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HOSPITAL UNIVERSITARIO LA FE SERVICIO HEMATOLOGIA 2 de Octubre de 2008 Leucemia linfática crónica B: una enfermedad heterogénea. Estudio del rol de las mutaciones de IgVH y BCL-6 en esta heterogeneidad. Aproximaciones genómica y funcional. Eloisa Jantus Lewintre INTRODUCCIÓN LLC-B: GENERALIDADES La leucemia linfática crónica B (LLC-B) se define como: Enfermedad causada por la acumulación progresiva monoclonal de células B que co-expresan CD5+ y CD19+, originada a partir de linfocitos B maduros con experiencia antigénica. Actualmente se la describe como una enfermedad por acumulación de células B con un alto nivel de proliferación, mientras que anteriormente se creía que se debía a un defecto en la apoptosis de células inmuno-incompetentes. Curso clínico variable: Grupo de pacientes con enfermedad agresiva con necesidad de tratamiento Grupo de pacientes con enfermedad indolente Se presenta en edad avanzada (10-15% en < 50 años) Afecta más a hombres que a mujeres (1.5 : 1.0 ). Desarrollo de Linfocitos B normales Pro B CD10 CD19 CD34 Pre B M.O. CD10 CD19 CD34 V3 Cel B inmadura BCR CD10 CD19 CD34 D9 J4 Vías de maduración de las células B: dependencia de células T AID BCL6 mutations Chiorazzi N, N Engl J Med 2005 Desarrollo y evolución de las células de LLC-B No Mutado Estim. antigénica Mutado Selección por antígeno Lesión genética LLC clon mutado LLC clon no mutado HETEROGENEIDAD FACTORES PRONÓSTICO EN LLC Estadíos de Binet o Rai Tiempo duplicación linfocitario Timidina-kinasa 2 microglobulina LDH Patrón histopatológico de médula ósea. Estado mutacional de IgVH Mutaciones en región 5’ no-codificante del gen BCL6 Expresión de CD38 Expresión de ZAP-70 Alteraciones citogenéticas (del 17p, del11q, del 13q, +12) MUTACIONES SOMÁTICAS EN IgVH y BCL6 1,0 year s GRUPOS ,8 GRUPO I BCL6 + / IgVH+ ,6 GRUPO II BCL6 - / IgVH + ILT years Hamblin TJ,. Blood. ,4 1999 No se pueden determinar de ,2 rutina en diagnóstico 0,0 0 MESES 20 40 60 80 GRUPO III BCL6 - /IgVH 100 Sarsotti E, Leukemia.2004 EXPRESIÓN DE ZAP70 y CD38 Del Príncipe y col, 2006 Damle y col, 1999 Damle RN.Blood 1999:94;1840-47 HIPOTESIS LLC: formas clínicas heterog. 1,0 year s GRUPOS ,8 GRUPO I BCL6 + / IgVH+ ILT ,6 GRUPO II BCL6 - / IgVH + ,4 ,2 0,0 GRUPO III BCL6 - /IgVH 0 MESES 20 40 60 80 100 Sarsotti E, Leukemia.2004 Subgrupos moleculares Influyen en evolución y necesidad de tratamiento (ptes en estadío A) Perfiles genómicos y funcionales DIFERENTES? OBJETIVO PRINCIPAL Valorar la implicación de las mutaciones en los genes IgVH y BCL-6 como responsables de la heterogeneidad en el comportamiento biológico y expresión génica en la LLC-B e identificar nuevos marcadores subrogados de las mutaciones en IgVH y de pronóstico en estadíos tempranos de la enfermedad CAPÍTULO I: ESTUDIOS FUNCIONALES OBJETIVOS: 1. Evaluar el estado mutacional de IgVH en muestras de LLC mediante protocolo Biomed2 modificado y valorar su utilidad 2. Secuenciar la región 5’ no codif del gen BCL6 y correlacionar polimorfismos y mutaciones en esta región con expresión. 3. Realizar estudios de quimiosensibilidad in vitro con Btz y correlacionarlos con el estado mutacional de los genes IgVH y BCL6 LLC-B: diagnóstico NCI 1996 [Cheson, Blood,1996] Edad mediana: 67,4 años (42-86) 56.7% varones N=74 Estadío A de Binet Inmunofenotipo, CD38, ZAP70 por FC Alteraciones citogenéticas (FISH) Otros: score, TDL, LDH, 2microglob ESTADO MUTACIONAL DEL GEN IgVH Dominio variable N CDR1 CDR3 CDR2 Dominio variable CDR1 CDR2 Dominio constante CDR3 N Ig, cadena pesada (proteína) V DJ mRNA (gen) 6 VH-Leader Homología <98% MUT >98% NO-MUT CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN IgVH VH Familia 3-7 IgVH mutado IgVH No mutado 6 VH1 5 1 3-30-3 VH3 44 % Familia IgVH mutado 1-69 3-23 3-30 VH 24 % 6 1-3 4 1-2 3 2 1-8 1 1 3-33 4 3 1-58 3-9 1 1 TOTAL 8 3-72 1 4-34 4 4-61 3 VH4 4-39 1 19% 4-31 2 2 3-74 3-11 3-20 3 3-21 1 4-59 3-48 1 TOTAL 3-53 2 3-64 3-66 TOTAL 1 1 2 26 1 12 VH2 8% 2-5 6 VH5 3% 5-51 1 VH6 1.3% 6-1 1 7 Mutadas= 54 (73%) IgVH No mutado No mut= 20 (27.0%) 10 2 2 1 ESTADO MUTACIONAL DEL GEN BCL6 Representación esquemática del gen BCL-6. Los exones codificantes y no codificantes se representan por rectángulos llenos y vacíos, respectivamente. La región que sufre SHM y que hemos analizado aparece indicada por una línea azul. 741 pb E1.21C E1.10 E1.11 E1.12 E1.26 E1.21C (sentido): E1.24 (antisentido): CTC TTG CCA AAT GCT TTG TAA TTC CCC TCC TTC CT E1.23 (sentido): E1.P1.6 (antisentido): AGG AAG GAG GGG AAT TAG AAG CAG TTT GCA AGC GAG E1.P1.7(sentido): E1.26 (antisentido) TTC TCG CTT GCA AAC TGC CAC GAT ACT TCA TCT CAT C ESTUDIO DE LA REGION 5’ DEL GEN BCL6 100% IgVH mut MUTACIONES 20 mutadas (29%) 34 mutaciones C (35.3%) Sustit. nucleót. N=69 T (29.4%) G (26.5%) delT 520 (29.0%) POLIMORFISMOS 397 G>C (17.4%) 502 G>A (7.2%) 31 mutac. diferentes MUTACIONES DEL GEN BCL6 Frecuencia de mutaciones 14 12 10 8 6 4 2 0 Posición BCL6: RELACIÓN ENTRE MUTACIONES Y EXPRESIÓN Prueba estadística: Pearson CULTIVOS CELULARES Control Stress oxidativo, Citoquinas (CD40 L, IL-4, IL-1, TNFa, otros) Infeccion viral/ bacteriana 24 hs RPMI 15% FBS 37ºC 5% CO2 Btz APOPTOSIS BORTEZOMIB Anexina V + PI BCL2 1,0 year s GRUPOS ,8 GRUPO I BCL6 + / IgVH+ ILT ,6 GRUPO II BCL6 - / IgVH + ,4 ,2 0,0 GRUPO III BCL6 - /IgVH 0 20 40 60 MESES 80 Btz 1.0 M 100 Sarsotti E, Leukemia.2004 Tratamiento Btz 0.1 M Inducción de apoptosis por Btz en células con IgVH mutado: correlación con mutaciones en BCL-6. Células con IgVH mutado: Mutaciones en BCL-6 n % Apoptosis (media SEM) IgVH mut/ BCL-6 no-mut 9 67.66 1.91 IgVH mut/ BCL-6 mut 11 51.59 4.61 IgVH mut/ BCL-6 no-mut 8 73.84 2.59 IgVH mut/ BCL-6 mut 9 62.12 3.44 p* 0.032 0.034 CAPÍTULO II: ESTUDIOS GENÓMICOS OBJETIVOS: 1. Estudiar la firma molecular de la LLC-B mediante el uso de micromatrices de alta densidad, identificando vías metabólicas o términos de ontología génica que estuvieran sobrerepresentados en esta patología. 2. Estudiar el perfil de expresión génica en distintos grupos moleculares de LLC-B con el fin de identificar genes y vías metabólicas diferencialmente expresados. 3. Validar los resultados obtenidos del estudio transcriptómico mediante RTqPCR. Células B seleccionadas ( CD19+ bolas inmunomagnéticas) CD19 • 11 Controles sanos • 36 muestras LLC-B estadío A de Binet (no tratados) * 24 IgVH mutado 15 BCL6 no mutado (G1) 9 BCL6 mutado (G2) LLC-B: estadío A * 12 IgVH no mutado (G3) Grupo INICIAL N=36 IgVH mut=24 BCL6mut=9 Micromatrices IgVH no mut= 12 Validación metodolog. por RTqPCR METODOLOGÍA GENÓMICA Extracción de ARN total de linf B Transcripción a ADNc Marcaje con fluorescencia Hibridación con Micromatrices de ADN (microarrays, chips) Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix) Datos Suite GEPAS Montaner D, Nucleic Acids Res, 2006, 34:W486-91 1. Preprocesamiento: Normalización, QC 2. Cluster jerárquico 3. Expresión diferencial (estudio supervisado) -> prueba t 4. Estudio de Anotación Funcional -> FatiScan CONTROLES vs LLC Cluster jerárquico – Método UPGMA LLC-B ASXL2 GLIPR1 POLR3B POLR2L ASXL2 NEDD8 SCLY Proteína relacionada a patogén. en Polimerasas gllioma ->pro Gen involucr. en Codif proteina apoptotica en Factor de asociado a transcrip. a Casimilar de próstata transcrip carcinogen. ubiquitina y vejiga esencial p/ ->ciclo celular, todos los embriogen. linajes hematopoy. NEDD8 Repar. y FIRMA MOLECULAR RBM14 replic. POLE4 LLC-B GLIPR1 RAD51L1 ERCC1 ADN HG U133 2.0 Plus (Affymetrix) SMAD3 POLB SIGLEC10 Proteína CLSTN1 integr. HLADOB membr. FCRL5 ANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScan ACTIVADOS EN LEUCEMIA GO KEGG - REPRIMIDOS EN CONTROLES Sínt de ATP acopl a transp de electrones Replicación ADN Recombinación ADN Reparación ADN Metabol. de nucleótidos Metabol. de hexosas Ciclo celular Fosforilación oxidativa Vía de las pentosas fosfato Ciclo del citrato ACTIVADOS EN CONTROLES GO - Muerte celular REPRIMIDOS EN LEUCEMIA GO KEGG - Diferenciación celular - Apoptosis - Proteólisis mediada por ubiquitina G1 + G2 (IgVH mut) vs G3 (IgVH no mut) CRY1: componente del reloj circadiano MGC9913 RGS4 CRY1 DMD ITGA9 BC7A (B-cell CLL/lymphoma 7A) involucrado en traslocaciones cromosóm. en linfomas no Hodgkin BCL7A TUBA8 LPL: enzima del metabolismo lipídico. Formación y estabiliz de “lipid raft” en LLC LPL CD82: gen supresor de metástasis CD82 FUT8 ADAM29 SVH DUSP22: fosfatasa dual. Activa vía JNK BCL11A: prot dedo de Zn, expresada en CG PDLIM5 DUSP22 BCL11A ANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScan G1 + G2 (IgVH mut) vs. G3 (IgVH no mut) REPRIMIDOS EN IgVH mut ACTIVADOS EN IgVH no mut GO KEGG - Señalización vía proteina G GO - Procesos rítmicos - Vía de señalización Frizzled-2 (WNT) - Vía de señalización mediada por Ca Interacc ECM- receptor Vía de señalización Hedgehog Uniones tipo Gap ACTIVADOS EN IgVH mut GO KEGG - Adhesión celular homofílica - Regulac positiva de IkB kinasa - Metabol glicerolipídico - Ribosoma REPRIMIDOS EN IgVH no mut GO - Apoptosis Expresión diferencial - FatiScan G1 (IgVH mut/ BCL6 no mut) vs. G2 (IgVH mut/ BCL6 mut) 1,0 year s GRUPOS ,8 GRUPO I BCL6 + / IgVH+ ILT ,6 GRUPO II BCL6 - / IgVH + ,4 ,2 0,0 GRUPO III BCL6 - /IgVH 0 MESES 20 40 60 80 100 Sarsotti E, Leukemia.2004 No hay genes expresados significativamente de manera diferencial MET. DE VALIDACIÓN: PCR cuantitat. a tiempo real Genes validados (N=14) Valor Expresión Normalizado= ETCpT(C)-CpT(S)x ERCpR(S)-CpR(C) ET = Efic.del gen diana ER = Efic. del gen de referencia CpT ciclo umbral del gen diana CpR ciclo umbral del gen de referencia C=Calibrador ; S= muestra Validación de resultados: Cuantificación de mRNA por RTqPCR Gen No mut (media + 2SEM) CRY1 LPL MGC9913 BCL7A IFT57 FUT8 DUSP22 BCL11A CD82 ITGA9 ZAP70* FAHD1 PDLIM5 SVH 0.335 + 0.114 297.01 + 89.32 1.96 + 1.193 0.2512 + 0.128 0.919 +1.718 0.966 +0.334 0.649 + 0.361 0.641 + 0.140 0.359 + 0.100 0.381 + 0.122 0.412 + 0.384 0.855 + 0.214 0.684 + 0.136 1.051 + 0.252 * No signif. estadíst. en datos de micromatrices IgVH Mut (media + 2SEM) 0.075 53.62 0.308 0.062 0.647 1.841 1.383 0.937 1.044 0.221 0.151 1.259 0.961 1.689 + + + + + + + + + + + + + + 0.050 44.86 0.302 0.038 0.170 0.370 0.504 0.160 0.382 0.070 0.056 0.196 0.192 0.394 p (prueba de Mann Whitney) <0.001 <0.001 <0.001 0.002 0.007 0.007 0.008 0.008 0.011 0.025 0.033 0.037 0.049 0.049 CAPÍTULO III: MARCADORES PRONÓSTICO EN LLC-B OBJETIVOS: 1. Validar biológicamente los marcadores identificados en un grupo muestral independiente. 2. Valorar la utilidad de los genes seleccionados como marcadores subrogados del estado mutacional de IgVH y de pronóstico en estadíos tempranos de la LLC-B Grupo N=36 INICIAL IgVH mut=24 Micromatrices Validación metodolog. por RTqPCR IgVH no mut= 12 LLC-B: estadío A BCL6mut=9 Grupo VALIDACIÓN N=38 IgVH mut=30 Validación BIOLÓGICA RTqPCR IgVH no mut= 8 BCL6mut=11 Marcador Subrogado IgVH N=74 IgVH mut=54 IgVH no mut= 20 Marcador Pronóstico (ILT) Correlación entre expresión relativa y estado mutacional de IgVH en muestras del grupo de validación Gen No mut (media + 2SEM) CRY1 LPL BCL7A ZAP70 CD82 DUSP22 0.275 + 0.114 228.4 + 59.6 1.44 + 0.742 0.661 + 0.418 0.433 + 0.076 1.18 + 0.38 IgVH p Mut (media + 2SEM) 0.055 + 0.004 20.11 + 13.72 0.073 + 0.042 0.071 + 0.052 0.689 + 0.112 1.90 + 0.30 (prueba de Mann Whitney) <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 0.013 0.023 Marcadores subrogados de IgVH Sensibilidad, especificidad, y área bajo la curva ROC en grupo de validación Gen Sensib (%) Especif (%) Valor de Corte Area ROC CRY1 100 100 < 0.090 1.00 LPL 100 93 < 82.45 0.987 BCL7A 100 82 < 0.1150 0.950 ZAP70 100 89 < 0.1050 0.960 CD82 83 50 > 0.4050 0.78 DUSP22 90 63 > 1.020 0.76 Expresión de genes seleccionados y estado mutacional del gen IgVH G en CRY1 LPL Valor de corte N o Mut Mut n % n >0.090 19 27.1 4 5.7 <0.090 1 1.4 46 65.7 >82.45 20 28.2 6 8.5 <82.45 0 0.0 45 63.4 20 28.2 12 16.9 0 0.0 39 54.9 17 23.9 10 14.1 3 4.2 41 57.7 ZAP70 >0.105 <0.105 BCL7A <0.115 >0.115 % Concordancia % p (Chi cuadrado) 92.8 <0.0001 91.6 <0.0001 83.1 <0.0001 81.6 <0.0001 A No mut IgVH Mut B No mut IgVH Mut CRY1 y LPL como marcadores subrogados del estado mutacional de IgVH Las barras de error representan el 95% del intervalo de confianza. La línea roja muestra el valor de corte para cada parámetro Curvas de Kaplan-Meier: Mutaciones en IgVH Actualm. usado en clínica. La significación estadística de las diferencias entre curvas fue evaluada por la prueba Log-rank. Curvas de Kaplan-Meier: LPL, CRY1 y ZAP70 N=71 p<0.0001 CRY1 p<0.0001 LPL p=0.001 ZAP70-RTqPCR CRY1: ¿NUEVO BIOMARCADOR EN LLC-B? Correlación con la expresión de ZAP70 o LPL y estado mutacional de IgVH CRY1 + ZAP70 qPCR + ZAP70 qPCR - CRY1 - 10 Mut 9 IgV 19 IgV22 H H No mut 1 IgVH No mut 3 IgVH Mut 1 1 IgVH Mut 15.5% discordancias 2= ZAP70 FC+ CD38+ 38 38 IgVH Mut CD38+ CRY1 + LPL + LPL - CRY1 - 5 Mut 20 IgV21 4 IgV H No mut H 1 IgVH Mut 1 IgVH No mut 2 2 IgVH Mut 42 42 IgVH Mut 10.0% discordancias 1= ZAP70 FC+ CD38+ CRY1: Expresión en PBMC N=18 sin selección de células B IgV H Gen CRY1 P No mut (media + 2 SEM) Mut (media + 2 SEM) 0.380 + 0.245 0.051 + 0.038 (prueba de Mann Whitney) 0.007 MARCADOR SUBROGADO IgVH Ensayo Clínico CONCLUSIONES 1. Los estudios funcionales y de expresión génica que hemos realizado sobre muestras de pacientes en estadíos tempranos de LLC, demuestran la heterogeneidad de esta entidad y manifiestan la existencia de subgrupos moleculares bien definidos dentro de esta patología. 2. Mas de un centenar de genes diferencian los perfiles transcriptómicos de muestras con y sin mutaciones en el gen IgVH, en cambio no se encuentran diferencias en los perfiles de expresión con respecto a las mutaciones en BCL6. 3. En el análisis de anotaciones funcionales, la herramienta FatiScan encuentra en las muestras con IgVH no mutado sobreexpresadas vías de señalización involucradas en supervivencia y proliferación celular provenientes del entorno y de la matriz extracelular e inhibida la apoptosis. 4. Existen varios genes cuya expresión podría utilizarse como marcador subrogado del estado mutacional de IgVH y de pronóstico en LLC-B, siendo el gen CRY1, uno de los que proponemos para ser incorporado en ensayos clínicos y posiblemente en la práctica clínica. Hospital Clínico CIPF Javier García Conde Hematología Molecular Ma Jose Terol Rosa Farras Isana Benet Cristina Reinoso Pilar Eroles Sandra Gallach Isabel Marugan Elena Sarsotti CIPF Miguel Marín Bioinformática Joaquín Dopazo David Montaner Hospital Arnau de Vilanova Jose Ramón Mayans Carlos García Ballesteros