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BIODIVERSIDAD Y BIODEGRADACIÓN
Introducción
Mecanismos de evolución y adaptación
Ejemplos
PROCARIOTAS en la biosfera
Hay de 4-6 x 1030 células de procariotas
Su biomasa es muy superior a la biomasa de eucariotas
90% de los procariotas se encuentran en el SUBSUELO
10% en SUELOS, SEDIMENTOS, MASAS DE AGUA, AIRE, EUCARIOTAS
Mucha BIODIVERSIDAD
 Estimación del nº de especies bacterianas: entre 10.000 y > 1 billón (109)
 Existen desde hace cerca de 3,5 G-años
(las plantas existen desde hace 600 millones de años)
Formación de la tierra
Homo sapiens
Caballo
Estabilización de la corteza
Atmósfera de oxígeno
Dinosaurios
procariotas
4.5
4.0
3.5
3.0
Trilobites
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
Billones de años
0
Woese, 1994
• Sin embargo, sólo unas 6000 especies descritas, frente a más de 1
millón entre animales y plantas, o ca. 1 millón de especies de insectos.
¿PORQUÉ? Pequeños, simples, dificultad cultivo puro, pocos estudios
taxonómicos, ...
Número de procariotas en habitats acuáticos
Hábitat
Volumen,
cm3
Celulas/ml
× 105
Nº total de celulas
× 1026
Marino
Plataforma continental
Océano abierto
Agua, por encima de 200 m
Agua, por debajo de 200 m
Sedimento, 0-10 cm
2.03 × 1020
5
1.0
7.2 × 1022
1.3 × 1024
3.6 × 1019
5
0.5
4600
1.25 × 1020
1.2 × 1018
10
10
1.3
0.012
1.04 × 1020
10
1.0
360
650
170
Dulce
Lagos
Rios
Lagos salinos
Total
1180 x 1026
Whitman et al., 1998
Número de procariotas en el suelo
Tipo de ecosistema
Area,
× 1012 m2
Selva tropical lluviosa
Selva tropical pluviestacional
Bosque templado esclerófilo
Bosque templado caducifolio
Bosque boreal (taiga)
Bosques y arbustedas
Sabana
Praderas templadas
Matorral desértico
Tierras cultivadas
Tundra y vegetación alpina
Pantanos y zonas húmedas
17.0
7.5
5.0
7.0
12.0
8.0
15.0
9.0
18.0
14.0
8.0
2.0
Total
123.0
No. of cells,
× 1027
1.0
0.5
0.3
0.4
0.6
28.1
52.7
31.6
63.2
49.1
20.8
7.3
255.6 x 1027
Número total de procariotas en sedimentos subsuperficiales
no consolidados (por debajo de 10 m)
Nº de células, × 1028
Intervalos de
profundidad (m)
0.1
10
100
200
300
400
600
1200
2000
3000
Cells/cm3
× 106
Océanos Plataforma Planicies
profundos continental costeras
220.0
45.0
6.2
19.0
4.0
7.8
0.95
0.61
0.44
0.34
Total
Grand Total: 380 × 1028 = 3.8 × 1030
66.0
121.5
18.6
57.0
12.0
14.5
26.6
4.1
12.5
2.6
10.1
3.7
3.2
2.6
4.4
8.1
1.2
3.8
0.8
3.2
1.2
1.0
0.9
0.7
275.1
79.9
25.3
APROXIMACIONES AL ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD BACTERIANA
¿Quién está ahí?
CULTIVOS (puros)
ESTUDIO DE COMUNIDADES
OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO
CULTIVOS (puros)
Estudios fenotípicos: muy limitados
Secuencias  grandes cambios en la taxonomía bacteriana
%GC
16S  Árboles filogenéticos
Análisis de fosfolípidos u otros marcadores
Inconvenientes:
Hay que cultivar!
(VNC)
Es posible que sólo detectemos el 1% de los presentes
< 5000 especies en colecciones
ESTUDIO DE COMUNIDADES
Métodos moleculares:
aislamiento de ADN total
PCR + clonación
Análisis de secuencias conservadas (16S)
Inconvenientes:
Información de secuencia 16S puede NO ser suficiente para delimitar especies
< 5000 secuencias de ARNr 16S en bases de datos
OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO
Muestras fijadas
Tinción general
Inconvenientes:
Información sobre ABUNDANCIA de microorganismos. NO sobre tipos
Tinción específica (sondas)  controles muy difíciles
Se recomienda utilizar una combinación de todas las aproximaciones.
VIABLES PERO NO CULTIVABLES
Microorganismos presentes en la naturaleza pero que NO somos capaces
de cultivar en el laboratorio.
V. cholerae en habitats “puros” incubadas en agua de mar artificial,
permanecían viables pero PERDÍAN la capacidad de formar colonias en
medios de cultivo
Muchas especies pueden alcanzar un estado de VIABLE, NO CULTIVABLE
Fallan los medios de cultivo. ¿Por qué?
“Desacoplamiento” entre metabolismo y división celular (daño oxidativo)
(atracón)
(suicidio microbiológico)
SOLUCIÓN: cultivos con restricciones nutricionales
Biodiversidad y biodegradación de aromáticos
CH3
tolueno
¿Por qué existen bacterias capaces de degradar tolueno y otros
compuestos aromáticos, incluso xenobióticos?
¿Cómo son?
¿Cómo se originan?
Lignina
CH3
tolueno
Meter aquí transparencia 15 de Biodiversidad
vamos a hablar de dioxigenasas del anillo
CH3
OH
COOH
OH
3-metilcatecol
OH
OH
protocatecuato
COOH
COOH
OH
OH
protocatecuato
OH
OH
cat D F
xylR
cbdA
S
B
I C
B
M
HI
K Q
A
J F
G
benD C
E T L Z
Y
B
A
N B A
X
M
C
C
nahAa ndoAB
C
DIOXIGENASA DEL ANILLO
bphA1 A2 A3 A4 B
t cbF E
IS
D
C
C
E
F
IS
R
cbaA B
G
C
D
ISPa
t cbAaAbAcAd
IS
B
IS
ISPß
Fd Rasa
Fd
DHDH
Rasa
C2, 3O
Van der Meer, 1997
Generalidades-Conclusiones
Patrones muy conservados de organización cromosómicas de las rutas,
aunque se observan reorganizaciones.
Flanqueadas por secuencias de inserción en algunos casos.
La mayoría son operones.
La mayoría están reguladas.
En muchos casos se puede predecir la ruta por les genes presentes.
¿Ocurre Biodegradación en la naturaleza?
(Madsen et al., 1991)
Capacidad biodegradadora
Mancha
alquitrán
Aguas subterráneas
fenantreno
100
Carretera
% Mineralización
U
D
L
Toma de muestra
50 m
50
D
L
p-HB
COOH
D
L
0
Abundancia microbiológica
naftaleno
U
U
NAF
L
D U
FEN
OH
p-HB
109
D
Log cfu
L
106
U
U
D
103
D
L
L
U
0
viables
totales
protozoos
 Se ha producido una adaptación de
las poblaciones autóctonas a
hidrocarburos poliaromáticos
 Ha habido crecimiento estimulado
por el contaminante
Evolución natural: RESPUESTA ADAPTATIVA
Con frecuencia, se observa:
 Compuesto xenobiótico
 Comunidad microbiana incapaz de degradarlo.
Incubación en presencia del compuesto
 Pasado un tiempo, se produce mineralización total del compuesto.
 Ha habido un CAMBIO en la comunidad bacteriana
MECANISMOS POSIBLES:
inducción de enzimas
 crecimiento de una subpoblación de la comunidad
 SELECCIÓN de una subpoblación con propiedades nuevas (adaptación genética)
Lleva más tiempo
No es reproducible
MECANISMOS NATURALES DE EVOLUCIÓN
Mutación /Selección
Mutaciones ocurren AL AZAR
El medio selecciona las favorables.
Mutaciones puntuales
Ocurren al azar, constantemente (dependen de la tasa de crecimiento)
Cambio de una base en el ADN
Recombinación y transposición
Pueden producir reorganización genética.
Duplicaciones.
(de uno o varios genes, generalmente por recombinación o slippage)
Suponen grandes ventajas
Elementos de inserción
Pueden tener consecuencias varias
Transferencia genética
Paso de ADN de una bacteria a otra
Mutaciones puntuales
- mutaciones silenciosas (se acumulan).
- mutaciones con efecto fenotípico (numerosos ejemplos en el laboratorio)
Son la fuente principal de biodiversidad.
ATG TTC GGA GGC ACC TTG.... .
Met Phe Gly Gly Thr Leu ...... Proteína A
Gly: GGN
Phe: TTC, TTT
Leu: TTG, TTA
Mutación no silenciosa
Mutación silenciosa
ATG TTC GGT GGC TTG.... .
Met Phe Gly Gly Leu ......
ATG TTA GGA GGC TTG....
Met Leu Gly Gly Leu ......
Proteína A*
Recombinación y transposición
Se observa en rutas conocidas.
bphA1 A2 A3 A4 B
benD C
B
A
C
E
G
F
D
.
Duplicaciones.
Se observan con frecuencia
Mecanismo importante de evolución: no se pierde ninguna función
gen A
Duplicación
gen A
Mutación
gen A
Acumulación de mutaciones
gen A
Etc...
gen A
gen A
gen B
Elementos de inserción.
gen A
A
“salto” de un elemento de inserción
IS
IS
gen A DESTRUIDO
B
“salto” de un elemento de inserción
que lleva gen de interés
genB
genB
gen A
C
“salto” de un elemento de inserción
que lleva secuencia promotora
GANANCIA DE FUNCIÓN
Px
gen A EXPRESADO CONSTITUTIVAMENTE
Transferencia genética
gen
Paso de ADN de una bacteria a otra
Muy útil en ingeniería de rutas
Vehículos:
Plásmidos (TOL, NAH, SAL) unidad de replicación independiente
Transposones
Fagos
xylR
S
HI
K Q
J F
G
E T L Z
Y
X
Existe transferencia génica en la naturaleza
- entre poblaciones naturales
- entre organismos introducidos y organismos indígenas
- ¿Retrotransferencia?
N B A
M
C
Elementos que intervienen en la evolución molecular de procariotas
Limitaciones a la
diversidad
Fuente de diversidad
Estrategias de
variación
Fuentes de
mutación
Aislamiento
Errores Polimerasa
Cambios locales de
secuencia
Reparación
Agentes
mutagénicos
Reorganizaciones
Recombinación
“Reshuffling”
Adquisición de ADN
Transferencia
horizontal
Diversidad
genética
Selección natural
Condiciones de vida
Entorno fisico-químico
Entorno biológico
Tamaño de la biosfera
(ca. 1030 células)
INTERCAMBIO DE GENES EN LA NATURALEZA
A.- En microcosmos, entre organismos conocidos
B.- Entre organismos indígenas y organismos introducidos
C.- Entre poblaciones naturales, in situ
Transferencia de genes entre Pseusomonas en microcosmos
Lodos industriales
Pseusomonas EB62
Pseusomonas UWC1
Plásmido TOL modificado. Crece en 4-Etilbenzoato.
RifR
Inocular lodos con las dos cepas
Medir supervivencia de las poblaciones
Aparición de transconjugantes
Añadir 4EB (4 mM)
Indígena
UWC1
EB62
104
UWC1/EB62
0
0
6
Tiempo (días)
12
108
Indígena
UWC1
Log cfu/ml
Log cfu/ml
108
EB62
104
UWC1/EB62
0
0
6
Tiempo (días)
12
Transferencia de genes en el suelo:
Obtención de organismos “recombinantes” in situ.
Buscamos degradadores de Bifenilos policlorinados (PCBs)
Es normal encontrar en la naturaleza degradadores de bifenilo.
NO es normal encontrar degradadores de clorobenzoato en la
naturaleza.
Tenemos Pseudomonas aeruginosa JB2, capaz de degradar
clorobenzoato.
Queremos ver si esta cepa le puede transferir sus genes a
alguna cepa del suelo, o vice versa.
+
Muestra de suelo
Bifenilo
Aroclor1242
P. aeruginosa JB2
Cln
Cln
COOH
Cln
Tomar muestras
Sembrar en medios selectivos
Estrategia
¿Ocurre en la naturaleza?
Cepa indígena
Cln
”INOCULAR” CON EL GEN QUE FALTA
Tomar muestras y conteo de dos poblaciones:
Cln
Degradadores de bifenilo
bph
Degradadores de clorobenzoato
Picar a bifenilo
Después de 15 días, empiezan a aparecer cepas
capaces de degradar los dos compuestos.
PCBs
8 son P. aeruginosa JB2 (BIOLOG)
Ciclo de Krebs
Se analizar algunos recombinantes:
son INESTABLES
1 es diferente  JB2-M (<78%)
P. aeruginosa JB2
La cepa indígena: Pseudomonas sp. AW
Cln
OH
Cln
clc
OH
Ciclo de Krebs
Esto se ha conseguido en el laboratorio
Log CFU/g de suelo
COOH
9
8
5
7
6
5
0
25
Tiempo (días)
50
C.- Entre poblaciones naturales, in situ
Sitio contaminado con alquitrán (N.Y.)
Análisis de la población:
Se aislan 21 cepas Gram – capaces de crecer en naftaleno
Se analiza la población con respecto al gen nahAc
Se analiza la población con respecto al gen del ARNr 16S
transparencia
C.- Entre poblaciones naturales, in situ
Sitio contaminado con alquitrán (N.Y.)
Análisis de la población:
Se aislan 21 cepas Gram – capaces de crecer en naftaleno
Se analiza la población con respecto al gen nahAc
Se analiza la población con respecto al gen del ARNr 16S
Se observa que hay mucha más distancia evolutiva al
analizar secuencias 16S que al analizar el gen nahAc
 Se deduce TRANFERENCIA HORIZONTAL (reciente).
 Datos sugieren que la transferencia de genes también ha
ocurrido a grandes distancias (dispersión).
 Todas las cepas aisladas llevan un megaplásmido. nahAc se
encuentra tanto en plásmido como en cromosoma, o en ambos.
¿Puede mejorar el
laboratorio a la
naturaleza?