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Bases Genética Molecular
http://biologia.ucr.ac.cr/profesores/Gabriela%20Chavarria/Clase%2
01-Gen%C3%A9tica%20Molecular.ppt.
Composición ADN
• Compuesto de 4 moléculas básicas:
nucleótidos
• Idénticas excepto en la base nitrogenada
• Cada nucleótido: grupo fosfato, azúcar
desoxiribosa, 1 de 4 bases
• Bases: Adenina, Guanina, Citosina, Timina
Purinas y Pirimidinas
• Adenina y Guanina: Purinas
• Citosina y Timina: Pirimidinas
Estructura del ADN
•
•
Watson y Crick la descifraron en 1953
Basados en hallazgos de otras personas:
1. Cristalografía de rayos X de Rosalind Franklin y
Maurice Wilkins
2. Datos de Chargaff
%A = %T
and
%G = %C
% Purina = % Pirimidina
(A + G = C + T)
antes de conocer estructura de doble hélice
En humanos:
A = 30.9%
C = 19.8%
T = 29.4%
G = 19.9%
Doble hélice
Enlace de Hidrógeno
Clave: poner azúcar
y grupo fosfato en
cadena lateral y las
bases nitrogenadas
hacia adentro
Sólo unión purinapirimidina podía
explicar diámetro
observado con rayos X
Bases complementarias
A-T
G-C
Polaridad del ADN
Unión de las bases en el ADN
G
C
A
T
Reconocimiento
• Premio Nobel 1962: Watson, Crick y Wilkins
• Libro: „La doble hélice“ de James Watson
James Watson y Francis Crick
Rosalind Franklin
Maurice Wilkins
Replicación
• Artículo en Nature: “No ha escapado a nuestra
atención que el emparejamiento específico que
hemos postulado sugiere de inmediato la
posibilidad de un mecanismo de copia para el
material genético“
Replicación es semiconservativa
Replicación
• ADN polimerasa no puede iniciar síntesis
de novo
• Necesita cebador de ADN o ARN
(sintetizado por primasa)
• Síntesis de nueva cadena: 5‘-3‘
5’ a 3’
Se agregan dNTPs al extremo 3’ de la cadena.
5’PPP
5’
3’
Choice of dNTPs: G-C ; A-T
3’OH
3’ OH
5’
PP
Horquilla de replicación
Fragmentos de Okasaki
Orígenes de Replicación
• Replicación de ADN inicia en orígenes de
replicación en procariotas y eucariotas
• Eucariotas hay múltiples orígenes: unos
30 000 en el genoma humano
• Cada origen genera dos horquillas de
replicación (que se mueven en direcciones
opuestas)
Proofreading: función de corrección
de las polimerasas
• Algunas polimerasas (no todas) corrigen errores
• Cuando se detecta error en ADN recién
sintetizado la polimerasa se devuelve un pb en
dirección 3‘-5‘
• La actividad exonucleasa de la enzima permite
eliminar la base incorrecta
• Seguidamente la polimerasa reinserta la base
correcta
Polimerasas en eucariotas y
procariotas
• 5 en procariotas
• Por lo menos 15 en eucariotas
ADN polimerasas procariotas
Eliminar
cebadores
ADN polimerasas eucariotas
Enzyme
 (I)
 (III)
 (II)
Location
Nuclear
Nuclear
Nuclear
function
priming
of both
strands
elongation repair & repair
of both
replicati
strands
on
3’-5’
exonuc.
No
relative
activity
80%
PRIMASE
Yes
Yes


Nuclear Mitochondrial
No
replication
Yes
10-15% 2-15%
REPLICASE
Proofreading reduce
drásticamente la cantidad de
errores en la replicación
Enzyme
Synthetic
domain
Proofreading
domain
Error rate
- proof. + proof.
N-terminal
10-5
DNA pol III  subunit
 subunit
7 x10-6 5 x10-9
T4 DNA pol C-terminal
N-terminal
5 x10-5 10-7
Rev. transcrip.
none
10-5
DNA pol I
aa 200-600
5 x10-7
Código Genético
• En cuanto se determinó la estructura del ADN fue
aparente que la estructura de las proteínas debe estar
codificada en la secuencia de nucleótidos del ADN
• 20 aminoácidos codificados por los codones
compuestos por combinaciones de 4 nucleótidos
• Posibilidades:
– Codón de 1 nucleótido: 4 posibles aminoácidos
– Codón de 2 nucleótidos: 16 posibles aminoácidos
– Codón de 3 nucleótidos: 64 posibles aminoácidos
Código Genético 2
• El codón debe tener por lo menos 3 nucleótidos
• En 1961 Francis Crick, Sidney Brenner y
colaboradores demostraron experimentalmente que
los codones consisten de tres nucleótidos
• Exceso de codones en relación con el número de
aminoácidos
• El código es degenerado (redundante) : algunos
aminoácidos están especificados por más de un
codón
• Ej:
ATT
ATC
ATA
Isoleucina
ATG
Metionina
Código es universal
• Transferencia de información y codificación son
prácticamente iguales en todos los organismos
– Excepción: ADN mitocondrial
Algunos protozoarios
• El aparato de traducción es el mismo en un amplio
rango de organismos (facilita técnicas de ADN
recombinante)
Estructura base de aminoácidos
Secuencia de proteína va dirección amino-carboxilo
Aminoácidos
ARN
•
•
•
•
•
Simple banda
3 de las bases son las mismas
En lugar de timina, tiene uracilo
Azúcar es ribosa
ARNm, ARNt, ARNr
Transcripción/Traducción
Dogma Central
Templete, No-templete
• Secuencia templete de ADN va de 3’ a 5’
• ARNm es complementario a secuencia templete
• Secuencia ARNm determina los aa (código genético)
• Secuencia ARNm corresponde a la secuencia no-templete
• Por convención se reporta en la literatura la secuencia notemplete de ADN (5’ a 3’) por ser la que corresponde al ARNm y
por lo tanto a los aa
De ADN a Proteína
ADN
ARNm
Proteína
3‘ TAC TTG GAC TTG GCC GAA CTG 5‘
AUG AAC CUG AAC CGG CUU GAC
Met Asp Leu Asn Arg Leu Asp
Inserción
ARNm
Proteína
AUG AAG CCU GAA CCG GCU UGA
Met Lys Pro Glu Pro Ala Stop
Transcripción
Transcripción
Transcripción en procariotas y eucariotas
Procariotas
Eucariotas
Genes agrupados en operones
Genes no agrupados en operones
ARNm pueden ser policistrónicos
ARNm monocistrónicos
Transcripción y traducción están
acopladas
Transcripción y traducción no
acopladas
Policistrónico/monocistrónico
ARNm humano típico
*
*
Pasos de gen a proteína
ARN polimerasas
• Procariotas: sólo una
• Eucariotas tienen 3:
– I, II y III
– Tipo II transcribe genes nucleares que
codifican para proteínas
– Tipo I transcribe ARNr
– Tipo III para ARNt
Similitud ARN polimerasas
Origen evolutivo común
Promotor procariotas/eucariotas
Promotores eucarióticos tipo II
• Elementos basales: secuencia corta de
pirimidinas (iniciador) y la caja TATA, posición
alrededor de –25.
• Elementos de control corriente arriba entre –
50 y –200. Incluyen caja CAAT y caja GC.
Todos genes requieren por lo menos uno,
pero no hay patrón común
Pasos generales de transcripción
Principio y fin de transcripción en
E.coli
• UUUU
• Después de secuencia
de ARN
autocomplementaria
que forma horquilla
Concepto de fábrica de ARN para ARN
polimerasa II de eucariotas
• -Factores de
“capping”
• Factores de
“splicing” (no todas
las enzimas pero
inician proceso)
• Factores de
poliadenilación
Regulación de la Transcripción
• Factores de especificidad alteran especificidad de
ARN polimerasa por un promotor
• Represores se unen a secuencias no codificantes
en el ADN, impidiendo el progreso de la ARN
polimerasa a lo largo del gen
• Activadores aumentan interacción entre ARN
polimerasa y el promotor, facilitando expresión del
gen.
• En procariotas, represores y activadores se unen a
regiones llamadas operadores usualmente ubicados
cerca del promotor
Regulación de la Transcripción
• En eucariotas, regulación de la transcripción es por
interacciones entre FT. Permite diff espaciales y
temporales en expresión.
• Eucariotas usan también enhancers: regiones de
ADN que hacen un loop de vuelta al promotor.
Splicing
Editaje ARN
Corte y Empalme
Genes divididos en eucariotas
• Genes eucariotas presentan interrupciones
• Interrupciones: Intrones
• Segmentos que llegan a ser parte del ARNm
(casi siempre codificantes): Exones
“ Splicing“
• El transcrito primario es procesado por splicing
• Elimina los intrones y une los exones
ARNm
• Ejempo: Gen de la distrofina tiene 74 intrones
Pasos “splicing”
Secuencia consenso
Conceptos
• Existen exones no codificantes (no traducidos).
Error pensar que exon siempre es codificante
• Regiones no traducidas (5’, 3’, exones nc) son
importantes para traducción eficiente
• Existen ARN completos nc
“Splicing” alternativo
•
•
•
•
A partir del mismo transcrito inicial se
obtienen diferentes ARNm
60% de genes humanos con splicing
alternativo
Explica bajo número de genes
Consecuencias búsqueda de mutaciones
An example of alternative splicing
Control del “splicing” alternativo
Errores en “splicing“ como
causantes de enfermedades
Traducción
Ribosomas en procariotas y
eucariotas
Codón de iniciación
Codón de terminación
ARNm:5’-C
G C -3’
Transfer RNA (tRNA)
Apareamiento “wobble”
(balanceo/titubeo)
• Bacterias: 30-40
ARNt con diff
anticodones
• Plantas y
animales: 50 ARNt
diff
• Pero hay 61
codones que
codifican aa
Sitio de unión del ribosoma en
E.coli
Secuencia Shine Dalgarno
Iniciación de la traducción
Elongación
Terminación traducción
Polipéptido se libera
ARNt se separa
Factor de
liberación se
une a sitio A
Produce
disociación
de
subunidades
del ribosoma
Ensamblaje de subunidad pequeña
ribosoma y el ARNt iniciador sobre el ARNm
en eucariotas
Codon de iniciación se
ubica escaneando
corriente abajo del
extremo 5’ del ARNm
Identificación codón de iniciación
en eucariotas
• Reconocimiento AUG iniciador gracias a
secuencia de Kozak
Definición de gen
• Gen: la secuencia completa de ácidos nucleicos
necearia para la síntesis de un producto génico
funcional (proteína o ARN)
• Incluye todas las secuencias requeridas para la
síntesis de un transcrito