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TRANSCRIPCIÓN
EN
TRIPANOSOMÁTIDOS
2007
Transcripción en Tripanosomátidos
• 4 ARN polimerasas (I, II y III; y mitocondrial)
• Factor universal de transcripción relacionado con
TBP (TRF4: TBP related factor 4)
• Organización general de genes: policistrónica (no
relacionados funcionalmente)
• “Capping” de ARNm (por trans-splicing)
• La regulación post-transcripcional es la clave para los
cambios en la expresión génica
• Esta regulación se ejerce a través de elementos en
las regiones intergénicas (rol de las regiones UTR)
ARN polimerasa III
•Transcribe ARN pequeños (5S, tARNs y snARN) usando snARN
•Básicamente presenta los mismos promotores que eucariotas
superiores: estar tanto en la región 3’ como 5’
Punto de inicio
A
Tipo 1
Tipo 2
Tipo 3
A
?
?
C
B
?
ARNr 5S
ARNt
U1-U5
(diferencia con eucariotas sup)
ARN polimerasa I
•Transcribe ARN ribosomal (nucleolo) y además,
transcribe 2 grupos de genes que incluye Ags de
superficie (VSG y PRO)
•Los transcriptos ARNr no se le agrega cap: 20%
5’ tri-PO4 y 80% 5’ OH
•La estructura del promotor es semejante a los
otros eucariotas: bipartita
Punto de inicio
–170
–150
–130
–110
Upstream control element
–60
–40 –20 –10 +10 +20
Core promoter
Promotores de ARN Pol I
Similar a los promotores de ARNr euc. superiores
Aparentemente están siempre activos (la regulación para las
unidades de VSG y de PRO es en la elongación).
Core
Suficiente para transcribir VSG
Se estimula la actividad por la presencia de elementos en el 5’ (UCE)
Mitocondrial transcripción:
ARN polimerasa mitocondrial (mitARNpol)
Nota: El ADN en el kinetoplasto está distribuído en:
maxi- y mini- círculos
30-50kb 0.8-1.6 kb
10-30 copias 30000-50000 copias
genoma mitocondrial ARNguias
No se han encontrado secuencias promotoras consenso
mitARNpol es transcripta en el núcleo como una única
subunidad
Nota: los ARNt del kinetoplasto se transcriben en el núcleo y
se deben importar
ARN polimerasa II (presenta dominio CTD)
•Es responsable de la transcripción de genes estructurales
(actina y tubulina), de los genes del miniexon (ARN-ME o
SLRNA) y otros snARN
• Bajo nº de promotores y diferentes a otros eucariotas
•No hay gran regulación en el inicio de la transcripción
•Expresión constitutiva
•Sin intrones (excep Poli(A) polim. de T.brucei, T.cruzi)
• Transcripción policistrónica
•la finalización de la transcripción al final del policistrón no
está caracterizada aún
• mRNA maduro monocistrónico: capping, poli(A)
Promotores de ARN Pol II
Como no existen evidencias de promotores clásicos de ARN pol
II, se ha sugerido que inicia la transcripción al azar
Se conoce:
-Secuencias consenso en promotores para miniexon
-Proteínas de unión a promotor del miniexon
Los promotores se encuentran en el 5’ de cada copia (bipartita)
-60
-30
PBP1
PBP2
3 subunidades
una TBP-like
SL-RNA
Evidencia que recluta
la pol II
T...T
Finalización?
(semejante a
bacteria: rhoindependiente)
Procesamiento del pre-ARNm / Trans-splicing
•Todos los ARNm estudiados comienzan con la misma
secuencia de 30-40 nt -> miniexon (ME - SL)
•Esa secuencia no se encuentra en las vecindades del gen
que está siendo analizado
•Existen 100-200 genes para ME por núcleo en tandem
•c/u está presente en un repetido de aprox 1,3 kb
•Su transcripto presenta Cap 4 (m7G, metilaciones 2’OH
ribosas 1-4 y metilaciones en las bases 1 y 4) y es
monocistrónico
El trans-splicing es un mecanismo utilizado para generar
ARNm maduro para ser exportado del núcleo
ADN
trans-splicing y
poliadenilación
están acoplados
Trans-splicing alternativo: se describió para LYT una proteína de
asociada con la virulencia. La diferncia son 28 aa en el N-t: La > es
de membr (fase virulenta) la menor está en el kinetoplasto.
Transcripción de genes para proteínas es constitutiva
No existen factores que regulen la iniciación de la
transcripción
Regulación se debe dar luego del inicio de
la transcripción
Elongación
ME/poli(A)
3’UTR
traduccional
estabilidad de la proteína
Maquinaria
de procesamiento
deARN
ARNm
transcripto
policistrónico
Podría
ser más
eficiente si se cambia
la elección
de un gen en un
preexistente que en el ADN ya que se debe reclutar reguladores específicos
(aunque esto implique una gran degradación del transcriptoma)
ARN polimerasa encargada de la elongación
Control sobre secuencias intergénicas
3’UTR de PRO: Estabilidad / Degradación
Factores que regulan la producción de ARNm de PRO también regulan
opuestamente el sitio activo de transcripción de la VSG
ME
5’ UTR
27º
citrato
ME
ME
3’ UTR
AAAAA
37º
no-citrato
Transcripción
basal
AAAAA
AAAA
n
n
ME
AAAAA
ME
n
AAAA
Se cree que estos factores externos actúan sobre elementos en el 3’UTR
Editado
• Modificación de la información génica codificada en el ADN.
• Se adicionan o se remueven bases del ARNm.
• Generalmente se introducen o se sacan “U”
• Se corrige el marco de lectura
• Ocurre en la mayor parte de los ARN mitocondrial.
Simple: número pequeño de U en el extremo 5´
cox2 en T.brucei
Extensa: 60% del ARNm maduro no codificado por el gen
> 50% de los genes de T. brucei mitocondriales, ej. Cox3
Eucariotas inferiores:
- En mitocondrias de Trypanosoma:
la citocromo oxidasa subII (coxII) que tiene insertadas 4 U
que cambian aminoácidos y además cambia el marco de
lectura. Como no existe otro gen, las U fueron agregadas
luego de la transcripción
- Mecanismo:
se encontraron ARN-guías, que contiene una secuencia
complementaria del transcripto
Acción de la TUTasa usando pool de UTP de la célula
Endorribonucleasa y ligasa (ATP)
CARACTERÍSTICAS DE LOS gARN
• Todos los gRNA tienen su propio gen en el
minicírculos mitocondriales (salvo el 3’ de COXII)
•Son pequeños (40-70nts) y no sufren edición.
•El extremo 5’ de cada gRNA es complementario a
la secuencia cercana a la región editada hacia el 3’
del mRNA.
•El extremo 3’ de los gRNAs tienen una cola de U
(5-15nts), que es agregada por una terminal uridil
transferasa (TUTasa).
•La secuencia intermedia contiene una secuencia
que es complementaria a la porción editada del
mRNA. (AU, GC y GU)
Algunas consideraciones del editado
Armar marcos de lectura:
- crear codón de inicio y de terminación,
- establecer marcos de lecturas funcionales
La edición es esencial para la diferenciación en T.
brucei
Las cantidades relativas de ARNm editado y sin
editar varía en los diferentes estadios
(mecanismo de regulación?)
RNA editing mechanism
pre-mRNA
uuuu
poly-U tail
gRNA
Variación antigénica
T. brucei:
Inmunofluorescencia de
formas sanguíneas usando
anticuerpos contra
la VSG 221 (verde) o
la VSG VO2 (rojo).
Variant surface glycoprotein (VSG)
• Glicoproteínas variables de superficie que constituyen
una cubierta densa e inmunogénica de la membrana
plasmática (107 por organismo)
• Son grandes 450-500kDa
• Sólo una se expresa por vez
• El cambio de expresión de VSG se realiza en forma
espontánea (1 cada 100 por generación)
• Existen aproximadamente 1000 potenciales variantes
por organismo
• Los sitios de expresión están ligados a telómeros
• Existen aproximadamente 20 sitios de expresión
• El sitio activo de expresión aparentemente no se encuentra
en un cuerpo nucleolar
Sólo una se expresa, es decir que sólo se expresa la
copia ELC que está localizada en el sitio de expresión
que está bien cerca del telómero
• Cada cambio se acompaña de un pico de
parasitemia
Genes VSG: copia ligada a la expresión (ECL)
1. Southern blot: ADN de distintas poblaciones del parásito,
Digestión con enzimas de restricción, Electroforesis en gel de
agarosa, Transferencia a membrana de nylon, Hibridización.
2. Hirbridización con un ADNc de una población (pej. b)
Copia Básica (BC)
Copia ligada a la expresión (ECL)
a b c d ...etc
Más del 50% de los genes VSGs siguen este patrón
Cada VSG es codificado por una copia básica que puede
encontrarse a 5-15kb del telómero (teloméricos) o
>50kb del telómero (internos)
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(tel-act)
Expresión algo programada (aparentemente involucra a la
cantidad de repetidos de 70pb)
La formación del ELC ocurre por conversión génica
VSG(tel-inact)
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(interno)
VSG(tel-act)
VSG(copia-act)
VSG(tel-inact)
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(interno)
VSG(tel-act)
VSG(tel-act)
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(tel-act)
VSG(tel-act)
VSG(interno)
VSG(tel-inact)
Existen muchas copias del gen VSG en el genoma.
La mayoría de los genes VSG son pseudogenes:
recombinación puede generar nuevos genes VSG
aumentando la variabilidad.
Esta nueva información la guarda temporariamente
cambiando el sitio de expresión
Aparentemente el silenciamiento de los otros sitios de
expresión y la recombinación son independientes
3000pb
VSG
1500pb
Región transpuesta
40kb
5’
Repetidos cortos?
8kb
3’ TELOMERO
(CCCTAA)n
Otro ejemplo es la bacteria Borrelia hermsii que causa la fiebre recurrente en el hombre. Esta bacteria sobrevive alterando una proteína de
superficie (VMP), que están asociados con rearreglos en el genoma. El
gen VMP activo está localizado cerca del telómero de un plásmido lineal.