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Tema 9. Genética reversa IV.
Construcciones antisentido.
Diseño de construcciones antisentido. Detección de la presencia
y efecto de la construcción AS. Análisis de la actividad génica.
RNAi. Silenciamiento.
Genética reversa IV. Construcciones
antisentido.
Estrategia:
Eliminación de una actividad génica mediante la expresión, vía
transgénesis, de un RNA antisentido
Construcciones:
Son fusiones transcripcionales en las que la secuencia de cDNA
se integra en posición invertida
El efecto es dependiente de la secuencia
No es necesario incluir todo el cDNA en la construcción
Genética reversa IV. Construcciones
antisentido.
Flexibilidad:
Inactivación de miembros específicos o de toda una familia de
genes (redundancia)
S. J. Temple, Suman Bagga and Champa SenguptaGopalan (1998)
Downregulation of specific members of the glutamine synthetase gene
family in alfalfa by antisense RNA technology. Plant Molecular Biology
37: 535–547.
Distintos alelos en distintos eventos de transformación
Dominante
Genética reversa IV. Construcciones
antisentido.
Métodos de análisis:
Presencia de la construcción
Nivel de transcripción
Acumulación de proteína
Problemas:
El mecanismo de acción es poco claro, resultado impredecible
Análisis Genético difícil si se da inestabilidad
Genética reversa IV. Construcciones
antisentido.
Hacia un modelo
La elaboración de un modelo para explicar el efecto de las
construcciones AS se ha visto facilitada por la observación de la
conexiones existentes entre tres fenómenos:
El silenciamiento mediado por sobre-expresión
Los mecanismos de defensa frente a RNA exógeno
El silenciamiento mediado por RNA duplexo
Genética reversa IV. Construcciones
antisentido.
El silenciamiento mediado por sobre-expresión
Plant gene silencing regularized G. Bruening (1998) Proc.
Natl. Acad.
Sci. USA 95,13349–13351
Intentos
de sobre-expresión
de un gen da lugar a veces al
silenciamiento del transgén+endógeno (co-supresión)
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antisentido.
En algunos casos el silenciamiento se ha correlacionado con el
nivel de expresión del transgén
El silenciamiento puede ser inducido por expresión transitoria
El silenciamiento puede transmitirse por multiplicación
vegetativa e injerto
Como el AS el fenómeno es impredecible entre generaciones
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antisentido.
Mecanismos de defensa frente a RNA exógeno
En la resistencia derivada del patógeno, un mecanismo de
defensa
natural es el
silenciamiento
Virus
resistance
and
gene silencing in plants can be
induced
by simultaneous
expression
of sense
La sobre-expresión
de un fragmento
del genoma
viral and
confiere
antisense
P. M. WATERHOUSE, M. W. GRAHAM, AND
resistencia RNA
No es(1998)
necesaria
traducción, resistencia mediada por
M-B. WANG. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,13959–13964
RNA
Virus resistance and gene silencing: killing the messenger
Resistencia elevada y altamente específica
(1999) P. M. Waterhouse, N. A. Smith and M-B. Wang. Trends in Plant
Sciences
4, 452-457
La resistencia
se mantiene incluso en protoplastos pero, como
en el silenciamiento, no es predecible tras la meiosis y
formación de semillas
AS, silenciamiento y resistencia mediada por RNA operan a
través de un mecanismo de PTGS que implica RNA duplex
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antisentido.
Silenciamiento mediado por RNA duplexo
En
C. Elegans,
la inyección
un RNA
la líneaE. G.
RNA
interference:
It’s a de
small
RNAduplex
worlden(2001)
germinal
provoca
pérdida,
Moss. Current
Biology
11 heredable, de función del gen
correspondiente
Genome-wide RNAi (2001) R. Barstead Current Opinion in
Chemical
El
métodoBiology
explota5,la63–66
existencia de mecanismos de regulación de
la expresión génica, posiblemente ancestrales, mediados por
pequeños RNA duplex y operativos en el desarrollo
El método es tan eficaz que se esta utilizando en la inactivación
sistemática de todos los genes del gusano
Un modelo
para el PTGS
El problema está siendo diseccionado genéticamente en
organismos modelo como C. Elegans, Drosophila, Arabidopsis o
Neurospora
Silencing genes silencing genes (2000) S. N. Covey. Trends in
Plant Science 5, 405-406
RNA silencing in plants (2004) David Baulcombe. Nature, 431,
356-363.
POSTER
Un modelo para el PTGS
Dicers at RISC: The Mechanism of RNAi. Previews
Cell, Vol. 117, 1–4, April 2, 2004,
En Drosophila se han encontrado dos genes DICER que parecen
especializados en el procesamiento de miRNA y siRNA,
respectivamente, y de la carga de los correspondientes RNA
monohebra en los RISC (RNA-induced silencing complex)
Un modelo para el PTGS
RNAi: RISC Gets Loaded. Preview. Cell, Vol. 123, 543–553,
November 18, 2005
La formación de RISC loading
complex (RLC) y la activación
de los correspondientes RISC
esta mediada por proteínas de
la familia Argonauta, que son
también responsables del corte
o desnaturalización de los
RNA duplex o microRNAs
hairpins
Un modelo para el PTGS, señales sistémicas
In this issue: Small RNA on the Move. The Plant Cell, Vol. 16,
1951–1954, August 2004.
A Systemic Small RNA Signaling System in Plants. Byung-Chun
Yoo y col. The Plant Cell, Vol. 16, 1979–2000, August 2004
Genética reversa IV. Construcciones
antisentido.
Aplicaciones
del modelo
de PTGS
Construct design for efficient, effective and high
throughput gene silencing in plants (2001) S. V. Wesley
y col. The Plant Journal 27, 581-590
Application of gene silencing in plants (2001) M-B
Wang and P M Waterhouse Current Opinion in Plant Biology 5:146–
150
Genética reversa IV. Construcciones
antisentido. Un ejemplo
A Genetic Screen for Candidate Tumor Suppressors Identifies
REST. Westbrook, T.F. y col. 2005. Cell, Vol. 121, 837–848.
Las células para el screening (TLM-HMECs), están predispuestaas
a la transformación tumoral, se crearon introduciendo la subunidad
catalítica de la telomerasa humana (hTERT) y el antígeno grande
de SV40 en una línea derivada de células epiteliales de mama
humana.
Además, estas células tienen niveles elevados del gen c-myc,
debido a sus múltiples pases por cultivo in vitro.
Las células no proliferan, sin embargo en la ausencia de matriz
extracelular, lo cual es fundamental para el éxito del screening.
Genética reversa IV. Construcciones
antisentido. Un ejemplo
La expresión de myr-p110α, un mutante activado
del
promotor
de
tumores
PI(3)K
(phosphatidylinositol
3'-kinase),
produce
crecimiento independiente del medio de anclaje.
El efecto no es un artefacto de la sobreexpresión,
se consigue también mediante supresión,
mediada por shRNA, de la expresión de PTEN,
un antagonista de PI(3)K
Genética reversa IV. Construcciones
antisentido. Un ejemplo
A
B
Para el screening, se infectaron
células TLM-HMEC con una
librería retroviral de 28000 shorthairpin RNAs (shRNA). Diseñados
para alterar la expresión de unos
9000 genes.
Cada shRNA estaba ligado a una
secuencia única de 60 bp para la
posterior identificación de la
construcción
A
B
Las células capaces de desarrollar
colonias en ausencia de matriz de
anclaje fueron analizadas por dos
vías.
Genética reversa IV. Construcciones
antisentido. Un ejemplo
La secuenciación de 200 colonias identificó 25 genes, 18 de ellos
encontrados también mediante la estrategia de pooling e
hibridación.
Genética reversa IV. Construcciones
antisentido. Un ejemplo
El 90 % de los shRNA iban dirigidos
contra 8 de los 25 genes en la lista
(ver tres de ellos en la figura), el
diseño de nuevos shRNAs ha
permitido validar algunos de estos
genes.
La estrategia utilizada ha servido
para identificar nuevos genes con
actividad supresora de tumores