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Especialidad en Microbiología Clínica
Módulo: “Biología Molecular Aplicada al Laboratorio de Microbiología”
UCA
Clase teórica V
Lic. M. Paula Quiroga
Los temas de hoy
6/5:
- Terapia génica:
aplicaciones
metodologías empleadas
Enfermedades “genéticas”
– Congénitas
– Adquiridas
Terapia Génica
Concepto de Terapia Génica
Es la introducción de material exógeno (natural o
recombinante) en humanos para corregir deficiencias celulares
expresadas en el nivel fenotípico.
Es una estrategia terapéutica basada en la modificación del
repertorio genético de células somáticas mediante la
administración de ácidos nucleicos y destinada a curar tanto
enfermedades de origen hereditario como adquirido.
Es la transferencia de material genético nuevo a células de
un individuo dando lugar a un beneficio terapéutico para el
mismo
Tipos de terapia
Somática
Germinal
A células dipoides
Sin consecuecias
evolutivas
Células haploides
Ideal para enfermedades genéticas hereditarias
Bioética (abuso y eugenesia)
Uso en biotecnología (animales transgénicos)
Largo plazo
la terapia génica, tiene cuatro
acepciones:
• somática (tratamiento de las células enfermas),
• germinal (para evitar la transmisión hereditaria de enfermedades),
• perfectiva (manipula los genes para mejorar ciertas características)
• eugénica (que busca mejorar cualidades complejas del individuo,
tales como la inteligencia).
http://www.bioetica.uchile.cl/doc/genoma.htm
Aplicaciones
Fibrosis quística
Fibroblastos de la piel usados en terapia génica
Terapia génica aplicada a hepatocitos
Linfocitos modificados genéticamente
Utilización de células hematopoyéticas en la expresión de células
en animales
Deficiencia de adenosín desaminasa en humanos
Transferencia de mioblastos usada para tratar la distrofia
muscular de Duchenne
Terapia génica en la cura del cáncer
Terapia génica en infección por HIV
Prevención de rechazo de órganos transplantados
Principales hallazgos relacionados a farmacología:
•
Una nueva generación de vacunas: bacterias o virus con un gen activo extirpado.
Ya ha salido al mercado una para la hepatitis B y se trabaja en vacunas para la
malaria, encefalitis y SIDA.
•
Fármacos obtenidos de manipulación genética, tales como la insulina, la hormona
del crecimiento y el Interferón.
Desarrollo en el campo de la neurobiología molecular de los
neurotransmisores, para posible uso en enfermedades psíquicas.
•
Obtención de activadores tisulares, tales como el t-PA ("tissue Plasmigen
Activator") que puede ayudar en la evolución del infarto.
•
Anticuerpos monoclonales, además de su uso en diagnóstico, pueden ser usados
en enfermedades infecciosas, al poder ser dirigidos a zonas específicas del
organismo.
Material a insertar
Transgenes
Fragmentos de AN
Expresión de un receptores
Expresión de proteínas secretorias
Expresión de un factor
transcripcional
Expresión de un inhibidor
Modificación genética
Silenciamiento de genes
Inhibición de la expresión
siRNA
miRNA
Inserción de transgenes
Inserción de fragmentos de AN
Ribozimas
Fase I Cancer
Fase II Cancer colorectal metastásico
AS-ODN
Aprobado Retinitis
Fase II y III Cancer
Fase II Hepatitis C
Fase II Asma
Fase II Artriris reumatoidea
Fase II y III Psoriasis
Fase I AIDS
Inserción de fragmentos de AN
Oligonucleótidos que inactivan genes relacionados a procesos
de una enfermedad
Inhibición de la expresión de genes in vivo
Inactivación o
disrupción génica
Estrategia antigen
Modificación de la
regulación transcripcional
Estrategia antisentido
Inactivación de la
transcripción/traducción
Estrategia antigen
RNA polimerasa
FT
Región
promotora
RNA polimerasa
FT
FT
Región
promotora
No hay transcripción
Estrategia antisentido
Herramientas
Mecanismo
Antisense oligodeoxynucleotide ( AS-ODN )
Induction of RNAse H
Antisense RNA ( AS-RNA )
Protein-dependent cleavage
2'-O-methyl phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotide ( AO )
Inhibition of splicing (Exon skipping)
DNAzymes
Protein-independent catalytic
cleavage
External guide sequences ( EGS )
RNAse-P mediated cleavage
Morpholino antisense ( MF-AS )
Inhibition of translation
Micro RNAs ( miRNA )
RNAi (inhibition of translation)
Peptide nucleic acids ( PNA )
Inhibition of translation
Phosphorothioate oligodeoxynucleotide ( PS-ODN )
Induction of RNAse H
Ribozyme ( RBZ )
Protein-independent catalytic
cleavage
Small interfering RNA ( siRNA )
RNA interference (RNAi) (cleavage)
Small hairpin RNA ( shRNA )
RNAi (cleavage)
Estrategia antisentido
Formación de triple-hélice
con oligonucleótidos
Baja eficiencia
Estrategia antisentido
Antisense oligonucleotides
AS-ODNs
Estrategia antisentido
Antisense oligonucleotides
AS-ODNs
Estructuras secundarias de ARN 
complicación
Pruebas previas para buscar loops
(regiones simple cadena)
Estrategia antisentido
Estrategia antisentido
MicroRNAs (miRNAs)
Genes reguladores: regulan la expresión de las proteínas mediante la
inhibición de la traducción y la degradación del mRNA
Estrategia antisentido
Ribozimas
RNA con estructura secundaria  actividad catalítica
Fragmentos largos o cortos:
Largos  intrones del GII o GI
Cortos  hammerheads (40nt)
Debe conocerse la secuencia previamente
Iguales problemas que AS-ODNs
Ingresan mediante plásmidos o administrados exógenamente
Hammerheads sintéticos son más estables
Estrategia antisentido
Estrategia antisentido
Vectores
Vehículos para la transferencia de
genes (transgenes) o fragmentos de
ácidos nucleicos
Virales
No Virales
Paso mas importante !!!
Vectores virales
Ventajas
• Tecnología basada en la evolución
• Variedad de tropismos celulares disponibles
• Frecuencia de transducción robusta
• 2 tipos de virus: ADN y ARN
• Genes pueden ser llevados episomalmente o integrados en el
genoma
Desventajas
• Tecnología viral con evolución por infección y proliferación (no
benigno)
• Puede haber replicación de virus competentes
• Riesgos de recombinación con virus wild type in vivo
• Oncogénesis
• Riesgo por respuesta inmune
Adenovirus
Retrovirus
Virales
(Huésped:
hombre)
Herpesvirus
Virus
adenoasociados
Retrovirus
• Se integran en células divisibles
• Toxicidad
• Para generar líneas celulares
estables en cultivos celulares
(tratamiento de enfermedades
hereditarias y crónicas)
• Administración: ex vivo o in situ
Adenovirus
• Más usado
• Facilidad de infectar tejidos (asociados enfermedades del
sistema respiratorio)  90% seres humanos poseen
anticuerpos  Rápida degradación (24hs)
• No hay integración del gen en el genoma
• Bueno para células divisibles y no divisibles (expresión mas
larga)
• Produce altas concentraciones de proteína en células
mamíferas
• Administración: ex vivo o in situ
• Alta inmunogenicidad: útil contra células tumorales (estimula
respuesta inmune)
Adenovirus
Inyección
del nuevo
gen en virus
Célula
humana
Tratamiento exitoso: síntesis de una
proteína funcional
Virus Adeno-asociados
•
•
•
•
•
•
Amplio espectro de células
Puede infectar células divisibles y no divisibles
Infección latente  Expresión a largo plazo de gen
Buena relación de bioseguridad  no patógenas
No estimulan la respuesta inmune
Se encuentran en células infectadas con adenovirus (helper)
Infección productiva
• Integración altamente específica (en un solo lugar) con baja
frecuencia
• Administración: desconocida, probablemente ex vivo
Virus Adeno-asociados
Limitación: baja capacidad de empaquetamiento (en
resolución)
Fase I de terapia génica: fibrosis quísitica, hemofilia B
Considerado para: hemofilia A, deficiencia de g antitripsina y
amaurosis congénita de Leber
Tratamiento para infarto del miocardio
cirrosis y tumores pancreáticos o
de colon
Vectores virales
Huésped: Bacterias
Bacteriófagos
Expresión del gen insertado:
estable
Aplicación: destrucción de bacteria
patógenas in vivo
Estrategias involucrando transgenes
y AN