Download estudio de las mutaciones de IgH y bcl6

HOSPITAL UNIVERSITARIO LA FE
SERVICIO HEMATOLOGIA
2 de Octubre de 2008
Leucemia linfática crónica B: una
enfermedad heterogénea. Estudio del
rol de las mutaciones de IgVH y BCL-6
en esta heterogeneidad.
Aproximaciones genómica y funcional.
Eloisa Jantus Lewintre
INTRODUCCIÓN
LLC-B: GENERALIDADES
La leucemia linfática crónica B (LLC-B) se define como:
 Enfermedad causada por la acumulación progresiva monoclonal
de células B que co-expresan CD5+ y CD19+, originada a partir de
linfocitos B maduros con experiencia antigénica.
 Actualmente se la describe como una enfermedad por
acumulación de células B con un alto nivel de proliferación,
mientras que anteriormente se creía que se debía a un defecto en
la apoptosis de células inmuno-incompetentes.
Curso clínico variable:
 Grupo de pacientes con enfermedad agresiva con necesidad de
tratamiento
 Grupo de pacientes con enfermedad indolente
Se presenta en edad avanzada (10-15% en < 50 años)
Afecta más a hombres que a mujeres (1.5 : 1.0 ).
Desarrollo de Linfocitos B normales
Pro B
CD10
CD19
CD34
Pre B
M.O.
CD10
CD19
CD34
V3
Cel B inmadura
BCR
CD10
CD19
CD34
D9 J4
Vías de maduración de las células B:
dependencia de células T
AID
BCL6
mutations
Chiorazzi N, N Engl J Med 2005
Desarrollo y evolución de las células de LLC-B
No Mutado
Estim. antigénica
Mutado
Selección por antígeno
Lesión genética
LLC clon mutado
LLC clon no mutado
HETEROGENEIDAD
FACTORES PRONÓSTICO EN LLC
 Estadíos de Binet o Rai
 Tiempo duplicación linfocitario
 Timidina-kinasa
 2 microglobulina
 LDH
 Patrón histopatológico de médula ósea.
 Estado mutacional de IgVH
 Mutaciones en región 5’ no-codificante del gen BCL6
 Expresión de CD38
 Expresión de ZAP-70
 Alteraciones citogenéticas
(del 17p, del11q, del 13q, +12)
MUTACIONES SOMÁTICAS EN IgVH y BCL6
1,0
year
s
GRUPOS
,8
GRUPO I
BCL6 + / IgVH+
,6
GRUPO II
BCL6 - / IgVH +
ILT
years
Hamblin TJ,. Blood.
,4 1999
No se pueden determinar de
,2
rutina en diagnóstico
0,0
0
MESES
20
40
60
80
GRUPO III
BCL6 - /IgVH 100
Sarsotti E, Leukemia.2004
EXPRESIÓN DE ZAP70 y CD38
Del Príncipe y col, 2006
Damle y col, 1999
Damle RN.Blood 1999:94;1840-47
HIPOTESIS
LLC: formas clínicas heterog.
1,0
year
s
GRUPOS
,8
GRUPO I
BCL6 + / IgVH+
ILT
,6
GRUPO II
BCL6 - / IgVH +
,4
,2
0,0
GRUPO III
BCL6 - /IgVH 0
MESES
20
40
60
80
100
Sarsotti E, Leukemia.2004
Subgrupos moleculares
Influyen en evolución y
necesidad de tratamiento
(ptes en estadío A)
Perfiles genómicos y
funcionales DIFERENTES?
OBJETIVO PRINCIPAL
Valorar la implicación de las mutaciones en los genes IgVH y
BCL-6 como responsables de la heterogeneidad en el
comportamiento biológico y expresión génica en la LLC-B e
identificar nuevos marcadores subrogados de las mutaciones
en IgVH y de pronóstico en estadíos tempranos de la
enfermedad
CAPÍTULO I:
ESTUDIOS FUNCIONALES
OBJETIVOS:
1. Evaluar el estado mutacional de IgVH en muestras de LLC
mediante protocolo Biomed2 modificado y valorar su
utilidad
2. Secuenciar la región 5’ no codif del gen BCL6 y
correlacionar polimorfismos y mutaciones en esta región
con expresión.
3. Realizar estudios de quimiosensibilidad in vitro con Btz y
correlacionarlos con el estado mutacional de los genes
IgVH y BCL6
LLC-B: diagnóstico NCI 1996
[Cheson, Blood,1996]
Edad mediana: 67,4 años (42-86)
56.7% varones
N=74
Estadío A de Binet
Inmunofenotipo, CD38, ZAP70 por FC
Alteraciones citogenéticas (FISH)
Otros: score, TDL, LDH, 2microglob
ESTADO MUTACIONAL DEL GEN IgVH
Dominio variable
N
CDR1
CDR3
CDR2
Dominio variable
CDR1
CDR2
Dominio constante
CDR3
N
Ig, cadena pesada (proteína)
V
DJ
mRNA (gen)
6 VH-Leader
Homología
<98% MUT
>98% NO-MUT
CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN IgVH
VH
Familia
3-7
IgVH
mutado
IgVH
No mutado
6
VH1
5
1
3-30-3
VH3
44 %
Familia
IgVH
mutado
1-69
3-23
3-30
VH
24 %
6
1-3
4
1-2
3
2
1-8
1
1
3-33
4
3
1-58
3-9
1
1
TOTAL
8
3-72
1
4-34
4
4-61
3
VH4
4-39
1
19%
4-31
2
2
3-74
3-11
3-20
3
3-21
1
4-59
3-48
1
TOTAL
3-53
2
3-64
3-66
TOTAL
1
1
2
26
1
12
VH2
8%
2-5
6
VH5
3%
5-51
1
VH6
1.3%
6-1
1
7
Mutadas= 54 (73%)
IgVH
No mutado
No mut= 20 (27.0%)
10
2
2
1
ESTADO MUTACIONAL DEL GEN BCL6
Representación esquemática del gen BCL-6.
Los exones codificantes y no codificantes se representan por rectángulos llenos y vacíos,
respectivamente. La región que sufre SHM y que hemos analizado aparece indicada por una línea azul.
741 pb
E1.21C
E1.10
E1.11
E1.12
E1.26
E1.21C (sentido):
E1.24 (antisentido):
CTC TTG CCA AAT GCT TTG
TAA TTC CCC TCC TTC CT
E1.23 (sentido):
E1.P1.6 (antisentido):
AGG AAG GAG GGG AAT TAG
AAG CAG TTT GCA AGC GAG
E1.P1.7(sentido):
E1.26 (antisentido)
TTC TCG CTT GCA AAC TGC
CAC GAT ACT TCA TCT CAT C
ESTUDIO DE LA REGION 5’ DEL GEN BCL6
100% IgVH mut
MUTACIONES
20 mutadas
(29%)
34
mutaciones
C (35.3%)
Sustit.
nucleót.
N=69
T (29.4%)
G (26.5%)
delT 520 (29.0%)
POLIMORFISMOS
397 G>C (17.4%)
502 G>A (7.2%)
31 mutac.
diferentes
MUTACIONES DEL GEN BCL6
Frecuencia de mutaciones
14
12
10
8
6
4
2
0
Posición
BCL6: RELACIÓN ENTRE
MUTACIONES Y EXPRESIÓN
Prueba estadística: Pearson
CULTIVOS CELULARES
Control
Stress oxidativo,
Citoquinas (CD40 L, IL-4, IL-1,
TNFa, otros)
Infeccion viral/ bacteriana
24 hs
RPMI 15% FBS
37ºC
5% CO2
Btz
APOPTOSIS
BORTEZOMIB
Anexina V
+ PI
BCL2
1,0
year
s
GRUPOS
,8
GRUPO I
BCL6 + / IgVH+
ILT
,6
GRUPO II
BCL6 - / IgVH +
,4
,2
0,0
GRUPO III
BCL6 - /IgVH 0
20
40
60
MESES
80
Btz 1.0 M
100
Sarsotti E, Leukemia.2004
Tratamiento
Btz 0.1 M
Inducción de apoptosis por Btz en
células con IgVH mutado:
correlación con mutaciones en
BCL-6.
Células con IgVH
mutado:
Mutaciones en BCL-6
n
% Apoptosis
(media  SEM)
IgVH mut/ BCL-6 no-mut
9
67.66  1.91
IgVH mut/ BCL-6 mut
11
51.59  4.61
IgVH mut/ BCL-6 no-mut
8
73.84  2.59
IgVH mut/ BCL-6 mut
9
62.12  3.44
p*
0.032
0.034
CAPÍTULO II:
ESTUDIOS GENÓMICOS
OBJETIVOS:
1. Estudiar la firma molecular de la LLC-B mediante el uso de
micromatrices de alta densidad, identificando vías
metabólicas o términos de ontología génica que estuvieran
sobrerepresentados en esta patología.
2. Estudiar el perfil de expresión génica en distintos grupos
moleculares de LLC-B con el fin de identificar genes y vías
metabólicas diferencialmente expresados.
3. Validar los resultados obtenidos del estudio transcriptómico
mediante RTqPCR.
Células B seleccionadas ( CD19+ bolas inmunomagnéticas)
CD19
• 11 Controles sanos
• 36 muestras LLC-B estadío A de Binet (no tratados)
* 24 IgVH mutado
15 BCL6 no mutado (G1)
9 BCL6 mutado (G2)
LLC-B: estadío A
* 12 IgVH no mutado (G3)
Grupo
INICIAL
N=36
IgVH mut=24
BCL6mut=9
Micromatrices
IgVH no mut= 12
Validación
metodolog.
por RTqPCR
METODOLOGÍA GENÓMICA
Extracción de ARN
total de linf B
Transcripción a ADNc
Marcaje con
fluorescencia
Hibridación con
Micromatrices de ADN
(microarrays, chips)
Human Genome U133 Plus 2.0
(Affymetrix)
Datos
Suite GEPAS
Montaner D, Nucleic Acids
Res, 2006, 34:W486-91
1.
Preprocesamiento: Normalización, QC
2.
Cluster jerárquico
3.
Expresión diferencial (estudio supervisado) -> prueba t
4.
Estudio de Anotación Funcional -> FatiScan
CONTROLES
vs
LLC
Cluster jerárquico – Método UPGMA
LLC-B
ASXL2
GLIPR1
POLR3B
POLR2L
ASXL2
NEDD8
SCLY
Proteína
relacionada a
patogén. en
Polimerasas
gllioma
->pro
Gen
involucr.
en
Codif
proteina
apoptotica
en
Factor
de
asociado
a
transcrip.
a
Casimilar
de próstata
transcrip
carcinogen.
ubiquitina
y vejiga
esencial p/
->ciclo celular,
todos los
embriogen.
linajes
hematopoy.
NEDD8
Repar. y
FIRMA
MOLECULAR
RBM14
replic.
POLE4
LLC-B
GLIPR1
RAD51L1
ERCC1
ADN
HG U133 2.0 Plus
(Affymetrix)
SMAD3
POLB
SIGLEC10 Proteína
CLSTN1 integr.
HLADOB
membr.
FCRL5
ANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScan
ACTIVADOS EN
LEUCEMIA
GO
KEGG
-
REPRIMIDOS EN
CONTROLES
Sínt de ATP acopl a transp de electrones
Replicación ADN
Recombinación ADN
Reparación ADN
Metabol. de nucleótidos
Metabol. de hexosas
Ciclo celular
Fosforilación oxidativa
Vía de las pentosas fosfato
Ciclo del citrato
ACTIVADOS EN
CONTROLES
GO
- Muerte celular
REPRIMIDOS EN
LEUCEMIA
GO
KEGG
- Diferenciación celular
- Apoptosis
- Proteólisis mediada por
ubiquitina
G1 + G2 (IgVH mut)
vs
G3 (IgVH no mut)
CRY1: componente del reloj circadiano
MGC9913
RGS4
CRY1
DMD
ITGA9
BC7A (B-cell CLL/lymphoma 7A)
involucrado en traslocaciones cromosóm.
en linfomas no Hodgkin
BCL7A
TUBA8
LPL: enzima del metabolismo lipídico.
Formación y estabiliz de “lipid raft” en LLC
LPL
CD82: gen supresor de metástasis
CD82
FUT8
ADAM29
SVH
DUSP22: fosfatasa dual. Activa vía JNK
BCL11A: prot dedo de Zn, expresada en CG
PDLIM5
DUSP22
BCL11A
ANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScan
G1 + G2 (IgVH mut) vs. G3 (IgVH no mut)
REPRIMIDOS
EN IgVH mut
ACTIVADOS EN
IgVH no mut
GO
KEGG
- Señalización vía proteina G
GO
- Procesos rítmicos
- Vía de señalización Frizzled-2 (WNT)
-
Vía de señalización mediada por Ca
Interacc ECM- receptor
Vía de señalización Hedgehog
Uniones tipo Gap
ACTIVADOS EN
IgVH mut
GO
KEGG
- Adhesión celular
homofílica
- Regulac positiva de IkB
kinasa
- Metabol glicerolipídico
- Ribosoma
REPRIMIDOS
EN IgVH no mut
GO
- Apoptosis
Expresión diferencial - FatiScan
G1 (IgVH mut/ BCL6 no mut) vs. G2 (IgVH mut/ BCL6 mut)
1,0
year
s
GRUPOS
,8
GRUPO I
BCL6 + / IgVH+
ILT
,6
GRUPO II
BCL6 - / IgVH +
,4
,2
0,0
GRUPO III
BCL6 - /IgVH 0
MESES
20
40
60
80
100
Sarsotti E, Leukemia.2004
No hay genes expresados
significativamente de manera
diferencial
MET. DE VALIDACIÓN: PCR cuantitat. a tiempo real
Genes
validados
(N=14)
Valor Expresión Normalizado= ETCpT(C)-CpT(S)x ERCpR(S)-CpR(C)
ET = Efic.del gen diana
ER = Efic. del gen de referencia
CpT ciclo umbral del gen diana
CpR ciclo umbral del gen de referencia
C=Calibrador ; S= muestra
Validación de resultados:
Cuantificación de mRNA por RTqPCR
Gen
No mut
(media + 2SEM)
CRY1
LPL
MGC9913
BCL7A
IFT57
FUT8
DUSP22
BCL11A
CD82
ITGA9
ZAP70*
FAHD1
PDLIM5
SVH
0.335 + 0.114
297.01 + 89.32
1.96 + 1.193
0.2512 + 0.128
0.919 +1.718
0.966 +0.334
0.649 + 0.361
0.641 + 0.140
0.359 + 0.100
0.381 + 0.122
0.412 + 0.384
0.855 + 0.214
0.684 + 0.136
1.051 + 0.252
* No signif. estadíst. en datos de micromatrices
IgVH
Mut
(media + 2SEM)
0.075
53.62
0.308
0.062
0.647
1.841
1.383
0.937
1.044
0.221
0.151
1.259
0.961
1.689
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
0.050
44.86
0.302
0.038
0.170
0.370
0.504
0.160
0.382
0.070
0.056
0.196
0.192
0.394
p
(prueba de Mann
Whitney)
<0.001
<0.001
<0.001
0.002
0.007
0.007
0.008
0.008
0.011
0.025
0.033
0.037
0.049
0.049
CAPÍTULO III:
MARCADORES PRONÓSTICO
EN LLC-B
OBJETIVOS:
1. Validar biológicamente los marcadores identificados en un
grupo muestral independiente.
2. Valorar la utilidad de los genes seleccionados como
marcadores subrogados del estado mutacional de IgVH y de
pronóstico en estadíos tempranos de la LLC-B
Grupo
N=36
INICIAL
IgVH mut=24
Micromatrices
Validación
metodolog.
por RTqPCR
IgVH no mut= 12
LLC-B: estadío A
BCL6mut=9
Grupo
VALIDACIÓN
N=38
IgVH mut=30
Validación
BIOLÓGICA
RTqPCR
IgVH no mut= 8
BCL6mut=11
Marcador
Subrogado IgVH
N=74
IgVH mut=54
IgVH no mut= 20
Marcador
Pronóstico
(ILT)
Correlación entre expresión relativa y estado
mutacional de IgVH en muestras
del grupo de validación
Gen
No mut
(media + 2SEM)
CRY1
LPL
BCL7A
ZAP70
CD82
DUSP22
0.275 + 0.114
228.4 + 59.6
1.44 + 0.742
0.661 + 0.418
0.433 + 0.076
1.18 + 0.38
IgVH
p
Mut
(media + 2SEM)
0.055 + 0.004
20.11 + 13.72
0.073 + 0.042
0.071 + 0.052
0.689 + 0.112
1.90 + 0.30
(prueba de Mann
Whitney)
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
0.013
0.023
Marcadores subrogados de IgVH
Sensibilidad, especificidad, y área
bajo la curva ROC
en grupo de validación
Gen
Sensib (%) Especif (%)
Valor de Corte Area ROC
CRY1
100
100
< 0.090
1.00
LPL
100
93
< 82.45
0.987
BCL7A
100
82
< 0.1150
0.950
ZAP70
100
89
< 0.1050
0.960
CD82
83
50
> 0.4050
0.78
DUSP22
90
63
> 1.020
0.76
Expresión de genes seleccionados y
estado mutacional del gen IgVH
G en
CRY1
LPL
Valor de corte
N o Mut
Mut
n
%
n
>0.090
19
27.1
4
5.7
<0.090
1
1.4
46
65.7
>82.45
20
28.2
6
8.5
<82.45
0
0.0
45
63.4
20
28.2
12
16.9
0
0.0
39
54.9
17
23.9
10
14.1
3
4.2
41
57.7
ZAP70 >0.105
<0.105
BCL7A <0.115
>0.115
%
Concordancia
%
p
(Chi cuadrado)
92.8
<0.0001
91.6
<0.0001
83.1
<0.0001
81.6
<0.0001
A
No mut
IgVH
Mut
B
No mut
IgVH
Mut
CRY1 y LPL como
marcadores
subrogados del
estado mutacional
de IgVH
Las barras de error representan el 95% del intervalo
de confianza. La línea roja muestra el valor de corte
para cada parámetro
Curvas de Kaplan-Meier: Mutaciones en IgVH
Actualm.
usado en
clínica.
La significación estadística de las diferencias entre curvas fue evaluada por la prueba Log-rank.
Curvas de Kaplan-Meier: LPL, CRY1 y ZAP70
N=71
p<0.0001
CRY1
p<0.0001
LPL
p=0.001
ZAP70-RTqPCR
CRY1: ¿NUEVO BIOMARCADOR EN LLC-B? Correlación con
la expresión de ZAP70 o LPL y estado mutacional de IgVH
CRY1 +
ZAP70 qPCR +
ZAP70 qPCR -
CRY1 -
10 Mut
9 IgV
19 IgV22
H
H No mut
1 IgVH No mut
3 IgVH Mut
1
1 IgVH Mut
15.5% discordancias
2= ZAP70 FC+ CD38+
38
38 IgVH Mut
CD38+
CRY1 +
LPL +
LPL -
CRY1 -
5 Mut
20 IgV21
4 IgV
H No mut
H
1 IgVH Mut
1 IgVH No mut
2
2 IgVH Mut
42
42 IgVH Mut
10.0% discordancias
1= ZAP70 FC+ CD38+
CRY1: Expresión en PBMC
N=18 sin selección de células B
IgV H
Gen
CRY1
P
No mut
(media + 2 SEM)
Mut
(media + 2 SEM)
0.380 + 0.245
0.051 + 0.038
(prueba de Mann
Whitney)
0.007
MARCADOR
SUBROGADO IgVH
Ensayo Clínico
CONCLUSIONES
1. Los estudios funcionales y de expresión génica que hemos
realizado sobre muestras de pacientes en estadíos tempranos
de LLC, demuestran la heterogeneidad de esta entidad y
manifiestan la existencia de subgrupos moleculares bien
definidos dentro de esta patología.
2. Mas de un centenar de genes diferencian los perfiles
transcriptómicos de muestras con y sin mutaciones en el gen
IgVH, en cambio no se encuentran diferencias en los perfiles
de expresión con respecto a las mutaciones en BCL6.
3. En el análisis de anotaciones funcionales, la herramienta
FatiScan encuentra en las muestras con IgVH no mutado
sobreexpresadas vías de señalización involucradas en
supervivencia y proliferación celular provenientes del entorno
y de la matriz extracelular e inhibida la apoptosis.
4. Existen varios genes cuya expresión podría utilizarse como
marcador subrogado del estado mutacional de IgVH y de
pronóstico en LLC-B, siendo el gen CRY1, uno de los que
proponemos para ser incorporado en ensayos clínicos y
posiblemente en la práctica clínica.
Hospital Clínico
CIPF
Javier García Conde
Hematología Molecular
Ma Jose Terol
Rosa Farras
Isana Benet
Cristina Reinoso
Pilar Eroles
Sandra Gallach
Isabel Marugan
Elena Sarsotti
CIPF
Miguel Marín
Bioinformática
Joaquín Dopazo
David Montaner
Hospital Arnau de Vilanova
Jose Ramón Mayans
Carlos García Ballesteros