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Detección de Estados Neoplásicos y Pre-Neoplásicos en Exámenes de rutina y Biología Molecular Francisco Gutiérrez C(1); Adolay Sobarzo E(1);Juan Luís Castillo N(2). (1) Alumno carrera de Tecnología Médica, Universidad de Concepción. (2) Tutor encargado del ramo Biología Molecular, Universidad de Concepción. 18/12/06 ¿QUÉ ES EL CÁNCER? Desequilibrio Muerte celular Proliferación celular ¿Qué es el cáncer? Neoplasia Maligna Clon celular Descontrol Ciclo celular Infiltración Tumor Metástasis Evolución Natural del Cáncer • Tejido Normal • Hiperplasia • Metaplasia • Anaplasia • Displasia • Neoplasia Génesis del cáncer Mutaciones Acumuladas Mutaciones Acumuladas 1. Continuidad de señales positivas de proliferación por activación de oncogenes. 4. Inmortalización atribuible a la activación de la telomerasa. 2.Pérdida de señales negativas de crecimiento por inactivación de genes supresores. CÁNCER 5. Angiogénesis sustentada por ? angiogénicos factores 3. Escape de la apoptosis por producción de factores de sobrevida IGF 6. Alteración de las moléculas de adhesión celular. Genes Involucrados Oncogenes • Oncogen ras • Oncogen c-myc • Oncogen c-fos Genes Involucrados Supresores de Tumores • Gen APC (poliposis adenomatosa coli) • Gen DDC (deleted in cancer colorectal) • Gen RB Genes Involucrados Reparadores del ADN • Gen TP53 • Gen MSH-2 • Gen MLH-1 • Gen PMS-1 y PMS-2 Génesis del cáncer Aneuploidía Mutaciones Acumuladas Teoría de Aneuploidía “Propone que el cáncer es causado por la dosificación anormal de miles de genes normales” “Esta dosificación anormal de genes es generada por la ganancia o pérdida de cromososmas específicos o segmentos de cromosomas, o simplemente una pequeña secuencia de ADN, alias aneuploidía” Proc Natl Acad Sci USA 94:14506-11 (1997) Biochem J 340:621-30 (1999) Proc Natl Acad Sci USA 97:3236-4 (2000) Cell Motil Cystoskel 47:81-107 (2000) Cell cycle 2:202-10 (2003) IUBMB life 56:65-81 (2004) Nature Biotechnol 21:13-14 (2003) GENES VII (Lewin B.) ¿Cuál es el origen de la aneuplodía? Ganancia o pérdida cromosómica durante la división celular: • Espontánea • Inducción química Mutat Res. 410:3-79 (1998) Biochem J. 340:621-30 (1999) División normal V/S aneuploidía 49,9 50,1 División Normal Aneuploidía Teoría de la Aneuploidía Aneuploidía al azar Cell cycle 3:823-828 (2004) Estado de Aneuplodía Desestabiliza genes y cromosomas Des balance en grupos de proteínas que segregan, sintetizan y reparan cromosomas Reordenamientos y acortamientos cromosómicos Near diploid (2n) Baja inestabilidad Near Aneuploid Alta inestabilidad y adaptabilidad Near Triploid (3n) Near tetraploid (4n) Muerte celular por aneuplodía: • Nulisomías • Acortamientos cromosómicos no viables • Mutaciones letales Aneuploidía Célula no cancerosa Bajo el límite para el cáncer Aneuploidía Célula cancerosa Se alcanza o sobre pasa el límite para el cáncer (en forma gradual o abrupta) Cytometry 22:307-316 (1995) Biochem J. 340:621-30 (1999) Métodos de Detección Métodos morfológicos Patología Muestra de tejido del paciente Biología Molecular Proteínas Proteómica Muestra de tejido o muestra de sangre del paciente Genómica ADN Chip del gen Detección por Morfología Citología http://www.mibiopsia.com/images/ CITOLOGIA.jpg Histología www.gyne.cz/fotogalerie/fotogalerieimages/otmucinous%20adenocarcinoma.jpg InmunoHístoquímica www2.udec.cl/~webpatologia/fotos/ cancer2/pages/page_3.html Tsissue Microarrays ww.zeiss.com/C12567BE00472A5C/G raphikTitelIntern/TMA_Array/$File/TM A_array_357.jpg Detección por Biología Molecular Microarrays ADNc fluorescente ADN Chip de gen Microarreglo escaneado Célula normal Aislar a los ARNms Producir ADNcs fluorescentes Añadir al microarreglo de ADN El rojo hace juego No hace juego El rojo hace juego Microarreglo escaneado El ADNc fluorescente de la célula muscular “ilumina” al gen de miosina Miocito ARNm de miosina ADNc fluorescente Microarreglo de ADN Microarreglo escaneado + transcriptasa inversa Miosina El ADNc fluorescente del linfocito “ilumina” al gen de inmunoglobulina Linfocito ARNm de inmunoglobulina ADNc fluorescente Microarreglo de ADN + transcriptasa inversa Microarreglo escaneado Inmunoglobulina Utilizando al ADN para Comparar Células Cancerosas con Células Normales Célula normal Célula cancerosa Aislar los ARNms Producir ADNcs fluorescentes rojos y verdes Añadir al microarreglo de ADN Ambos, rojos y verdes hacen juego Ninguno hace juego Sólo los verdes hacen juego Microarreglo escaneado Sólo los rojos hacen juego Interpretando los Datos Artwork by Jeanne Kelly. © 2002. El gen del cáncer se expresó 18 veces más que el gen normal Citometría de Flujo Estudio de Ploidía de ADN mediante estudio del ciclo celular de lesiones pre-neoplasicas y neoplasicas ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR • Se evalúa el contenido relativo de ADN en el núcleo de una célula normal o neoplásica. • Se obtiene una estimación de las fases del ciclo celular. • Se obtienen resultados de la cantidad de ADN celular, lo que se traduce en discriminar poblaciones diploides y aneuploides. Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999 CONTENIDO ADN CANTIDAD DE ADN V/S TIEMPO 2X 1X G1 S G2 M FASES CICLO CELULAR G1 150 0 75 Counts 225 300 DNA Análisis 0 200 400 2N 600 800 4N PI Fluorescence Purdue University Cytometry Laboratories 1000 300 DNA Análisis 225 DNA index 1.21 150 0 75 Counts Aneuploid peak 0 200 400 600 PI Fluorescence Purdue University Cytometry Laboratories 800 1000 ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR INDICE ADN (ID): Medición de Ploidia de ADN. ID: Razón de la Cantidad de ADN de la Muestra v/s el control. ID = Contenido ADN Células G0G1 Muestra Contenido ADN Células G0G1 Control Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999 ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR INDICE ADN (ID): Medición de Ploidía de ADN PLOIDIA ADN Diploide ADN Aneuploide ADN Hiperdiploide ADN Hipodiploide INDICE ADN =1 =1 >1 <1 Proteómica • Entendida como una genómica funcional • Biomarcadores • Pautas terapéuticas Electroforesis Bidimensional Nuevos puntos Puntos perdidos http://www.upf.edu/cexs/sct/proteomi/img/ef2D.gif Protein Chip www.ipht-jena.de/BEREICH_3/bilder/protein_array.jpg Espectrometría de Masa Discusión • Faltan mas estudios comparativos entre ambas teorías, motivo por el cual se conoce poco de Aneuploidía. • Todas las neoplasias presentan aneuploidía, en contraste con mutaciones acumuladas. • Existen estudios que desprecian la teoría de la Aneuploidía como causa común en neoplasias de Adenocarcinoma esofágico(1). • La aneuploidía es una consecuencia de inestabilidad genómica de las mutaciones acumuladas. (1)www.academia.cat/societats/digest/5curs/esofag.htm Discusión • Las técnicas de genómica, detectan los problemas a nivel de Ac. Nucleicos, lo que posibilita un diagnóstico oportuno y a la raíz misma de éste. • Las técnicas proteómicas detectan el resultado de todo el proceso de expresión génica (inclusive los factores epigenéticos), siendo más efectivo y fácil de dilucidar. Conclusión La displasia es un • Los diagnósticos concepto en el que ni morfológicos se los propios morfologos hacen cada vez más están de acuerdo, por lo incompletos sin que las técnicas de técnicas biología molecular son complementarias que la futura solución a este determinen más dilema. certeramente el pronóstico de la neoplasia. Conclusión • Es importante poder identificar cual técnica es la mas ideal para poder diagnosticar una neoplasia en particular, considerando que en un futuro se harán tratamientos personalizados. • A futuro, la detección de estados neoplásicos y preneoplásicos serán diagnósticados de forma predictiva en base a la proteómica y genómica, identificando tempránamente el cáncer. Agradecimientos • Profesor Juan Luís Castillo N. • Dr. Marcelo Larremendi.