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Trypanosoma cruci
Trypanosoma brucei
EXPRESIÓN
EN
TRIPANOSOMÁTIDOS
Verónica Fernández Mancebo
2013
[email protected]
Leishmania major
Leishmania mexicana
Trypanosoma brucei
Organización del genoma nuclear
L. major:
32.8Mb en 36 cr peq. (0.28-2.8Mb)
T. brucei:
26Mb en 11cr grandes
T. cruci:
60.3Mb en 41 cr peq
Organizado en grandes grupos de genes policistrónicos (PGCs)
(10 a cientos de genes codifican proteínas en la misma hebra)
32
53
Repetidos
GGGTTA
Repetidos
¿Promotor? ¿Otras seq?
Codif. para ARNt ó ARNr
Organización policistrónica
Inicio de la transcripción
ARN polimerasas nucleares
• 3 ARN polimerasas nucleares (I, II y III)
• Transcripción policistrónica (genes no relacionados func.)
SUBUNIDADES
ARNpol II 12, ARNpol I 14, ARNpol III 17
5 subun son compartidas entre las 3
2 subun son compartidas entre I y III con homólogas en la II
5 subun homólogas entre las 3
5 subun son específicas de III
2 subun son específicas de I
Diferencias con eucariotas superiores:
Existen varias copias para algunas de las subunidades
El CTD de la pol II no contiene los repetidos 7-pept característicos
de eucariotas superiores
Inicio de la transcripción
Factores de transcripción
Se han identificado muy pocos
Algunos muestran clara identidad de seq con los ortólogos en
levaduras y vertebrados
Otros presentan muy baja identidad
Para ARN-pol II: TRF4 (ortólogo div de TFIIB); SNAPc
(SNAP50+SNAP2+SNAP3); TFIIA; TFIIH (9 sub); complejo PBP2
Para ARN-pol III: TFIIIB (2 subunidades)
Para ARN-pol I: CITFA (específico para tripanosomátidos)
•Factor universal de transcripción relacionado
con TBP (TRF4: TBP related factor 4)
Copyright © 2004, American Society for Microbiology
Mol Cell Biol. 2004 November; 24(21): 9610–9618.
doi: 10.1128/MCB.24.21.9610-9618.2004.
Functional Characterization of a Trypanosoma brucei TATA-Binding ProteinRelated Factor Points to a Universal Regulator of Transcription in Trypanosomes
Jia-peng Ruan,1 George K. Arhin,2 Elisabetta Ullu,2,3 and Christian Tschudi1,2*
Departments of Epidemiology and Public Health1 Internal Medicine2 Cell Biology, Yale University Medical School, New Haven,
Connecticut3
*Corresponding author. Mailing address: Department of Epidemiology and Public Health, Yale University Medical School, 295 Congress
Ave., New Haven, CT 06536-0812. Phone: (203) 785-7332. Fax: (203) 785-7329. E-mail: [email protected].
Received 2004 May 16; Revised 2004 July 19; Accepted 2004 August 13.
TRF-4 y SNAP50
Rol esencial en ARN pol I, II y III
No necesariamente se unen en la región promotora, pero son
importante en la transcripción de los genes:
PARP, SL, U-snRNA
Finalización de la transcripción
Para ARN-pol II:
Tract de 6 o más “T” en 3’ del SL (similar a pol III) está involucrado en la
finalización de la transcripción, pero no en la transcripción de genes de proteínas
(¿diferencia en los complejos que transcriben?)
En PGCs convergentes se separan por varios ARNt ¿la transcripción termina dentro
de los genes de ARNt?
¿estructura de la cromatina importa en la finalización de la transcripción?
Para la ARN-pol III:
Finaliza en varias Ts en el 3’ (nº variable en cada ARNt). No se ha identificado
alguna proteína involucrada
Para la ARN-pol I:
Finaliza en el 3’, en área conteniendo secuencias cortas con potencial de formar un
loop (similar a bacteria indep de rho)
En genes de PRO: 3 elementos de secuencias en el 3’ que actúan sinergisticamente
en una manera dependiente de la orientación
ARN polimerasa II
•Es responsable de la transcripción de genes estruct (act, tubulina),
de los genes del miniexon (ARN-ME o SLRNA) y otros snoARN
•No parece existir promotores clásicos de eucariotas
•Expresión constitutiva sin gran regulación en el inicio de la
transcripción (similar a los TATA-less de eucariotas superiores)
•Sin intrones (excep Poli(A) polim. de T.brucei, T.cruzi)
•Transcripción policistrónica mRNA maduro monocistrónico:
capping, poli(A)
Promotor para ARN-pol II
Tripartita
Inr
100pb
Inr = CYAC/AYR(+1)
-60
-30
PBP1
PBP2
3 subunidades
una TBP-like
Inr
Evidencia que recluta
la pol II
SL-RNA
T...T
Qué se sabe sobre los pre-ARNm
•Todos los genes de un PGC son transcriptos al mismo nivel como
unidad policistrónica
•Todos los ARNm maduros comienzan con la misma secuencia de 3040 nt -> miniexon (ME - SL)
•Esa secuencia no se encuentra en las vecindades del gen que está
siendo analizado
•Existen 100-200 genes para ME por núcleo en tandem
•c/u está presente en un repetido de aprox 1,3 kb
•Su transcripto presenta Cap 4 (m7G, metilaciones 2’OH ribosas 1-4
y metilaciones en las bases 1 y 4) y es monocistrónico
trans-splicing y poliadenilación están acoplados
Generan ARNm maduro para ser exportado del núcleo
ARNm de las sintetasas
de aminoacil-tRNA
Si todos los genes del una PGC se
transcribe en un mismo transcripto
primario
¿por qué se tiene diferente
concentración de las proteínas
codificadas por esos genes?
Incluso ¿diferente concentración de
ARNm maduro?
Regulación de la expresión
Transcripción constitutiva de genes para proteínas
La principal regulación se da a nivel
POST-TRANSCRIPCIONAL
Elongación
Regiones intergénicas (ME/poli(A))
Estabilidad ARNm (3’UTR)
Traducción
Estabilidad de la proteína
• Esta regulación es la clave para los cambios en la expresión génica
• Elementos en las regiones intergénicas (rol de las regiones UTR)
5’ UTR
ME
Reg. Cod.
3’ UTR
AAAAA
n
GP82: gp de
superficie
presente en la
forma infectiva y
ausente en la
sanguínea
3’UTR
Destinos de los
ARNm en
tripanosomátidos
(modelo)
ORF
CAP4
5’UTR
RBP
Promotor para ARN-pol III
•Transcribe ARN pequeños (5S, tARNs, 7SL-ARN y todos
snARN) usando snARN
•Básicamente presenta los mismos promotores que
eucariotas superiores: estar tanto en la región 3’ como 5’
TSS/Inr
Punto de inicio
A
Tipo I
C
ARNr 5S
Tipo II
Tipo III
A
DSE
PSE
TATA
B
ARNt
U2-U6
T. brucei
Promotor para ARN-pol I
•
Transcribe: ARN ribosomal (nucleolo) y
genes de Ags de superficie (VSG y PRO)
•
ARNr maduro: 20% 5’PO4 y 80% 5’ OH
•
Promotor parecido de los eucariotas
superiores
Punto de inicio
–170
–150
–130
–110
Upstream control element
Dom III (distal)
–60
–40 –20 –10 +10 +20
Core promoter
Dom II
DomI
Promotor para
ARN Pol I
Aparentemente están siempre activos (regulación de las
unidades de VSG y de PRO?).
Core
Suficiente para transcribir VSG
Se estimula la actividad por la presencia de elementos en el 5’ (UCE)
VSGs
Variant Surface Glycoprotein
T. brucei:
Inmunofluorescencia de
formas sanguíneas
usando Acs contra
VSG 221
VSG VO2
VSG
Cambio de Expresión
• Cada cambio se acompaña de un pico de parasitemia
Genes VSG: copia ligada a la expresión (ECL)
1. Southern blot: ADN de distintas poblaciones del parásito,
Digestión con enzimas de restricción, Electroforesis en gel de
agarosa, Transferencia a membrana de nylon, Hibridización.
2. Hirbridización con un ADNc de una población (pej. b)
Copia Básica (BC)
Copia ligada a la expresión (ECL)
a b c d ...etc
Más del 50% de los genes VSGs siguen este patrón
La formación del ELC ocurre por conversión génica
VSG(tel-inact)
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(interno)
VSG(tel-act)
VSG(copia-act)
VSG(tel-inact)
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(interno)
VSG(tel-act)
VSG(tel-act)
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(tel-act)
VSG(tel-act)
VSG(interno)
VSG(tel-inact)
ARN pol mitocondrial (mitARNpol)
El ADN en el kinetoplasto está distribuído en:
maxi-(30-50kb) y mini-(0.8-1.6 kb) círculos
10-30 copias 30000-50000 copias
genoma mitocondrial
ARNguias
No se han encontrado secuencias promotoras consenso
Transcribe ARN poli-cistrónicos que luego se procesa
(corte en ARN monocistrónicos seguido/acompañado de
editado (+/-U), poli-A para ARNm y poli-U para ARNg)
NOTA: en el núcleo se transcriben:
.el ARN mitARNpol, que se sintetiza en el citosol (1 subunidad)
.los ARNt del kinetoplasto y se deben importar
RET1 (RNA editing
TUTase 1).
Editado
• Modificación de información génica codificada en el ADN
• Se adicionan o se remueven bases del ARNm (en general
se introducen o se sacan “U”)
• Ocurre en la mayor parte de los ARN mitocondrial.
• Se corrige el marco de lectura.
Simple: número pequeño de U en el extremo 5´ cox2 T.brucei
Extensa: 60% del ARNm maduro no codificado por el gen
> 50% de los genes de T. brucei mitocondriales, ej. Cox3
Editado
ARNg
• Todos los ARNg tienen su propio gen en
el minicírculos mitocondriales (salvo el 3’
de COXII)
•Son pequeños (40-70nts) y no sufren
edición.
anclas
•El extremo 5’ de cada ARNg es
pre-ARNm
complementario a la secuencia cercana a
5’
3’
la región editada hacia el 3’ del mRNA.
•El extremo 3’ de los gRNAs tienen una
cola de U (5-15nts), agregada por una
terminal uridil transferasa (TUTasa).
•La región intermedia contiene la
secuencia complementaria a la porción
editada del mRNA. (AU, GC y GU)
3’
5’
ARNg
Seq guía de
edición
•Editosoma: corta el transcripto y agrega Us (TUTasa), mantiene los
extremos abiertos, elimina las Us no apareadas (exoribonucleasa Uespecífica) y liga los extremos del transcripto mRNA editado.
al. 1990
TbRGG2
Editado
Algunas consideraciones
Armar marcos de lectura:
- crear codón de inicio y de terminación,
- establecer marcos de lecturas funcionales
La edición es esencial para la diferenciación en T. brucei
Las cantidades relativas de ARNm editado y sin editar
varía en los diferentes estadios (¿mec. de regulación?)
La edición alternativa del RNAm de la citocromo C oxidasa
mitocondrial III (COXIII) en Trypanosoma brucei produce una
nueva proteína de unión a ADN: AEP-1.
AEP-1 sería una estructura que enlaza físicamente el kADN y
cuerpos basales flagelares.
La expresión en tripanosmátidos…
•Entender la regulación la expresión génica ayudaría a comprender
procesos (diferenciación, virulencia, variación antigénica) y a
encontrar blancos claves para controlar la infección.
•Mecanismo de expresión único (transcrip policistrónica, transsplicing, editado de ARNm, la ARNpol I sintetiza ARNm).
•La iniciación de la transcripción de genes de proteínas parece ser
comparable a los promotores sin caja TATA de humanos y otros
mamíferos (cr 1 de L major).
•La transcripción no parece ser atípica ya que se han identificado
factores de transcripción generales diferentes a los eucariotas
superiores.
¿PREGUNTAS?