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INGENIERÍA GENÉTICA DE RUTAS CATABÓLICAS (Evolución experimental de rutas) ¿Porqué es necesario? ¿Cómo se hace? Aplicaciones (ejemplos) Bioseguridad Biogénicos (Se degradan) Dos grupo de compuestos Biotransformantes Xenobióticos (No se degradan) Recalcitrantes Mineralización A) COOH Biotransformación B) Recalcitrancia C) COOH COOH Substrato Crecimiento CL CL CL Producto 0 1 2 0 1 2 Tiempo (Unidades) 0 1 2 ¿Porqué? Muchos compuestos tóxicos YA son degradados por cepas naturales. Sin embargo, y para algunos compuestos concretos (organoclorados, organofosforados), la velocidad de degradación por organismos naturales es muy baja. Para moléculas muy complejas (y de aparición reciente en la naturaleza), NO es de esperar que UNA SOLA cepa tenga TODA la ruta necesaria para degradarla. En estos casos, se plantea CONSTRUIR CEPAS MEJORADAS para expandir las características naturales CONSTRUCCIÓN DE RUTAS HÍBRIDAS AMPLIAR RUTA PREEXISTENTE Identificar pasos NO permisivos o cuello de botella Reclutar enzimas isofuncionales Mutagenizar y seleccionar enzimas con más amplio espectro de sustrato Añadir pasos a ruta preexistente Eliminar actividades NO deseadas "Adecuación" del regulador CONSTRUIR RUTA NUEVA Diseñar secuencia de pasos enzimáticos necesarios Reclutar las enzimas de distinta fuente ¿Cómo? Ingeniería de rutas Objetivo final: MEJORAR LAS CEPAS BACTERIANAS • Ganancia de función • Modificación de función • Pérdida de función Pasos limitantes más frecuentes: Especificad de las enzimas Fallo en la activación por el regulador Metodología: -MUTAGÉNESIS (para ganancia o pérdida de función) - al azar (requiere selección posterior) - dirigida -TRANSFERENCIA DE GENES - CONJUGACIÓN y recombinación - TRANSFORMACIÓN - y recombinación (ADN libre se integra en el cromosoma) - plásmidos (unidades replicativas independientes) -SELECCIÓN EN QUIMIOSTATOS A Rif+ Rif- La bacteria receptora A, resistente a rifampicina, no puede crecer con catecol B La bacteria donadora B, sensible a rifampicina, lleva plásmido con genes que metabolizan el catecol CONJUGACIÓN + A Rif Rif- B SELECCIÓN (Rif + catecol) A Rif+ + A Rif RECEPTORA B RifDONADORA TRANSCONJUGANTE TRANSFORMACIÓN genA (o varios genes) Ap + Plásmido manipulado oriV Bacteria Electrochoque o CaCl2 A Bacteria con función adicional Proteína A + Selección EVOLUCIÓN DE RUTAS CATABÓLICAS S A A’ A A’ A B B B B C C C D D D E E E HORIZONTAL VERTICAL EJEMPLO 1 ELIMINACIÓN BIOLÓGICA DE ALTAS CONCENTRACIONES DE NITRATO EN EFLUENTES DE FABRICACIÓN DE EXPLOSIVOS Producción de DNEG Aguas residuales con alta carga de nitrato • Aislamiento de organismos tolerantes a altas concentraciones de nitrato. • Caracterización. • Establecimiento de las condiciones óptimas para la eliminación de nitrato. • Optimización del proceso (económica): Dilución de las aguas. Suministro de nutrientes. Fuente de carbono exógena. • Mejora genética de la cepa. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS 10 g de suelo en medio mínimo GLICEROL/NITRATO SIEMBRA (24, 48, 72 H) 40 TIPOS DIFERENTES CULTIVO PURO PURIFICACIÓN SELECCIÓN Se analizan los 40 clones: Tiempo de generación (velocidad de crecimiento) Tolerancia a nitrato Eficiencia de eliminación de nitrato Baja acumulación de nitrito Nitrato Reductasa NO3¯ 2e¯ nasA Nitrito Reductasa NO2¯ 6e¯ En glicerol En etilenglicol “Clon 15” “Clon AH1” Klebsiella oxytoca Arthrobacter globiformis NH4+ nasB N orgánico Nitrato Reductasa 2e¯ nasA NO2¯ 6e¯ NH4+ nasB 18 18 16 16 14 14 amonio (mM) nitrito (mM) NO3¯ Nitrito Reductasa 12 10 8 6 12 10 8 6 4 4 2 2 0 0 10 20 tiempo (h) 30 10 20 tiempo (h) 30 oriT Plac R R Nitrato Reductasa pUPE2 9.552 kb NO3¯ nasB 2e¯ nasA Nitrito Reductasa NO2¯ 6e¯ NH4+ nasB Gen nasB de K. pneumoniae 18 18 16 16 14 14 amonio (mM) nitrito (mM) KpnI 12 10 8 6 12 10 8 6 4 4 2 2 0 0 010 20 tiempo (h) 30 010 20 tiempo (h) 30 EJEMPLO 2 DEGRADACIÓN BIOLÓGICA DE TNT (para aplicar en fábrica de explosivos) Explosivo militar y civil Almacenado desde la segunda guerra mundial (Alemania, USA). En desuso. Pérdidas en los embalajes de almacenamiento, desertizaciónEnriquecimiento y aislamiento de cepas (C1S1, Clon A) Selección de C1S1. TNT sólo es fuente de nitrógeno. Selección de ClonA (crecimiento rápido en TNT). Caracterización Fuentes de carbono óptima. Temperatura. Requerimiento de oxígeno. Crecimiento con TNT. Actividades enzimáticas. Crecimiento en aguas de la factoría. Metabolismo. Cultivo contínuo No utiliza el TNT como fuente de carbono. Construcción de cepas híbridas CH3 CH3 NO2 NO2 NO2 Clon A CO2 + H2O NO2¯ TNT tolueno CH3 COOH OH OH Plásmido TOL de P. putida tolueno benzoato catecol COOH OH CO2 + H2O Transferir plásmido TOL al Clon A CH3 CH3 NO2 NO2 NO2 TNT OH NO2¯ tolueno benzoato catecol CO2 + H2O TNT como fuente de C y N Crecimiento ClonA + TOL ClonA 0 3 6 9 Tiempo (días) CH3 EJEMPLO 3 NO2 Nitro-tolueno MINERALIZACIÓN DE MONONITROTOLUENOS Objetivo: Conseguir una cepa capaz de degradar p-nitrotolueno Las Enzimas de la ruta upper de degradación de tolueno de P. putida TOL puede llevar el p -nitrotolueno hasta nitrobenzoato. El activador XylR NO reconoce a p-nitrotolueno como activador. Ruta meta NO puede llevar el nitrobenzoato hasta CO2 + H2O. Necesitamos: Alterar el regulador XylR para que SÍ reconozca p-nitrotolueno y sea capaz de poner en marcha la ruta. Encontrar el segundo segmento de la ruta: nitrobenzoato hasta CO2 + H2O. ELEMENTO DE CONTROL: Regulación metabólica en TOL P. putida mt-2 3-metilbenzoato l pWW0 (ruta meta) Reguladores + Pu xylUWCMABN + + upper n Pm xylXYLTEGFJQKIH xylS Ps2 Ps1 Pr1 Pr2 xylR + - meta n o tolueno 4NT CH2OH CH3 Mutagénesis química CH3 NO2 Regulador XylR XylR6 XylR49 XylR7 A 85 Pro Ser - 3-MBA 4NT 180 1150 1500 150 1050 1900 2600 900 110 2110 3380 400 B 135 172 Asp Glu Asn Lys C D P. putida 2440 (pWW0Pm) P. fluorescens 410P CH 3 P. fluorescens 410PRif (pWW0Pm) + xylR6 CH3 COOH NO2 NO2 CH2OH COOH NO2 NHOH COOH NO 2 NO2 CH2OH COOH NO2 CHO X NH3 NHOH NH3 COOH CHO COOH OH NO2 OH NO2 Rotura del anillo OH COOH Rotura del anillo OH COOH CO2+H2O CO2+H2O NO2 NO2 EJEMPLO 4 EXPANSIÓN DE LA CAPACIDAD DE DEGRADAR ALQUILAROMÁTICOS EL CASO DEL ETILBENZOATO COOH CH2CH3 Ruta TOL de P. putida puede degradar muchos derivados alquilados del benzoato, pero no etilbenzoato. Las limitaciones son: El etilbenzoato NO es efector del regulador XylS no se activa la ruta. La catecol 2,3-dioxigenasa se INACTIVA con etilcatecol. Estrategia Mutagenizar el regulador XylS para que pueda reconocer etilbenzoato Mutagenizar la cateco 2,3 dioxigenasa para que pueda “romper” etilcatecol 3-metilbenzoato COOH OH CH3 CH3 CO2 + H 2O OH Efector + Sustrato COOH No es efector No es sustrato CH2CH3 xylS* COOH OH OH CH2CH3 CH2CH3 COOH OH xylE xylE* OH CH2CH3 CH2CH3 CO2 + H 2O E E H H Pm Ap Tet pBR322 pJLR100 Ap Ligación EcoRI-HindIII E Ap H Pm pJLR200 Tet xylS E.coli (pNM 185) (pJLR 200) Pm Ap pNM 185 Tc pJLR 200 Ap,Km,Tc,4EB,EMS .. . . . .. . Km Tc-r en 3MB Ap,Km Ap,Km,Tc Ap,Km,Tc,4EB Tc-s en 4EB Pm Ap xylS4 pRD4 Km Tc pJLR 200 P.putida (pWW0) (pRD4) 4EB,EMS DL E . pWW0 pERD4 xylS4 Km 4EB . .. . . . 3MB 4MB 3MB+ 4MB+ 4EBD L pWW0 E* pERD4 xyylS4 Km P.putida (pWW0-EB)(pRD4) EJEMPLO 5 COMPETENCIA ENTRE CEPA MANIPULADA Y CONSORCIO Degradación de naftalenosulfonato Se pretende comparar la eficiencia de un consorcio con la de una cepa manipulada genéticamente. Uno de los miembros del consorcio degrada naftaleno sulfonato hasta salicilato. El otro miembro del consorcio lleva salicilato hasta el ciclo de Krebs. La cepa manipulada puede mineralizar naftalenosulfonato La velocidad degradadora de ambos sistemas es equivalente. ¿Cómo compiten? Consorcio SO3H P. putida NCIB9816 Sphingomonas BN6 OH OH OH COOH OH pWW60-3026 OH OH COOH CHO COOH OH Sphingomonas BN6 CO2 + H2O Cepa manipulada COMPETENCIA EN QUIMIOSTATO Nº de células 1010 Cepa manipulada 109 108 P. putida 107 BN6 106 0 5 10 Tiempo (días) 15 CONSTRUCCIÓN DE CEPA CAPAZ DE DEGRADAR CLOROY METIL BENZOATOS B13 B13 3CB 3CC 4CB 4MB Reclutamiento de la B13 benzoate 1,2-dioxygenase Reclutamiento adicional B13 de la -lactona isomerase 3CB 4CB 4MB 3CB 4CB 4MB 3CC 4CC 4MC 3CC 4CC 4MC -L -L OAA OAA º OAA OAA OAA -L TCA TCA TCA TCA TCA TCA EXISTEN PROBLEMAS LEGALES PARA LA LIBERACIÓN AL MEDIO DE ORGANISMOS MANIPULADOS GENÉTICAMENTE NECESITAMOS SISTEMAS DE CONTROL SISTEMAS DE CONTROL DE MICROORGANISMOS MANIPULADOS GENÉTICAMENTE OBJETIVO: queremos que la cepa manipuLada desaparezca una vez que ha cumplido su función: contención biológica. • Construcción de cepas de Pseudomonas putida portadoras de un sistema activo de contención biológica • Caracterización del proceso de lisis en P. putida tras la inducción de la muerte celular • Validación en microcosmos de las cepas construídas ESTRATEGIA: diseñar un sistema de muerte programada Buscar elemento matador Elegir elemento regular Ensamblar los componentes e introducirlos en la cepa de interés. SISTEMA ACTIVO DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA ELEMENTO MATADOR ELEMENTO REGULADOR Gen regulador P P Gen letal + Señal externa La proteína reguladora impide la expresión del gen letal GENES MATADORES • • Nucleasas Proteínas tipo porinas • Gen gef de E. coli • Colapso del potencial de membrana • Liberación de ARNasa periplásmica • Permeabilización a iones Mg2+ • Gen E del fago X174 • Formación de túnel transmembrana • Liberación del contenido citoplásmico Gen gef ELEMENTO DE CONTROL: Regulación metabólica en TOL P. putida mt-2 3-metilbenzoato l pWW0 (ruta meta) Reguladores + Pu xylUWCMABN + + upper n Pm xylXYLTEGFJQKIH xylS Ps2 Ps1 Pr1 Pr2 xylR + - meta n o tolueno SISTEMA REGULADO DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA ELEMENTO REGULADOR ELEMENTO MATADOR Gen matador Supervivencia xyl S Pm lac I - + S S 3MB xyl S Plac I Pm lac I I I I I SI Plac NO S ENSAMBLAJE DE LOS ELEMENTOS Pm Tc lacI xylS 2 R gef O I ori R6K ori Km R PA1-04/03 pCC102 pMCC29 nic 14.7 kb tnp 7500 bp oriT RP4 mob Ap R Cepas contenidas biológicamente Cepa de P. putida EEZ30 Elemento matador P A1-04/03 gef Elemento control xylS2 R Pm lacI Tc R Km pCC102 14.7 kb CMC12 PA1-04/03 genE Tel R or i nic mob P. putida CMC12 Crecimiento celular (DO 660 nm ) Cepa control glucosa 1 3MB 3MB 0.1 glucosa 0.01 0 4 8 12 16 20 0 0 4 8 12 16 20 24 P. putida CMC4 (pWW0) P. putida CMC12 P. putida CMC12 OTRAS TÉCNICAS DISPONIBLES Ingeniería de proteína DNA shuffling Sistemas asociados a la raíz (rizorremedio) Sistemas asociados a biofilms EN TODOS LOS CASOS, HAY QUE CONOCER EL FUNCIONAMIENTO DE LOS SISTEMAS
