Download Estudiio de la Respuesta Inmune humoral en pacientes con Anemia

INSTITUTO DE HEMATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA
ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE
HUMORAL EN PACIENTES CON ANEMIA
DREPANOCÍTICA
INTRODUCCIÓN
• Los trastornos de la hemoglobina (Hb) constituyen el grupo de
enfermedades monogénicas más frecuentes en el mundo
ocupando la anemia drepanocítica (AD) un lugar cimero entre las
mismas. Hb S es el nombre de la molécula de Hb anormal, siendo
este defecto molecular el primero en ser demostrado en humanos.
• La secuenciación nucleotídica del mARN de los genes de la
globina  s ha revelado que el codón normal GAG en la posición 6
ha sido reemplazado por GUG. Este cambio determina la inserción
de valina en la posición del ácido glutámico que se encuentra en la
Hb A, predominante en el adulto normal, lo que favorece la
polimerización de las moléculas de Hb S en condiciones de baja
presión parcial de oxígeno. La gelificación distorsiona el glóbulo
rojo y disminuye su flexibilidad lo que puede provocar fenómenos
oclusivos vasculares.
INTRODUCCIÓN (Continuación)
• Los pacientes con AD tienen una gran variabilidad en el cuadro
clínico. Los individuos heterocigotos (Hb AS) son comúnmente
asintomáticos, en cambio, los homocigotos (Hb SS) presentan
diferentes manifestaciones clínicas las cuales no se expresan en el
momento del nacimiento debido a los niveles elevados de
hemoglobina fetal (Hb F) que interfiere en la polimerización de la
Hb S.
• Las manifestaciones clínicas más frecuentes en los primeros
años de vida son:
- anemia
- ictericia
- crisis mano - pie
- crisis vasooclusivas dolorosas abdominales y
ostiomioarticulares.
- infecciones
INTRODUCCIÓN (Continuación)
Trastornos del sistema inmune:
- Los neutrófilos presentan alteraciones en la quimiotaxis, baja
actividad oxidativa, escaso poder bactericida y mayor adhesividad al
endotelio.
- La fibrosis esplénica, presente en la mayoría de estos enfermos,
compromete la síntesis de anticuerpos y la función fagocítica.
- Una actividad opsónica disminuida, así como trastornos en la
actividad de la vía alternativa del complemento.
- Elevación de citocinas inflamatorias: IL 6, IL 1, TNF , formas
solubles de las moléculas de adhesión ICAM-1, VCAM-1, E-Selectina y
P-Selectina.
- Un aumento de reactantes de fase aguda, como la proteína C
reactiva y el amiloide A sérico, aún en enfermos en estado basal, lo
que indica un nivel de inflamación constante subclínico.
INTRODUCCIÓN (Continuación)
- Se ha referido tanto una disminución en los niveles relativos de
linfocitos T por deficiencias en células CD4 , como aumentos de
células T citotóxicas.
- Hipergammaglobulinemia, ya sea a expensas de IgM o más
frecuentemente de la clase IgG siendo las subclases predominantes la
IgG1 e IgG3.
- Se ha demostrado la síntesis de autoanticuerpos contra antígenos
de grupos sanguíneos y contra los fosfolípidos de la membrana celular
de los hematíes falciformes, entre los que se destacan anticuerpos
antifosfatidiletanolamina y antifosfatidilserina.
Considerando que la severidad clínica de la AD al parecer está
influenciada por múltiples factores, se plantea la siguiente hipótesis de
trabajo:
HIPÓTESIS DE TRABAJO
“Alteraciones de la respuesta inmune humoral pueden
incidir en la expresión clínica y severidad de la
enfermedad en pacientes con AD.”
OBJETIVO GENERAL
Evaluar las posibles alteraciones de diversos parámetros de la
respuesta inmune humoral en enfermos con AD en diferentes
fases clínicas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1- Determinar la actividad de las vías clásica y alternativa del
sistema complemento, así como la concentración de algunos de
sus componentes en diferentes fases clínicas.
2- Determinar los niveles de inmunocomplejos circulantes en
diferentes fases clínicas.
3- Evaluar los fenómenos de solubilización y de inhibición de la
formación y precipitación de inmunocomplejos en diferentes
fases clínicas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS (Continuación)
4- Realizar estudios seriados del complemento e inmunocomplejos
circulantes y de la proteína C reactiva.
5- Evaluar la actividad funcional del factor D de la vía alternativa del
complemento en enfermos en estado basal.
6- Determinar la actividad del sistema complemento en enfermos en
estado basal con y sin historia previa de complicaciones clínicas.
7- Determinar los niveles de subclases de IgG en enfermos en
estado basal, con y sin historia previa de complicaciones clínicas.
8- Identificar la posible presencia de anticuerpos anticitoplasma de
neutrófilos (ANCA) en enfermos en estado basal y con crisis
vasooclusiva dolorosa.
UNIVERSO DE LA MUESTRA
Se incluyeron enfermos con el diagnóstico de AD atendidos en la
consulta de Hemoglobinopatías del Instituto de Hematología e
Inmunología:
- con 15 o más años de edad,
- en estado basal, sin manifestaciones clínicas en los 3 meses
previos al estudio,
- con crisis vasooclusivas dolorosas de cualquier focalización,
sin síntomas ni signos de infección u otras complicaciones
clínicas,
- con úlceras maleolares sin otras complicaciones de la
enfermedad, las infecciones demostradas estaban limitadas a la
zona de la úlcera,
- con crisis hepática cuyo diagnóstico se realizó por el cuadro
clínico y pruebas funcionales hepáticas.
UNIVERSO DE LA MUESTRA (Continuación)
Ninguno de los enfermos recibió transfusiones de glóbulos rojos en
los 3 meses anteriores al estudio y en todos el HBsAg fue negativo.
Los valores normales en cada uno de los estudios realizados se
obtuvieron en 30 individuos sanos con características de edad, sexo
y raza similares a los de la muestra problema.
BIOÉTICA
A todos los pacientes se les explicó de forma comprensible la
naturaleza de su enfermedad, los riesgos y beneficios de los
procedimientos a emplear, la confidencialidad de los resultados,
precisando el principio de voluntariedad. A continuación se solicitó,
mediante firma de documento, su consentimiento de participación
en la investigación.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se empleó el análisis de varianza no paramétrico de Kruskal - Wallis,
el coeficiente de correlación de rangos de Spearman y la t de
Student. Se consideró un nivel de confianza del 95%.
ESTUDIOS REALIZADOS
 Activación del sistema complemento en diferentes fases clínicas.
Se estudiaron 45 enfermos, se agruparon: 23 en estado basal, 14 con
crisis vasooclusivas dolorosas y 8 con crisis hepática. En todos los
casos se midió la actividad hemolítica de la vía clásica del
complemento (AHVC), la vía alternativa (AHVA), C3 y C4.
 Determinación de inmunocomplejos circulantes en diferentes
fases clínicas.
Se estudiaron 100 enfermos, agrupados: en estado basal, 42; con
crisis vasooclusivas dolorosas, 28; con úlceras maleolares, 14 y con
crisis hepática, 16.
Los inmunocomplejos circulantes se
determinaron mediante actividad anticomplementaria, precipitación
con PEG 6000, inhibición de roseta EAC, título de
inmunoconglutininas.
ESTUDIOS REALIZADOS (Continuación)
 Estudio de la solubilización e inhibición de la formación y
precipitación de inmunocomplejos.
El estudio se realizó en 13 enfermos en crisis hepática y 26 en
condiciones basales. La inhibición de la precipitación de
inmunocomplejos se determinó haciendo reaccionar el 125 I - TT con
una cantidad equivalente de anti TT en presencia de suero
problema. La solubilización de inmunocomplejos se determinó
añadiendo un complejo insoluble de 125 I - TT / anti TT al suero
problema.
 Estudio seriado del complemento e inmunocomplejos
circulantes.
Se efectuó la medición seriada en 13 enfermos que cursaron cada
uno por diferentes fases clínicas. De las 35 muestras de suero
analizadas, 17 correspondieron a condiciones basales, 8 a crisis
vasooclusivas dolorosas y 10 a crisis hepáticas. En todas las
muestras se midió AHVC, AHVA, factor B, C3, C4 e
inmunocomplejos circulantes mediante la prueba de desviación del
C1q (PDC1q) y PEG 6000.
ESTUDIOS REALIZADOS (Continuación)
 Estudio seriado de la proteína C reactiva.
Se analizaron 42 muestras de sangre, obtenidas en diferentes
momentos, de 16 enfermos en condiciones basales. La proteína C
reactiva se detectó mediante un método de aglutinación con
latex.
 Evaluación de la actividad funcional del factor D del sistema
complemento.
Se estudiaron 28 enfermos en estado basal. Se midió la AHVA,
factor B y factor D.
ESTUDIOS REALIZADOS (Continuación)
 Comparación de los niveles de complemento entre grupos de
enfermos con AD en estado basal, con y sin historia de
complicaciones clínicas previas al estudio.
Se estudiaron 46 enfermos en estado basal. Se revisaron las
historias clínicas y se analizó la enfermedad en el año previo al
estudio, se clasificaron en dos grupos: con y sin manifestaciones
clínicas. Se determinó en ambos grupos la AHVC, AHVA, factor B,
C3 y C4.
 Comparación de los niveles de subclases de IgG entre grupos
de enfermos con AD en estado basal, con y sin historia de
complicaciones clínicas previas al estudio.
Se estudiaron 46 enfermos en estado basal. Se revisaron las
historias clínicas y se analizó la enfermedad en el año previo al
estudio, se clasificaron en dos grupos: con y sin manifestaciones
clínicas. Se determinaron los niveles de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
ESTUDIOS REALIZADOS (Continuación)
 Determinación de ANCA en enfermos en diferentes fases
clínicas.
Se estudiaron 55 enfermos, 35 con crisis vasooclusiva dolorosa y
20 en estado basal. Los niveles de cANCA y pANCA fueron
determinados mediante juegos comerciales anti MPO Elisa y anti
PR3 Elisa. Se incluyeron como controles, además de los 30
sujetos sanos, 50 enfermos con glomerulonefritis, 45 con
nefroangioesclerosis y 25 con diversas formas de vasculitis no
precisadas.
RESULTADOS
Tabla 1. Niveles de complemento en enfermos con anemia
drepanocítica en diferentes fases clínicas.
Determinación
Controles
Normales
( n = 30 )
Estado
Basal
( n = 23 )
Crisis
Vasooclusiva
dolorosa
( n = 14 )
Crisis
Hepática
(n=8)
AHVC (CH50)
27.5  6.5
25.4  5.4
26.2  4.6
25.3  4.7
AHVA ( %)
98.3  15.7
73.7  19.5
81.7  17.0
76.9  18.9
()
C3 ( g / L)
C4 ( g / L )
( )
( )
1.5  0.38
1.14  0.30
1.34  0.38
()
1.16 ± 0.39
0.35  0.15
0.37 ± 0.07
0.30  0.11
0.29 ± 0.08
(   )
Leyenda - () p < 0.05; (  ) p < 0.005;
(  ) p < 0.001
(  )
Tabla 2 – Inmunocomplejos circulantes y niveles de complemento en
enfermos con anemia drepanocítica en diferentes fases clínicas.
Determinación
Estado
Basal
( n = 42 )
Crisis
Vasooclusiva
dolorosa
( n = 28 )
Úlceras
Maleolares
( n = 14 )
Crisis
Hepática
( n = 16 )
Control
Normal
( n = 30 )
16.2 ± 9.7
15.8  12.1
21.7  13.0
( )
30.2 10.2
(  )
12.5 
Actividad
Anti
complementaria
(Uds. CH50
residuales)
1.34  0.2
1.26  0.2
1.19 ± 0.21
1.05  .22
(  )
1.35 
Precipitación
PEG 6000
(DO . 10-2)
13.0  7.1
14.5  5.9
21.0  12.2
( )
28.6 11.6
(  )
13.0  9.0
IKs
(Recíproco de la
dilución)
M = 32
(16 - 256)
M = 32
(16 - 258)
M = 64
(16 - 256)
( )
M = 64
(16- 256)
( )
M = 32
(0 - 64)
AHVC (CH50)
26.3  3.7
27.1  3.5
26.8 ± 4.0
25.0  4.8
27.5  6.5
C4 ( g / L )
26.8  4.3
26.8  4.0
25.2  6.19
25.0  7.5
27.5  7.5
C3 d ( g / dl)
12.8  2.1
12.6  2.0
16.2  3.6
( )
16.0  3.2
( )
12.0  3.0
Inhibición
Roseta EAC
(% inhibición)
Leyenda -
Iks: inmunoconglutininas; M: mediana
() p< 0.05; ( ) p< 0.001
12.5
0.30
Tabla 3. Solubilización e inhibición de la formación y precipitación de
inmunocomplejos, así como niveles de complemento e
inmunocomplejos circulantes en enfermos con anemia drepanocítica
con crisis hepática.
PACIENTES
( n = 13 )
CONTROLES
( n = 30)
p
AHVC (CH50)
23.2  1.87
27.5 
AHVA (%)
81.8 
6.8
98 .0  16.0
< 0.01
PDC1q (% de inhibición)
19.5 
8.6
10.0  10.0
< 0.01
C3 (g / L)
1.07  0.15
1.52  0.50
< 0.01
C4 (g / L)
0.28  0.04
0.35  0.05
NS
AHFB (%)
77.75  7.82
100.0  24.0
< 0.01
IPIC (%)
24.2  19.53
91.41  8.45
< 0.01
SIC (%)
10.4  7.29
47.11  9.48
< 0.01
Determinación
6.5
NS
Leyenda – IPIC: inhibición de la formación y precipitación de inmunocomplejos
SIC: solubilización de inmunocomplejos
• Estudio seriado de la proteína C reactiva
Se demostró la proteína C reactiva positiva en 23 muestras de
sangre, extraidas en diferentes momentos, de 12 de los 16
enfermos en estado basal estudiados.
Tabla 4 – Evaluación de la actividad funcional del factor D de la
vía alternativa en pacientes con anemia drepanocítica en estado
basal.
Determinación
Pacientes
( n = 28 )
Control
Normal
( n =30)
p
AHVA ( % )
80.1 
6.0
98.0 
16.0
 0.001
AHFB ( % )
81.6  7.3
100.0 
24.0
 0.001
AHFD ( % )
93.0  12.5
95.0
 14.0
NS
Tabla 5- Comparación de los niveles de complemento entre los grupos de
enfermos con anemia drepanocítica en estado basal con y sin
complicaciones clínicas previas y con los controles normales.
Enfermos
Con complicaciones Sin complicaciones
(n = 25)
(n = 21)
Controles
normales
(n = 30)
25.8 ± 3.0
26.4 ± 2.8
27.0 ± 2.7
AHVA (%)
78.1 ± 10.2 ()
97.1 ± 14.8
98.0 ± 16.0
AHFB (%)
75.0 ± 11.3 ()
98.6 ± 17.4
100.0 ± 24.0
C3 (g / l )
0.90 ± 0.37 ()
1.53 ± 0.44
1.52 ± 0.50
C4 (g / l )
0.32 ± 0.10
0.33 ± 0.11
0.35 ± 0.15
Determinación
AHVC (CH50)
Leyenda – () diferencia significativa con respecto al grupo de pacientes sin complicaciones y controles
normales para una p  0.001.
Tabla 6- Comparación de los niveles de las subclases de IgG entre los
grupos de enfermos con anemia drepanocítica en estado basal con y sin
complicaciones clínicas previas y con los controles normales.
Controles
Con complicaciones Sin complicaciones normales
(n = 25)
(n = 21)
(n = 20)
Enfermos
Determinación
IgG1
11.56  1.32 ()
8.98  1.12
8.32  1.25
IgG2
6.18  0.73 ()
4.59  0.96
4.78  0.93
IgG3
0.56  0.17
0.55  0.15
0.49  0.10
IgG4
1.05  0.27
0.95  0.17
0.99  0.14
Leyenda - () diferencia significativa con respecto a los controles normales y al grupo de pacientes sin
complicaciones para una p< 0.001.
Tabla 7 – Anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) en enfermos con
anemia drepanocítica .
Pruebas
( U / ml )
Estado
Basal
( n  20 )
Crisis
Vasooclusiva
dolorosa
( n  35 )
Glomerulonefritis
( n  50 )
Anti MPO
171.0  32.5
239  33.2
()
168.3 25.1
165.9 27.2
170.2 5.8
166  26.7
Anti PR3
136.5  23.0
142.5 9.2
134.5 21.1
138.2  22.7
135.8  23.5
133.5  18.0
Leyenda - MPO: mieloperoxidasa; PR3: proteinasa 3
(): p  0.001
Nefroangioesclerosis
( n  45 )
Vasculitis
no
precisadas
( n  25 )
Control
Normal
( n  30 )
FORMACIÓN DE
ANTICUERPOS IgG
RESPUESTA
AUTOINMUNE
PREVIENE REACCiONES AUTOINMUNES
ESTIMULA CÉLULAS NK
MODULA ACTIVACIÓN PLAQUETARIA
IL-6
LIBERACIÓN DE
ANTIGENOS TISULARES
(ACTIVACIÓN DE Th1)
ESTÍMULO A LA
MÉDULA ÓSEA
(ESTRÉS DE LA ANEMIA)
PROTEINAS DE
CHOQUE TÉRMICO
LIBERACIÓN DE
CITOCINAS:
IL-1, IL- 6, FNT
PROTEINA C
REACTIVA
ACTIVACIÓN DEL SISTEMA DE ESTRÉS
HIPOTÁLAMO - HIPÓFISO - ADRENAL
ESTRÉS TISULAR
(FENÓMENOS INFLAMATORIOS)
LIBERACIÓN DE
GLUCOCORTICOIDES
LIBERACIÓN DE
RETICULOCITOS DE ESTRÉS
OCLUSIÓN
DESVIACIÓN Th1 Th2
ADHESIÓN
AL ENDOTELIO
ERITROCITOS FALCIFORMES
IRREVERSIBLES
ACCIÓN SUPRESORA
SOBRE Th1
eosinofilia
mastocitosis
 I gE
AMPLIFICACIÓN DEL DAÑO
Y DEL ESTRÉS TISULAR
ACTIVACIÓN DE LA INMUNIDAD HUMORAL:
AUTOANTICUERPOS; INMUNOCOMPLEJOS;
HIPOCOMPLEMENTEMIA ;  IPIC;  SIC
Figura 1: Esquema integrador de las alteraciones de la respuesta inmune que se observan en pacientes con anemia drepanocítica.
Nota: IPIC - Inhibición de la precipitación de inmunocomplejos; SIC - Solubilización de inmunocomplejos; línea discontinua- - -Inhibición.