inmunoestimuladoras.
Inhibición génica: mediante estrategias con
ácidos nucleicos «antisentido» o de ARN de
interferencia.
La terapia génica puede realizarse tanto directamente sobre el individuo enfermo (in vivo)
como sobre tejidos previamente aislados de este
para su posterior reimplantación (ex vivo). Un
ejemplo de método ex vivo es la extracción de
sangre o médula ósea de un paciente, su cultivo
en el laboratorio (durante el cual se introduce el
gen o ADN recombinante de interés) y la posterior reinfusión en el paciente (v. fig. e2-8). La
terapia génica puede clasificarse en somática o
germinal. En la terapia somática se tratan células
del organismo adulto, pero el defecto genético
no es corregido en las células germinales, por lo
que no sería transmitido a la descendencia. La
terapia génica germinal acarrea serios problemas
éticos al modificar la información genética de
la línea germinal de un individuo. Por ejemplo,
podría aplicarse con vistas a la mejora genética,
por lo que su uso no está permitido.
De modo teórico, muchas enfermedades
podrían ser corregidas mediante terapia génica.
La principal dificultad que encuentra su aplicación es el desarrollo de métodos eficaces y
27.e10
Biología celular biomédica
selectivos para la introducción del gen en las
células adecuadas en cada caso. Muchas veces
no se consigue introducir el factor terapéutico
en el suficiente número de células enfermas.
En otras ocasiones, la introducción del factor
terapéutico en células sanas puede resultar peligrosa (un gen puede curar a un tipo celular pero
afectar gravemente a otro). Por todo esto, los
mayores esfuerzos en el campo de la terapia
génica se centran en el desarrollo de vehículos
(vectores) que transfieran el factor terapéutico
a las células deseadas de un modo selectivo.
Los principales vectores empleados en terapia
génica son virus que causan enfermedades en
mamíferos. Estos virus son modificados de
modo que dejen de ser peligrosos y patógenos,
pero mantengan su capacidad de penetrar en
células de mamífero. En el genoma de estos
virus se incluye la secuencia terapéutica que
se quiere introducir en la célula enferma, eliminando las secuencias que permiten la replicación vírica (v. fig. e2-8). Se pueden utilizar
diferentes tipos de virus, cada uno de ellos con
ventajas e inconvenientes. La elección de uno
u otro depende de la patología, de la estrategia
terapéutica que se quiera utilizar y del tejido
diana. Los adenovirus y virus adenoasociados
son virus frecuentemente utilizados en terapia génica. Otro tipo de virus (cuyo genoma
se integra en el genoma del hospedador) es
el retrovirus, pero la aparición de tumores en
varios pacientes durante los ensayos clínicos los
ha descartado por el momento para la terapia
génica. Además de los virus, existen otras alternativas para introducir ADN recombinante en
células. En general, los principales métodos que
se están probando en terapia génica son:
●
Virus: adenovirus, virus adenoasociados,
retrovirus, virus del herpes simple y lentivirus.
● Microbalas: consiste en recubrir diminutas
partículas de metal con el ADN recombinante.
Mediante una pistola especial (pistola génica), se lanzan las partículas contra el tejido
diana.
● Reactivos químicos: existen reactivos químicos capaces de transportar el ADN e introducirlo a través de la membrana celular.
● Anticuerpos: mediante un anticuerpo se puede vehiculizar un complejo que contenga el
factor génico terapéutico para que entre en la
célula diana.
Existen muchas circunstancias que hacen que
una patología pueda ser más o menos tratable
mediante terapia génica. Las más importantes
son las siguientes:
●
Complejidad genética de la enfermedad: las
enfermedades genéticas monogénicas son, en
principio, mejores candidatas para la terapia
génica que las complejas, en las que están
involucrados varios defectos genéticos.
● Dominancia y penetrancia del defecto genético: los defectos genéticos recesivos y/o poco
penetrantes auguran mayor probabilidad de
éxito que los dominantes.
● Tipo de defecto: la falta de un gen es más fácilmente tratable que el exceso o la mutación.
La carencia de un gen se puede tratar mediante
terapia de aumento génico, y en muchas ocasiones no requiere la transferencia del factor a
todas las células enfermas. En cambio, cuando el
defecto incluye la presencia de un gen alterado,
es complicado eliminarlo o corregirlo totalmente,
algo que, por lo general, incluiría un acceso de la
terapia a todas las células portadoras del defecto.
El primer caso célebre de terapia génica fue la
introducción en 1990 del gen ADA (adenosina
desaminasa) ex vivo en la sangre de dos niñas con
inmunodeficiencia combinada severa (causada
por la falta de dicho gen). Tras ser reinfundida la
sangre en la que se corrigió el defecto genético,
las niñas comenzaron a desarrollar las funciones
inmunológicas de las que carecían. Hoy en día
se investiga profusamente en modelos animales
la aplicación de terapias génicas aplicadas a un
gran número de patologías humanas. Existen
actualmente ensayos clínicos para enfermedades
genéticas hereditarias (inmunodeficiencia combinada severa, fibrosis quística o hipercolesterolemia familiar), cáncer, desórdenes inmunológicos,
Parkinson o SIDA.
MICROARRAYS Y MICROCHIPS
PARA ESTUDIOS GENÓMICOS
DE EXPRESIÓN A GRAN ESCALA
Fundamento de la técnica
Muchos procesos biológicos ocurren por cambios
en la expresión de diversos genes, lo que desencadena una modificación en la fisiología celular.
Para investigar estos cambios, tradicionalmente se
han utilizado técnicas como el northern blot, RTPCR (ambas destinadas a conocer la cantidad de
ARNm para un gen concreto presente en un tejido
o célula) o Western blot (para el caso de proteínas;
v. más adelante). Pero estas tecnologías permiten
el análisis de pocos ARNm/proteínas en cada
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
ensayo. La técnica de microarrays proporciona
métodos rápidos y proporcionalmente asequibles desde el punto de vista económico para el
estudio de la expresión de miles de genes en un
solo ensayo, lo que permite una visión global de
la actividad celular.
Los microarrays consisten generalmente en
fragmentos de ADN inmovilizados en puntos
definidos de una manera ordenada y precisa, en
un soporte físico (fig. e2-9). Los soportes están
fabricados de vidrio, silicona o plástico, donde se
depositan las sondas, que consisten en fragmentos de ADN con una secuencia de nucleótidos que
hibridará con un gen concreto. El ADN sonda de
los microarrays puede tratarse de:
●
Oligonucleótidos (de una longitud de 20-65
pares de bases): se emplean frecuentemente
en experimentos de genotipado con el fin
de detectar mutaciones o polimorfismos, así
como en experimentos para evaluar la expresión génica.
● ADNc completo o parcial (500-5.000 pares
de bases): se emplean para el análisis de la
expresión génica.
● ADN genómico (50.000 pares de bases): su
uso está destinado principalmente al estudio
de pérdidas o ganancias génicas (arrays de
CGH, véase más adelante).
En los microarrays de expresión, las muestras de
ARNm se preparan a partir de células en cultivo
o tejidos de interés. Se procede a la obtención del
ADNc a partir del ARNm mediante retrotranscripción, utilizando nucleótidos marcados con
sustancias fluorescentes, para conseguir ADNc
marcado. El ADNc se deposita sobre el microarray
para su hibridación con las sondas. Una vez se ha
producido la hibridación, se procede a eliminar
el ADNc no hibridado y a la cuantificación de
cada una de las sondas hibridadas del microarray
mediante programas informáticos. Habitualmente,
el ADNc de la muestra patológica, marcada con
una sustancia fluorescente (p. ej., con un fluorocromo de color rojo) se mezcla en la hibridación con
el ADNc de la muestra normal (marcada, p. ej.,
con un fluorocromo de color verde). Por lo tanto,
si la cantidad de ARNm expresada por un gen se
encuentra incrementada en la muestra patológica
con respecto a la muestra normal, el color resultante en el punto donde se localizaba la sonda correspondiente será el rojo. Si, por el contrario, hay una
mayor cantidad de ARNm en la muestra normal,
el color resultante será el verde. Una expresión
equivalente de un gen en la muestra normal y en
la patológica daría lugar a un color amarillo. Este
patrón de colores se utiliza para valorar y cuantificar los datos de los microarrays y poder interpretar
los resultados de expresión (v. fig. e2-9).
FIGURA E2-9 A. Esquema de la preparación de muestras para un microarray de expresión. El ARNm de muestras sanas
y patológicas se convierte mediante retrotranscripción en ADNc marcado con un fluorocromo que emite luz verde (para la
muestra sana) o rojo (para la patológica). A continuación, estos ADNc se hibridan competitivamente con sondas específicas
para cada gen situadas en cada uno de los puntos del microarray. Dependiendo de la cantidad de ADNc «verde/rojo» para
cada gen en la muestra sana/patológica se obtendrá un color distinto, que se relaciona con la cantidad de expresión
(cantidad de ARNm) que tenía cada muestra. B. Imagen de un microarray de expresión hibridado.
27.e11
27.e12
Biología celular biomédica
Aplicaciones biomédicas
Aunque la tecnología de los microarrays todavía
no se utiliza con fines diagnósticos de modo
rutinario, es una técnica con un gran potencial
en este sentido. Las aplicaciones posibles de los
microarrays son muy diversas:
●
Conocimiento de los cambios globales en la
expresión génica de tejidos patológicos.
● Descubrimiento de nuevos genes causantes
de enfermedades.
● Estimación de la evolución de una enfermedad. El estudio de genes asociados con la
evolución de los pacientes tras la aplicación
de una terapia podría predecir el pronóstico
de dicha enfermedad.
● Farmacogenómica: gracias a la identificación
de genes centinelas (o biomarcadores) que
demuestran una expresión alterada en una
célula o tejido determinado tras la aplicación
de un fármaco, se podría determinar si dicho
fármaco va a ser efectivo y no va a causar
toxicidad en un paciente.
TRANSFERENCIA DE ADN
A CÉLULAS Y EMBRIONES
DE MAMÍFEROS. DESARROLLO
DE ANIMALES TRANSGÉNICOS
Y KNOCK OUT
La capacidad de introducir genes de nuestro interés
en una célula y expresarlos en grandes cantidades
(o, por el contrario, disminuir artificialmente su
expresión basal) permite conocer mejor la función
de dichos genes. Por otro lado, la terapia génica se
basa también en la capacidad de transferir determinados genes en células alteradas. El proceso de
introducción de ADN exógeno en células se llama
transfección, cuando se hace de modo directo,
y transducción cuando se introduce mediante infección vírica. Existen varios métodos de transfección,
entre los que citaremos: a) la electroporación, por
el que las células se incuban con ADN en unos
tubos de ensayo especiales que contienen electrodos y se aplica una pequeña corriente eléctrica
que hace que en la membrana se creen poros por
los que se introduce el ADN, y b) el uso de liposomas, pequeñas esferas de membrana artificial
donde se puede meter el ADN por determinados
métodos químicos. Los liposomas se fusionan
con la bicapa lipídica de la membrana celular e
introducen el ADN en el citoplasma.
Estos métodos permiten modificar genéticamente las células para ver cómo cambian
sus propiedades o para la creación de animales
transgénicos y knock out. Para la creación de animales transgénicos (habitualmente ratones),
primero hay que fabricar un vector adecuado que
contendrá la secuencia de ADN de interés, la cual
lleva el gen codificante para la proteína que se
quiere introducir. La expresión de este gen puede
estar controlada por un promotor específico de
tejido o por un promotor genérico que permitirá la
expresión del gen en todas las células del organismo. En ambos casos, el promotor está situado en
la región 5 de dicho gen introducido en el vector.
El vector se transfiere a un cigoto, donde el ADN
se integrará en los cromosomas y, tras su implantación en una hembra preparada para la gestación,
se obtendrán animales que llevarán en todas sus
células ese transgén. Pero eso no quiere decir necesariamente que todas sus células vayan a expresar
o a producir la proteína codificada por el transgén,
porque como se puede utilizar un promotor específico, solo se expresará en células del tejido que sea
capaz de activar al promotor (fig. e2-10).
Los ratones knock out (KO) son ratones
alterados genéticamente en los que, utilizando
técnicas de ingeniería genética, se elimina uno de
sus genes. Si en los ratones transgénicos lo que
se intenta es aumentar la expresión de un gen
concreto, en los ratones KO se elimina la función de un gen. El propósito es ver qué papel
tienen dichos genes en el organismo; si se elimina
un gen y no ocurre nada, es que ese gen no es vital
para el ratón, pero si observamos un fenotipo
patológico podremos conocer en qué funciones
fisiológicas participaba ese gen.
El primer paso para generar estos ratones es
construir un fragmento de ADN con una secuencia
modificada que reemplace a la secuencia original
del gen, con el fin de inactivarlo. Este fragmento
debe incluir una secuencia «de selección» (que va
a expresar un gen de resistencia frente a un agente
tóxico) flanqueada por secuencias idénticas a la
del locus del gen que se quiere inactivar, para que
pueda tener lugar la recombinación homóloga.
Tras la recombinación entre el ADN exógeno y
el ADN genómico, se cultivan las células con el
agente tóxico cuyo gen de resistencia lleva el vector
(p. ej., la neomicina); solo sobrevivirán entonces
las células que lo hayan incorporado (fig. e2-11).
A partir de un blastocisto de ratón (un embrión
temprano, formado por una masa esférica de células indiferenciadas rodeada por células extraembrionarias) se aíslan las células madre embrionarias (ES, del inglés embryonic stem) que se cultivan
in vitro. En estas células se transfiere el fragmento
de ADN que hemos generado para que tenga lugar
la recombinación homóloga. El ADN exógeno se
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
27.e13
FIGURA E2-10 A. Esquema simplificado de la generación de ratones transgénicos. En la región 5’ del transgén
(en este caso el oncogén antígeno T) se introduce un promotor que permitirá la expresión del mismo en un tejido específico,
como por ejemplo la glándula mamaria. Tras la transferencia del ADN a un cigoto e introducción del mismo en una ratona
preparada hormonalmente para la gestación, se obtendrá una progenie que lleva en todas sus células el transgén, pero que
solo lo expresa en el tejido específico. B. Fotografías de ratones transgénicos C3(1)/Tag hembras donde
la expresión del antígeno T en la glándula mamaria genera tumores. (Imágenes procedentes de: Dr. A. Calvo. Departamento
de Histología y Anatomía Patológica, Universidad de Navarra.)
integrará en el genoma mediante recombinación
homóloga con el ADN genómico de la célula, de
tal manera que se sustituye la secuencia original
por la del ADN exógeno. Pero la frecuencia de
recombinación es muy baja, y en la mayoría de las
células se recombina uno solo de los alelos. Por lo
tanto, las células modificadas son heterocigóticas
para ese gen. Las células que han incorporado el
transgén se seleccionan mediante la adición del
agente tóxico que va a permitir que solo sobrevivan
las que han incorporado esta secuencia de ADN.
En este momento tenemos células embrionarias con uno de los alelos deficientes para el gen
que queremos eliminar. ¿Cómo conseguir, a partir
de esto, un ratón en el cual todas las células de su
organismo tengan las dos copias deficientes para
ese gen? Para ello hay que recurrir a determinadas
técnicas genéticas. Supongamos que las células ES
se obtuvieron de un ratón marrón; en este caso,
las células ES con una copia deficiente de nues-
tro gen de interés se introducen en un blastocisto
de un ratón cuyo pelaje sea de otro color (p. ej.,
negro). Los blastocistos se implantan entonces
en el oviducto de una ratona a la que se ha preparado hormonalmente para que pueda llevar a
cabo la gestación. Los blastocistos contienen en
este momento dos tipos de células madre: las
originales, que provienen de la ratona portadora
de color negro, y las modificadas, provenientes
de una ratona de color marrón. Los ratones que
nazcan serán quimeras, porque parte del cuerpo
se ha desarrollado a partir de células madre originales de la ratona negra, y otra parte de las células
que nosotros les hemos inyectado (de la ratona
marrón). El pelaje de estos ratones tendrá, por lo
tanto, zonas negras y zonas marrones.
Los ratones quiméricos solo nos sirven si sus
células germinales (las de las gónadas) han incorporado también las células que nos interesan (las
que llevan un alelo mutado, provenientes de la
Biología celular biomédica
27.e14
FIGURA E2-11 Primeras etapas de la generación de un ratón knock out (KO) para un gen concreto. 1, aislamiento de
células embrionarias (ES) de blastocisto de ratón; 2, cultivo; 3, inyección del ADN exógeno (transgén) que lleva el gen
alterado, el cual sufrirá recombinación homóloga con el gen que se quiere eliminar presente en las células. El transgén lleva
incorporado el gen de resistencia Neor; 4, inyección de las células modificadas en un blastocisto de un ratón con pelaje
distinto al original e introducción en una ratona preparada para la gestación; 5, la descendencia dará lugar a ratones quimera.
ratona marrón), ya que podrán transmitir este gen
a la descendencia. Solo si esto es así, tras cruzar los
ratones quimera con otros negros se obtendrá una
progenie no quimérica marrón (fig. e2-12). Los
ratones obtenidos de este modo aún contienen
solo una copia funcional del gen (son heterocigóticos) en todas las células de su organismo. Estos
ratones tienen que someterse a un cruzamiento
endogámico posterior para producir un ratón que
no lleve ninguna copia funcional del gen que se
quiere inactivar, consiguiendo así una homocigosis
de ese alelo. Por lo tanto, el cruce de los ratones
marrones heterocigóticos para el transgén con otros
del mismo tipo dará lugar a una descendencia en
la que el 25% de los ratones serán homocigóticos
para el gen alterado. Tras este largo procedimiento
obtenemos ratones KO para nuestro gen de interés.
Esta técnica es valiosa, pero tiene algunas limitaciones; aproximadamente un 15% de los genes
que se eliminan son letales para el desarrollo, por
lo que los embriones genéticamente alterados no
pasan a adultos. Esto indica que son genes impres-
cindibles para la vida, pero no podemos estudiar
qué ocurre en los ratones adultos. Empleando
esta tecnología se han conseguido ratones que
sirven como modelos para estudiar el cáncer, la
obesidad, la diabetes, la ansiedad, el Parkinson
o el envejecimiento. Actualmente se están desarrollando tecnologías novedosas como la técnica
CRISPR/Cas9, que permite «editar» el genoma de
una manera muy precisa, introduciendo las modificaciones que sean de nuestro interés científico.
TÉCNICAS CITOGENÉTICAS
Las técnicas citogenéticas tienen como objetivo
estudiar los cromosomas en el contexto celular.
Son técnicas de desarrollo reciente, que en los
últimos años han experimentado un crecimiento
exponencial. Se pueden clasificar en dos grupos:
técnicas de análisis convencional y técnicas de
análisis molecular. El análisis citogenético convencional consiste en el estudio de los cromosomas metafásicos presentes en las células de
interés, obtenidos tras el cultivo in vitro del tejido.
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
27.e15
FIGURA E2-12 Segunda parte de la generación de un ratón KO. A. Los ratones quimera se cruzan con otros de color
negro. Los ratones quimera que tengan células germinales procedentes de las células que llevaban el transgén (que venían
de un ratón negro) generarán una descendencia de ratones negros heterocigóticos para el gen que se quiere eliminar;
6, el cruce endogámico de estos ratones producirá una descendencia con un 25% de ratones negros con deleción
homocigótica para el gen de interés. B. Ejemplo de ratones wild type (WT) (con fenotipo salvaje; ratón de la izquierda)
y ratones obesos (los dos de la derecha) generados por la eliminación de genes que controlan la obesidad. (Imagen
procedente de: Sakkou et al. Cell Metabolism 2007;5:450-63.)
Fundamento de la técnica
El protocolo básico para conseguir cromosomas
en metafase de una célula conlleva los siguientes
pasos (v. también capítulo 7):
●Cultivo
in vitro del tejido (sangre, médula
ósea, piel, un tumor, etc.) con un medio de
cultivo específico a 37 °C y con fitohemaglutinina para inducir la mitosis celular.
● Interrupción de la división celular mediante
la adición de un agente antimitótico como la
colchicina, que detiene la división en la metafase.
● Tratamiento de la suspensión celular con una
solución hipotónica para romper las membranas celulares, fijación de las estructuras
obtenidas y tinción de los cromosomas para
la obtención de un patrón de bandas específico.
●
Recuento y análisis de la estructura de los
cromosomas para el estudio de las posibles
alteraciones.
La técnica de tinción más utilizada en citogenética
convencional es la tinción de bandas G. Consiste
en el tratamiento de los cromosomas con tripsina
y tinción con el colorante Giemsa. De esta manera,
los cromosomas aparecen teñidos con un patrón
de bandas claras y oscuras que es específico de cada
cromosoma, puesto que es reflejo de la secuencia
de ADN presente en cada uno de ellos. La disposición ordenada de los cromosomas presentes
en la célula, denominada cariotipo (fig. e2-13),
permite detectar tanto alteraciones numéricas
(monosomías, trisomías, etc.) como estructurales
(translocaciones, inversiones, deleciones, etc.). Esta
es la técnica más utilizada para el estudio citogenético, debido a que, de forma rápida y económica,
27.e16
Biología celular biomédica
FIGURA E2-13 Imagen
de cariotipo humano.
permite llevar a cabo un análisis de todo el genoma célula a célula. Sus principales inconvenientes
son: la necesidad de disponer de tejido fresco para
poder cultivar las células de interés, y su resolución, ya que no son detectadas alteraciones que
afectan a regiones de un tamaño menor de 5 Mb.
Las técnicas de citogenética molecular están
basadas en la hibridación in situ fluorescente
(FISH), que consiste, como se ha comentado
previamente, en la hibridación de un fragmento
de ADN o ARN con secuencia conocida (sonda), marcada con una sustancia fluorescente
(fig. e2-14). El esquema básico de la técnica de
FISH convencional es el siguiente:
●
●
●
●
●
Preparación de la sonda: marcaje fluorescente
del fragmento de ADN que actúa como sonda.
Preparación del ADN diana, que puede tratarse de cromosomas en metafase o núcleos en
interfase.
Desnaturalización de las moléculas de ADN
(tanto de la sonda como de la diana) e hibridación de las secuencias.
Procesos de lavado para eliminar las uniones
inespecíficas de la sonda.
Análisis mediante el microscopio de fluorescencia.
La técnica de FISH ha revolucionado el mundo de
la citogenética desde sus primeras aplicaciones a
finales de la década de los ochenta del siglo xx, ya
que permite llevar a cabo el estudio cromosómico
sin la necesidad de tener células en cultivo. Es
capaz de detectar no solo ganancias y pérdidas
génicas, sino también translocaciones e inversiones en interfase. Además, dado que permite el
análisis célula a célula, puede describir la posible
heterogeneidad celular de la muestra. Su principal desventaja es que no se trata de una técnica
de cribado, porque requiere conocer de antemano
cuál es la región genética que se va a estudiar para
poder disponer de la sonda adecuada. La visualización de los resultados resulta laboriosa, puesto
que implica contar señales fluorescentes, célula a
célula. En la actualidad existen algunos equipos
capaces de automatizar el análisis de FISH.
Con el fin de resolver las principales limitaciones de la técnica de FISH, se han ido desarrollando
nuevas metodologías derivadas de ella; una de
las más importantes es la hibridación genómica
comparada (CGH) (v. capítulo 7). La técnica de
CGH consiste en mezclar dos ADN en cantidades
equimoleculares (un ADN problema y un ADN
normal de referencia) marcados con fluorocromos
diferentes (rojo y verde). Estos ADN compiten por
hibridar sobre un ADN diana normal en forma de
cromosomas en metafase o, más recientemente,
chips con miles de secuencias genómicas que pueden llegar a diferenciarse en un único nucleótido
(microarray-CGH y microarray-SNP). La diferencia
de material genómico entre el ADN problema y
el de referencia se manifiesta en una diferencia
de intensidad rojo-verde en cada punto del micro­
array. La imagen obtenida en el microscopio de
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
FIGURA E2-14 Técnica
FISH para la detección de la
amplificación del gen ERBB2 en
una muestra de tumor de mama.
La sonda de color rojo identifica
el gen ERBB2 y la sonda de
color verde, el centrómero del
cromosoma 17, donde se localiza
este gen. Las flechas rojas indican
células tumorales con ganancia
génica (5-10 copias del gen), y la
flecha blanca señala una célula
normal con dos copias del gen
y del centrómero del cromosoma.
(Imagen procedente de: Servicio
de Análisis Genéticos de la
Universidad de Navarra.)
fluorescencia o en un escáner es cuantificada por
un programa informático que calcula el cociente de las intensidades de cada fluorocromo en
cada región, dando información de la ganancia o
pérdida de material genómico para dicha región.
La gran ventaja de la técnica CGH es que, al
igual que la citogenética convencional, describe
las alteraciones presentes en todo el genoma,
pero con una elevada resolución. Su principal
inconveniente reside en no ser capaz de detectar
reordenaciones equilibradas que no supongan
un cambio en la cantidad de material genómico.
Aplicaciones biomédicas
Las diversas técnicas anteriormente descritas permiten estudiar alteraciones presentes en enfermedades
tanto congénitas como adquiridas. Las enfermedades congénitas son aquellas que afectan al individuo desde el nacimiento. Muchas de ellas tienen
un origen cromosómico. Tras el examen clínico, su
diagnóstico citogenético se lleva a cabo obteniendo
el cariotipo principalmente a partir del cultivo de
sangre periférica del paciente. En ocasiones, es necesario además recurrir a la técnica de FISH para describir el mosaicismo de la enfermedad (presencia
de clones celulares con dotaciones cromosómicas
diferentes). Para algunas enfermedades causadas
por microdeleciones, la resolución del cariotipo
no es suficiente, por lo que se recurre al análisis
mediante FISH utilizando una sonda específica
de la región delecionada y/o microarrays de CGH.
Recientemente se están haciendo grandes
esfuerzos para identificar las alteraciones que causan retraso mental. En muchas ocasiones, el cariotipo de los pacientes es normal, y sus características
clínicas y fenotípicas no permiten identificar la
enfermedad que pueda ser estudiada mediante
una sonda de FISH. En estos casos, la técnica de
microarrays de CGH ha posibilitado la identificación de alteraciones que afectan a regiones de
menos de 3 Mb, características de este tipo de enfermedades. En la tabla e2-1 se presentan algunas
de las enfermedades congénitas más importantes
y las alteraciones cromosómicas asociadas a ellas.
En cuanto a las enfermedades adquiridas,
el análisis citogenético se ha incorporado en
los laboratorios de genética como una técnica
que complementa el diagnóstico morfológico e
inmunofenotípico de neoplasias hematológicas
y tumores sólidos. La citogenética no solo aporta
valor diagnóstico, sino que además permite:
●
Definir el pronóstico del paciente: por ejemplo, en las leucemias agudas linfoides tipo B,
27.e17
27.e18
Biología celular biomédica
TABLA E2-1 Ejemplos de enfermedades congénitas en relación a sus alteraciones
citogenéticas
Enfermedades congénitas
Alteración citogenética
Trisomías
Down
Edwards
Patau
Klinefelter
+21
+18
+13
47,XXY
Monosomías
Turner
45,X
Alteraciones estructurales
Cri du chat
Prader-Willi y Angelman
DiGeorge
Williams
Wolf-Hirschhorn
del 5p15.2
del 15q11-13
del 22q11.2
del 7q11.23
del 4p16.3
Inestabilidad cromosómica
Región de fragilidad
Ataxia-telangiectasia
Síndrome de X frágil
11q22-23
Xq27.3
del, deleción, pérdida de un fragmento cromosómico; p, brazo corto del cromosoma; q, brazo largo del cromosoma.
la hiperdiploidía de más de 50 cromosomas
y la presencia de la translocación t(12;21)/
ETV6-AML1 definen un pronóstico favorable,
mientras que la casi haploidía (23-28), la
presencia de la t(9;22) y la t(4;11)/AF4-MLL
indica un pronóstico desfavorable.
● Definir la respuesta que va a tener a un determinado tratamiento: por ejemplo, la presencia de
la t(15;17) en la leucemia aguda promielocítica
permite seleccionar a los pacientes que son susceptibles de ser tratados con ácido retinoico.
● Controlar la progresión de la enfermedad.
● Controlar el éxito de un trasplante de médula
ósea.
La lista completa de alteraciones cromosómicas
descritas en neoplasias hematológicas puede
consultarse en la siguiente base de datos: http://
www.ncbi.nml.nih.gov/CCAP.
En la rutina diagnóstica, la técnica de FISH es
la técnica de elección para el estudio de tumores
sólidos, debido a las dificultades encontradas en
la obtención de cariotipos de calidad en este tipo
de tumores. Los ejemplos más representativos del
diagnóstico citogenético en tumores sólidos son
los siguientes:
●
Análisis de translocaciones en distintos
tipos de sarcoma: utilizando FISH, junto con
otras técnicas de genética molecular como la
PCR, se pueden identificar translocaciones
que caracterizan distintos subtipos de sarcoma; así, una translocación entre el cromosoma 11 y 22, t(11;22)(q24; q12), que produce
la fusión de los genes EWS y FLI1, caracteriza
a los sarcomas de Ewing. La translocación
t(X;18)(p11;q11) (fusión de los genes SYT/
SSX) caracteriza a los sarcomas sinoviales y
las translocaciones t(2;13)(q35;q14) y t(1;13)
(p36;q14) a los rabdomiosarcomas.
● Análisis de la amplificación del gen ErbB2
(o Her-2) en cáncer de mama y del gen EGFR
(Her-1) en cáncer de pulmón: los genes de la
familia de Her son receptores de membrana
encargados de transmitir señales de proliferación celular al interior de la célula. Alrededor del
30% de los tumores de mama y el 80% de los
carcinomas de pulmón de células no pequeñas
sobreexpresan ErbB2 y EGFR, respectivamente.
El estudio mediante FISH de la amplificación
de ambos oncogenes está resultando de gran
utilidad como complemento al análisis de la
sobreexpresión de la proteína, no solo para
caracterizar el peor pronóstico de los pacientes,
sino también para definir el subgrupo que puede
beneficiarse de tratamientos basados en fármacos diseñados para bloquear estos receptores.
El enorme desarrollo tecnológico y bioinformático de los últimos años en el ámbito de la
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
secuenciación masiva hace prever una nueva revolución en el campo de la citogenética, con el desarrollo de plataformas que permitirán diagnosticar
y pronosticar el curso de una enfermedad, así
como poder predecir la respuesta de cada paciente a tratamientos cada vez más individualizados.
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS
POLICLONALES
Y MONOCLONALES
Para obtener anticuerpos específicos contra una
proteína de nuestro interés, lo primero que hay
que conseguir es aislar y purificar la proteína (o
sintetizar un péptido de esa proteína contra el
cual se quieren dirigir los anticuerpos). Pongamos por caso una proteína de la cápside del virus
de la hepatitis C. Esa proteína, cuando se inyecte
en un animal, constituirá un antígeno (Ag), ya
que es una sustancia extraña que, introducida en
un mamífero, provoca una respuesta inmunitaria
que estimula la producción de anticuerpos. Los
Ag tienen diversos epítopos o determinantes
antigénicos: regiones concretas del Ag que estimulan la producción de anticuerpos. Un mismo
antígeno puede tener distintos epítopos.
Como se describe con detalle en el capítulo 17, los anticuerpos (o inmunoglobulinas) son
glucoproteínas producidas por los linfocitos B en
respuesta a una estimulación antigénica. Están
constituidos por la asociación de cuatro cadenas
polipeptídicas (dos pesadas y dos ligeras) unidas
por puentes disulfuro. A su vez, cada cadena
posee una región variable, cuya secuencia de
aminoácidos es característica de cada anticuerpo
y constituye la región del mismo que reconoce y
se une al epítopo correspondiente; y otra región
constante, con la misma secuencia para cada clase
de inmunoglobulina de una especie. Mediante
digestión con papaína se obtienen dos fragmentos Fab (antigen binding), que contienen las regiones variables (y, por lo tanto, las que se unen al
antígeno), y un fragmento Fc (región constante).
La inyección del Ag en el animal causa la
producción de un conjunto de anticuerpos que
provienen de diferentes clones de linfocitos B y,
por lo tanto, tienen diferente especificidad para
reconocer diferentes epítopos de ese Ag. Esta es
una respuesta policlonal, ya que implica la diferenciación de varios clones de linfocitos B (uno
por cada epítopo). Si se obtiene el suero de ese
animal, se consigue un suero policlonal, rico en
una mezcla de anticuerpos que reconocen los
diferentes epítopos del Ag (fig. e2-15). El suero
poseerá además muchos otros anticuerpos que
27.e19
FIGURA E2-15 Representación de la unión de anticuerpos
policlonales a distintos epítopos del antígeno (A) y de
anticuerpos monoclonales a un único epítopo del antígeno (B).
Cada uno de los tipos de estructura geométrica representa
un determinante antigénico.
reconocen proteínas generadas en otras respuestas inmunes. Por medio de diversas técnicas, se
puede purificar la fracción sérica que es rica en
nuestro anticuerpo de interés.
Muchas veces, en las técnicas inmunohistoquímicas y en otras aplicaciones de diagnóstico
o terapéuticas interesa poder utilizar anticuerpos
que solo se dirijan contra un epítopo, es decir, que
sean monoclonales (v. fig. e2-15), ya que todos
provienen de un único clon de linfocitos B. El ais-
27.e20
Biología celular biomédica
lamiento y mantenimiento en cultivo de un linfocito B productor de un determinado anticuerpo
permitiría la obtención de grandes cantidades del
mismo, con idénticas características y con la misma
afinidad por el Ag. Sin embargo, los linfocitos B no
pueden mantenerse en cultivo durante un tiempo
suficiente para obtener una cantidad adecuada
de anticuerpos. Para solucionar este problema se
fusionan los linfocitos B con células de mieloma
(células cancerosas que, al ser tumorales, pueden
crecer en placas de cultivo de modo indefinido).
La fusión celular se consigue mediante polietilenglicol, una sustancia que favorece la fusión de las
membranas. Las células de mieloma poseen una
deficiencia genética que les impide crecer en un
medio de cultivo llamado «HAT» (que contiene
hipoxantina, aminopterina y timidina). Por lo
tanto, solo van a crecer en cultivo aquellas células
de mieloma que se hayan fusionado con linfocitos
B (hibridomas), pero no las de mieloma que no se
hayan fusionado, debido a que no pueden replicar
su ADN en este medio. Los hibridomas se diluyen
entonces hasta que se obtiene solo una célula por
pocillo de cultivo. Los anticuerpos que estas células
generan se analizan entonces por ELISA (v. más adelante) para comprobar que se produce el anticuerpo
que nos interesa en grandes cantidades (fig. e2-16).
¿Cuáles son las ventajas de utilizar anticuerpos monoclonales sobre los policlonales?
La obtención de gran cantidad de sueros policlonales implicaría inyectar numerosas veces el
antígeno en animales. Esto da lugar a distintas
respuestas inmunológicas de diferente intensidad, por lo que la cantidad de anticuerpo y su
especificidad pueden ser bastante variables. En
el caso de anticuerpos monoclonales, como se
ha aislado un clon celular productor del anticuerpo de interés, mediante el cultivo in vitro de
dicho clon podemos tener una fuente ilimitada
de anticuerpos con una especificidad definida. Al
reconocer un único epítopo, se reduce la posibilidad de reacciones cruzadas y, por lo tanto, de
que el anticuerpo reconozca otras proteínas que
no son las que interesa identificar. No obstante, el
procedimiento técnico para obtener anticuerpos
monoclonales es bastante más caro y laborioso
que el de los anticuerpos policlonales. Las aplicaciones biomédicas de los anticuerpos monoclonales se comentan en el capítulo 17.
ELISA
El ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) es
una técnica basada en el reconocimiento antígenoanticuerpo, muy empleada en los laboratorios
de diagnóstico, con la que se puede cuantificar
una proteína en un fluido o en un extracto de
tejido (fig. e2-17). El modelo más habitual es el
llamado «ELISA sándwich». Imaginemos que se
quiere conocer si un paciente tiene en la sangre
concentraciones altas de una determinada proteína. Si tenemos dos anticuerpos monoclonales
que reconocen dos regiones distintas de la proteína, se puede unir covalentemente uno de ellos al
fondo de cada pocillo de una placa de cultivo de
96 pocillos (por la región Fc). Se añaden entonces
a cada pocillo de la placa muestras de suero de
pacientes diferentes (alguno de los cuales contendrá la proteína que se quiere cuantificar). En los
pocillos en los que haya suero de los pacientes
con concentraciones detectables de la proteína,
esta se unirá al anticuerpo (por la región Fab).
A continuación se añade el segundo anticuerpo
monoclonal, previamente ligado a una enzima
capaz de transformar una molécula concreta (sustrato) en un producto coloreado. Finalmente se
añade el sustrato de la enzima ligada al segundo
anticuerpo monoclonal. En las muestras en las
que haya mucha proteína, habrá quedado retenido
mucho anticuerpo y, por lo tanto, habrá una cantidad equivalente de enzima capaz de transformar el
sustrato en la molécula coloreada. Así, los pacientes
cuyos sueros se añadieron en los pocillos que han
quedado coloreados contienen niveles elevados
de la proteína estudiada. La intensidad del color
en cada pocillo tiene, por lo tanto, una relación
directa con la cantidad de proteína presente en el
suero del paciente. La sencillez y rapidez de esta
técnica la convierten en una de las aplicaciones de
los anticuerpos más empleada en los laboratorios
de investigación y de rutina clínica.
WESTERN BLOT
El Western blot es un método para la detección
de proteínas en extractos de tejido o células que
implica una separación electroforética de dicha
proteína y una identificación mediante interacción
antígeno-anticuerpo (fig. e2-18). Con esta técnica
se puede identificar la naturaleza de las proteínas
presentes en una muestra, así como su cantidad.
Las proteínas, debido a su composición de aminoácidos, suelen tener una carga neta positiva o
negativa, de modo que si aplicamos un campo
eléctrico a un extracto de proteínas, estas migrarán
hacia el polo positivo o negativo (dependiendo de
su carga), y lo harán más rápido cuanto menores
sean su tamaño y su complejidad estructural. La
separación electroforética de proteínas se realiza
en una matriz sólida de poliacrilamida, compuesta
por monómeros de acrilamida entrelazados entre
sí, dejando unos poros que variarán de tamaño
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
27.e21
FIGURA E2-16 Esquema del proceso de producción de anticuerpos monoclonales. (Dibujos procedentes de: Montuenga et
al. Técnicas en histología y biología celular. Barcelona: Elsevier; 2009.)
dependiendo de la proporción de acrilamida
presente en la matriz. Al aplicar un campo eléctrico a esta matriz, las proteínas migrarán dependiendo de su carga neta. Si se quisiera determinar
tamaños de proteínas, esto sería un problema,
puesto que habrá proteínas de distintos tamaños
y cargas, que migrarán de forma distinta. Por ello,
el Western blot utiliza una modificación de esta
electroforesis denominada electroforesis en gel de
acrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE,
Biología celular biomédica
FIGURA E2-17 Ilustración
del procedimiento del ELISA para
la determinación de la cantidad de
proteína en un fluido o extracto de
tejido.
del inglés sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel
electrophoresis). Las proteínas se colocan en una
solución que contiene el dodecil sulfato sódico
(SDS), un potente detergente con carga negativa.
El SDS es capaz de unirse a regiones hidrófobas
presentes en las proteínas, de forma que la carga
neta que poseían queda neutralizada y las proteínas adquieren una carga neta negativa otorgada
por el SDS. De esta forma, al aplicar un campo
eléctrico, las proteínas migrarán ahora al polo
27.e22
FIGURA E2-18 Procedimiento para la realización del Western blot. Las proteínas tratadas con SDS y calentamiento se
separan según su peso molecular mediante electroforesis en un gel de acrilamida; posteriormente se transfieren del gel a una
membrana para su incubación con anticuerpos específicos (primarios) y secundarios marcados con una molécula cromógena
(p. ej., una enzima o un fluorocromo). Tras el revelado y obtención de la imagen se observan las bandas positivas situadas
a una altura correspondiente al peso molecular de la proteína que se quiere identificar. El esquema muestra un ejemplo de
Western blot para detectar la proteína Id1 (imagen superior) y b-actina en células tumorales. Los números indican la masa
molecular en kDa. (Imagen procedente de: I. Manrique. CIMA, Universidad de Navarra.)
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
positivo, con una velocidad que dependerá solo
de su tamaño. Para evitar interacciones debidas a
la estructura terciaria de las proteínas, la muestra
se calienta a altas temperaturas para desnaturalizar
las proteínas. Así, cuanta más masa tenga una
proteína, más lenta será al migrar por los poros
del gel de poliacrilamida.
A partir de esta separación de las proteínas de
una muestra, en función de su tamaño, podemos
identificar una proteína concreta mediante la
unión específica antígeno-anticuerpo. Para poder
enfrentar estas proteínas a un anticuerpo, se realiza primero una transferencia de las mismas a un
soporte más adecuado (una membrana de nitrocelulosa) mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel (blotting). Una vez que las
proteínas están en la membrana, se puede proceder
a la incubación de esta con un anticuerpo primario
específico para la proteína de interés; posteriormente se aplica un anticuerpo secundario (que
se une a la fracción Fc del anticuerpo primario)
marcado con un cromógeno que permita detectar
la banda correspondiente a la proteína en estudio.
La técnica de Western blot no se aplica normalmente para el diagnóstico, pero se utiliza
habitualmente en investigación biomédica para
el descubrimiento y caracterización de nuevas
proteínas, y para el estudio de las alteraciones
debidas a patologías (cantidades anormales,
diferencias en tamaños, etc.).
CITOMETRÍA DE FLUJO
La citometría de flujo es una técnica de análisis
del número, tamaño y forma de una suspensión
celular. También sirve para cuantificar el número
de determinadas poblaciones celulares marcadas
específicamente con sustancias fluorescentes y
para aislar poblaciones celulares. Por el hecho
de analizar suspensiones celulares, esta técnica
es especialmente útil para el estudio y evaluación
de muestras normales y patológicas de sangre y
médula ósea. También se pueden analizar muestras procedentes de tejidos, pero hay que hacer
previamente un procesamiento de los mismos
para separar las células entre sí y para separarlas
también de la matriz extracelular.
El citómetro contiene las siguientes partes:
●
Un sistema fluídico de transporte de células.
Un sistema óptico de iluminación de las partículas mediante láser. Se suele utilizar un láser
de argón, ya que la luz que emite es capaz de
excitar más de un fluorocromo.
● Un detector electrónico que convierte la luz
en señal digital. Las señales ópticas son con●
vertidas en señales eléctricas y analizadas en
una computadora.
En el citómetro de flujo las células se hacen pasar
por un capilar muy fino, de tal modo que pasan
de una en una, en fila (fig. e2-19). Según van
pasando, el rayo láser impacta sobre ellas y se
produce una distorsión del rayo que es registrada
por el detector. Este sistema de análisis cuantifica
el número de eventos (células) que son impactados por el láser, pero también es capaz de analizar
la forma y complejidad interna de las células.
El grado de alteración que se produce cuando
el láser atraviesa los límites celulares da lugar a
una dispersión frontal (FSC, del inglés forward
scatter), que se relaciona con el tamaño celular
(a mayor tamaño, mayor dispersión frontal). La
complejidad interna de las células produce una
dispersión lateral u ortogonal (SSC, del inglés
side scatter). Por lo tanto, las células granulares o
complejas producirán mayor dispersión lateral.
Por ejemplo, si se hace pasar una población
de glóbulos blancos por el citómetro y se representa tamaño frente a complejidad, obtenemos
unas nubes de puntos correspondientes a cada
una de las poblaciones celulares, que sitúa a estas
en diferentes regiones de la gráfica en función de
estos parámetros. Los linfocitos, células pequeñas
y con escasa complejidad interna, quedan situados hacia el borde inferior izquierdo, mientras
que los neutrófilos aparecen en el lado superior
derecho (v. fig. e2-19).
Otra posibilidad es marcar una población
celular específicamente con un fluorocromo para
identificarla en el citómetro. Un fluorocromo
frecuentemente utilizado es el isotiocianato de
fluoresceína (FITC), que absorbe luz cerca de los
490 nm y emite luz de 525 nm. Un ejemplo que
ilustra la utilidad de esta técnica es la incubación
de células sanguíneas con un anticuerpo antiCD19 (presente solo en las membranas de los
linfocitos B, y no en las de linfocitos T o NK).
Cuando el láser impacta con un linfocito B se
genera información para estimar la FSC y la SSC
y, además, se capta la señal debida a la fluorescencia. De este modo, se puede distinguir un
linfocito B de uno T o de uno NK. Esto último
sería imposible solo con los parámetros FSC y
SSC, dado que todos los linfocitos aparecen como
una población celular única en función de estos
parámetros. La presencia de un número anormalmente alto de células CD19 positivas puede ser
indicativo de una leucemia. Habitualmente, se
emplean otros marcadores de superficie celular
para aseverar una patología neoplásica concreta.
27.e23
27.e24
Biología celular biomédica
FIGURA E2-19 Esquema del funcionamiento de la citometría de flujo. A. Las células se hacen pasar por un fino capilar
(de una en una), donde son impactadas por un rayo láser; la distorsión lumínica es recogida en un detector. B. El grado de
distorsión frontal (FSC, forward scatter) indica el tamaño de la célula y el grado de distorsión lateral (SSC, side scatter), su
complejidad interna. C. Representación del patrón observado mediante citometría de flujo de leucocitos.
Otro ejemplo de uso frecuente en clínica es
la detección de linfocitos CD4 positivos para monitorizar la carga vírica de los pacientes infectados
con el VIH. La proteína CD4 se encuentra en la
membrana de los linfocitos T cooperadores (helper
en inglés) y es utilizada por el virus VIH para infectar dichas células. La infección va reduciendo progresivamente el número de linfocitos CD4+, provocando inmunodepresión en el paciente. Mediante
el marcaje fluorescente de anticuerpos anti-CD4 y
análisis de la sangre de pacientes infectados en el
citómetro se puede hacer una cuantificación de la
población de linfocitos CD4+ y, por lo tanto, un
seguimiento de la evolución de la enfermedad. En
este caso, se puede hacer una representación de
tipo histograma de la intensidad de fluorescencia frente al porcentaje de células analizadas (fig.
e2-20). La población de la izquierda de la gráfica
corresponde a células no marcadas, mientras que
la población de la derecha (población que emite
la fluorescencia) pertenece a las células fluorescentes CD4+.
Se pueden realizar también dobles o múltiples marcajes fluorescentes. Para ello habría que
utilizar diferentes anticuerpos, cada uno conjugado con un fluorocromo concreto. Entre los
fluorocromos frecuentemente utilizados en cito-
metría están (aparte del FITC), la ficoeritrina (PE;
absorción a 480-565 nm, emisión a 578 nm),
y la aloficocianina (APC; absorción a 650 nm,
emisión a 661 nm). Imaginemos que queremos
responder a la siguiente pregunta: ¿cuántos linfocitos CD4+ expresan interferón g (INF-g)? Esta
pregunta nos puede interesar porque el INF-g es
una citoquina reguladora de la respuesta inmunitaria, que interviene, entre otras cosas, en la
activación de los macrófagos y las células NK.
Para responder a esta pregunta, lo que habría
que hacer es realizar un inmunomarcaje con
anticuerpos anti-CD4 conjugados con un fluorocromo (p. ej., FITC, que produce fluorescencia
en el verde) y anticuerpos anti-INF-g marcados
con otro fluorocromo (p. ej., APC, que produce
una fluorescencia en el rojo). En este caso podemos hacer una representación de intensidad
de fluorescencia en el verde frente a intensidad de
fluorescencia en el rojo. Observaríamos así cuatro
nubes de puntos diferentes, correspondientes
a cuatro poblaciones celulares. La población A
corresponde a células que no se han marcado
con ninguno de los anticuerpos (CD4−/INF−).
La población B es la que emite fluorescencia en
el verde pero no en el rojo (CD4+/INF−), al contrario de lo que ocurre con la C (CD4−/INF+).
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
FIGURA E2-20 A. Representación en forma de histograma de una población de linfocitos positivos para el marcador CD4.
La población de la derecha indica el porcentaje (44,46%) de linfocitos positivos. B. Representación en forma de nube de
puntos tras el marcaje de linfocitos con doble inmunofluorescencia (anti-CD4, en color verde; anti-INF-g, en color rojo).
La población positiva para ambos marcadores
corresponde a la D (CD4+/INF+) (v. fig. e2-20).
Los citómetros «clásicos», de un solo rayo
láser, permiten el análisis de cinco parámetros
al mismo tiempo: FSC, SSC y tres canales de
fluorescencia. Hoy en día existen aparatos que
contienen hasta 18 canales de fluorescencia, lo
que constituye un total de 20 parámetros analizables al mismo tiempo, para cada célula. Esto
es algo asombroso si tenemos en cuenta que se
analizan miles de células por segundo. Con estos
equipamientos se puede encontrar una célula con
características propias entre una población de
cientos de miles, o incluso de millones de células.
La tecnología de la citometría de flujo continúa
avanzando. El campo principal es el desarrollo de
más y mejores fluorocromos, que permitan obtener señales más nítidas y más fuertes, con lo que
se potenciaría la capacidad analítica de la técnica.
Además de su conjugación con anticuerpos para
encontrar proteínas en una célula, el citómetro
puede analizar muchas otras funciones y características celulares, como la apoptosis, necrosis,
número de mitocondrias, cantidad de ADN, actividad de una determinada enzima, presencia de
un determinado metabolito, etc. Algunos citómetros, además de todo esto, permiten el aislamien-
to de las células analizadas, lo que posibilita una
investigación posterior más profunda con otro
tipo de técnicas.
El campo donde más se ha desarrollado la
citometría de flujo es la hematología, donde
constituye una técnica diagnóstica esencial. Los
distintos tipos de leucemias y tumores hematológicos se pueden clasificar en muchos casos
mediante la citometría de flujo. Además, continuamente aparecen publicaciones científicas
en las que se describen nuevas subpoblaciones
celulares caracterizadas por la presencia de un
grupo especial de marcadores celulares, lo cual
puede ser importante de cara al diagnóstico o
pronóstico de estas enfermedades.
CULTIVOS CELULARES
Fundamento de la técnica
Una de las herramientas más utilizadas para el
estudio de la biología de las células, tanto normales como tumorales, son los cultivos celulares. Las
células cultivadas in vitro provienen de un órgano
o un tejido normal o tumoral. Estas células se
mantienen en medios de cultivo de composición
conocida y condiciones de temperatura y oxigenación controladas. De esta forma, se asegura
27.e25
27.e26
Biología celular biomédica
su supervivencia y propagación, lo que ofrece
una fuente ilimitada de células para el estudio. El
origen de los cultivos celulares se remonta al siglo
xix, cuando se realizaron los primeros ensayos
de supervivencia de células fuera de organismos.
Actualmente, en el laboratorio se cultivan células
procedentes de una amplia gama de tejidos y
organismos diferentes. Los cultivos celulares pueden ser de dos tipos: cultivos primarios y líneas
celulares.
1. Cultivos primarios: cuando el cultivo proviene de células, tejidos y órganos tomados
directamente del paciente o de un animal,
recibe el nombre de cultivo primario. Una
de las ventajas del cultivo primario es que las
células mantienen las características del órgano del que provienen, lo que es fundamental
en el campo de la ingeniería de tejidos. En
ciertas patologías, como el infarto de miocardio o algunas lesiones hepáticas, las células
dañadas se pueden reemplazar por células
sanas cultivadas in vitro procedentes del propio paciente (v. capítulo 18). En el caso del
tratamiento de quemados, se han desarrollado métodos de cultivo de piel con los que se
generan grandes superficies de este tejido en
muy poco tiempo, que sirven para regenerar
la piel con gran eficacia.
2. Líneas celulares: cuando las células del cultivo
primario adquieren capacidad ilimitada de
multiplicación y son líneas puras (es decir, sin
contaminación de otros tipos celulares) reciben el nombre de línea celular (fig. e2-21). Las
líneas celulares son una herramienta de trabajo
FIGURA E2-21 Células tumorales
en cultivo. (Imagen procedente de:
Dra. J. Agorreta. Departamento
de Histología y Anatomía Patológica,
Universidad de Navarra.)
de fácil manipulación y ofrecen una fuente ilimitada y homogénea de células fácilmente
caracterizables. El desarrollo y estudio de las
líneas celulares ha sido uno de los mayores
logros técnicos de la biología celular, y ha servido como herramienta para el análisis de una
gran variedad de funciones celulares: la actividad intracelular (replicación y transcripción de
ADN, síntesis de proteínas), el ciclo celular, la
diferenciación, las interacciones célula-célula,
los análisis genéticos, etc.
La mayoría de las células normales son capaces de
dividirse un número finito de veces, tras el cual
entran en senescencia y no son capaces de dividirse más. El proceso de senescencia está relacionado
con el acortamiento progresivo de los telómeros,
situados en los extremos de los cromosomas. Las
células somáticas humanas tienen inactivada la
enzima responsable del mantenimiento de los
telómeros, la telomerasa, por lo que en cada
división celular se produce el acortamiento de los
telómeros hasta que la célula entra en el proceso
de senescencia.
Para obtener una línea celular continua
(«inmortalizada») es necesario realizar ciertas
modificaciones genéticas que confieran a las
células capacidad ilimitada de división; por ejemplo, la introducción del gen de la telomerasa, o
inactivación de genes de control del ciclo celular
como P53. La derivación de líneas celulares a
partir de muestras tumorales es una tarea más
sencilla a priori, ya que las células tumorales ya
poseen modificaciones genéticas que alteran los
puntos de control del ciclo celular. No obstante,
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
el estrés al que se ven sometidas en el cultivo in
vitro impide a veces el crecimiento de las mismas.
Habitualmente, el objetivo principal del cultivo celular es reproducir las condiciones existentes
in vivo. Sin embargo, existen ciertas limitaciones
inherentes a esta técnica. Las células cultivadas in
vitro no se comportan exactamente igual que en
el tejido de origen, debido al cambio en las condiciones de crecimiento de las células. Se pierde
la estructura tridimensional típica de cada tejido,
existen diferencias en las interacciones célulacélula y célula-matriz extracelular, y la disponibilidad de oxígeno y nutrientes se ve fuertemente
alterada. Asimismo, las células en cultivo suelen
sufrir procesos de desdiferenciación o pérdida
de las características típicas del tejido del que
se aislaron. Estas limitaciones hacen necesaria
una cuidadosa interpretación de los resultados
obtenidos mediante esta técnica.
Aplicaciones biomédicas
En un principio se aislaron líneas celulares para
profundizar en el conocimiento de muchos aspectos de su fisiología. Posteriormente, el campo de
los cultivos celulares se encaminó hacia el desarrollo de la virología. Las células eucariotas en cultivo
son el sustrato perfecto para la replicación de los
virus, lo que permite conocer nuevos aspectos de
la biología de estos microorganismos, así como
el desarrollo de medidas preventivas a través de la
producción de vacunas. Igualmente, el desarrollo
de las técnicas de fusión y cultivo celular permitió
la creación de los anticuerpos monoclonales, contribuyendo así al progreso de la inmunología.
Una de las prioridades de la medicina es la
comprensión de la biología de la célula tumoral. Actualmente se cuenta con líneas celulares
de la mayoría de los tumores conocidos; de
hecho, la primera línea celular de origen humano
se derivó a partir de un carcinoma de cérvix en
1952 (células HeLa). Esto, junto con el desarrollo de las técnicas de transferencia de material
genético en células en cultivo, ha hecho que las
líneas celulares sean el modelo más utilizado en
el estudio del cáncer. En este sentido, el cultivo
primario de células de un determinado tumor
podría dar una información muy valiosa acerca
de la sensibilidad del paciente frente a ciertos
fármacos utilizados en quimioterapia, lo que
permitiría dar un tratamiento más personalizado.
El desarrollo de las técnicas de aislamiento
y cultivo de células madre ha abierto un nuevo
campo de tratamiento de muchas enfermedades
mediante la terapia celular e ingeniería de tejidos
(v. capítulo 18). Las aplicaciones de la terapia
celular se extienden a áreas tan diversas como
las enfermedades cardiovasculares (regeneración de tejido cardíaco después de un infarto),
la oftalmología (regeneración de la córnea) o la
traumatología (regeneración de cartílago).
FRACCIONAMIENTO CELULAR
Y CENTRIFUGACIÓN
DIFERENCIAL
Si se desea estudiar la composición química y
la función de orgánulos y otras partículas subcelulares, necesitamos separarlos del resto de
los componentes citoplasmáticos y nucleares.
Para ello habría que romper la membrana plasmática, lo que permitiría obtener una suspensión
con todos los componentes subcelulares. Existen
diversos métodos para romper las células. Uno
de ellos es el choque hipotónico. Al sumergir las
células en un medio con menor cantidad de solutos que el citoplasma, el agua entra y las células
se hinchan, rompiéndose fácilmente. También
se utilizan homogeneizadores mecánicos, basados en la aplicación de presión, ultrasonido y
otras fuerzas. La homogeneización se realiza en
soluciones isotónicas a bajas temperaturas. Un
homogenado típico es una suspensión de orgánulos, componentes celulares y macromoléculas,
que podemos separar mediante la centrifugación.
Centrifugación
Las partículas o células en suspensión tienden
a sedimentar debido a la fuerza de la gravedad.
La velocidad de sedimentación de las partículas
pequeñas es muy lenta, pero aumenta si utilizamos un campo centrífugo. Cuando un cuerpo se
somete a centrifugación se genera una fuerza que
tiende a escapar del centro de rotación (fuerza
centrífuga). Los aparatos que utilizan este tipo de
fuerza cuentan con un rotor (donde se ubican las
muestras) que puede girar a altísimas velocidades.
La fuerza centrífuga aplicada a una partícula es
proporcional a la velocidad de rotación del rotor
(en revoluciones por minuto) y a su distancia con
respecto al centro de rotación (en centímetros). La
fuerza centrífuga relativa (RCF, del inglés relative
centrifugal force), que se expresa en relación con la
fuerza gravitacional g, se calcula como:
RCF = 1.119 × 10−5 × r (cm) × V 2 (rpm)
La constante 1.119 depende de la aceleración
gravitacional y la RCF se expresa en unidades × g.
Por ejemplo, una fuerza centrífuga relativa de
500 × g significa que se aplica una fuerza 500
veces mayor a la fuerza gravitacional. La velocidad
27.e27
Biología celular biomédica
con la que sedimentan las partículas depende de
su masa y de su densidad, así como de la densidad
y viscosidad del medio en el que se encuentran. La
sedimentación de una partícula será directamente
proporcional a su masa y densidad, e inversamente proporcional a la densidad y viscosidad del
solvente. Las moléculas y las estructuras subcelulares se pueden definir por un coeficiente de sedimentación que se expresa en unidades Svedberg
(S) (1 S = 10−13 s). Habitualmente se definen para
la sedimentación en agua a 20 °C. El coeficiente
refleja no solo su masa, sino también su forma,
superficie expuesta y densidad. Esto explica por
qué el coeficiente de sedimentación de determinadas partículas celulares, como el ribosoma (80 S),
no es igual a la suma de los coeficientes de sus dos
subunidades (60 y 40 S, respectivamente).
Centrifugación diferencial
La centrifugación diferencial aprovecha la
propiedad de las partículas de mayor tamaño o
27.e28
FIGURA E2-22 Esquema
de una centrifugación
diferencial. El homogenado
es sometido a sucesivas
centrifugaciones. En cada
paso se centrifuga
el sobrenadante de
la centrifugación anterior,
pero con mayor velocidad
y durante más tiempo.
En la figura se muestra
la obtención de las cuatro
fracciones crudas.
densidad para sedimentar más rápido que aquellas de menor tamaño o densidad. Se basa en
sucesivas centrifugaciones a velocidades crecientes
(fig. e2-22). En el primer precipitado, obtenido a
bajas velocidades, aparecen los núcleos y restos de
células sin fragmentar. El sobrenadante se centrifuga con velocidad media, precipitando entonces
los orgánulos citoplasmáticos de mayor tamaño,
como las mitocondrias, lisosomas, peroxisomas
y cloroplastos. Cuando el segundo sobrenadante
es centrifugado a mayor velocidad, precipita la
denominada fracción microsómica, que contiene
fragmentos del retículo endoplasmático y de la
membrana. La centrifugación del tercer sobrenadante permite la precipitación de los ribosomas, mientras que en el sobrenadante quedan
las moléculas solubles del citosol (v. fig. e2-22).
Cuando se requieren fuerzas superiores a 20.000 × g,
se utilizan ultracentrífugas que trabajan en vacío
para evitar el sobrecalentamiento de la muestra
y del equipo.
CAPÍTULO 2
Cómo se estudian las células. Métodos y técnicas básicas en biología celular
Este método tiene poco poder de resolución
y las fracciones pueden incluir varios orgánulos
con la misma velocidad de sedimentación. Aunque cada fracción cruda (nuclear, mitocondrial,
microsómica y ribosómica) está enriquecida en
un tipo de estructura u orgánulo, contiene contaminantes que deben ser eliminados mediante
la resuspensión del precipitado obtenido tras
una nueva centrifugación, o bien aplicando la
centrifugación en gradientes de densidad. Para
asegurar la pureza de las distintas fracciones
se evalúa el enriquecimiento en determinadas
moléculas características de cada orgánulo,
mediante procedimientos enzimáticos, inmunocitoquímicos o microscópicos. Algunos ejemplos de marcadores son la presencia de ADN
(núcleo), citocromo oxidasa (mitocondrias),
hidrolasa (lisosomas), catalasa (peroxisomas),
a-manosidasa (aparato de Golgi), adenilato
ciclasa (membrana plasmática) y lactato deshidrogenasa (citosol).
Centrifugación en gradientes
de densidad
La fuerza centrífuga aplicada a las partículas es contrarrestada por fuerzas de fricción y de flotación.
La primera depende de la viscosidad del medio,
mientras que la segunda es proporcional a la densidad del medio. La partícula no se mueve cuando
su densidad es igual a la del medio (isopícnica).
Esta propiedad se refleja en diversos métodos de
sedimentación isopícnica (igual densidad) o
de equilibrio, que permiten purificar las fracciones
crudas. El homogenado o, más frecuentemente, el
sobrenadante posnuclear o posmitocondrial, se
aplica a un gradiente de osmolaridad, viscosidad
o densidad, continuo o discontinuo, cuya mayor
densidad se encuentra en el fondo del tubo. Después de cierto tiempo de centrifugación, las partículas forman una banda en la zona del gradiente
que tiene la misma densidad que las partículas.
Este método se conoce como sedimentación isopícnica o de equilibrio (fig. e2-23, A).
27.e29
FIGURA E2-23 A. Ilustración
de la separación isopícnica de
la fracción mitocondrial cruda
en un gradiente de sacarosa. La
densidad de las partículas que se
deben separar está comprendida
dentro del rango de densidades
del gradiente y, al cabo de 2 h
de centrifugación, los lisosomas,
mitocondrias y peroxisomas se
encuentran en bandas situadas
en niveles de distinta densidad.
B. Ilustración de la centrifugación
zonal en gradiente de densidad.
La densidad de las partículas
que se deben separar es mayor
que la del medio. Al centrifugar,
las partículas migran más o
menos según su coeficiente de
sedimentación. La centrifugación
debe ser detenida antes de que
las más rápidas lleguen al fondo.
27.e30
Biología celular biomédica
En la sedimentación zonal, la densidad de
las partículas que se deben separar es mayor
que la densidad del medio de separación. La
fracción que debe purificarse se coloca sobre la
solución o gradiente. Al centrifugar, las moléculas se desplazan con una velocidad determinada
por su coeficiente de sedimentación. Dado que
todos los componentes tienen mayor densidad
que la sustancia del gradiente, es indispensable
detener la centrifugación cuando las partículas
se hayan acumulado en zonas diferentes del
tubo (v. fig. e2-23, B). Si la centrifugación es
demasiado prolongada, todas las partículas
sedimentarán en la base del tubo.
Los gradientes se preparan con diferentes
sustancias. La sacarosa es una de las más utilizadas, en concentraciones variables desde 5%
(1,017 g/ml) hasta 50% (1,23 g/ml). El cloruro de
cesio es el componente preferido para la separación de ácidos nucleicos (ADN, ARN). La centrifugación diferencial también puede aplicarse
a suspensiones de células enteras. En estos casos
suelen utilizarse gradientes de Ficoll, Percoll o
Nicodenz.